Nghiên cứu một số giải pháp công nghệ làm khả năng sinh tổng hợp gsh của nấm men saccharomyces cerevisiae

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ Nghiên cứu số giải pháp công nghệ làm tăng khả sinh tổng hợp GSH nấm men Saccharomyces cerevisiae TRẦN THỊ HOA Hoa.TT202926M@sis.hust.edu.vn Ngành Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Trần Liên Hà TS Trương Hương Lan Viện: Chữ ký GVHD Chữ ký GVHD Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm HÀ NỘI, 10/2022 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP HVTH: Trần Thị Hoa GVHD: PGS.TS Trần Liên Hà, TS Trương Hương Lan LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS Trần Liên Hà, TS Trương Hương Lan ĐỀ TÀI LUẬN VĂN Đề tài: Nghiên cứu số giải pháp công nghệ làm tăng khả sinh tổng hợp GSH nấm men Saccharomyces cerevisiae Khoá: 2020B Tác giả luận văn: Trần Thị Hoa Ngành: Công nghệ Sinh học Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Trần Liên Hà TS Trương Hương Lan Cán hướng dẫn HVTH: Trần Thị Hoa Ngày tháng năm 2022 Cán hướng dẫn LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS Trần Liên Hà, TS Trương Hương Lan LỜI CẢM ƠN Để luận văn đạt kết tốt đẹp, nhận hỗ trợ, giúp đỡ nhiều quan, tổ chức, cá nhân Với tình cảm sâu sắc chân thành nhất, cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến tất cá nhân quan tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Trước hết xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo trường Đại học Bách khoa Hà Nội nói chung, thầy viện Cơng nghệ Sinh học Cơng nghệ Thực phẩm nói riêng dạy dỗ cho kiến thức môn đại cương môn chuyên ngành, giúp tơi có sở lý thuyết vững vàng tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình học tập Với quan tâm, dạy dỗ, bảo tận tình chu đáo thầy cơ, đến tơi hồn thành luận văn thạc sĩ khoa học, đề tài: “Nghiên cứu số giải pháp công nghệ làm tăng khả sinh tổng hợp GSH nấm men Saccharomyces cerevisiae” Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Liên Hà TS Trương Hương Lan – người dìu dắt, giúp đỡ đồng hành với suốt khoảng thời gian học tập nghiên cứu đề tài Và thiếu hướng dẫn tận tâm cô chú, anh chị môn Thực phẩm Dinh dưỡng, Viện công nghiệp thực phẩm nơi thực luận văn Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình ln u thương, hỗ trợ tơi mặt để tơi n tâm rèn luyện, học tập trường Đại học Bách khoa Hà Nội Với kinh nghiệm cịn hạn chế, luận văn khơng thể tránh thiếu sót Tơi mong nhận bảo, đóng góp ý kiến thầy giáo để tơi có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức mình, phục vụ tốt cơng tác thực tế sau Hà Nội, ngày HVTH: Trần Thị Hoa tháng năm 2022 Học viên LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS Trần Liên Hà, TS Trương Hương Lan TĨM TẮT NỘI DUNG LUẬN VĂN Mục đích luận văn nghiên cứu nhằm khảo sát, lựa chọn nguyên liệu cho môi trường cải tiến làm tăng khả sinh tổng hợp GSH chủng nấm men S cerevisiae YM22, tiếp tiến hành tối ưu hố thông số nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy, tỷ lệ cấp giống khảo sát sơ trước việc thiết kế thí nghiệm theo phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) kết hợp với mơ hình BoxBehnken (BBD) Tiến hành khảo sát thời gian nồng độ bổ sung axit amin tiền chất chất phụ trợ lượng Sau khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly GSH từ sinh khối nấm men cồn ethanol Nghiên cứu chọn môi trường cải tiến làm tăng khả sinh tổng hợp GSH chủng S cerevisiae YM22 bao gồm thành phần: Rỉ đường, glucose, sucrose; cao đậu tương, cao nấm men, cao malt, ZnSO4, (NH4)2HPO4, MgSO4, K2HPO4, KH2PO4 Đồng thời tìm điểm tối ưu thông số nhiệt độ, pH, thời gian ni cấy, tỷ lệ cấp giống mà hàm lượng GSH cao gấp 3,6 lần so với ban đầu Tiếp đó, xác định thời điểm nồng độ bổ sung thích hợp L-cysteine natri citrate Nghiên cứu khảo sát sơ yếu tố ảnh hưởng đến q trình trích ly GSH từ sinh khối nấm men sử dụng cồn ethanol, bao gồm: ảnh hưởng nồng độ ethanol, nồng độ chất/ethanol, nhiệt độ trích ly thời gian trích ly đưa nhận xét ảnh hưởng yếu tố tới trình thu nhận GSH từ sinh khối nấm men Luận văn làm tài liệu tham khảo cho sinh viên trường đại học, độc giả muốn nghiên cứu khảo sát tối ưu hố thơng số trình lên men Trong khuân khổ luận văn chắn chưa thể giải triệt để mục tiêu đề tài, mong nhận giúp đỡ đóng góp ý kiến q thầy hội đồng để đề tài hoàn chỉnh Học viên HVTH: Trần Thị Hoa LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS Trần Liên Hà, TS Trương Hương Lan MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ 11 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 12 LỜI MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Glutathione 1.1.1 Cấu trúc glutathione 1.1.2 Chức glutathione 1.2 Công nghệ sản xuất glutathione 1.2.1 Lịch sử cấu trúc phân tử glutathione 1.2.2 Tổng hợp glutathione phương pháp hoá học .4 1.2.3 Tổng hợp glutathione phương pháp enzyme .8 1.2.4 Tổng hợp glutathione phương pháp lên men vi sinh vật 11 1.3 Giải pháp công nghệ làm tăng khả sinh tổng hợp glutathione vi sinh vật 14 1.3.1 Cải tiến thành phần môi trường nuôi cấy 14 1.3.2 Tối ưu thông số trình lên men 15 1.3.3 Bổ sung axit amin tiền chất chất phụ trợ lượng .15 1.4 Hiện trạng sản xuất glutathione phương pháp vi sinh 16 1.5 Nấm men Saccharomyces cerevisiae sinh tổng hợp GSH .18 1.5.1 Nấm men Saccharomyces cerevisiae 18 1.5.2 Ứng dụng công nghệ nấm men Saccharomyces cerevisiae .19 1.5.3 Sinh tổng hợp glutathione Saccharomyces cerevisiae 20 1.5.4 Vai trò glutathione nấm men Saccharomyces cerevisiae 23 1.6 Thu nhận glutathione từ sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae 24 1.7 Ứng dụng glutathione 26 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 28 2.1.1 Vật liệu 28 2.1.2 Môi trường nuôi cấy 29 HVTH: Trần Thị Hoa LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS Trần Liên Hà, TS Trương Hương Lan 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 29 2.2 Phương pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Phương pháp phân tích 29 2.2.2 Phương pháp thiết kế thí nghiệm 32 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 Khảo sát lựa chọn nguyên liệu thay để tạo môi trường cải tiến sinh tổng hợp GSH nấm men 37 3.1.1 Nguồn dinh dưỡng cacbon 37 3.1.2 Nguồn dinh dưỡng nitơ 39 3.1.3 Nguyên tố vi lượng 42 3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng axit amin tới trình sinh tổng hợp GSH nấm men S cerevisiae YM22 43 3.2 Nghiên cứu lựa chọn tối ưu hoá điều kiện lên men sinh tổng hợp glutathione 45 3.2.1 Tối ưu hoá điều kiện nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy tỷ lệ nhân giống 45 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng chế độ thơng khí tới q trình sinh tổng hợp GSH nấm men S cerevisiae YM22 50 3.2.3 Dựng đường cong sinh trưởng nấm men S cerevisiae YM22 51 3.3 Khảo sát thời gian nồng độ bổ sung axit amin tiền chất chất phụ trợ lượng 53 3.3.1 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung L-cysteine đến trình lên men sinh tổng hợp GSH 53 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ L-cysteine đến trình lên men sinh tổng hợp GSH 54 3.3.3 Nghiên cứu lựa chọn thời điểm nồng độ bổ sung natri citrate .55 3.3.4 Động học sinh trưởng chủng nấm men S cerevisiae YM22 57 3.4 Khảo sát điều kiện thu hồi glutathione từ sinh khối nấm men phương pháp trích ly cồn ethanol 58 3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ cồn ethanol đến hiệu suất trích ly GSH .59 3.3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ sinh khối khơ/dung mơi ethanol đến hiệu suất trích ly GSH 60 3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ trích ly đến hiệu suất trích ly GSH 61 HVTH: Trần Thị Hoa LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS Trần Liên Hà, TS Trương Hương Lan 3.3.4 Ảnh hưởng thời gian trích ly đến hiệu suất trích ly GSH 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC 73 HVTH: Trần Thị Hoa LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS Trần Liên Hà, TS Trương Hương Lan DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1 Xu hướng phát triển công nghệ sản xuất GSH Bảng 1.2 Tổng hợp nghiên cứu sản xuất GSH vi sinh vật phương pháp enzyme .9 Bảng 1.3 Các hướng nghiên cứu khác việc tăng cường sinh khối nồng độ glutathione sản xuất GSH vi sinh vật 11 Bảng 1.4 Thống kê nghiên cứu sinh tổng hợp GSH vi sinh vật tái tổ hợp 13 Bảng Các chiến lược xu hướng sản xuất GSH lên men vi sinh vật 17 Bảng So sánh trình thu hồi GSH từ sinh khối nấm men phương pháp trích ly cồn ethanol sử dụng nước nóng 25 Bảng 1.7 Các ứng dụng chế tác dụng glutathione sản phẩm liên quan 27 Bảng Ma trận bố trí thí nghiệm mã hoá biến 34 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon thay tới phát triển khả lên men GSH S cerevisiae YM22 38 Bảng 3.2 Ảnh hưởng tỉ lệ rỉ đường thay glucose tới khả phát triển sinh tổng hợp GSH chủng S cerevisiae YM22 39 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nguồn nitơ khác tới phát triển khả lên men GSH S cerevisiae YM22 40 Bảng 3.4 Ảnh hưởng tỉ lệ cao chiết đậu tương tới khả phát triển sinh tổng hợp GSH chủng S cerevisiae YM22 41 Bảng 3.5 Ảnh hưởng số loại muối khoáng vi lượng (FeSO4, ZnSO4, MnSO4) tới sinh tổng hợp GSH 42 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nồng độ muối ZnSO4 đến khả sinh tổng hợp GSH S cerevisiae YM22 43 Bảng 3.7 Ảnh hưởng việc bổ sung loại axit amin khác đến khả sinh tổng hợp glutathione chủng S cerevisiae YM22 44 Bảng Các mức thí nghiệm biến số 45 Bảng Ma trận thực nghiệm kết thực nghiệm theo ma trận .45 Bảng 10 Bảng kết phân tích hồi quy tuyến tính 46 Bảng 3.11 Ảnh hưởng tốc độ lắc tới trình sinh tổng hợp GSH nấm men S cerevisiae YM22 50 HVTH: Trần Thị Hoa LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS Trần Liên Hà, TS Trương Hương Lan Bảng 3.12 Ảnh hưởng tốc độ sục khí tới q trình sinh tổng hợp GSH nấm men S cerevisiae YM22 51 Bảng 3.13 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung chất L-cysteine đến trình lên men sinh tổng hợp GSH chủng S cerevisiae YM22 53 Bảng 3.14 Ảnh hưởng tỷ lệ chất L-cysteine đến trình lên men sinh tổng hợp GSH chủng S cerevisiae YM22 54 Bảng 3.15 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung natri citrate khác tới sinh tổng hợp GSH chủng S cerevisiae YM22 56 Bảng 3.16 Ảnh hưởng hàm lượng natri citrate đến trình lên men sinh tổng hợp GSH chủng S cerevisiae YM22 56 HVTH: Trần Thị Hoa