Hợp chất thứ cấp flavonoid đã được chứng minh có chứa nhiều hoạt tính sinh học quý như chống oxy hóa kháng viêm chống khối u lão hóa v v do đó được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu y sinh dược và thực tiễn Hiện nay người ta có nhiều phương pháp điều chế tổng hợp để thu nhận flavonoid như tách chiết từ thực vật tổng hợp hóa học và vi sinh vật học Tuy nhiên phương pháp vi sinh vật học ngày càng được quan tâm vì đơn giản cho sản lượng cao dễ tiến hành và thân thiện với môi trường Trong đó các nhà nghiên cứu thường sử dụng chủng vi sinh vật thuần khiết dạng tự nhiên hoặc tái tổ hợp di truyền và tiến hành nuôi cấy Trong bài báo này chúng tôi trình bày kết quả sinh tổng hợp naringenin 7 O glucoside bằng hệ thống đồng nuôi cấy hai chủng vi khuẩn Escherichia coli cải biến di truyền EC1 và EC2 Kết quả nghiên cứu cho thấy naringenin 7 O glucoside đã được tổng hợp thành công từ cơ chất axit p coumaric với hàm lượng cao nhất đạt 4 82 µM sau 48 giờ nuôi cấy với tỷ lệ phối trộn hai chủng là EC1 EC2 1 8 v v dựa trên mật độ quang mỗi chủng ban đầu OD600nm 2 2 2 4 nhiệt độ 32oC Do đó nghiên cứu này chứng minh đồng nuôi cấy có tiềm năng ứng dụng trong sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp khác ở vi sinh vật
ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐÀ NẴNG VÕ TRẦN KHÁNH HUYỀN NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP NARINGENIN GLUCOSIDE BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY HỖN HỢP HAI CHỦNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI CẢI BIẾN DI TRUYỀN LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT ĐÀ NẴNG - NĂM 2017 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐÀ NẴNG VÕ TRẦN KHÁNH HUYỀN NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP NARINGENIN GLUCOSIDE BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY HỖN HỢP HAI CHỦNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI CẢI BIẾN DI TRUYỀN Chuyên Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã Ngành : 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Người hướng dẫn khoa học 1: TS NGUYỄN HUY THUẦN Người hướng dẫn khoa học 2: TS ĐẶNG ĐỨC LONG ĐÀ NẴNG - NĂM 2017 LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận văn cao học này, việc tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Thầy TS Nguyễn Huy Thuần (Hướng dẫn khoa học 1), người tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, hỗ trợ nhiều để thực đề tài nghiên cứu thành công dành nhiều thời gian để đọc, sửa chữa luận văn cho Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy TS Đặng Đức Long (Hướng dẫn khoa học 2) Cô Trưởng môn Công nghệ sinh học – GVC TS Lê Lý Thùy Trâm quan tâm, bảo tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy, cô kỹ thuật viên Trung tâm sinh học Phân tử - Viện Nghiên cứu Phát triển công nghệ cao, Đại Học Duy Tân bao gồm thầy TS Nguyễn Minh Hùng, TS Nguyễn Thành Trung, TS Nguyễn Thị Hà, TS Lê Thành Đô, TS Hồ Viết Hiếu cử nhân Đặng Thị Kim Mai cho phép sử dụng trang thiết bị hướng dẫn kỹ thuật để tiến hành tốt thí nghiệm Và nơi môi trường giúp trưởng thành nhiều cơng tác nghiên cứu Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời tri ân đến cán bộ, giảng viên trường Đại học Bách Khoa số trường khác giảng dạy kiến thức tảng đầy thú vị bổ ích suốt trình học tập Xin cảm ơn anh, chị khóa K32.CSH – Đại học Bách Khoa Đà Nẵng sinh viên K19 khoa Dược – Đại học Duy Tân gồm em Nguyễn Hồng Phong, học viên cao học Phạm Thị Uyên động viên, hỗ trợ nhiều thực hành thí nghiệm Chúng tơi chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Đại học Đà Nẵng; Ban Giám hiệu, Phòng đào tạo Sau đại học Trường đại học Bách Khoa Đà Nẵng; Ban Chủ nhiệm khoa Hóa – môn Công nghệ Sinh học Ban lãnh đạo trường Đại học Duy Tân quan tâm tạo điều kiện tốt học tập hoàn thành luận văn Nhân dịp này, vô biết ơn người thân gia đình, đặc biệt bố mẹ, ln tảng động lực phía sau, tạo điều kiện giúp vững tin hồn thành tốt khóa học thực nghiên cứu thành công đề tài luận văn cao học Đà Nẵng, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn Võ Trần Khánh Huyền LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan, nghiêm túc chưa công bố công trình Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Nếu có sai sót, tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm Đà Nẵng, ngày… tháng… năm… Tác giả luận văn Võ Trần Khánh Huyền SINH TỔNG HỢP NARINGENIN GLUCOSIDE BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY HỖN HỢP HAI CHỦNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI CẢI BIẾN DI TRUYỀN Võ Trần Khánh Huyền1, Đặng Đức Long2, Nguyễn Huy Thuần3, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Hóa học, Đại học Bách Khoa Đà Nẵng Viện VN-UK – Đại học Đà Nẵng Viện Nghiên cứu Phát triển, Đại học Duy Tân Tóm tắt Hợp chất thứ cấp flavonoid chứng minh có chứa nhiều hoạt tính sinh học quý chống oxy hóa, kháng viêm, chống khối u, lão hóa, v.v, đó, ứng dụng rộng rãi nghiên cứu y sinh dược thực tiễn Hiện nay, người ta có nhiều phương pháp điều chế, tổng hợp để thu nhận flavonoid tách chiết từ thực vật, tổng hợp hóa học vi sinh vật học Tuy nhiên, phương pháp vi sinh vật học ngày quan tâm đơn giản, cho sản lượng cao, dễ tiến hành thân thiện với mơi trường Trong đó, nhà nghiên cứu thường sử dụng chủng vi sinh vật khiết (dạng tự nhiên tái tổ hợp di truyền) tiến hành nuôi cấy Trong báo này, trình bày kết sinh tổng hợp naringenin-7-O-glucoside hệ thống đồng nuôi cấy hai chủng vi khuẩn Escherichia coli cải biến di truyền (EC1 EC2) Kết nghiên cứu cho thấy naringenin 7-O-glucoside tổng hợp thành công từ chất axit p-coumaric với hàm lượng cao đạt 4,82 µM sau 48 ni cấy với tỷ lệ phối trộn hai chủng EC1:EC2 = 1:8 (v:v) dựa mật độ quang chủng ban đầu OD600nm= 2,2-2,4, nhiệt độ 32oC Do đó, nghiên cứu chứng minh đồng ni cấy có tiềm ứng dụng sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp khác vi sinh vật Từ khóa: Đồng ni cấy, E coli, cải biến di truyền, naringenin glucoside, sinh tổng hợp BIOSYNTHESIS OF NARINGENIN GLUCOSIDE USING CO-CULTURE OF METABOLICALLY ENGINEERED ESCHERICHIA COLI Vo Tran Khanh Huyen1, Dang Duc Long2, Nguyen Huy Thuan3* Department of Biotechnology, Faculty of Chemistry, University of Science and Technology - The University of Da Nang VN-UK - The University of Da Nang Center for Molecular Biology, Duy Tan University ABSTRACT Flavonoids, type of secondary metabolites, have been demonstrated to contain numerous valuable bioactivities such as antioxidant, anti-inflammatory, anti-tumor, anti-aging, etc Thereby those compounds are widely used in pharmaceutical and biomedical researches and practical applications There are various methods of synthesis and production of the desired flavonoid compounds including the extraction techniques from plants, chemical and microbiological synthesis Among them, microbiological methods have gained much interest due to its simplicity, simple implement, high yield and environment frendly Traditionally, microorganism strains (type of natural or recombinant) are usually used in pure culture for biosynthesis of target compound In the present paper, we described the biosynthetic method of naringenin -7-O-glucoside using co-culure system with two metabolically engineered Escherichia coli strains (EC1 and EC2 strain) The results of study showed successfull biosynthesis of naringenin -7-O-glucoside from p-coumaric acid as substrate and the highest concentration of 4.82 µM after 48 hours culture with the mixing ratio of EC1:EC2 = 1:8 (v:v) based on starting optical density of each strains OD600nm = 2.2-2.4 and temperature of 32 oC Therefore, the present research showed that co-culture has a great potential for application in the biosynthesis of other secondary metabolites using microoraganisms Keywords Co-culture, Escherichia coli, metabolic engineering, naringenin glucoside, biosynthesi MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ĐỐI TƯỢNG – PHẠM VI NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI BỐ CỤC NỘI DUNG LUẬN VĂN CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT FLAVONOID 1.2 ĐẶC TÍNH SINH DƯỢC HỌC CỦA NARINGENIN GLYCOSIDE 1.2.1 Giới thiệu sơ hợp chất glycoside 1.2.2 Hợp chất naringenin glycoside số tác dụng 10 1.3 CON ĐƯỜNG SINH TỔNG HỢP NARINGENIN VÀ NARINGENIN GLUCOSIDE 12 1.3.1 Con đường sinh tổng hợp naringenin (NRN) 12 1.3.2 Quá trình tổng hợp glycoside thực vật vi khuẩn 14 1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP HIỆN ĐẠI SINH TỔNG HỢP CHẤT THỨ CẤP 18 1.4.1 Sinh tổng hợp theo phương pháp nuôi cấy đơn (mono-culture) 18 1.4.2 Sinh tổng hợp theo phương pháp nuôi cấy hỗn hợp 21 CHƯƠNG 2- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 25 2.1.1 Hệ thống chủng vi khuẩn mang vector plasmid tái tổ hợp 25 2.1.2 Môi trường nuôi cấy 26 2.1.3 Hóa chất phương tiện nghiên cứu 29 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 30 2.2.1 Nội dung thứ 30 2.2.2 Nội dung thứ hai 30 2.2.3 Nội dung thứ ba 30 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.3.1 Phương pháp sinh học phân tử 33 2.3.2 Các phương pháp tổng hợp naringenin naringenin glucoside điều kiện invivo 33 a Phương pháp nuôi cấy hỗn hợp (co-culture) 34 b Phương pháp nuôi cấy đơn (mono-culture) 35 2.3.3 Các phương pháp phổ ứng dụng phân tích sản phẩm chuyển hóa 36 a Kỹ thuật tách chiết sản phẩm 36 b Định tính định lượng sản phẩm 37 2.3.4 Xử lý, phân tích số liệu kiện 40 CHƯƠNG 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 TỔNG HỢP NRN VÀ NGS BẰNG NUÔI CẤY ĐƠN TỔNG HỢP (MONOCULTURE) 41 3.1.1 Tổng hợp NRN từ chất axit pCA 41 3.1.2 Đường hóa chất NRN thành NGS 42 3.1.3 Chuyển hóa tổng hợp NRN trung gian sản phẩm NGS từ chất pCA 43 3.2 TỔNG HỢP NGS TỪ CƠ CHẤT PCA BẰNG NUÔI CẤY HỖN HỢP 44 3.2.1 Ảnh hưởng tỷ lệ nuôi cấy (EC1/EC2) đến hiệu suất sản phẩm NGS môi trường TB lỏng 45 3.2.2 Ảnh hưởng tỷ lệ nuôi cấy (EC1/EC2) đến hiệu suất sản phẩm NGS môi trường M9 lỏng (+ 2% glucose) 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC QUYẾT ĐỊNH GIAO ĐỀ TÀI (BẢN SAO) HỒ SƠ HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ LUẬN VĂN THẠC SỸ (BẢN SAO) NHẬN XÉT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ 4CL 4-coumaroyl-CoA ligase CHI Chalcone isomerase CHS Chalcone synthase CPR cytochrome P450 reductase DMSO Dimethyl sulfoxide F3H Flavone 3β-hydroxylase F3GT Flavonol 3-O-glycosyltransferase FLS Flavonol synthase GT Glycosyltransferase HPLC High-performance liquid chromatography IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside KLPT Khối lượng phân tử LB Lysogeny broth LC-ESI/MS Liquid Chromatography Electrospray Spectroscopy NDP nucleotide diphosphate OD Optical density OMT O-methyltransferase PAL phenylalanine amoniac lyase TAL Tyrosine amoniac lyase TB Terrific Broth TDP Thymidine diphosphate UDP Uridine diphosphate UGT Uridine diphosphate glycosyltransferase NRN Naringenin NGS Naringenin glucoside Ionization Mass DANH MỤC CÁC BẢNG Số hiệu bảng 2.1 Tên bảng Danh sách chủng vi khuẩn Escherichia coli tái tổ hợp sử dụng nghiên cứu Trang 26 2.2 Tỷ lệ thành phần dinh dưỡng môi trường LB thạch 27 2.3 Tỷ lệ thành phần dinh dưỡng môi trường TB lỏng 28 2.4 Danh sách nguyên – vật liệu sử dụng đề tài 29 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Số hiệu Tên hình vẽ hình vẽ Trang 1.1 Cấu trúc khung flavonoid 1.2 Phân nhóm hợp chất flavonoid 1.3 Các loại hợp chất thuộc phân nhóm euflavonoid 1.4 Cấu trúc naringenin 1.5 Cấu trúc chung hợp chất O-glycoside 1.6 Cấu trúc naringin 11 1.7 Cấu trúc prunin 11 1.8 Con đường sinh tổng hợp naringenin thực vật 13 1.9 Q trình đường hóa hợp chất aglycone tạo glycoside 15 1.10 2.1 2.2 3.1 3.2 3.3 Hai chế tác dụng enzyme glycosyltransferase Sơ đồ thể quy trình chung tiến hành thí nghiệm Sơ đồ thiết kế chủng vi khuẩn E coli tái tổ hợp phương thức hoạt động tạo NGS từ chất p-coumaric Chuyển hóa chất pCA tổng hợp thành NRN chủng vi khuẩn E coli EC1 Chuyển hóa chất NRN tổng hợp thành NGS chủng vi khuẩn E coli EC2 Tổng hợp NGS từ chất pCA chủng vi khuẩn E coli ECNGS 16 32 34 42 43 44 PHỤ LỤC 4: HÌNH ẢNH HĨA CHẤT – THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM Hình 5: Cơ chất Naringenin – Axit p-coumaric – Naringenin-7-O-glucoside Hình 6: Mơi trường ni cấy LB thạch – TB lỏng – M9 lỏng Hình 7: Tủ ấm ni lắc vi sinh – Máy cô quay chân không PHỤ LỤC 5: MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM Hình 8: Cấy ria E coli đĩa LB thạch Hình 9: Ni cấy E coli ống nhựa bình tam giác mơi trường TB-M9 Hình 10: Dịch chiết sau quay Hình 11:Mẫu cần phân tích (từ TB-trái M9-phải) DAI HOC DA NANG TRlfONG D�I HQC BACH KHOA C()NG HOA XA H()I CHU NGHiA VI)::T NAM Dc)c l�p - Tl! - H�nh phuc NHAN XET LUAN VAN TOT NGHIEP • • • (Danh cha vien -� � HQ va ten nguai nh�n xet: NGUYEN HOANG MINH HQc vi: Ti€n sI HQc ham: Chuyen nganh: Cong ngh� sinh hQc Ca quan cong tac: Khoa H6a, Dl;l.i hQc Bach Khoa, Dl;l.i hQc Da Ning Kh6a: K32.CSH HQ va ten hQc vien cao hQc: VO TRAN KHANH HUY.EN Chuyen nganh: Cong ngh� sinh hQc Ten d� tai lu�n van: Nghien cuu sinh t6ng hqp Naringenin glucoside bing phuang phap h6n hqp Y KIEN NHJN XET 1- v� ly do·chQn d� tai: Naringenin- glucoside (NGS) la hqp chfrt c6 hol;l.t tinh sinh hQc cao, c6 nhi�u ung di,mg y duqc va my phfrm Hi�n nay, phuang phap t6ng hQ·p NGS bing phuang phap nuoi cfty don dang rfrt ph6 bi€n, don gian nhung hl;l.n ch€ phl;l.m vi (mg d1,mg cl'.ia ky thu�t di truy�n Do d6, vi�c thu nghi�m t6ng hqp NGS g6p phftn khic phvc nhung nhuvc di�m k� tren 2- V� phuo·ng phap nghien Cll'U, dQ tin c�y CUa cac sfJ li�u: Cac phuong phap nghien CU'U t6t, cac s6 li�u thu nh�n c6 d