TỔNG QUAN
Glutathione
Glutathione là một chất chống oxy hoá trong cơ thể sống Đây là một tripeptide bao gồm các đơn phân L-glutamate, L-cysteine và glycine (hình 1.1).
GSH có thể được tìm thấy trong nhiều loại động thực vật, trong đó được tìm thấy nhiều nhất trong nấm men, mầm lúa mạch, và gan động vật [44] Cấu trúc của
GSH chứa một nhóm thiol có tính khử mạnh (R-SH) Glutathione ổn định ở trạng thái rắn nhưng dễ bị oxy hoá trong môi trường nước Ở dạng oxy hoá, glutathione disulfide (GSSG) được minh hoạ ở hình 1.2 Dạng oxy hoá của của
GSH được liên kết bằng liên kết disulfide, thu được bằng cách khử hydro ở hai nguyên tử GSH GSSG bị khử thành GSH bằng enzyme glutathione reductase
[31] Phương trình (1.1) thể hiện phản ứng hoá học này [43],[51].
Glutathione có thể tồn tại cả ở trạng thái khử và trạng thái oxy hoá trong các tế bào, mô và màng plasma [4] Trong tế bào và mô khoẻ mạnh, có hơn 90%
GSH tồn tại dưới dạng khử và khoảng dưới 10% tồn tại dưới dạng oxy hoá Tỷ lệ chuyển đổi GSSG – GSH thường được coi là một dấu hiệu của sự mất cân bằng oxy hoá [21],[32].
Hình 1.1 Cấu trúc của glutathione [4]
Hình 1.2 Cấu trúc của glutathione disulfide
Glutathione có nhiều chức năng sinh lý quan trọng, thể hiện trong hình 1.3. GSH liên quan tới quá trình chống sự mất cân bằng oxy hoá; vận chuyển axit amin; ổn định hoạt tính enzyme; giải độc các chất ngoại bào và xenobiotic; chuyển hoá nitơ và lưu huỳnh [55],[57].
Hình 1.3 Tóm tắt về chức năng của glutathione [58]
Glutathione có nhiều chức năng sinh lý khác nhau, có thể tóm tắt trong ba khía cạnh chính: chống oxy hóa, chống lại các phân tử ngoại lai và tăng cường miễn dịch[16],[56] Các chức năng sinh lý này khiến GSH trở thành một loại sinh phẩm quan trọng dùng trong điều trị nhiều bệnh, chẳng hạn như xơ gan, nhiễm
HIV và viêm tuyến tụy [35],[83] Ngày nay, GSH đã được sử dụng trong ngành công nghiệp mỹ phẩm và phụ gia thực phẩm.
Công nghệ sản xuất glutathione
1.2.1 Lịch sử cấu trúc phân tử của glutathione
Glutathione được phát hiện lần đầu tiên bởi J.de Rey-Paihade vào năm 1888 từ cao nấm men và nhiều loại mô động vật (mô cơ xương và gan bò, cơ xương của cá, ruột non và não của cừu) và trong lòng trắng trứng J.de Rey-Paihade còn đặt tên cho hợp chất này là philothion với ý nghĩa là tình yêu và lưu huỳnh trong tiếng Hy Lạp [62] Năm 1921, Hopkins đã xác định được thành phần của philothion phân lập từ gan, cơ xương và nấm men và cho rằng đây là một dipeptide có chứa cysteine và glutamate Tuy nhiên, Hopkins và cộng sự đã bỏ qua sự có mặt của glycine trong cấu trúc của philothion Và để tôn vinh lịch sử phát hiện ra philothion, Hopkins đã đặt tên cho hợp chất này là ‘glutathione’.
Dựa trên hàm lượng nitơ và lưu huỳnh có trong GSH được phân lập từ nấm men, máu và gan, năm 1927, Hunter và Eagles đã chỉ ra rằng GSH không phải là một dipeptide chỉ có chứa glutamate-cysteine mà là một tripeptide chứa glutamate- cysteine và một phân tử amino axit trọng lượng phân tử thấp (có thể là serine).
Bằng cách sử dụng phương pháp thuỷ phân axit, năm 1929 Hopkins đã xác định được cấu trúc tripeptide bao gồm glutamate, cysteine và glycine của GSH Và kết quả này được củng cố bởi nghiên cứu độc lập của tác giả Kendall và cộng sự vào năm 1929 và 1930 Dựa trên thí nghiệm chuẩn độ GSH trong nước và formaldehyde cũng như các giá trị pK quan sát được, năm 1929, Pirie và Pinhey đã báo cáo cấu trúc của GSH là γ-glutamate – cysteine – glycine Cấu trúc của
GSH đã được xác nhận một lần nữa vào năm 1935 bởi Mead và Harington thông qua tổng hợp hoá học từ N-carbobenzoxycystine và glycine ethyl ester Một năm sau đó, quá trình tổng hợp hoá học khác của GSH được thực hiện bởi Vigneaud và Miller sử dụng S-benzylcysteinylglycine metyl este và hợp chất acyl clorua của N-carbobenzoxyglutamate- α-methyl ester Trong suốt nửa thế kỷ trước,
GSH được tìm thấy ở hầu khắp các tế bào Những hợp chất liên quan đã được báo cáo tới hiện tại bao gồm γ-Glu-Cys-Gly-essenceidine ở E coli và (γ-Glu-
Cys) n-Gly trong thực vật [1],[84].
1.2.2 Tổng hợp glutathione bằng phương pháp hoá học
Quá trình tổng hợp glutathione được mô tả lần đầu tiên bởi Harrington và Mead (Hình 1.4) như sau: N-benzyloxycarbonyl cysteine 1 được chuyển đổi thành acyl clorua 2 và sau đó liên kết với glycine ethyl ester 3, sản phẩm 4 được xử lý với Phosphonium iodide trong axit acetic được chuyển thành cysteylglycyl ethyl ester 5 được phân tách thuận tiện dưới dạng hydroiodide Sau đó axit N- benzyloxycarbonylglutamic 6 được chuyển thành anhydrit N-benzyloxycarbonyl glutamic acid 7 Xử lý thành phần 7 bởi photpho pentaclorua để tạo acyl clorua 8. Sau đó acyl clorua 8 sẽ kết hợp với cysteylglycyl ethyl ester 5 để tạo ra ester 9. Nhóm chức ester sau đó sẽ được loại bỏ khỏi 9 bằng cách thuỷ phân cẩn thận trong dung dịch kiềm và axit được loại ra sẽ được xử lý với phosphonium iodide dưới điều kiện thông thường Từ hỗn hợp phản ứng, thu được lượng nhỏ tripeptide glutathione 10 được chứng minh là giống nhau về mọi mặt với một mẫu GSH thu được từ các nguồn tự nhiên [1].
Hình 1.4 Sơ đồ phản ứng tổng hợp glutathione từ N-benzyloxycarbonyl cysteine [1]
1.2.2.2 Phương pháp tổng hợp từ Di(N-p-nitrocarbobenzoxy) L-cystine
Berse và cộng sự (1959) đã mô tả phương pháp sản xuất glutathione (Hình
1.5) Di(N-p-nitrocarbobenzoxy) L-cystine 1 được ngưng tụ với glycine ethyl ester 2 trong sự có mặt của N,N’-dicyclohexylcarbodiimide; ester trung gian 3 bị khử một phần để phá vỡ nhóm amino của L-cysteine mà không phân cắt liên kết disulfate của nó Kết quả dietyl L-cysteinyl diglycinat 4 được ngưng tụ với 2 đương lượng mol của p-nitrocarbobenzoxy-L-glutamic 5 để tạo ra ester 6, sau đó cấu trúc GSH được hình thành Quá trình xà phòng hoá (a) và sự khử một phần (b) của 6 tạo ra GSH oxy hoá Quá trình hydro hoá với xúc tac paladi tạo ra GSH 7 [7].
Hình 1.5 Sơ đồ phản ứng tổng hợp Glutathione từ Di(N-p- nitrocarbobenzoxy) L-cystine [7]
Mặc dù, sản xuất GSH bằng phương pháp hoá học đã được thương mại hoá vào những năm 1950 của thế kỷ trước, nhưng sản phẩm tạo ra bởi phương pháp này thường là hỗn hợp racemic bao gồm cả hai dạng đồng phân D- và L- Bởi vì, chỉ có đồng phân dạng L mới có chức năng sinh lý, do đó đòi hỏi thêm giải pháp
Dựa trên sự nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp GSH trong gan và các đặc trưng của quá trình này, năm 1949 Bloch đã khám phá ra con đường sản xuất GSH bằng phương pháp enzyme và lên men vi sinh vật Theo đó, GSH được tổng hợp bằng hai phản ứng enzyme phụ thuộc ATP kế tiếp nhau [44] Đầu tiên dipeptide γ-glutamylcysteine (γ-GC) được tổng hợp từ axit glutamic và L- cysteine bởi enzyme dipeptide γ-glutamylcysteine synthetase (cũng được biết đến với tên gọi glutamate-cysteine ligase, EC 6.3.2.2, GSH I) Trong bước thứ 2, glycine được gắn vào vị trí C cuối của γ-glutamylcysteine (γ-GC) bởi glutathione synthetase (EC 6.3.2.2, GSH II) để tạo thành GSH Thông thường, hoạt động của GSH I bị ức chế phản hồi bởi GSH để tránh sự tích tụ quá mức GSH, bảo đảm hàm lượng GSH ở mức độ sinh lý [35] Trong khi đó, GSH nội bào có thể bị phân huỷ bởi glutamyltranspeptidase (γ-GTP) để tạo thành gốc γ-glutamyl – có vai trò quan trọng trong vận chuyển amino axit Để sản xuất quá mức GSH sử dụng xúc tác sinh học hoặc lên men vi sinh vật cần phải giải phóng GSH I khỏi sự ức chế phản hồi bởi GSH cùng với đó là sự bất hoạt hoặc loại bỏ enzyme γ- GTP [46] Hình 1.6 cung cấp một cái nhìn tổng quan về sinh hoá, cho thấy các con đường sinh tổng hợp, chuyển hoá và minh hoạ các vai trò sinh lý của GSH.
Hình 1 6 Các con đường chuyển hoá liên quan đến GSH và vai trò sinh lý của GSH ở vi sinh vật [35]
(Cys: cysteine, Gly: glycine, Glu: glutamate, G6PDH: glucose-6- phosphate dehydrogenase, GPx: glutathione peroxidase, GR: glutathione reductase, GRX: glutaredoxin, GSH I: γ-glutamylcysteine synthetase, GSH II: glutathione synthetase, GTP: γ-glutamyltransferase, R-OOH: các peroxide, R-
OH các peroxide bị khử, S–S: liên kết disulfide).
Bảng 1.1 tóm tắt xu hướng phát triển trong công nghệ sản xuất GSH Các nghiên cứu về sản xuất GSH bằng phương pháp enzyme hay lên men rất thịnh hành ở giai đoạn 1976-1985; quá trình sản xuất GSH bằng phương pháp lên men bởi nấm men được thương mại hoá vào đầu những năm 1980 Tới hiện tại, xu hướng nghiên cứu tập trung vào việc tối ưu quá trình lên men cũng như tạo biến chủng siêu tổng hợp GSH ở vi khuẩn.
Bảng 1 1 Xu hướng phát triển trong công nghệ sinh tổng hợp GSH [35]
Xu hướng phát triển của các nghiên cứu về sản xuất Thời kỳ glutathione
Sử dụng nấm men (chủ yếu Saccharomyces cerevisiae và 1976 – 1985
Candida utilis) để sản xuất nấm men bằng phương pháp lên men hoặc enzyme
Tinh sạch glutathione từ các hệ thống sinh học 1976 – 1987
Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sản sinh glutathione để 1978 – 1991 sử dụng trong phương pháp enzyme
Kỹ thuật gen ở E coli và tạo chủng E coli tái tổ hợp để sản 1982 – 1990 xuất GSH
Tạo chủng S cerevisiae tái tổ hợp để sản xuất GSH 1986 – 1990
Tối ưu hoá và kiểm soát quá trình lên men sinh tổng hợp 1991 – hiện tại glutathione
Kỹ thuật trao đổi chất để sinh tổng hợp glutathione ở vi 2001 – hiện tại khuẩn
1.2.3 Tổng hợp glutathione bằng phương pháp enzyme Đây là một trong các phương pháp được tiếp cận để sản xuất GSH Về nguyên tắc, các yếu tố cần thiết để cấu thành một hệ thống tổng hợp GSH bởi enzyme bao gồm: các enzyme GSH I, GSH II, các axit amin tiền chất (L-glutamate, L-cysteine, glycine), ATP, các co-factor cần thiết (Mg 2+ ) để duy trì hoạt tính của GSH I và GSH
II, cùng với đó là mức pH thích hợp (thường là pH 7,5) Bảng 1.2 trình bày tổng quan về phương pháp enzyme sản xuất GSH bằng cách sử dụng tế bào nguyên vẹn hoặc enzyme thô Từ thông tin được thu thập cho thấy, khi sử dụng nấm men S. cerevisiae thì không cần bổ sung thêm ATP, tuy nhiên điều này là ngược lại nếu sử dụng vi khuẩn hoặc enzyme thô Qua đó có thể khẳng định, ở S cerevisiae có một hệ thống tái tạo ATP mạnh mẽ của quá trình đường phân để bù đắp cho sự tiêu thụ trình đông lạnh – rã đông hoặc xử lý bằng các chất hoạt động bề mặt hoặc enzyme) giúp tăng cường sản xuất enzyme một cách hiệu quả khi sử dụng các tế bào nguyên vẹn.
Bảng 1.2 Tổng hợp các nghiên cứu sản xuất GSH bởi vi sinh vật bằng phương pháp enzyme [35]
Nguồn enzyme từ vi Nguồn tái tạo Nguồn bổ sung Hàm lượng sinh vật ATP ATP GSH
C krusei IFO 0011 - Không bổ sung 350
(xử lý bằng sodium - Đường phân 9060 dodecyl sulfate và β- (glucose)
5 (xử lý bằng sodium - Đường phân 8989 dodecyl sulfate, cố (glucose) định enzyme)
(enzyme GSHI, GSHII ATP 325 cố định) từ
S cerevisiae (cố định - ATP 2517 enzyme GSHI, GSHII)
Achromobacter lacticum FERM-P - Không bổ sung 560
Corynebacterium Brevibacterium Đường phân 2456 glutamicum ATCC ammoniagenes (glucose)
21171 (tế bào lạnh ATCC 21170 đông xử lý bằng chất (tế bào lạnh hoạt động bề mặt, đông xử lý xylene) bằng chất hoạt động bề mặt, xylene)
E coli (xử lý bằng chất hoạt động bề mặt, - ATP 2714 xylene)
E coli B ATCC 23226 Acetate kinase Dextran-N-[(6-
(hỗn hợp enzyme Từ E coli B ami- nohexyl)- 46,3
Proteus mirabilis Nấm men khô ATP, glucose 1320
Nhu cầu về ATP trong sản xuất GSH bằng phương pháp enzyme khiến cho quy trình này khó có thể nâng lên quy mô sản xuất pilot và công nghiệp vì việc bổ sung ATP tạo ra chi phí lớn cho quá trình Do đó, cần xây dựng một hệ thống tái tạo
ATP hiệu quả, mô tả một cách ngắn gọn thì đó là một hệ thống trong đó các phản ứng đòi hỏi ATP được kết hợp với các phản ứng tạo ATP Các hệ thống tái tạo ATP có thể được phân loại thành các hệ thống tự kết hợp hoạt động trong một visinh vật và hệ thống đồng kết hợp được xây dựng giữa hai hay nhiều vi sinh vật.
Giải pháp công nghệ làm tăng khả năng sinh tổng hợp glutathione ở vi sinh vật
1.3.1 Cải tiến thành phần môi trường nuôi cấy Điểm chung của các hướng tiếp cận hiện có để đạt được nồng độ GSH cao là thông qua sự gia tăng về hàm lượng sinh khối [35] Một trong những nhân tố quyết định để đạt được điều này chính là thành phần môi trường nuôi cấy Các nhóm nghiên cứu của Liu và cộng sự (1999); Rollini và Manzoni (2006) và
Zhang và cộng sự đã sử dụng các cách tiếp cận thiết kế thử nghiệm (DoE) để khảo sát các thành phần môi trường khác nhau và nồng độ tối ưu của các hợp chất [38],[62],[87] Năm 2004, nhóm nghiên cứu của tác giả Cha và cộng sự đã khảo sát các nguồn cacbon và nitơ khác nhau cũng như các muối khoáng để tìm ra điều kiện sản xuất tối ưu Hơn thế nữa, việc ứng dụng các nguồn cơ chất thay thế có thể đem lại hiệu quả kinh tế hiệu quả trong sản xuất GSH quy mô lớn Ví dụ, Yoshida và cộng sự (2011) đã sử dụng chủng S cerevisiae biến đổi gen
(chủng được biểu hiện enzyme amylase để sử dụng tinh bột) và nhờ đó tránh được sự xuất hiện của hiệu ứng Crabtree [86] Hiệu ứng Crabtree phát sinh nếu như glucose được chuyển hoá dưới điều kiện phản ứng oxy hoá khử, tức là glucose được chuyển hoá một phần qua đường hô hấp và một phần thông qua lên men với ethanol là sản phẩm cuối khi quá trình hô hấp bị hạn chế [67] Quá trình chuyển hoá này làm hạn chế năng suất của các sản phẩm khác từ glucose khi mà ethanol được hình thành Hơn nữa, Taskin và cộng sự (2013) đã nghiên cứu thuỷ phân lông gà – nguồn nitơ, cysteine và muối khoáng giá rẻ [70] Gần đây,
Schmacht và cộng sự 2017 đã phát triển một hỗn hợp môi trường hoá học dựa trên thành phần của nấm men, phù hợp cho việc nuôi cấy với mật độ tế bào cao đồng thời tạo hàm lượng GSH nội bào lớn [64].
Trong hầu hết trường hợp, môi trường nuôi cấy phức tạp để sản xuất GSH liên quan nhiều đến khía cạnh kinh tế, vì phương thức chuẩn bị đơn giản và tất cả nhu cầu dinh dưỡng được đáp ứng chỉ bởi một vài nguyên liệu Tuy nhiên môi trường được xác định về mặt hoá học đem lại khá nhiều lợi ích, chẳng hạn khả năng tái tạo quá trình cao, ít thách thức hơn và có thể nâng quy mô từ phòng thí nghiệm tới vận hành công nghiệp nhanh hơn [87] Đồng thời, môi trường xác định về mặt hoá học cũng được sử dụng trong các nghiên cứu về đường hướng trao đổi chất để khám phá những con đường sản xuất đầy hứa hẹn [64] Đặc biệt, hàm lượng lưu huỳnh trong môi trường được cho là chìa khoá cho sản xuất GSH [39] Hàm lượng GSH đạt được qua chu trình γ-glutamyl [17],[39] Việc tối ưu hoá môi trường đảm bảo khả năng tái tạo cũng như chi phí thấp có tiềm năng to lớn về mặt kinh tế.
1.3.2 Tối ưu các thông số của quá trình lên men
Thông thường, các thông số của quá trình lên men, chẳng hạn nhiệt độ, tốc độ thông khí, pH, tỷ lệ cấp giống là những yếu tố quan trọng có ảnh hưởng đáng kể tới quá trình sản xuất sinh khối cũng như sinh tổng hợp GSH của nấm men.
Tối ưu hoá các thông số của quá trình lên men để lựa chọn một thời điểm mà tại đó thu được sản phẩm với năng suất cao là một bước rất quan trọng để phát triển một quy trình sinh học vận hành hiệu quả với chi phí hợp lý Thông thường, trong quá trình tối ưu, phương pháp tối ưu đơn yếu tố được sử dụng, tuy nhiên thời gian dành cho thực nghiệm tương đối dài Do đó, phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) là một công cụ hiệu quả để xác định ảnh hưởng của nhiều thông số tới hàm mục tiêu bằng đưa ra các ma trận thực nghiệm, phương pháp này hiện đang được sử dụng phổ biến hiện nay [27] Hiện có một số mô hình thiết kế thí nghiệm tích hợp với RSM, trong đó hai mô hình được sử dụng phổ biến nhất hiện nay là Central Composite Design (CCD) và Box-Behnken Design (BBD).
Phương pháp đáp ứng bề mặt được sử dụng rộng rãi trong tối ưu các quá trình hoá học và sinh học, chẳng hạn như sản xuất enzyme, tối ưu thành phần môi trường nuôi cấy, tối ưu điều kiện phản ứng thuỷ phân bởi enzyme , tối ưu các thông số của quá trình tổng hợp polime hoặc quá trình sản xuất các sản phẩm thực phẩm.
1.3.3 Bổ sung axit amin tiền chất và cơ chất phụ trợ năng lượng
Một quá trình sản xuất GSH có đem lại năng suất cao hay không phụ thuộc vào hiệu quả chuyển đổi sinh học của các axit amin tiền chất Do đó nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng các axit amin tiền chất trong nghiên cứu của họ Chiến lược bổ sung một lần L-cysteine, L-glutamate và L-glycine được sử dụng trong phần lớn các nghiên cứu hiện có Thêm vào đó sự kết hợp của các axit amin cảm ứng khác như methionine, L-serine hoặc cysteine ethyl ester được áp dụng [3], [39],[77] Tuy nhiên sự ức chế của cysteine tới sự sinh tổng hợp GSH cũng được công nhận bởi nhóm nghiên cứu của Alfafara và Wang [2],[77] Do đó, sự bổ sung chỉ một lần L-cysteine kết hợp với các kỹ thuật khác, chẳng hạn kiểm soát nồng độ oxy hoà tan để tránh sự oxy hoá; thay đổi nhiệt độ; tạo pH thấp cho sự bài tiết ra ngoài tế bào, hoặc cấp dưỡng cysteine liên tục cũng được sử dụng để tăng khả năng kết hợp [36],[40] Do đó, nồng độ luôn tăng một cách đáng kể khi so sánh với lên men đối chứng không bổ sung tiền chất L-cysteine.
Ngoài L-cysteine, một vài chất khác cũng có tác dụng kích thích tổng hợp
GSH, chẳng hạn như natri citrat, chất này đóng vai trò quan trọng trong sinh lý của visinh vật Nó có thể điều chỉnh sự phân tán của dòng cacbon giữa các con đường hexose monophosphate (HMP) và Embden- Meyerhof-Parnas (EMP) và tăng hàm lượng inosine [13] Ngoài ra, quá trình kiềm hóa có thể được gây ra bởi quá trình thẩm thấu natri citrat, điều này sẽ làm tăng khả năng chịu axit của các vi sinh vật
[85] Hơn nữa, natri citrat có thể đẩy nhanh phản ứng dehydrogenase liên kết NAD
+, một lượng lớn NADH sẽ được hình thành trong quá trình này [29] NADH có thể được kết hợp với chuỗi hô hấp của ty thể và do đó dẫn đến tăng cường sản xuất ATP và tỷ lệ ATP trên ADP (ATP/ADP) lớn hơn trong điều kiện hiếu khí [88].
GSH được tổng hợp thông qua sự tiêu thụ năng lượng ATP, và hàm lượng ATP ngoại bào có thể là tác nhân gây ức chế trở lại quá trình sản xuất GSH [35],[87].
Những nghiên cứu trước đó cho thấy, quá trình sinh tổng hợp GSH được cải thiện rõ rệt khi sử dụng bổ sung các amino axit định hướng ATP GSH tăng rõ rệt nếu ATP nội bào được sử dụng hiệu quả trong quá trình nuôi cấy [87] Tất cả các nghiên cứu kể trên cho thấy việc điều chỉnh lượng bổ sung ATP trong lên men sinh tổng hợp GSH quy mô lớn có thể đem lại tiềm năng to lớn để đạt được nồng độ GSH cao hơn Tuy nhiên, dường như việc này là không quá thiết thực khi bổ sung ATP ngoại bào trong sản xuất GSH bởi giá thành ATP trên thị trường rất cao Do đó, cần tìm ra nguồn cơ chất với giá thành thấp hơn, thay thế vai trò của
ATP nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp GSH Tác giả Wang và cộng sự đã chứng minh natri citrate là nguồn cơ chất trợ lực có hiệu quả như thế [77].
Hiện trạng sản xuất glutathione bằng phương pháp vi sinh
Các hoạt động công nghiệp và đổi mới công nghệ trong lên men sinh tổng hợp GSH được phản ánh phần nào thông qua các sáng chế hiện có Bảng 1.5 minh hoạ cho tình hình sản xuất GSH bằng vi sinh vật hiện nay thông qua phân tích xu hướng, các chiến lược sản xuất Thông qua các nghiên cứu được công bố từ năm 2010 tới năm 2017, có thể thấy rằng phần lớn số lượng các nghiên cứu này đến từ các quốc gia châu Á, đặc biệt là Trung Quốc Đặc biệt, chiến lược tối ưu hoá thành phần môi trường và bổ sung các axit amin tiền chất trong sinh tổng hợp GSH đang được ưu tiên trong các nghiên cứu hiện nay.
Bảng 1 5 Các chiến lược và xu hướng sản xuất GSH bằng lên men vi sinh vật hiện nay
Số hiệu sáng chế Chiến lược Vi sinh vật TLTK
Fed-batch ba cấp độ với glycerol, [27]
CN101824451 sorbitol là nguồn P.pastoris cacbon, không tích tụ ethanol
Biểu hiện gen tổng hợp GSH lên KR20100095829 chủng nấm men S.cerevisiae 54-8m [34]
S.cerevisiae bằng (KACC 93070) cách tạo đột biến bằng tia UV
Nâng cao hiệu suất tổng hợp GSH KR20100095829 bằng lên men fed- S.cerevisiae FF-08 [15] batch ở áp suất bên trong ở 0,78 bar
Tối ưu thành phần Debaryomyces,
Kluyveromyces, năng tích tụ GSH
Sự thêm vào các Saccharomyces, thành phần có lợi Candida, tới môi trường lên Debaryomyces,
JP2011234645 men được sản xuất Rhodotorula, [73] từ các axit amin từ Torulopsis, quá trình chuyển Hansenula, hoá của nấm men Schizosaccharomyces,
(Ví dụ: axit Pichia, phenylpyruvic, Kluyveromyces, phenylalanine) Phaffia Điều kiện nuôi cấy, chiến lược cấp dưỡng, và những EP2501823 kỹ thuật liên quan Nấm men bột [8] được tối ưu hoá để thu được sản phẩm bột nấm men giàu GSH
Chuyển đổi bởi Phaffia rhodozyma
CN101921712 công nghệ di [54] truyền
Nấm men Saccharomyces cerevisiae và sự sinh tổng hợp GSH
Nấm men Saccharomyces cerevisiae (Hình 1.7) là một trong những vi sinh vật được nghiên cứu nhiều nhất và là sinh vật nhân thực được nghiên cứu nhiều trong sinh học phân tử Thực tế các cơ chế phản hồi, tái tổ hợp , phân chia tế bào và trao đổi chất của S cerevisiae khá tương đồng với các sinh vật nhân thực bậc cao, kể cả động vật có vú [90].
Một sinh vật mẫu có nhiều đặc điểm quan trọng, trong số đó có thể kể tới là kích thước, thời gian sinh trưởng, và lợi ích kinh tế S cerevisiae đã và đang được phát triển như một sinh vật mẫu, với các đặc điểm nổi bật như sau: a) S cerevisiae là sinh vật nhân thực đơn bào với đời sống không phức tạp và vòng đời ngắn sinh sản vô tính bằng hình thức nảy×chồi [23] Các tế bào S cerevisiae thường có hình elip với kích thước 1-7 m 5-10 m, thời gian nhân đôi tế bào là 1,25-2 giờ ở 30 o C. b) S cerevisiae có hệ gen nhỏ, bao gồm khoảng 6000 gen, đã được giải trình tự hoàn toàn và lưu trữ trên bản đồ gen. c) Đặc điểm nổi bật của vi sinh vật này đã cho phép phát triển một công cụ sinh học phân tử, đóng góp đáng kể vào sự hiểu biết về các quá trình trong sinh học tế bào như: truyền tín hiệu, kiểm soát chu kỳ tế bào, cơ sở của việc chuyển từ nguyên phân sang giảm phân, tái tổ hợp gen, quá trình vận chuyển protein nội bào, phản ứng lại yếu tố gây stress và sự phân huỷ protein. d) Nhiều bộ gen nấm men được chứng minh có các ortholog tương đồng với bộ gen người, kể cả các gen gây bệnh Nhiều protein của người có chức năng thay thế cho các protein tương tự trong nấm men khi chuyển gen người vào nấm men. e) Nuôi cấy S cerevisiae số lượng lớn có chi phí rẻ với môi trường nuôi cấy đơn giản và dễ dàng tiếp cận nghiên cứu [23].
Hình 1.7 Nấm men Saccharomyces cerevisiae [91]
1.5.2 Ứng dụng công nghệ của nấm men Saccharomyces cerevisiae
Nấm men S cerevisiae đã được sử dụng từ thời cổ đại, đây là loài vi sinh vật được sử dụng lâu đời nhất trong ngành công nghiệp thực phẩm và đồ uống có cồn. Mỗi quá trình truyền thống chuyển đổi cơ chất thành ethanol, CO 2 và sinh khối được khai thác một cách khác nhau Ngày nay, S cerevisiae được sử dụng trong nhiều quy trình, khai thác dựa trên các đặc điểm trao đổi chất, chẳng hạn như sản xuất các sản phẩm lên men, đặc biệt là bioethanol, protein đơn bào, protein enzyme và protein dị hợp chẳng hạn như human insulin; nấm men bất hoạt và các dẫn xuất của nấm men đã được sử dụng làm chất bổ sung dinh dưỡng và nguồn nguyên liệu cho nhiều công thức sản xuất trong ngành công nghiệp thực phẩm [86].
Trong số các công nghệ truyền thống, đồ uống có cồn được sản xuất trên khắp thế giới từ nguồn nguyên liệu sẵn có tại địa phương như trái cây, nhựa cây và mật ong hoặc từ dịch thuỷ phân ngũ cốc và tinh bột của củ quả Các sản phẩm của quá trình lên men là ethanol, các hợp chất cảm quan (hương vị và mùi thơm) và CO 2 Đồ uống có cồn có thể được uống tươi hoặc được ủ để thay đổi hương vị hay chưng cất để tăng nồng độ cồn Mặc dù vi khuẩn có thể tham gia vào một số quá trình, nhưng nấm men vẫn là loài được sử dụng chủ yếu và đa số là các chủng thuộc loài S cerevisiae Trong số các công nghệ hiện đại, mối quan tâm về sản xuất cồn sinh học ngày càng gia tăng do nhu cầu cấp thiết về một nguồn năng lượng tái tạo thay thế cho dầu mỏ [89],[90].
Bên cạnh sản xuất ethanol, con đường trao đổi chất tự nhiên của S. cerevisiae thường tạo ra sinh khối Nấm men cho thấy sản lượng sinh khối lớn nhất trong số các loài sinh vật đơn bào Sản xuất nấm men bánh mì bao gồm việc nhân giống nhiều giai đoạn các chủng S cerevisiae đã được tuyển chọn trên môi trường dinh dưỡng từ đường mía và củ cải đường có bổ sung thêm các nguồn nitơ (muối amoni hoặc urê), phốt pho và các ion khoáng thiết yếu như magiê.
Mục tiêu là thu được sản lượng sinh khối cao được đặc trưng bởi hoạt động lên men cao và đặc tính bảo quản tốt Do đó, để duy trì khả năng lên men của nấm men, chỉ những công đoạn cuối cùng được thực hiện trong điều kiện hiếu khí cao và môi trường rỉ đường được cung cấp dần dần đến các tế bào đang phát triển theo từng đợt để tránh hiệu ứng Crabtree và tối đa hóa sự phát triển của đường hô hấp Tế bào nấm men, có nguồn gốc từ mẫu đông khô hoặc môi trường thạch, ban đầu được chuyển vào các bình nuôi cấy lỏng nhỏ, sau đó đến các bình trung gian lớn hơn trước khi được sử dụng để cấy vào thiết bị lên men sản xuất có dung tích lớn từ 50 – 350 m 3 Quá trình được tiến hành ở 28 – 30°C và pH được điều chỉnh đến 4,0 – 4,5 Dịch cấy thu được (chứa 60 g sinh khối/L) được ly tâm và các tế bào thu hoạch được rửa sạch và làm khô khác nhau theo các dạng thương mại của nấm men yêu cầu: dạng lỏng (có khoảng 18-20% khối lượng khô), nén
(khoảng 30% khối lượng khô) và dạng khô (90% khối lượng khô).
Bên cạnh việc sử dụng làm nguyên liệu làm bánh, S cerevisiae có thể được sử dụng dưới dạng toàn bộ tế bào vì nguồn protein và vi chất của nó có thể cung cấp trong thức ăn chăn nuôi và thực phẩm dinh dưỡng Hơn nữa, cao nấm men được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm để tạo hương vị hoặc trong việc điều chế môi trường nuôi dưỡng vi sinh vật Thành tế bào nấm men, sản phẩm cuối cùng của quá trình sản xuất chiết xuất nấm men, có thể được sử dụng làm chất hấp thụ sinh học để loại bỏ các kim loại nặng từ nước thải công nghiệp Gần đây, sự quan tâm lớn đã được khơi dậy bởi ứng dụng này, hấp thụ sinh học, khai thác vỏ bọc tế bào vi sinh vật để loại bỏ kim loại trong nước [23].
1.5.3 Sinh tổng hợp glutathione ở Saccharomyces cerevisiae
1.5.3.1 Tổng quan về quá trình trao đổi chất glutathione ở nấm men, chu trình γ-glutamyl
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra quá trình chuyển hoá GSH diễn ra trong tế bào thực vật, động vật thông qua chu trình γ-glutamyl [57] Một chu trình γ-glutamyl cerevisiae Bằng kỹ thuật đánh dấu phóng xạ [U- 14 C]GSH and [ 14 C]5-oxoproline ởtế bào nấm men, nhóm nghiên cứu của tác giả Jaspers và cộng sự đã chứng minh được sự tồn tại của một chu trình γ-glutamyl phiên bản ngắn hơn ở loài sinh vật này. ỞS cerevisiae, quá trình dị hoá GSH có thể chỉ được thực hiện thông qua sự hoạt động hai enzyme γ-glutamyltranspeptidase and cysteinylglycine dipeptidase Tuy nhiên, khi kiểm tra cơ sở dữ liệu proteome của các protein ở nấm men S cerevisiae và Schizosaccharomyces pombe cho thấy sự tương đồng khoảng 48,4% và 44% so với 5-oxoprolinase ở tế bào thận chuột Điều này bỏ ngỏ câu hỏi về sự tồn tại của chu trình γ-glutamyl trong tế bào nấm men.
(1) γ-glutamylcysteine synthetase; (2) GSH synthetase; (3) γ- glutamyltranspeptidase; (4) cysteinylglycine dipeptidase; (5) γ- glutamylcyclotransferase; (6) 5-oxoprolinase.
1.5.3.2 Sự tổng hợp glutathione ở nấm men Saccharomyces cerevisiae
GSH được sinh tổng hợp thông qua hai phản ứng tiêu thụ ATP được xúc tác bởi enzyme γ-glutamylcysteine synthetase (γ-GCS, GSH I, EC 6.3.2.2); và enzyme glutathione synthetase (GSH II, GS, EC 6.3.2.3) (Hình 1.9) GCS xúc tác sự hình thành của γ-glutamylcysteine ( γ-GC), sau đó được liên hợp với glycine dưới sự xúc tác của GS để hình thành GSH.
L-Glu + L-Cys + ATP γ-L-glutamyl-l-cysteine (γ-GC) + ADP + PiATP + γ-L-glutamyl-L-cysteine + glycin ADP + phosphate + GSH
Hình 1.9 Quá trình chuyển hoá GSH ở nấm men S cerevisiae [1]
(GCS: γ-glutamyl-cysteine synthase, GS: glutathione synthetase, GR: glutathione reductase, GP: glutathione peroxidase)
Hoạt động của γ-GCS bị ức chế phản hồi bởi GSH để tránh sự tích tụ quá mức GSH trong tế bào Trong tế bào, hoạt tính của enzyme γ-GCS được nâng cao nhờ ion Cd 2+ và sự biểu hiện gen trong con đường tổng hợp GSH được kích thích bởi As, Cd, Hg, Cr Hai yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp
GSH là sự sẵn có của lưu huỳnh và sự ức chế phản hồi enzyme γ-GCS Sự tổng hợp GSH trong tế bào phụ thuộc bởi cơ chế kìm hãm phản hồi, khi mà GSH đóng vai trò như một chất ức chế hoạt động của γ-GCS Trong quá trình stress kim loại, GSH trong tế bào bị oxy hoá và tiêu thụ để tổng hợp phytochelatin, dẫn đến suy giảm hàm lượng GSH do đó giải phóng sự ức chế phản hồi và làm tăng hàm lượng GSH Dựa trên những nghiên cứu về động học, dòng chuyển hoá của con đường sinh tổng hợp glutathione bị kiểm soát phần lớn bởi hoạt tính của enzyme γ-GCS Không giống như γ-GCS, GS không bị ức chế phản hồi bởi GSH và nó cũng không có đơn vị điều hoà liên quan Như vậy, GS dường như được kiểm soát chủ yếu ở cấp độ phiên mã và sự có mặt của cơ chất [69].
1.5.3.3 Sự phân huỷ glutathione ở nấm men Saccharomyces cerevisiae γ-
Glutamyltranspeptidase [γ-GT: GSH + amino acid (H 2 O) → L-γ-glutamyl- amino acid (L-glutamate), EC 2.3.2.2] là enzyme phân huỷ GSH duy nhất được mô tả hiện nay ở nấm men γ-GT xúc tác chuyển gốc γ-glutamyl của GSH và các được xác định là protein glycosyl hoá màng không bào với khối lượng phân tử khoảng 90 000 Da.
L-cysteinyl glycine dipeptidase (CGase: L-cysteinyl glycine+H 2 O→L- cysteine+glycine, EC 3.4.13.6) tham gia xúc tác bước cuối cùng trong quá trình thuỷ phân GSH Hoạt tính này đã được xác nhận có ở nấm men S cerevisiae và liên quan tới màng không bào [45].
1.5.4 Vai trò của glutathione đối với nấm men Saccharomyces cerevisiae
Glutathione là thành phần thiol nonprotein chính có trong nấm men (95%), đóng vai trò phản hồi lại stress dinh dưỡng và stress oxy hoá [34].
Khả năng chống stress dinh dưỡng : Nghiên cứu của Penninckx (2000) khẳng định rằng khi tế bào S cerevisiae thiếu nguồn lưu huỳnh bổ sung từ bên ngoài, GSH sẽ được sử dụng như nguồn lưu huỳnh nội bào [55] Ngoài ra, khi tế bào nấm men S cerevisiae thiếu hụt nguồn nitơ cho sự phát triển, hơn 90% GSH nội bào được di chuyển về trung tâm không bào của nấm men Khi đó enzyme γ-
GT tạo ra trong trường hợp nghèo nitơ được dịch chuyển từ thể Golgi đến màng không bào và cùng với enzyme CGase xúc tác thuỷ phân hoàn toàn GSH dự trữ tại trung tâm không bào và giải phóng các axit amin cấu thành của GSH là L- Glu, L-Cys và Gly vào phần bào tan Từ cơ chế này có thể thấy rõ ràng rằng nấm men khi thiếu thức ăn sẽ sử dụng các axit amin cấu thành từ GSH như nguồn dinh dưỡng nitơ cho nhu cầu phát triển của chúng.
Khả năng chống stress môi trường: Glutathione S-tranferase tham gia vào quá trình chuyển hoá xenobibotic và các ion kim loại nặng trong môi trường nuôi cấy.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
• Nguyên liệu: ° Rỉ đường: mua của Công ty Mía đường Lam Sơn Trước khi bổ sung vào môi trường lên men, rỉ đường mía được xử lý để loại bỏ một số tạp chất Hoà tan rỉ đường với nước theo tỷ lệ 1:1 rồi chuẩn độ pH dung dịch lên 1,5 bằng H 2 SO 4 98% Sau đó, đun sôi dung dịch trong 30 phút để thuỷ phân bã hữu cơ Làm nguội dung dịch và điều chỉnh pH đến
7,5 bằng Ca(OH) 2 Để lắng dung dịch trong 12 giờ, gạn lắng và lọc bỏ kết tủa Hấp khử trùng ở 121 o C trong 15 phút [94]. ° Dịch chiết đậu tương: thu mua tại Hà Nội (Đông Anh).
• Vi sinh vật: Chủng nấm men S cerevisae YM22 được phân lập từ syro mơ mật ong trong bộ sưu tập giống của Bộ môn Thực phẩm và Dinh dưỡng, Viện
Hình 2 1 Hình thái chủng S cerevisiae YM22
(A: Hình thái khuẩn lạc chủng S cerevisiae YM22; B: Hình thái tế bào chủng
• Hóa chất: Các hóa chất phân tích sử dụng của Merck (Đức), Sigma (Mỹ),
BDH (Anh) và A.R (Trung Quốc).
- Môi trường lên men: Cao malt (3 g/L), Cao nấm men (3 g/L), Glucose (25 g/ L), K 2 HPO 4 (1 g/L), KH 2 PO 4 (1 g/L), MgSO 4 (0,8 g/L), (NH 4 ) 2 HPO 4 (3 g/L), Peptone (3 g/L), Sucrose (3 g/L) [26].
- Môi trường nhân giống: Cao nấm men (10 g/L), Glucose (20 g/L), Peptone
- Môi trường nhân giống và môi trường lên men được chuẩn về pH 6,0 Hấp thanh trùng ở 115 o C trong 20 phút.
- Nồi hấp tiệt trùng Sturdy 300 (Đài Loan).
- Thiết bị sấy, tủ ấm lạnh Sanyo (Nhật Bản).
- Cân phân tích điện tử Libro (Nhật Bản).
- Máy đo pH WTW 2A10 – 1012 (Đức).
- Khúc xạ kế Milwauke (Phần Lan).
- Thiết bị đo quang phổ kế UV – VIS Spectrophotometer Halo DB – 20 (Pháp).
- Kính hiển vi Olympus CH 20 (Nhật Bản).
- Thiết bị lên men 50 L (Việt Nam).
- Thiết bị ly tâm Hettich (Đức).
Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp xác định độ ẩm : Lấy 5 g mẫu cho vào một cốc thủy tinh có nắp đậy, sấy ở 105 o C đến khối lượng không đổi (AOAC 927.05).
- Phương pháp xác định nồng độ chất khô hòa tan: Bằng khúc xạ kế Milwauke.
- Phương pháp đo pH: 30ml mẫu được lấy ra cho vào cốc đong Giá trị pH được xác định trực tiếp bằng máy đo pH meter.
- Phương pháp thu hồi GSH từ sinh khối nấm men: sử dụng phương pháp trích ly bằng dung dịch cồn ethanol được mô tả bởi tác giả Xiong và cộng sự
[85] o Sinh khối nấm men được thu hồi bằng phương pháp ly tâm. o Rửa sinh khối với nước cất. o Trích ly GSH ở điều kiện 25 o C, nồng độ cồn ethanol sử dụng 25%, tỷ lệ sinh khối nấm men/dung môi cồn là 100g/L, trích ly trong 2 giờ.
- Xác định hàm lượng glutathione trong sinh khối nấm men bằng phương pháp alloxan:
Thu nhận sinh khối nấm men bằng ly tâm ở 6.000 vòng/phút, trong 10 phút, rửa sinh khối nấm men bằng nước RO, ly tâm loại nước (rửa nước 2 lần).
Ly tâm ở 6.000 vòng/phút, trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi.
Trích ly GSH trong sinh khối bằng dung dịch cồn ethanol 25%.
Chuẩn bị hoá chất phân tích:
Chuẩn bị glycine 0,1M và dung dịch đệm 0,24M Na 2 HPO 4 và 0,24M
KH 2 PO 4 (pH=7,6) được pha trong nước (đề ion) tỷ lệ: (88:12)
Pha loóng nồng độ GSH (200 àM) thành cỏc nồng độ khỏc nhau: 0; 40;
80; 120; 160; 200 àM, hũa tan với nước cất để dựng đường chuẩn GSH.
Alloxan: 1 mg alloxan monohydrate/ml HCl loãng (1 giọt HCl đặc + 100 ml nước cất) Sử dụng trong 5 phút.
Mỗi một ống nghiệm chứa 1ml dung dịch chuẩn được thêm vào 3,5 ml
0,24M Na 2 HPO 4 - KH 2 PO 4 (pH=7,6) và 0,5 ml glycine 0,1M.
Phản ứng được bắt đầu khi bổ sung 1ml dung dịch alloxan và thời gian phản ứng là 20 phút.
Cuvet trống (đối chứng) không có GSH được sử dụng để chuẩn về 0,
Các giá trị đo DO 305nm của các nồng độ GSH khác nhau được sử dụng để dựng đường chuẩn.
Mỗi một ống nghiệm chứa 1 ml dung dịch mẫu được thêm vào 3,5 ml 0,24
M Na 2 HPO 4 - KH 2 PO 4 (pH=7,6) và 0,5 ml Glycine 0,1 M.
Phản ứng được bắt đầu khi bổ sung 1ml dung dịch alloxan và thời gian phản ứng là 20 phút.
Cuvet trống (đối chứng) không có GSH được sử dụng để chuẩn về 0,
Đo bước sóng của mẫu ở DO 305nm để xác định hàm lượng GSH trong mẫu theo đường chuẩn đã dựng.
- Công thức xác định hàm lượng glutathione trong dịch lên men:
Hàm lượng GSH trong dịch lên men (mg/L) = A x
B Trong đó: A là hàm lượng sinh khối (g/L);
B là hàm lượng glutathione có trong sinh khối (mg/g).
- Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu được xử lí bằng phần mềm Excel Sự khác biệt giữa các công thức được so sánh theo phân tích phương saiANOVA một chiều theo chuẩn Tukey trên phần mềm SPSS.
2.2.2 Phương pháp thiết kế thí nghiệm
• Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn cacbon/ nitơ khác nhau
• Khảo sát hàm lượng nguồn cacbon/nitơ thay thế
- Tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy
(pH, nhiệt độ, thời gian lên men, tỷ lệ cấp giống)
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy
• Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn muối vi lượng khác nhau
• Khảo sát hàm lượng nguồn muối vi lượng thay thế
• Xác định thời gian bổ sung cysteine/natri citrate
• Khảo sát hàm lượng L- cysteine/natri citrate bổ sung
- Ảnh hưởng của nhiệt độ
- Ảnh hưởng của nồng độ cồn
- Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và cơ chất
- Ảnh hưởng của thời gian trích ly
2.2.2.1 Khảo sát và lựa chọn nguồn nguyên liệu thay thế để tạo môi trường cải tiến trong sinh tổng hợp GSH của nấm men a Ảnh hưởng của nguồn cacbon
- Xác định nguồn nguyên liệu cacbon cho quá trình lên men phát triển sinh khối và sinh tổng hợp GSH: môi trường lên men (thành phần cơ bản tại mục 2.1.2), thay glucose bằng các nguồn cacbon khác: dịch chiết malt, siro ngô, glycerol và rỉ đường.
- Nhiệt độ lên men 30 o C, pH 6, tốc độ lắc 120 rpm thời gian lên men 65 h
- Xác định hàm lượng sinh khối khô, hàm lượng GSH trong sinh khối khô và nồng độ GSH trong dịch lên men. b Ảnh hưởng của nguồn nitơ
- Sử dụng nguyên liệu cao malt, pepton, cao nấm men, cao chiết đậu tương làm nguồn nitơ khác nhau, thành phần cơ bản như mục 2.1.2.
- Nhiệt độ lên men 30 o C, pH 6, tốc độ lắc 120 rpm, thời gian lên men 65h
- Xác định hàm lượng sinh khối khô, hàm lượng GSH trong sinh khối khô và nồng độ GSH trong dịch lên men. c Ảnh hưởng của nguyên tố vi lượng
- Sử dụng các muối khoáng vi lượng FeSO 4 , ZnSO 4 , MnSO 4 bổ sung vào môi trường lên men (mục 2.1.2).
- Nhiệt độ lên men 30 o C, pH 6, tốc độ lắc 120 rpm, thời gian lên men 65h
- Xác định hàm lượng sinh khối khô, hàm lượng GSH trong sinh khối khô và nồng độ GSH trong dịch lên men. d Ảnh hưởng của axit amin tiền chất
- Xác định loại axit amin đặc hiệu: các axit amin được sử dụng là L-cystein, L-methionine, L-serine, L-glycine và axit glutamic với tỷ lệ 1,0 g/L vào thời điểm 24 h sau khi lên men [39].
- Nhiệt độ lên men 30 o C, pH 6, tốc độ lắc 120 rpm, thời gian lên men 65h.
- Xác định hàm lượng sinh khối khô, hàm lượng GSH trong sinh khối khô và nồng độ GSH trong dịch lên men.
2.2.2.2 Tối ưu hoá điều kiện lên men sinh tổng hợp glutathione a Tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy, tỷ lệ nhân giống)
Lựa chọn nhân tố độc lập ảnh hưởng đến hàm mục tiêu Y (năng suất GSH mg/L dịch lên men) Để thiết kế thí nghiệm tối ưu bằng mô hình Box-Behnken, trước tiên tìm thí nghiệm ở tâm của 4 yếu tố cần kháo sát Trong nghiên cứu trước đó, nhóm nghiên cứu đã khảo sát từng yếu tố riêng lẻ bằng phương pháp cổ điển để tìm điểm tại tâm của mô hình BBD, thu được giới hạn khảo sát như trình bày bảng 2.1.
Bảng 2 1 Ma trận bố trí thí nghiệm mã hoá các biến
Kí Các mức của biến số Khoảng biến
Biến số hiệu Mức dưới Mức cơ sở Mức trên thiên
Mô hình thống kê biểu diễn sự phụ thuộc của hàm lượng GSH (mg/L) vào các nhân tố được mã hoá là một phương trình đa thức bậc hai có dạng:
Y: hàm lượng GSH (mg/L) dự đoán; : hệ số hồi quy bậc 0; x i nhân tố độc lập thứ i ảnh hưởng đến hàm mục tiêu Y; β : o hệ số hồi quy bậc 1 mô tả ảnh hưởng của nhân tố x i tới hàm mục tiêu Y;
: hệ β s i ố hồi quy tương tác mô tả ảnh hưởng i : hệ số hồi quy tương tác mô tả ảnh hưởng đồng thời của của yếu tố x tới Y; β ij βii x i và x j với Y.
Tính toán lập phương trình hồi quy, chọn điểm tối ưu của các yếu tố cho hàm lượng GSH (mg/L) đạt cực đại bằng chương trình Design-Expert 13, từ đó áp dụng vào thực nghiệm. Đánh giá mô hình thực nghiệm
Lên men thử nghiệm mô hình tối ưu và so sánh với kết quả dự đoán của mô hình b Lựa chọn chế độ thông khí phù hợp cho quá trình sinh tổng hợp Glutathione
- Khảo sát tốc độ lắc ở các giá trị 100; 120; 150; 200 và 250 vòng/phút.
- Khảo sát chế độ thông khí ở thiết bị lên men với các giá trị 0; 0,1; 0,2; 0,3;
- Xác định hàm lượng sinh khối khô, hàm lượng GSH trong sinh khối khô và nồng độ GSH trong dịch lên men.
2.2.2.3 Khảo sát thời gian và nồng độ bổ sung axit amin tiền chất và cơ chất phụ trợ năng lượng a Khảo sát ảnh hưởng của thời điểm và nồng độ bổ sung L-cysteine
- Xác định thời điểm bổ sung axit amin: bổ sung L-cystein 1,0 g/L tại các thời điểm 0; 12; 24; 32; 36 giờ.
- Sau khi đã lựa chọn được thời điểm bổ sung thích hợp, tiến hành khảo sát nồng độ L-cysteine thêm vào ở các giá trị 0; 0,5; 1; 1,5 và 2 g/L.
- Tiến hành lên men ở điều kiện tối ưu.
- Xác định hàm lượng sinh khối khô, hàm lượng GSH trong sinh khối khô và nồng độ GSH trong dịch lên men. b Khảo sát và lựa chọn thời điểm và nồng độ bổ sung natri citrate
- Xác định thời điểm bổ sung axit amin: bổ sung natri citrate 2g/L tại các thời điểm 0; 10; 15; 20; 25 giờ.
- Sau khi đã lựa chọn được thời điểm bổ sung thích hợp, tiến hành khảo sát nồng độ natri citrate thêm vào ở các giá trị 0, 1, 2, 3, 4 g/L.
- Tiến hành lên men ở điều kiện tối ưu.
- Xác định hàm lượng sinh khối khô, hàm lượng GSH trong sinh khối khô và nồng độ GSH trong dịch lên men. c Động học sinh trưởng của chủng nấm men S.cerevisiae YM22
- Tiến hành trên thiết bị lên men dung tích 50L chứa 30L môi trường lên men.
- Lên men trên môi trường lên men cải tiến, bổ sung L-cysteine và natri citrate với nồng độ và thời điểm thích hợp theo khảo sát.
- Tiến hành lên men ở điều kiện tối ưu.
- Lấy mẫu phân tích sau mỗi 4 giờ để phân tích giá trị OD 600nm và hàm lượng GSH có trong dịch lên men.
2.2.2.4 Khảo sát điều kiện thu hồi glutathione từ sinh khối nấm men bằng phương pháp trích ly cồn ethanol a Ảnh hưởng của nồng độ cồn
- Sử dụng cồn ethanol ở các nồng độ 25, 30, 35 và 40% v/v; tỷ lệ sinh khối nấm men/dung môi cồn ethanol: 100 g/L, thời gian 2 h, nhiệt độ 25 o C.
- Ly tâm 6.000 vòng/phút trong 10 phút, thu nhận dịch chiết và phân tích hàm lượng GSH có trong dịch trích ly để lựa chọn được nồng độ EtOH thích hợp. b Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và cơ chất
- Thay đổi tỷ lệ sinh khối nấm men/dung môi cồn ethanol là 100g/L; 200g/
L và 300g/L, 400g/L thực hiện trong thời gian 2 h, nhiệt độ xác định ở mục trước.
- Ly tâm 6.000 vòng/phút trong 10 phút, thu nhận và phân tích hàm lượng
GSH có trong dịch trích ly để lựa chọn được tỷ lệ nấm men/dung môi. c Ảnh hưởng của nhiệt độ
- Thay đổi nhiệt độ trích ly ở 20; 25; 30 và 35 o C, nồng độ ethanol, tỷ lệ sinh khối nấm men /dung môi đã được xác định ở phần trước, thời gian trích ly