Nghiên cứu tuyển chọn bộ chủng vi sinh vật hữu hiệu sử dụng cho cây chè shan (camellia sinensis var shan) ở yên bái

BỘGIÁODỤCVÀĐÀOTẠO BỘNÔNGNGHIỆPVÀPTNT VIỆNKHOAHỌCNÔNGNGHIỆPVIỆTNAM TRẦNTHỊHUẾ NGHIÊNCỨUTUYỂNCHỌNBỘCHỦNGVISINHVẬT HỮUHIỆUSỬDỤNGCHOCÂYCHÈSHAN (Camelliasinensis V a r Shan)ỞYÊNBÁI Chuyênn g n h :Công nghệsinhhọc Mãsố :6 TĨMTẮTLUẬNÁNTIẾNSĨNƠNGNGHIỆP HÀNỘI–2016 Cơngtrìnhđƣợccơngbốtại VIỆNKHOAHỌ CNƠNG NGHIỆP VIỆTNAM Ngƣờihƣớngdẫnkhoahọc: PGS.TS.LêNhƣKiểu PGS.TS.TốngKim Thuần Phảnb i ệ n : Phảnb i ệ n : Phảnb i ệ n : LuậnánsẽđượcbảovệtrướcHộiđồngchấm luậnáncấpViệnHọptạ i Vàoh i g i n g y t h n g năm Cóthểtìmhiểuluậnántại: ThưViệnQuốc gia ThưViệnViệ nKhoa họcNơngnghiệpVi ệ t Nam MỞĐẦU Cây chè Shan(Camellia sinensisvar Shan)được coi nguồn gen địaquý với nét đặc trưng hương thơm, vị đượm, giàu dinh dưỡng Nhiều cơngtrìnhnghiêncứutrênthếgiớichorằng,câychèShantỉnhnBáilànơithủ ytổvàtiến hốcủalồi chèShan Số liệu điều tra TUEBA (Dự án CPWF, 2006)c h o t h ấ y , v ù n g t r n g chè Shan tỉnh Yên Bái vùng đất dốc, phân bố độ cao 600 m, đất đai ởvùng dễ bị xói mịn, thối hóa, dẫn đến khả cung cấp chất dinh dưỡngcủa đất cho chè Shan bị hạn chế, ảnh hưởng trực tiếp đến suất chấtlượng chèShan Phụch i h ệ s i n h t h i đ ấ t v ù n g đ ấ t d ố c , đ ấ t đ i n ú i n h ằ m h n c h ế x ó i mịn, rửa trơi thối hóa đất việc làm quan trọng Đã có nhiều giải phápđượcđ a r a , t r o n g đ ó g i ả i p h p v ề s d ụ n g s ả n p h ẩ m v i s i n h t r o n g c a n h t c coi yếu tố quan trọng mang lại hiệu cao việc cải thiệnđộphìđất,đồngthờicótácđộngtốtđếnmơi trườngvàhệsinhthái Theo nghiên cứu Nepolean eta l ( 2 ) , k h i s d ụ n g hỗn hợp c c chủngV S V t r ê n đ ấ t t r n g c h è t h ì n â n g c a o n ă n g s u ấ t c h è , g i ả m đ ợ c l ợ n g phânhóahọc,giảmsâubệnhhạivàcảithiệnđángkểđộphìđất.Tuynhiên,đốivớicâychèShannBái,hiệnnay chưacómộtsảnphẩmVSVnàođượcnghiêncứuvàứng dụng Chính vậy, để cải thiện tính chất đất, góp phần nâng cao suất, chấtlượng sản phẩm chè Shan Yên Bái cần thiết phải tuyển chọn chủngVSV hữu hiệu, phù hợp với vùng đất đồi núi cao Yên Bái Do vậy, chúng tôithực đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi sinh vật hữu hiệu sửdụngchocâychèShan(CamelliasinensisVarShan)ởYênBái” Mụcđích củađềtài - Mục đích:Tuyển chọn chủng VSV hữu hiệu phù hợp để sản xuấtchếphẩmvi sinhsửdụng chocâychè ShanởYên Bái Ýnghĩakhoahọcvà thựctiễncủađềtài - Ý nghĩa khoa học:Kết nghiên cứu đề tài luận án góp phần bổsung liệu khoa học phục vụ cho việc nghiên cứu, ứng dụng sản xuất loạichế phẩm, phân bón VSV phân bón hữu VSV phục vụ cho vùng trồngchèShan ởYên Bái - Ý nghĩa thực tiễn:Kết nghiên cứu đề tài luận án sở để phổbiến,t u y ê n t r u y ề n v khuyế n c o t r o n g s ả n x u ấ t c hè Sha n c h ấ t l ợ n g c a o t i tỉnhYênBái,thayđổitậpquánsảnxuấtcủangườinôngdântheohướngnôngnghiệphữu cơ(sử dụng cácloại phân bónVSV) Điểmmớicủaluậnán LựachọnđượcbộchủngVSVcókhảnăngphângiảiphốtphátkh ó tan,cốđịnhnitơ tựdo, kíchthíchsinhtrưởngt h ự c v ậ t t c h í n h v ù n g đ ấ t trồngchèShanởYênBái C h ọ n đ ợ c c h ủ n g V S V p h â n g i ả i p h ố t p h t s ắ t v c h ủ n g V S V p h â n giảip hốt phátnhômtừ đất trồng chèđược đánhgiá cóảnhh n g t ố t đến s i n h trưởng,pháttriểncủacâychèShannBái Cấutrúccủaluậnán Luậnánchính148trangvới41bảngsốliệuvà20hình.Luậnángồm5 phần: - Mởđầu (4trang) - Chương1.Tổngquantàiliệu(40trang) - Chương2.Vậtliệu,nộidungvàphươngphápnghiêncứu(25trang) - Chương3.Kết quảvàthảo luận(76trang) - Kếtluậnvàkiếnnghị(2trang) Đãthamkhảo121tàiliệu.Trongđócó61tàiliệuTiếngViệt,60tàiliệutiếng nướcngồi Chƣơng1 TỔNGQUANTÀI LIỆUNGHIÊNCỨU Cây chè (Camellia sinensis(L.) O Kuntze) côngnghiệp chủ yếu nhiều nước giới Tại Việt Nam, nămgần đây, ngành sản xuất chè ngày tăng mạnh, đứng thứ tổng số cácnướcsản xuấtchèlớn trênthếgiới(Hiệphội ChèViệtNam,2012) Chè Shan bốn biến chủng chè giới, có khả chonăng suất cao, chất lượng tốt Theo thống kê, Việt Nam có khoảng40 nghìn chè Shan, chiếm 30% diện tích chè nước, tập trung vùng núicaophíaBắcnhư:YênBái,HàGiang,SơnLa,LàoCai, LaiChâu,PhúThọ Theo nghiên cứu nhà khoa học, hầu hết vùng đất trồng chè trênthếgiớiđềucóđặcđiểmlàchua(pH4,5-5,5)vànghèodinhdưỡng.Tínhchấtchua đất ảnh hưởng đến việc sử dụng dinh dưỡng Đặc biệt, đốivới phản ứng chua đất chứa lượng lớn Fe 3+và Al3+, bón cácloại phân lân vào đất tạo thành dạng phốt phát sắt, nhơm khó tiêu, chè khósửdụng Các nghiên cứu ngồi nước việc sử dụng loạiphân bón có bổ sung thêm số chủng VSV có lợi giảipháp khoa học nhằm làm tăng suất chất lượng chè, đồng thời cải thiệntínhchất đất, giảmơnhiễmmơi trường Tại Việt Nam, có số nghiên cứu phân bón vi sinh sử dụng cho câychè Tuy nhiên, chè Shan Yên Bái, chưa có sản phẩmVSVnào đượcnghiên cứuvàứng dụng Chƣơng2 VẬTLIỆU,NỘIDUNG,PHƢƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 2.1 Vậtliệunghiêncứu - Cácm ẫ u đ ấ t t r n g c h è đ ợ c t h u t h ậ p t i t h ô n P a n g C n g v t h ô n B ả n MớixãSuốiGiàng,huyện VănChấn,tỉnh YênBái - GiốngchèShanSuốiGiàngtuổi1(dùngtrongnghiêncứuchậuvại),câychèSh anSuốiGiàngtuổi5(dùngtrongnghiêncứu đồng ruộng) 2.2 Nộidungnghiêncứu - Đánhgiámộtsốđặcđiểmlý,hóahọcvàVSVcủađấttạivùngtrồngchèShanYên Bái - Phânlập,tuyểnchọncácchủngvisinhvậthữuhiệusửdụngchocâychèShanYên Bái - NghiêncứulựachọntổhợpchủngvisinhvậthữuhiệusửdụngchocâychèSh an Yên Bái - NghiêncứuquytrìnhsảnxuấtchếphẩmvisinhvậtsửdụngchocâychèShanYê n Bái - Nghiênc ứ u ả n h h n g c ủ a c h ế p h ẩ m VS V đ ế n s i n h t r n g , p há t t r i ể n củacâychèShan tuổi 2.3 Phƣơngphápnghiêncứu 2.3.1 Phươngphápđánhgiámộtsốđặcđiểmlý,hóahọcvàvisinhvậtcủađấttại vùng trồng chèShan YênBái 2.3.1.1 Phươngpháplấymẫunghiêncứu Mẫu đất lấy theo phương pháp điểm, theo hướng dẫn Sổ tayphân tích đất, nước, phân bón, trồngcủa Viện Thổ nhưỡng Nơng hóa(1998) 2.3.1.2 Phươngphápphântíchmộtsốchỉtiêulý,hóahọcvàvisinhvậtđất - ĐộẩmđấttheoTCVN6648:2000;pH theoTCVN5979:2007;OC(%) theo TCVN 8941 : 2011; Đạm tổng số (N%) theo TCVN 6498 : 1999; Lân tổngsố (P2O5%) theo TCVN 8940 : 2011; Kali tổng số (K2O%) theo TCVN 8660 :2011; Lân dễ tiêu theo TCVN 5256 : 2009; Kali dễ tiêu theo TCVN 8662 :2011; Phành phần giới hạttheoTCVN 8567: 2010; Phốt phát thànhp h ầ n (Fe– P,Fe– Al,Ca- P) theoP R.Hesse,Chang vàJackson - Kiểmtramậtđộvisinhvật(NguyễnXuânThành,2007) 2.3.2 Phương pháp phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật hữu hiệu sửdụngcho câychèShanYên Bái 2.3.2.1 Phânlậpcácchủngvisinhvật - Phươngphápphânlậpcácchủngvisinhvật(tiếnhànhtươngtựnhưởph ầnphương phápphân tích chỉtiêu VSVđất) - Hìnhtháikhuẩnlạcgồmcácđặcđiểm theoNguyễnXuânThành(2007) - NhuộmG r a m t i ế n h n h t h e o p h n g p h p c ủ a N g u y ễ n X u â n T h n h (2007) - HìnhdạngtếbàotheoNguyễnKimGiao(2004) 2.3.2.2 Tuyểnchọncácchủngvisinhvậthữuhiệu * Xácđịnhkhảnăngphângiảiphốtphátkhótan - Tuyểnchọntheohoạttínhsinhhọc +DựavàonồngđộPO43-theophươngphápXanhmolipdate(Maiti,2004) + Phương pháp định tính dựa vào khả cho vịng phân giải đĩapetri (TCVN6167:1996) - TuyểnchọntheokhảnăngthíchnghivớinhiệtđộvàpHmơitrường Xác định pH thích hợp: Các chủng VSV ni giá trị pH môi trườngkhác nhau: 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 6,0 Sau ngày nuôi, tiến hành xác định mật độtếbàoVSVtheoTCVN6167:1996, hoạttínhđược xác địnht h e o M a i t i (2004) Xác định nhiệt độ: Các chủng VSV nuôi môi trường đặc hiệu ởcácmốcnhiệt độkhácnhau 200C,250C,300C,350C,400C - Tuyểnchọntheokhảnăngtácđộnglênlý,hóasinhvàsinhtrưởngcủa +Thínghiệmchậuvại1:gồm3cơngthức(Khơngbónphân+20mldịch mơi trường chứa Al – P; Khơng bón phân + 20 ml dịch vk PAl – chứa 108CFU/ml Khơng bón phân + 20 ml dịch vk PAl – chứa 10 8CFU/ml) với 3lần lặp lại (1 cây/1 chậu, lần lặp chậu) Các tiêu theo dõi: Chiều caocây,đườngkínhgốc,khốilượngthânlákhơ/cây,hàmlượngdiệplụctronglá + Thí nghiệm chậu vại 2: Tiến hành tương tự thí nghiệm thaychủng vk PAl – chủng vk PFe – 1, chủng vk PAl – thay chủng vkPFe– vàmôi trường chứaAl– Pbằngmôi trườngchứaFe–P * Xácđịnhkhảnăngcốđịnhnitơtựdo - Tuyểnchọntheohoạttínhsinhhọc Xác định thơng qua hàm lựng NH4+có dịch ni cấy phươngphápNessler (Jefferyetal, 1989) - TuyểnchọntheokhảnăngthíchnghivớinhiệtđộvàpHmơitrường Các chủng VSV nuôi môi trường Burk lỏng, ngưỡng pHmôi trường khác nhau: pH4, pH4,5, pH5, pH5,5, pH6 Sau ngày nuôi, tiếnhành xác định mậtđ ộ t ế b o V S V t h e o T C V N 6 : 0 v x c đ ị n h h o t tínhcủacác chủngbằngphương pháp Nessler Tiến hành tương tự để xác định khả thích nghi củac c c h ủ n g V S V với nhiệt độ môi trường, chủng nuôi mốc nhiệt độ khác nhau:200C,250C,300C,350C,400C - Tuyểnchọntheokhảnăngtácđộnglênlý,hóasinhvàsinhtrưởngcủa Thínghiệmđượctiếnhànhtươngtựphươngphápđánhgiátácđộngcủa cácc h ủ n g V S V p h â n g i ả i p h ố t p h t k h ó t a n , c n g t h ứ c t h í n g h i ệ m bao g m : Đ/C:Khơngbónphân+20mldịch mơitrườngnicấy;CT1:Khơngbónphân +20mldịchvkD12chứa10 8CFU/mlvàCT2:Khơngbónphân+20mldịchvkC5 chứa108CFU/ml * XácđịnhkhảnăngsinhIndoleaxeticaxit(IAA) - Tuyểnchọntheohoạttínhsinhhọc Nồng độ IAA xác định phương pháp so màu Salkowski bướcsóng530nm(TCVN2012),mơitrườngnicấyVSVđượcbổsungL-tryptophan - TuyểnchọntheokhảnăngthíchnghivớinhiệtđộvàpHmơitrường Các chủngVSV ni mơi trường LB lỏng có bổ sung Ltryptophan (100mg/l), ni lắc 200 vòng/phút máy lắc ủ nhiệt nhiệt độ300C, với giá trị pH môi trường khác nhau: 4, 4,5, 5, 5,5 Sau ngàynuôi, xác định mật độ tế bào có dịch ni theo TCVN - 2012, xác địnhhoạttínhcủacácchủngbằngphươngphápsomàuSalkowski(TCVN2012) PhươngphápxácđịnhkhảnăngthíchnghicủacácchủngVSVvớinhiệtđ ộmơitrườngđượctiếnhànhtươngtựnhưngởcácmốcnhiệtđộkhácnhaulà200C;250C;300C;350C; 400C - Tuyểnchọntheokhảnăngtácđộnglênlý,hóasinhvàsinhtrưởngcủa Thínghiệmđượctiếnhànhtươngt ự phươngphápđánhgiátácđộngcủa cácc h ủ n g V S V p h â n g i ả i p h ố t p h t k h ó t a n , c ô n g t h ứ c t h í n g h i ệ m bao g m : Đ/C:Khơngbónphân+20mldịch mơitrườngnicấy; CT1:Khơngbónphân +20mldịchvkTS1chứa108CFU/ ml;CT2:Khơngbónphân+20mldịchvkTS4chứa108CFU/ml 2.3.2.3 Phươngphápđịnhdanhđếnlồivàxácđịnhmứcđộantồnsinhhọccủacá cchủngvi sinh vật * Phƣơngphápphânloạibằngphƣơngpháptruyềnthống Dựa vào đặc điểm hình thái như: nhuộm Gram, hình thái khuẩn lạc,hình thái tế bào đặc điểm khác để sơ phân loại theo phương pháptruyền thống (nội dung phương pháp mục 2.3.2.1 phần Phân lập chủng visinhvật) * Phƣơngphápphânloạibằngkỹthuậtsinhhọcphântử Dựa trình tự gen 16S chủng vi khuẩn đọc trực tiếp máyđọc trình tự tự động 3100 Avant Kết trình tự so sánh với trình tựnucleotitcủacáclồiđãđượcxácđịnhtrongngânhànggen(http://www.ncbi.nlm.ni h.gov) Sau so sánh đối chiếu xử lý số liệu tấtcả chuỗi chương trình GENDOC2.5.TênVSVđượcxácđịnhvớixácsuấttương đồng cao * Phƣơngphápxácđịnhmứcđộantoànsinhhọc Dựa theo hướng dẫn Ủy ban tác nhân sinh học(The Committee forBiological Agents (ABAS), 2010)thuộc Viện Liên bang Đức theo hướng dẫncủatổ chứcWHO(2004) 2.3.3 Phương pháp lựa chọn tổ hợp chủng vi sinh vật sử dụng cho chèShanởn Bái 2.3.3.1 Phươngpháplựachọntổhợpvisinhvậttrongphịngthínghiệm Dựavàophươngphápđịnhtính vàđịnhlượngđểlựachọn 2.3.3.2 Phương pháp lựa chọn tổ hợp vi sinh vật thông qua mức độ tác độngđếnsinhtrưởngvàpháttriển giốngchèSG1tuổi Thí nghiệm chậu vại gồm cơng thức (Khơng bón phân + 20 ml dịch mơitrường ni cấy; Khơng bón phân + 20 ml hỗn hợp chủng VK (mật độ tế bàomỗi chủng 108CFU/ml)) với lần lặp lại (1 cây/1 chậu, lần lặp chậu).Các tiêu theo dõi: Chiều cao cây, số cành cấp 1, cấp 2, chiều dài rễ, khốilượngrễkhơ/cây,chiều dài,rộng lá,diện tíchlá(cm2) 2.3.4 PhươngphápnghiêncứuquytrìnhsảnxuấtchếphẩmVSVsửdụngc hocâychèShan ởn Bái 2.3.4.1 Phươngphápnghiêncứuđiềukiệnnhânsinhkhối * Xácđịnhmơitrƣờngthíchhợpchonicấyvisinhvật ĐánhgiákhảnăngpháttriểncủacácchủngVSVở cácmơitrườngkhácnha uđểxácmơi trường nicấythích hợp * XácđịnhpHmơitrƣờngthíchhợpchonhângiống 04chủngvikhuẩnđượcniởcácgiátrịpH4,5-8,0.Tiếnhànhkiểmtramậtđộ VSVđểxácđịnh pHthích hợp * Xácđịnhnhiệtđộmơitrƣờngthíchhợpchonhângiống Nhiệt độ điều chỉnh từ 20 0C - 400C Sau thời gian ni cấy thích hợp,xácđịnhmậtđộtếbàocủacácchủngvkđểxácđịnhnhiệtđộnicấythíchhợp * Xácđịnhthờigianthíchhợpchonhângiống chủng vk ni điều kiện pH, nhiệt độ thích hợp tiến hànhkiểm tra mật độ tế bào VSV sau nuôi cấy từ 12-108 để lựa chọn thời gianthíchhợp * Xácđịnhtốcđộkhuấythíchhợpchonhângiống 04 chủng vk ni riêng rẽ, tiến hành khảo sát tốc độ khuấy: 250 400vịng/phút.SaukhoảngthờigianthíchhợptiếnhànhđếmmậtđộtếbàoVSVđểxácđịnh tốcđộkhấy * Xácđịnhtỷ lệtiếpgiốngthíchhợpchonhângiống Nghiên cứu tiếp giống chủng vkở t ỷ l ệ - % , k ế t t h ú c thời g i a n nuôic ấ y t i ế n h n h đ n h g i m ậ t đ ộ t ế b o V S V đ ể xá c đ ị n h t ỷ l ệ t i ế p g i ố n g thíchhợp 2.3.4.2 Phươngphápnghiêncứulựachọnchấtmangchosảnxuấtchếphẩm Dịch lên men của04 chủngvkđượctrộn vàothanbùnvàhỗnhợpthanbùn : cám gạo : rỉ đường với tỉ lệ 10:2:0,1 Mật độ hoạt tính chủng vkđược kiểm tra bắt đầu bảo quản, định kì sau bảo quản tháng, tháng 6tháng 2.3.4.3 Phươngphápxácđịnhtỷlệphốitrộndịchvisinhvậtvớichấtmang Dịch lênmencủa chủng vk phối trộn với chất mangở c c t ỷ l ệ khác từ 2-10%, tiến hành kiểm tra mật độ tế bào VSV để lựa chọn tỷ lệthích hợp 2.3.4.4 Phươngpháp sảnxuấtthửnghiệmchếphẩmvisinhvật Tổng hợp thông số kỹ thuật thích hợp cho q trình nhân sinh khối 04chủng vk đề tài tiến hành sản xuất thử nghiệm 200 kg chế phẩm Sau thángbảo quản, tiến hành đánh giá số tiêu chế phẩm như: Độ ẩm theoTCVN 9297 : 2012, pH theo TCVN 5779 : 2007, mật độ tế bào VSV cố địnhnitơ theo TCVN 6166 : 2002, mật độ tế bào VSV phân giải phốt phát khó tantheo TCVN 6167 : 1996, mật độ tế bào VSV kích thích sinh trưởng theo TCVN2012 2.3.4.5 Phương pháp xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm vi sinh vật sử dụngchocâychèShan Yên Bái Tổng hợp kết nghiên cứu để xây dựng quy trình sản xuất chếphẩmVSVsử dụngchocây chèShanởYênBái 2.3.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng chế phẩm vi sinh vật đếnsinhtrưởng,pháttriển củacâychèShanSG1 tuổi5 Thí nghiệm đồng ruộng gồm cơng thức (Nền + Không bổ sung chế phẩmVSV; Nền + 15 kg chế phẩm/ha; CT3: Nền + 20 kg chế phẩm/ha) với lần lặplại,diện tích thí nghiệm: 45 m2 Các tiêu theo dõi: Mật độ tế bào VSV cố định nitơ (TCVN 6166 :2002); VSV phân giải phốt phát khó tan (TCVN 6167 : 1996), VSV kích thíchsinhtrưởngthựcvật(TCVN2012)trướcvàsauthínghiệm;Phântíchm ộtsốchỉ tiêu hóa tính đất độ sâu - 20 cm 20 - 40 cm trước sau thí nghiệm(phương pháp phần 2.3.1.2); Chiều cao cây; Sinh trưởng búp; Rộng tán;Đường kính thân; CSDTL; Số lứa hái; Số búp cây; Năng suất búp/cây;Năng suất thí nghiệm; Hàm lượng tanin; Hàm lượng chất hoà tan; Hàm lượngaxit amin; Hàm lượng đường khử chất lượng chè thành phẩm (TCVN 3218-2012) 2.3.6 Phươngphápxửlýsốliệu Kết thí nghiệm tổng hợp xử lý, vẽ đồ thị, biểu đồ MicrosoftExcel-2007.SốliệuđượcxửlýtheochươngtrìnhxửlýthốngkêsinhhọctrênphầnmềmSTATISTIX 10.0 Chƣơng3 KẾTQUẢNGHIÊNCỨUVÀTHẢOLUẬN 3.1 Đánh giá số đặc điểm lý, hóa học vi sinh vật đất vùng trồngchèShan Yên Bái * Chỉtiêulý,hóahọcđất Tiến hành lấy mẫu đất nghiên cứu độ cao tương ứng 600 m, 900m 1.200m Kết phân tích thành phần lý, hóa học mẫu đấtđượcthểhiện ởbảng 3.1 Kết bảng 3.1 cho thấy: Đất có thành phần giới nặng, thành phần cấphạt sét dao động 40,5% - 50,3%, thành phần cấp hạt limon chiếm 39,5% đến49,9%vàthànhphầncấphạtcátchỉchiếmkhoảng9,6%-13,7%.Đấtcóphản 3.2.2.2 Tuyểnchọncácchủngvisinhvậtcốđịnhnitơtựdo * Tuyểnchọntheohoạttínhsinhhọc Hoạt tính cố định nitơ chủng VSV xác định dựa vào hàmlượng NH4+tổng hợp dịch nuôi cấy Kết nghiên cứu trìnhbàytại bảng 3.8 Bảng 3.8 Khả tổng hợp NH4+của 37 chủng vi sinh vật có hoạt tính cốđịnhnitơ sau3ngàyncấy,ởpH4,5 T T 10 11 12 13 Kíh iệu chủng D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D10 D11 D12 S1 Hoạttínhcốđị nhnitơ (mgNH4+/l) 0,61 0,64 1,63 1,46 0,68 0,38 1,52 0,85 1,31 0,20 0,43 2,06 0,62 Hoạttínhcốđị nhnitơ (mgNH4+/l) 14 S2 0,43 15 S3 1,20 16 S4 0,70 17 S5 0,82 18 S6 1,43 19 S7 1,28 20 S8 0,25 21 C1 1,61 22 C2 1,10 23 C3 1,30 24 C4 0,52 25 C5 2,15 26 C6 0,23 LSD0,05=0,04;CV(%)=2 , Kíhiệuc TT hủng 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 Hoạttínhcốđị nhnitơ (mgNH4+/l) 0,70 1,42 0,35 1,67 0,28 1,15 1,03 0,27 0,23 1,58 37 C17 1,04 Kíhiệuc TT hủng 7 Nồngđộ NH4+(mg/l) Mậtđộtếbào(log10xCFU/ml) Bảng 3.8 cho thấy, 37 chủng vk nghiên cứu có chủng (kí hiệu D12và C5)có hoạt tínhcốđịnh nitơcao nhất,chủngD12(2,06mgN H 4+/l) vàchủngC5(2,15 mgNH4+/l) *Đánh giá khả thích nghi chủng vi sinh vật với môi trườngđấttrồng chèShanYên Bái Kết đánh giá giá khả thích nghi với độ chua nhiệt độ mơitrườngcủahaichủng vk D12 vàC5đượcthểhiệnởhình 3.8và3.9 pHpHpHpHpHpHpHpHpHpH (4,0) (4,5) (5,0) (5,5) (6,0)(4,0) (4,5) (5,0) (5,5) (6,0) Chủng D12 Chủng C5 pH môi trƣờng Mật độ Hoạt tính Hình 3.8 Khả thích nghi chủng vi khuẩn D12 C5 với độ chuamôitrƣờngkhácnhau Kết hình 3.8 cho thấy, dải pH từ 4,0-6,0 chủng vi khuẩn đềupháttriểnbìnhthườngđếntốt(mậtđộtếbàođạt105-107CFU/ml).Hoạttínhcố định nitơ chủng vi khuẩn mức trung bình đến mạnh (1,25-6,09 mgNH4+/l) Trong điều kiện môi trường chua (pH4,5) hai chủng vi khuẩn pháttriển tốt 300C (mậtđộ tế bào VSV đạt 106- 107CFU/ml), đồng thời hoạttính sinh học cao nhất: chủng D12 (1,98 mg NH 4+/l) chủng C5 (2,15 mgNH4+/l) Nhiệt độ thích hợp cho phát triển chủng D12 25 - 35 oC chủngC5là25- 30oC(Hình 3.9) 2.5 1.5 NồngđộNH4+(mg/l) Mậtđộtếbào(log10xCFU/ml) 0.5 0 20oC 25oC 30oC 35oC 40oC 20oC 25oC Chủng D12 30oC 35oC 40oC Chủng C5 Nhiệt độ Mật độ Hoạt tính Hình 3.9 Khả thích nghi chủng vi khuẩn D12 C5 vớinhiệtđộ môitrƣờngkhácnhau(pH4,5) *Đ n h g i t c đ ộ n g c ủ a c c c h ủ n g V S V l ê n s i n h l ý , s i n h h ó a v s i n h trưởngcủacâychèShan tuổi giá mức độ tác động chủng vi khuẩn D12 C5 đến trồng Kết theo dõi tổng h Bảng 3.9 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn D12 C5 đến số tiêusinhlý,sinhhóa vàsinhtrưởng củacâychèShan SG1tuổi1 Công thức Chỉ tiêu HàmlượngN (%) HàmlượngP205(%) HàmlượngK20(%) Chlorophylla(mg/glá) Chlorophyllb(mg/glá) Tổngdiệplục(mg/glá) Carotenoit(mg/glá) Chiềucao cây(cm) Đườngkínhthân(cm) Khốilượngchấtkhơ(g/cây) Đ/C CT1 CT2 LSD0,05 CV(%) 1,36c 0,21b 0,24b 0,44c 0,37c 0,81c 0,20c 25,30b 0,39b 19,64c 1,53b 0,22ab 0,26ab 0,50b 0,43b 0,93b 0,23b 26,20ab 0,41ab 22,48b 1,70a 0,23a 0,27a 0,56a 0,51a 1,06a 0,27a 27,93a 0,47a 24,28a 0,14 0,02 0,03 0,04 0,04 0,05 0,03 2,54 0,06 1,79 4,12 3,81 4,60 3,49 3,59 2,46 5,45 4,23 6,62 3,57 Kết bảng 3.9 cho thấy, chủng vi khuẩn cố định nitơ có tácđộng tích cực đến sinh lý, sinh hóa sinh trưởng chè Shan SG1 tuổi 1.Tuynhiên,chủngvikhuẩnC5cótácđộngrõrệtnhấtởcácchỉtiêutheodõinhư: hàm lượng nitơ tổng số, chlorophylla, chlorophyllb, carotenoit, diệp lụctổngsốvàkhối lượng chất khơ) 3.2.2.3 Tuyểnchọncácchủngvisinhvậtkíchthíchsinhtrưởngthựcvật * Tuyểnchọntheohoạttínhsinhhọc Hoạtt í n h k í c h t h í c h s i n h t r n g t h ự c v ậ t c ủ a c c c h ủ n g V S V đ ợ c x c địnhthơngquakhảnăngsinhtổnghợpIAAtrongdịchnicấy.Kếtquảđược trìnhbàytạibảng3.10 Bảng 3.10 Khả kích thích sinh trưởng thực vật 16 chủng vi khuẩnsau3 ngàynuôi cấy,ở pH4,5 TT 10 11 12 13 14 15 16 Kí hiệuch ủng TD1 TD2 TD3 TD4 TD5 TD6 TS1 TS2 TS3 TS4 TC1 TC2 TC3 TC4 TC5 TC6 Độ caolấymẫu( m) 1200 1200 1200 1200 1200 1200 900 900 900 900 600 600 600 600 600 600 LSD0,05 CV(%) Khả sinh tổnghợpIAA(µgIAA/ ml) 9,35 6,16 13,88 4,36 6,39 1,29 16,18 8,30 5,65 16,53 8,77 14,24 2,37 10,93 4,33 13,32 0,27 1,82 10 25 20 15 10 NồngđộIAA(µg/ml) Mậtđộtếbào(log10xCFU/ml) Kếtquảởbảng3.10chothấy,2chủngvkphânlậpđượcởđộcao900mcókhả năngtổnghợpIAAcaonhấtlàTS1(16,18µgIAA/ml)vàTS4(16,53µgIAA/ml) * Đánhg i k h ả năngthích nghicủa c h ủ n g V S V v i m ô i t r n g đấttrồng chèShan Yên Bái Đánh giá thích nghi chủng VSV với điều kiện nhiệt độ pHmơitrường khácnhau.Kết quảđượctổnghợp ởhình 3.10và3.11 pHpHpHpHpHpHpHpHpHpH (4,0) (4,5)(5,0)(5,5) (6,0)(4,0) Chủng TS1Chủng TS4 (4,5)(5,0)(5,5) (6,0) pH mơi trƣờng Mật độHoạt tính Hình 3.10 Khả thích nghi vi khuẩn TS1 TS4 với độ chua mơitrƣờngkhácnhau Nhìnchung, ởdả i pH4,06, 0chủng vkT S4 sinhtrưởng tốthơnchủng TS1.pH6,0 làphùhợp cho cả2chủng phát triển Kết quảởhình3.11chothấy,ởmơitrườngpH4,5cả2chủngvk cómật độtếb o đ t 4-1 7CFU/ml.T u y n h i ê n , k h ả n ă n g s i n h t ổ n g h ợ p I A A c ủ a2 Mậtđộ tếbào(log10xCFU/ml) 20 18 16 14 12 10 NồngđộIAA(µg/ml) chủngvẫnđạtởmứctrungbìnhđếntốt(8,41- 17,61µg IAA/ ml).Dovậy,2chủngvk đượclựachọnđểtiếp tụcthửnghiệmtrên trồng 20oC 25oC 30oC 35oC 40oC 20oC 25oC 30oC 35oC 40oC Chủng TS1 Chủng TS4 Nhiệt độ mơi trƣờng Mật độ Hoạt tính Hình3.11.KhảnăngthíchnghicủavkTS1,TS4vớinhiệtđộmơitrƣờngkhácnhau ở(pH4,5) * Đánhgiátácđộngc ủ a c c c h ủ n g V S V l ê n s i n h l ý , s i n h h ó a v sinhtrưởng củacâychèShan tuổi Đánh giá tác động chủng vk TS1 TS4 đến số tiêu sinh lý,sinhh ó a v s i n h t r n g c ủ a c â y c h è n g h i ê n c ứ u K ế t q u ả đ ợ c t ổ n g h ợ p t i bảng3.11 Bảng 3.11 Ảnh hưởng chủng vi khuẩn TS1 TS4 đến số tiêusinhlý,sinhhóa vàsinh trưởngcủa câychèSG1 tuổi1 Côngthức Đ/C CT1 CT2 CV(%) LSD0,05 Chỉtiêu HàmlượngN (%) 1,52b 1,83a 1,85a 0,26 6,72 b ab ab HàmlượngP205(%) 0,21 0,23 0,23 0,02 4,42 b a a Hàmlượng K20 (%) 0,26 0,30 0,30 0,03 4,37 b ab a Chlorophylla(mg/glá) 0,50 0,55 0,56 0,05 4,20 b ab a Chlorophyllb(mg/glá) 0,48 0,51 0,53 0,04 3,48 b ab a Tổngdiệplục(mg/g lá) 0,98 1,06 1,09 0,08 3,25 b a a Carotenoit(mg/g lá) 0,22 0,24 0,25 0,02 4,35 b a a Chiềucaocây(cm) 27,67 31,40 32,47 2,53 3,65 b a a Đườngkínhthân(cm) 0,37 0,47 0,48 0,06 6,00 b a a KLchấtkhô(g/cây) 20,49 26,77 27,19 2,22 3,95 Kết bảng 3.11 cho thấy, chủng vk nghiên cứu có tác động tíchcựcđếncâytrồng,khảnăngtíchlũyNtổngsốtăngtừ20,3921,71%sovớiđốichứng(khơngbổsung vk), làm tăng chiều cao 3,73-4 , c m v đ ặ c biệtlàmtăng khảnăng tích lũychấtkhơ6,28- 6,7g/cây 3.2.2.4 Địnht ê n đ ế n l o i v x c đị nh độ a n t o n s i n h h ọ c c ủ a c c c hủ ng v i sinhvật *Địnhtênđếnlồicácchủngvisinhvậttuyểnchọn Phânloạibằngphƣơngpháptruyềnthống Kết đánh giá đặc điểm hình thái khuẩn lạc hình ảnh tế bào 5chủng vi khuẩn cho thấy, với đặc điểm khuẩn lạc tế bào vikhuẩnPAl–1,TS1,C5,TS4mangnhiềuđặcđiểmcủachiBacillus.Vikhuẩn PFe-1mangnhiềuđặcđiểmthuộchọEnterobacteriaceae Phânloạibằngkỹthuậtsinhhọcphântử Kết giải trình tự nucleotit đoạn gen 16S riboxom 05 chủng vk chothấy, chủng PFe - có quan hệ họ hàng gần với loài vkEnterobacterludwigii, chủng PAl - với loàiBacillus subtilis, chủng C5 với loàiBacillusmegaterium, chủng TS1 với loàiBacillus cereusvà chủng TS4 với loàiBacillusamyloliquefaciens 3.2.2.5 Mứcđộ antoànsinhhọccácchủngvisinhvậttuyểnchọn Kết đánh giá mức độ an toàn sinh học cho thấycả 05 chủng vk nghiêncứu cấp độ an toàn Tuy nhiên, loài vi khuẩnBacillus cereus(cấpđộ an toàn 2) biết đến nhiều với nguy gây ngô độc thực phẩm Mặtkhác, khả sinh IAA chủngBacillus cereusTS1 không cao so vớichủng TS4 Do vậy, để đảm bảo an toàn sản xuất sử dụng chúng tôiquyếtđịnh loạibỏ chủngBacilluscereusTS1 3.3 Nghiên cứu lựa chọntổ hợp chủng vi sinh vật hữu hiệus d ụ n g c h o câychèShan YênBái 3.3.1 Nghiên cứu khả tổ hợp chủng vi sinh vật phươngphápđịnh tính C vịtrítiếpxúc 3.3.2 Nghiên cứu khả tổ hợp chủng vi sinh vật phươngphápđịnh lượng Mật độ tế bào chủng vk dạng phối trộn đơn lẻ dạng hỗn hợpkhơng có khác biệt đáng kể theo thời gian bảo quản Mật độ tế bào vk đượcduytrìtrongsuốtthờigian tháng bảoquản vàđạt >108CFU/g Hoạttínhsinhhọccủacả4chủngvknghiêncứusuygiảmkhơngđángkểởcảđi ềukiệnriêng lẻvàhỗnhợptrongsuốtthờigian 6thángbảoquản 3.3.3 Đánh giá tác động hỗn hợp chủng vi sinh vật lên sinh lý, sinh hóavàsinh trưởng củacâychèShan SG1tuổi * Ảnhhƣởngđếnmộtsốchỉtiêusinhlý,sinhhóacủaláchè Sau năm theo dõi chúng tơi tiến hành phân tích số tiêu sinh lý,sinhhóaởlácâychè.Kết quảđượctổng hợp tạibảng 3.18 Bảng 3.18 Ảnh hưởng hỗn hợp chủng VSV đến số tiêu sinh lý,sinhhóa chètuổi Côngthức Đ/C TN CV(%) LSD0,05 Chỉtiêu HàmlượngN (%) 1,7 2,37 0,07 1,04 HàmlượngP205(%) 0,24 0,32 0,05 5,26 Hàmlượng K20 (%) 0,30 0,39 0,02 1,68 Chlorophylla(mg/glá) 0,45 1,79 0,14 3,47 Chlorophyllb(mg/glá) 0,51 0,74 0,11 5,09 Tổngdiệplục(mg/g lá) 0,96 2,53 0,19 3,07 Carotenoit(mg/g lá) 0,28 0,67 0,04 2,28 Kếtquảởbảng3.18chothấy: Bổ sung chủng vi khuẩn làm tăng rõ rệt khả tích lũy N, P 2O5và K2Otrong chè so với đối chứng không bổ sung VSV Hàm lượng N đạt 2,37%,tăng 39,41%,hàm lượng P205đạt 0,32%, tăng 33,3% hàm lượng K20 đạt 0,39%,tăng30% so vớiđốichứng Hàm lượng diệplụcthành phần (chlorophylla, chlorophyllb,carotenoit) vàdiệp lục tổng số cao rõ rệt so với ĐC Hàm lượng chlorophyll tổng số đạt2,53 mg/g lá, tăng 1,57 mg/g lá, lượng chlorophyll ađạt 1,79 mg/g lá, tăng 1,34mg/g lávàlượngcarotenoitđạt 0,67mg/glá,tăng0,33 mg/glá sovớiĐC * Ảnhhƣởngđếnsựpháttriểncủabộrễcâychè Số rễ cơng thức bón hỗn hợp chủng vi khuẩn nhiều rõrệt so với đối chứng khơng bón chiều dài rễ dài so với cơng thứckhơngbónVSV Khối lượng thân khối lượng rễ công thức thí nghiệm cao hơnso với cơng thức đối chứng Tỷ lệ khối lượng rễ/thân khô công thức đượcbónhỗnhợpvi khuẩn đạt0,73,ở cơngthứcđốichứng thấphơn,chỉđạt 0,68 Bảng 3.19 Ảnh hưởng hỗn hợp chủng vi sinh vật đếnsựpháttriểncủa bộrễcâychèSG1tuổi1 LSD0,05 Cơng thức Đ/C TN CV(%) Sốrễchính/cây(cái) 5,36 6,24 0,82 4,05 Chiềudài rễ(cm) 23,63 27,36 1,34 1,50 Khốilượngthânlákhô(g/cây) 133,00 163,33 Khốilượngrễkhô(g/cây) 89,72 119,73 Tỷlệkhốilượng rễ/thânlá 0,68 0,73 * Ảnh hƣởng đến sinh trƣởng chè Theo dõi ảnh hưởng chúng đến sinh trưởng thông qua chiềucao, đường kính thân cây, chiều rộng tán, số cành cấp Kết thểhiệnởbảng 3.20 Bảng 3.20 Ảnh hưởng hỗn hợp chủng VSV đến sinh trưởng củacâychèSG1 tuổi Công thức Đ/C TN LSD0,05 CV(%) Chỉ tiêu TrướcTN 24,51 24,47 0,88 1,02 SauTN 35,83 47,40 1,62 1,11 Cao cây(cm) Tốcđộtăng 11,20 23,06 TrướcTN 0,31 0,30 0,02 2,32 Đường SauTN 0,56 0,66 0,14 6,38 kínhthân(cm Tốcđộtăng 0,25 0,36 ) Đườngkínhtán(cm) 32,19 34,39 1,75 1,49 Sốcànhcấp1 (cành) 3,39 4,80 0,45 3,15 Sốcànhcấp2 (cành) 1,75 2,59 0,32 4,26 Kết bảng 3.20 cho thấy, chiều cao cây, số cành cấp số cành cấp2 tăng rõ rệt cơng thức bón hỗn hợp chủng vi khuẩn so với côngthứcđốic h ứn g Tốc đột ă ng c hi ề uc a o câyởcông t c t hí ng hi ệ m đạt2 3, 06 cm,ởcông thứcđốichứng đạt11,20cm