Nghiên cứu sinh tổng hợp protein nucleocapsid tái tổ hợp của virus sars cov 2 và bước đầu ứng dụng cho phát triển kit thử nhanh

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu sinh tổng hợp protein Nucleocapsid tái tổ hợp virus SARS-CoV-2 bước đầu ứng dụng cho phát triển kit thử nhanh NGUYỄN THỊ HIỀN hien.nt211162@sis.hust.edu.vn Ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Trương Quốc Phong Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 03/2023 ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu sinh tổng hợp protein Nucleocapsid tái tổ hợp virus SARS-CoV-2 bước đầu ứng dụng cho phát triển kit thử nhanh NGUYỄN THỊ HIỀN hien.nt211162@sis.hust.edu.vn Ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Trương Quốc Phong Viện: Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Chữ ký GVHD HÀ NỘI, 03/2023 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc BẢN XÁC NHẬN CHỈNH SỬA LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên tác giả luận văn: Nguyễn Thị Hiền Đề tài luận văn: Nghiên cứu sinh tổng hợp protein Nucleocapsid tái tổ hợp virus SARS-CoV-2 bước đầu ứng dụng cho phát triển kit thử nhanh Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số SV: 20211162M Tác giả, Người hướng dẫn khoa học Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác giả sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên họp Hội đồng ngày 14 tháng năm 2023 với nội dung sau: Thêm danh mục từ viết tắt Sửa lỗi tả số từ viết sai In nghiêng tên vi khuẩn Việt hoá từ Tiếng Anh, bảng hình ảnh Bổ sung đơn vị trục toạ độ đồ thị Cập nhật số liệu thống kê dịch Covid-19 Bổ sung hãng/nước sản xuất kháng thể protein thương mại Sửa đổi cách trình bày tài liệu tham khảo Ngày 16 tháng năm 2023 Giảng viên hướng dẫn Tác giả luận văn CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ thực phẩm, thầy cô trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình giảng dạy truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian học tập trường Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới thầy PGS TS Trương Quốc Phong – Phó Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà Nội, người truyền cảm hứng, tận tình hướng dẫn tạo điều kiện tốt cho em suốt trình nghiên cứu thực đề tài Em xin cảm ơn hướng dẫn, giúp đỡ nhiệt tình anh/chị/em phịng thí nghiệm 307 B1 – Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học – Đại học Bách Khoa Hà Nội thời gian em làm nghiên cứu học tập Với tất lòng kính yêu biết ơn chân thành nhất, em xin gửi tới gia đình: bố, mẹ, em trai, người ln nhiệt tình động viên, tạo điều kiện chỗ dựa tinh thần cho em trình học tập trường Em xin chân thành cảm ơn! TÁC GIẢ Nguyễn Thị Hiền TÓM TẮT LUẬN VĂN Đề tài: Nghiên cứu sinh tổng hợp protein Nucleocapsid tái tổ hợp virus SARS-CoV-2 bước đầu ứng dụng cho phát triển kit thử nhanh Tác giả luận văn: Nguyễn Thị Hiền Khóa: 2021A Cán hướng dẫn: PGS.TS Trương Quốc Phong – Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Nội dung tóm tắt:  Lý chọn đề tài Đại dịch Covid-19, gọi đại dịch Coronavirus, virus SARSCoV-2 gây hội chứng hơ hấp cấp tính nghiêm trọng, xác định lần vào tháng 12 năm 2019 Vũ Hán, Trung Quốc Virus corona gây hội chứng hô hấp cấp tính nặng 2, viết tắt SARS-CoV-2 (tiếng Anh: Severe acute respiratory syndrome corona virus 2), trước có tên virus corona 2019 (2019-nCoV), chủng coronavirus gây bệnh viêm đường hô hấp cấp virus corona 2019 (COVID-19) Virus SARS-CoV-2 cho lây lan dễ dàng trường hợp nhiễm có triệu chứng khơng có triệu chứng, qua giọt bắn (khi ho, hắt hơi) tiếp xúc gần Theo tổ chức y tế giới WHO, tính đến 9/8/2021, giới có tổng 202,608,306 ca nhiễm Covid-19, xác nhận 224 quốc gia vùng lãnh thổ, có 4,293,591 ca tử vong Mỗi ngày có khoảng 461 nghìn ca mắc báo cáo Trong tình hình dịch bệnh diễn biến ngày phức tạp chưa có dấu hiệu dừng lại nay, việc nhanh chóng xác định cách ly cá nhân bị nhiễm bệnh vô quan trọng, mang tính sống cịn việc kiểm sốt dịch bệnh Chẩn đoán ca nhiễm thực dựa triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm hình ảnh học Vì triệu chứng hình ảnh học COVID-19 khơng đặc hiệu, chẩn đốn xác định nhiễm SARS-CoV-2 phải thực phản ứng chuỗi polymerase dựa axit nucleic (polymerase chain reaction – PCR), khuếch đại đoạn gen di truyền cụ thể virus Tuy nhiên, với mức độ lây lan nhanh chóng virus SARS-CoV-2 chủng mới, đòi hỏi phương pháp xét nghiệm chỗ, nhanh chóng, dễ dàng thực nhằm sàng lọc ca nhiễm bệnh, thay phương pháp xét nghiệm phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase chép ngược (RT PCT) có độ xác cao, nhiên thời gian xét nghiệm lâu đòi hỏi nhân viên thực có kỹ thuật cao Các nghiên cứu protein Nucleocapsid (protein N) virus SARS-CoV-2 protein bật dịch nuôi cấy virus, đồng thời chứa tương đồng protein Nucleocapsid virus corona khác Điều cho thấy kháng nguyên quan có giá trị việc chẩn đốn sớm bệnh nhân nhiễm Covid-19 Do đó, nhóm nghiên cứu thực đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp protein N tái tổ hợp virus SARS-CoV-2 bước đầu ứng dụng cho chế tạo kit thử nhanh”  Mục đích đề tài • Xác định điều kiện biểu thu nhận protein N tái tổ hợp tinh • Tạo kháng thể đa dịng thỏ chuột lang kháng protein N • Bước đầu ứng dụng phát triển kit thử nhanh phát kháng nguyên virus SARS-CoV-2  Nội dung nghiên cứu • Tối ưu hố trình tự gen mã hố protein N virus SARS-CoV-2 phù hợp chủng chủ E coli BL21(DE3) • Nghiên cứu điều kiện biểu hiện, thu nhận tinh protein N • Nghiên cứu điều kiện tạo thu nhận kháng thể đa dòng thỏ chuột lang kháng protein N • Nghiên cứu ứng dụng protein N phát triển kit thử nhanh  Phương pháp nghiên cứu • Phương pháp biểu tinh protein tái tổ hợp • Phương pháp ELISA • Phương pháp gây miễn dịch động vật • Phương pháp tinh kháng thể sắc ký lực với protein A • Phương pháp tạo cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng • Phương pháp cố định kháng thể màng lai  Kết luận • Thu nhận thành cơng protein Nucleocapsid tái tổ hợp có đặc tính kháng nguyên tương đương với protein Nucleocapsid thương mại • Tạo kháng thể đa dịng thỏ chuột lang kháng protein Nucleocapsid • Ứng dụng kháng thể đa dòng thỏ chuột lang, phát triển que thử nhanh phát kháng nguyên N virus Sars-CoV-2 với độ lặp lại 100%, độ đặc hiệu 100% độ nhạy 93,3% MỤC LỤC CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tình hình dịch Covid-19 giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình Covid-19 giới 1.1.2 Tình hình Covid-19 Việt Nam 1.2 Virus SARS-CoV-2 1.2.1 Đặc điểm cấu trúc di truyền virus SARS-CoV-2 1.2.2 Đặc điểm protein Nucleocapsid 1.2.3 Cơ chế xâm nhập lây nhiễm virus SARS-CoV-2 1.3 Các phương pháp chẩn đoán 1.4 Que thử 11 1.4.1 Thành phần cấu tạo 11 1.4.2 Nguyên lý, đặc tính que thử 14 1.4.3 Ưu, nhược điểm que thử 16 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18 2.1 Vật liệu 18 2.1.1 Chủng vi sinh vật 18 2.1.2 Vector biểu pET-22b(+) 18 2.1.3 Các kháng thể protein sử dụng cho ELISA Western Blot 18 2.1.4 Môi trường – Hóa chất 19 2.2 Thiết bị 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Phương pháp vi sinh 21 2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử 21 2.3.3 Phương pháp hóa sinh 23 2.3.4 Phương pháp miễn dịch học 26 2.3.5 Đánh giá đặc tính que thử 34 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Kết tối ưu trình tự gen N thuật tốn có sẵn 36 3.2 Nghiên cứu điều kiện sinh tổng hợp protein Nucleocapsid 38 3.2.1 Biến nạp biểu protein Nucleocapsid 38 3.2.2 Thu nhận tinh protein Nucleocapsid 40 3.2.3 Đánh giá hoạt tính protein N tái tổ hợp sau tinh 42 3.3 Nghiên cứu tạo kháng thể đa dòng kháng protein N thỏ chuột lang 43 3.3.1 Quy trình gây miễn dịch thỏ chuột lang 43 i 3.3.2 lang 3.3.3 Đánh giá hiệu trình gây đáp ứng miễn dịch thỏ chuột 44 Tinh chế kháng thể đa dòng kháng protein Nucleocapsid 45 3.4 Nghiên cứu chế tạo que thử nhanh phát kháng nguyên protein N virus Sars-CoV-2 49 3.4.1 Thiết lập điều kiện ban đầu que thử 49 3.4.2 Nghiên cứu điều kiện tạo phức hợp kháng thể - hạt nano vàng 50 3.4.3 Nghiên cứu cố định kháng thể lên màng lai 52 3.4.4 Nghiên cứu vật liệu tạo que thử 52 3.4.5 Đánh giá que thử 54 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 4.1 Kết luận 59 4.2 Kiến nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 ii DANH MỤC VIẾT TẮT ACE2 Angiotensin Converting Enzyme Amp Ampicillin AuNP Gold nanoparticle ARN Axit ribonucleic Bp Base pair BSA Bovine Serum Albumine CBB Coomassie Brilliant Blue E coli Escherichia coli EDTA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Asay ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Asay FCA Freund’s Complete Adjuvant FIA Freund’s Incomplete Adjuvant FPLC Fast protein liquid chromatography HRP Horseradish Peroxidase Ig Immonoglobulin/globulin IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kDa Kilo Dalton LB Luria Bertani MERS Middle East Respiratory Syndrome mRNA Messenger Ribonucleic acid OD Optical Density PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis PBS Phosphate Buffered Saline PBS-T Phosphate Buffered Saline – Tween – 20 PCR Polymerase Chain Reaction RT-PCR Reverse Transcription PCR SARS-CoV-2 Severe acute respiratory syndrome corona virus SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis TMB Tetramethylbenzidine WHO World Health Organization iii băng protein mẫu huyết Đối với mẫu kháng thể tinh (đường chạy 3) thấy xuất hai băng protein tương ứng với IgG chuỗi nặng chuỗi nhẹ Các kết cho thấy thành phần protein khơng mong muốn hồn tồn khơng bám bị thải sau nạp mẫu, IgG bám đặc hiệu vào cột thơng qua protein A thu lại sau đẩy glycine Từ kết thu kết luận IgG tinh từ huyết Sau đổi đệm PBS 1X pH 7,4 Amicon Ultra-4 30 kDa dịch kháng thể bảo quản -20°C Tương tự kháng thể thỏ kháng protein N tinh (hình 3.11) Hình 3.11: Điện di SDS-PAGE kiểm tra kết tinh kháng thể thỏ kháng protein Nucleocapsid Đường chạy M: thang protein chuẩn; Đường chạy 1: huyết thỏ 1; Đường chạy 2: dịch qua cột; Đường chạy 3: kháng thể thỏ tinh Kết điện di cho thấy tinh kháng thể IgG từ huyết thỏ gây miễn dịch Tiếp theo, để đánh giá khả phản ứng kháng thể đa dòng thu với protein N, tiến hành phương pháp ELISA sử dụng loại protein N: protein N 47 tái tổ hợp thu từ nghiên cứu protein N thương mại từ công ty TNHH Medicon Hai loại protein cố định giếng hai loại kháng thể đa dòng thỏ chuột lang thu từ nghiên cứu sử dụng làm kháng thể sơ cấp Quy trình ELISA trình bày chi tiết mục 2.3.4 Kết ELISA thể hình 3.12 1.8 1.6 1.4 OD450nm 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 Rabbit antibody prN-BK Guinea pig antibody prN-TM Hình 3.12: Kết ELISA đánh giá tương tác kháng thể đa dòng kháng protein N với hai loại protein N PrN-BK: protein Nucleocapsid tái tổ hợp thu nhận từ nghiên cứu này; prN-TM: protein Nucleocapsid từ công ty Medicon, Việt Nam Kết ELISA cho thấy kháng thể thỏ kháng thể chuột lang bắt giữ hai loại protein, kháng thể chuột lang có phản ứng mạnh kháng thể thỏ 48 3.4 Nghiên cứu chế tạo que thử nhanh phát kháng nguyên protein N virus Sars-CoV-2 3.4.1 Thiết lập điều kiện ban đầu que thử Que thử nhanh nghiên cứu thiết kế dựa nguyên lý sắc ký miễn dịch, mô tả chi tiết mục 2.3.5 Trước tiên để xác nhận que thử có hoạt động, tiến hành thiết lập điều kiện ban đầu Dựa vào nghiên cứu chế tạo que thử nhanh trước đó, thiết lập que thử với điều kiện ban đầu sau: - Điều kiện tạo cộng hợp: cộng hợp kháng thể đa dòng chuột lang kháng proN với hạt nano vàng với lượng 1,5 µg/miếng cộng hợp, sử dụng K2CO3 0,02M để điều chỉnh pH sử dụng vật liệu miếng cộng hợp JZ112 - Vạch T: phun cố định kháng thể đa dòng thỏ kháng proN với lượng 1,0 µg/que thử màng Vivid170 - Vạch C: sử dụng protein A với lượng 0,05 µg/que thử Sau điều kiện ban đầu thiết lập, thử nghiệm với mẫu âm tính dương tính với virus Sars-CoV-2 Kết mẫu âm tính, xuất vạch tín hiệu màu hồng tía vị trí vạch C, mẫu dương tính, xuất hai vạch tín hiệu vị trí vạch C vạch T (hình 3.13) Điều chứng tỏ với điều kiện ban đầu, bước đầu thiết lập que thử hoạt động tốt Tuy nhiên tín hiệu vạch T mẫu dương cịn mờ, cần tiến hành khảo sát để tăng tín hiệu que thử Vạch C A B Vạch T Hình 3.13: Kết kiểm tra hoạt động que thử với điều kiện thiết lập ban đầu (A): que chạy mẫu âm tính; (B) que chạy mẫu dương tính 49 3.4.2 Nghiên cứu điều kiện tạo phức hợp kháng thể - hạt nano vàng a) Khảo sát giá trị pH tối ưu Trong nghiên cứu sử dụng phương pháp hấp phụ vật lý để cộng hợp kháng thể lên hạt nano vàng nhờ lực tương tác vật lý Liên kết có độ bền khơng cao phụ thuộc nhiều vào pH môi trường tạo cộng hợp Sự thay đổi pH dẫn đến thay đổi chất chất bị hấp phụ, nhóm chức bề mặt, oxi hoá - khử, dạng tồn hợp chất,… Theo lý thuyết, kháng thể hấp phụ bề mặt hạt vàng tương tác ion pH trì xung quanh điểm đẳng điện kháng thể Để xác định giá trị pH phù hợp với kháng thể đa dòng chuột lang kháng protein N sử dụng nghiên cứu này, tiến hành khảo sát tạo cộng hợp điều kiện pH khác cách sử dụng nồng độ K2CO3 khác Kết thể hình 3.14: Hình 3.14: Khảo sát pH tạo cộng hợp với hạt nano vàng (a): Kết chạy que mẫu âm tính; (b): Kết chạy que với mẫu dương tính Kết cho thấy tất điều kiện pH không xuất hiện tượng dương giả que chạy mẫu âm tính, mẫu dương tính, điều kiện pH sử dụng K2CO3 0,04 M cho tín hiệu vạch T rõ Vì vậy, chọn điều kiện K2CO3 0,04 M cho thí nghiệm 50 b) Khảo sát lượng kháng thể miếng cộng hợp Kháng thể chuột lang kháng protein N có nhiệm vụ bắt cặp với kháng nguyên protein N mẫu Hàm lượng kháng thể có liên quan mật thiết đến khả phát hiển thị tín hiệu que thử Lượng kháng thể sử dụng để tạo cộng hợp với hạt nano vàng ảnh hưởng đến số lượng phân tử kháng thể cộng hóa trị bề mặt hạt vàng Lượng kháng thể thấp gây ảnh hưởng tới độ nhạy que thử Tuy nhiên lượng kháng thể cao gây tốn kém, dẫn đến tượng dương tính giả làm thay đổi điện tích bề mặt hạt vàng Do vậy, tiến hành khảo sát sáu lượng kháng thể khác bao gồm: 0,5 µg; 1,0 µg; 1,5 µg; 2,0 µg; 2,5 µg; 3,0 µg/phản ứng cộng hợp/que thử, nhằm chọn lượng kháng thể phù hợp tạo cộng hợp với hạt nano vàng Hình 3.15:Kết khảo sát lượng kháng thể miếng cộng hợp a: Kết thử que với mẫu âm b: Kết thử que với mẫu dương Tuy việc tăng lượng kháng thể miếng cộng hợp tăng tín hiệu vạch T mẫu dương, đồng thời dẫn tới tương dương giả Do cần phải chạy đồng thời mẫu âm tính mẫu dương tính điều kiện lượng kháng thể khác Kết hình 3.15 cho thấy không xuất hiện tượng dương giả tăng lượng kháng thể lên tới 3,0 µg/miếng cộng hợp Ở que chạy mẫu dương, tín hiệu vạch T tăng dần que có lượng kháng thể tạo cộng hợp 2.5 µg, khơng tăng que có lượng kháng thể tạo cộng hợp 3,0 µg Vì đánh 51 giá điều kiện 2,5 µg điều kiện lượng kháng thể phù hợp để cộng hợp với hạt nano vàng 3.4.3 Nghiên cứu cố định kháng thể lên màng lai Xác định hàm lượng kháng thể kháng protein N cố định vạch kiểm tra Bên cạnh đặc tính màng lai, lượng kháng thể cố định vị trí vạch kiểm tra màng ảnh hưởng nhiều tới độ nhạy độ đặc hiệu que thử Kháng thể đa dòng thỏ kháng protein N virus Sars-CoV-2 phun vị trí vạch kiểm tra que thử Tại đây, kháng thể bắt cặp với kháng nguyên N mẫu dương tính màu cộng hợp Ab-AuNPs, trường hợp âm tính khơng xuất vạch tín hiệu Tiến hành khảo sát lượng phun kháng thể khác 0,5 µg; 1,0 μg; 1,5 μg; 2,0μg kháng thể thỏ/que thử Hình 3.16: Kết thử que mẫu dương tính với lượng kháng thể cố định màng lai khác Kết cho thấy tăng lượng kháng thể phun vạch T từ 0,5 µg đến 2,0 µg cường độ tín hiệu tăng Tuy nhiên, que có lượng kháng thể cố định 2,0 µg, cường độ tín hiệu vạch khơng tăng so với que có lượng kháng thể 1,5 Vì chọn lượng kháng thể đa dòng thỏ kháng protein N cố định màng lai 1,5 µg/que cho nghiên cứu 3.4.4 Nghiên cứu vật liệu tạo que thử a) Khảo sát vật liệu miếng cộng hợp Miếng cộng hợp thành phần quan trọng que thử, có ảnh hưởng lớn đến độ nhạy độ đặc hiệu que thử Các loại vật liệu sử dụng làm miếng cộng hợp cần có độ thấm phù hợp để nhỏ dịch cộng hợp phân bố 52 miếng cộng hợp, có khả giữ cố định cộng hợp kháng thể - hạt nano vàng q trình sấy, khơng làm hỏng hay bất hoạt kháng thể ổn định đặc điểm dòng chảy, có khả nhả phức hợp kháng thể - hạt nano vàng hoàn toàn Các vật liệu thường dùng để làm miếng cộng hợp bao gồm sợi thuỷ tinh (Glass fiber) Polyester Mặc dù loại vật liệu độ dày khác ảnh hưởng tới hiệu que thử Để lựa chọn loại vật liệu tốt nhất, tiến hành khảo sát loại vật liệu có sẵn phịng thí nghiệm Đặc điểm chi tiết loại vật liệu mô tả bảng 1.3 Tiến hành tạo cộng hợp điều kiện nhỏ dung dịch cộng hợp lên loại miếng cộng hợp khác nhau, sau thử với mẫu dương tính Kết thu hình 3.17 Hình 3.17: Kết thử mẫu dương với loại vật liệu miếng cộng hợp khác Kết cho thấy vật liệu JZ112 có độ thấm mẫu tốt, khả nhả mẫu nhanh, từ tín hiệu quán sát rõ nét Vì vậy, chọn vật liệu JZ112 để tạo miếng cộng hợp thí nghiệm b) Lựa chọn vật liệu màng nitrocellulose Màng thành phần quan trọng chế tạo que thử, ảnh hưởng đến chất lượng que thử Các đặc tính khác màng có ảnh hưởng trực tiếp tới độ nhạy độ đặc hiệu que thử, thời gian chảy mao quản số đặc tính Tốc độ dịng chảy nhanh (thời gian chảy mao quản ngắn) thời gian đánh giá kết nhanh, nhiên thời gian bắt cặp kháng nguyên kháng thể bị giảm, dẫn tới giảm độ nhạy Ngược lại tốc độ dòng chảy chậm (thời gian chảy mao quản dài) phản ứng kháng nguyên kháng thể diễn tốt hơn, dẫn tới độ nhạy cao 53 Tuy nhiên thời gian dài làm giảm độ đặc hiệu que thử Bốn loại màng nitrocellulose khác sử dụng khảo sát tốc độ mao dẫn để chọn vật liệu phù hợp Bảng 3.1: Đặc điểm màng nitrocellulose TT Tên sản phẩm Pall Vivid 170 (Vivid 170) Milipore 140 (NC 140) Milipore 135 (NC 135) Milipore 180 (NC 180) Loại sản Hãng sản phẩm xuất NC-b103 Pall 170 NC-b101 Milipore 140 NC-b102 Milipore 135 NC-b110 Milipore 95 Tốc độ (giây/4cm) Kết chạy que với mẫu dương tính thể hình 3.18 Hình 3.18: Kết thử mẫu dương tính loại màng lai khác Từ kết cho thấy cường độ tín hiệu vạch rõ nét quan sát que sử dụng màng Pall Vivid 170 Vì vậy, chọn màng Pall Vivid 170 (Pall, Mỹ) cho nghiên cứu 3.4.5 Đánh giá que thử a) Đánh giá giới hạn phát que thử Để xác định giới hạn phát que thử, tiến hành sử dụng mẫu nhân tạo cách trộn protein N virus Sars-CoV-2 với dịch hầu họng 54 dung dịch đệm thử mẫu để đạt tới nồng độ 0,1 ng; ng; 10 ng; 100 ng/ ml tiến hành thử que Hình 3.19: Kết khảo sát giới hạn phát que thử Kết hình cho thấy nồng độ 10 ng/ml, quan sát vạch tín hiệu mờ vị trí vạch T Từ kết luận giới hạn phát que thử 10 ng/ml b) Độ lặp lại que thử Để đánh giá độ lặp que thử, tiến hành kiểm tra 10 que thử với mẫu âm tính 10 que thử với mẫu dương tính cùng điều kiện (về người thao tác, thiết bị,…) Hình 3.20: Kết độ lặp lại với mẫu âm tính 55 Hình 3.21: Kết độ lặp lại với mẫu dương tính c) Đánh giá độ đặc hiệu que thử Để đánh giá độ đặc hiệu que thử, tiến hành sử dụng mẫu âm cách thu thập mẫu dịch họng hầu 30 cá nhân bình thường, khơng bị bệnh Sau tiến hành chạy 30 que thử Kết hình 3.22 cho thấy tất 30 mẫu dịch tỵ hầu âm tính chạy với que thử cho tín hiệu vạch vị trí vạch C Vì kết luận độ đặc hiệu que thử đạt 100% 56 Hình 3.22: Kết đánh giá độ đặc hiệu que 30 mẫu âm tính d) Đánh giá độ nhạy que thử Để đánh giá độ nhạy que thử, tiến hành thử que với 30 mẫu dịch tỵ hầu dương tính với protein N, đọc kết sau 15 phút Kết trình bày hình 3.23 Kết quan sát 28/30 que có tín hiệu vạch (mẫu số 10 mẫu số không quan sát tín hiệu vạch T) Từ tính tốn độ nhạy que đạt 93,3%, đáp ứng yêu cầu Tổ chức Y tế giới (WHO) 57 Hình 3.23: Kết đánh giá độ đặc hiệu 30 mẫu dương tính 58 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết thu được, kết luận sau: - Thu nhận thành công protein Nucleocapsid tái tổ hợp có đặc tính kháng ngun tương đương với protein Nucleocapsid thương mại - Tạo kháng thể đa dòng thỏ chuột lang kháng protein Nucleocapsid - Ứng dụng kháng thể đa dòng thỏ chuột lang, phát triển que thử nhanh phát kháng nguyên N virus Sars-CoV-2 với độ lặp lại 100%, độ đặc hiệu 100% độ nhạy 93,3% 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu tối ưu thêm điều kiện que thử - Đánh giá que thử mẫu bệnh phẩm - Thử nghiệm phản ứng chéo với biến chủng virus Sars-CoV-2 mẫu bệnh có triệu chứng với Covid-19 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] "covid19.gov.vn," [Online] Available: https://covid19.gov.vn/ [2] S.-L Wee, "Japan Confirms First Case of New Chinese Coronavirus," The New York Times, 2020 [3] "who.int," [Online] Available: https://www.who.int/ [4] J Helms, Julie, et al., "High risk of thrombosis in patients with severe SARSCoV-2 infection: a multicenter prospective cohort study," Intensive Care Medicine, vol 46, no 6, pp 1089-1098, 2020 [5] Carfì, Angelo, et al., "Persistent symptoms in patients after acute COVID19," Jama, vol 324, no 6, pp 603-605, 2020 [6] Huang, Chaolin, et al., "6-month consequences of COVID-19 in patients discharged from hospital: a cohort study," The Lancet, vol 397, no 10270, pp 220-232, 2021 [7] Bahrami, Afsane, et al., "Genetic and pathogenic characterization of SARSCoV-2: a review," Future Virology, vol 15, no 8, pp 533-549, 2020 [8] Zhu, Na, et al., "A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019," New England journal of medicine, 2020 [9] Ke, Zunlong, et al, "Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions," Nature, vol 588, no 7838, pp 498-502, 2020 [10] Lan, Jun, et al., "Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor," nature, vol 581, no 7807, pp 215220, 2020 [11] F e a Li, "Structure of SARS coronavirus spike receptor-binding domain complexed with receptor," Science, vol 309, no 5742, pp 1864-1868, 2005 [12] Lu, Guangwen, et al, "Molecular basis of binding between novel human coronavirus MERS-CoV and its receptor CD26," Nature, vol 500, no 7461, pp 227-231, 2013 [13] Y.-H e a Li, "Detection of the nucleocapsid protein of severe acute respiratory syndrome coronavirus in serum: comparison with results of other viral markers," Journal of virological methods, vol 130, no 1-2, pp 40-50, 2005 [14] "vinatom," [Online] Available: vinatom.gov.vn [15] N E e a Grossoehme, "Coronavirus N protein N-terminal domain (NTD) specifically binds the transcriptional regulatory sequence (TRS) and melts TRS-cTRS RNA duplexes.," Journal of molecular biology, vol 394, no 3, pp 544-557, 2009 [16] A e a Szymczak, "Antibodies specific to SARS-CoV-2 proteins N, S and E in COVID-19 patients in the normal population and in historical samples," The Journal of General Virology, vol 102, no 11, 2021 60 [17] Cevik, Muge, et al, "Virology, transmission, and pathogenesis of SARSCoV-2," bmj, vol 371, 2020 [18] Corman, Victor M., et al, "Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR," Eurosurveillance, vol 25, no 3, 2020 [19] Loeffelholz, M.J and Y.-W Tang, "Laboratory diagnosis of emerging human Coronavirus infections–the state of the art.," Emerging microbes & infections, vol 9, no 1, pp 747-756, 2020 [20] Wang, W., et al, "Detection of SARS-CoV-2 in different types of clinical specimens.," Jama, vol 323, no 18, pp 1843-1844, 2020 [21] Azzi, L., et al, "Saliva is a reliable tool to detect SARS-CoV-2.," Journal of Infection, 2020 [22] Lippi, G., A.-M Simundic, and M Plebani, "Potential preanalytical and analytical vulnerabilities in the laboratory diagnosis of Coronavirus disease 2019 (COVID-19)," Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM), 2020 [23] Wyllie, Anne L., et al, "Saliva is more sensitive for SARS-CoV-2 detection in COVID-19 patients than nasopharyngeal swabs," MedRxiv , 2020 [24] Xie, Chunbao, et al, "Comparison of different samples for 2019 novel coronavirus detection by nucleic acid amplification tests," International Journal of Infectious Diseases, vol 93, pp 264-267, 2020 [25] Sambrook, J., et al., "Molecular Cloning: a Laboratory Manual 3rd Edition Cold Springer Harbor Laboratory Press," Cold Springer Harbor, New York, USA, 2001 [26] Laemmli, Ulrich K., "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4," nature , vol 227, no 5259, pp 680-685, 1970 [27] Wingfield, Paul T, "Preparation of soluble proteins from Escherichia coli," Current protocols in protein science, vol 78, no 1, 2014 [28] M R J Salton, "The properties of lysozyme and its action on microorganisms," Bacteriological reviews , vol 21, no 2, pp 82-100, 1957 [29] Voller, A., A Bartlett, et al., "Enzyme immunoassays with special reference to ELISA techniques.," Journal of clinical pathology, vol 31, no 6, pp 507520, 1978 [30] Jacobs, S., and A Koj, "Amino acid composition of rabbit plasma albumin and fibrin," Analytical Biochemistry, vol 27, no 1, pp 178-182, 1969 61