Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa news.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa news.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa news.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa news.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa news.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa news.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa news.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa news.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa news.Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật và tác động đến biểu hiện gen liên quan đến đáp ứng mặn của cây lúa news.1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Vũ Văn Dũng NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CHỊU MẶN CÓ ĐẶC TÍNH KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG THỰ.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Vũ Văn Dũng NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CHỊU MẶN CĨ ĐẶC TÍNH KÍCH THÍCH SINH TRƯỞNG THỰC VẬT VÀ TÁC ĐỘNG ĐẾN BIỂU HIỆN GEN LIÊN QUAN ĐẾN ĐÁP ỨNG MẶN CỦA CÂY LÚA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: : 42 02 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2023 Cơng trình hồn thành tại: 2Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: GS TS Nguyễn Huy Hoàng Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS Đỗ Hữu Nghị Phản biện 1: PGS.TS Phạm Thế Hải Phản biện 2: PGS.TS Trương Quốc Phong Phản biện 3: PGS.TS Đỗ Thị Huyền Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi , ngày tháng năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Sự sinh trưởng suất trồng bị ảnh hưởng nghiêm trọng yếu tố stress sinh học phi sinh học Các yếu tố stress sinh học côn trùng phá hoại vi sinh vật gây bệnh cho trồng Các yếu tố stress phi sinh học bao gồm hạn hán, độ mặn, nhiệt độ, kim loại nặng chất ô nhiễm hữu Trong số yếu tố stress phi sinh học, độ mặn ảnh hưởng nghiêm trọng coi yếu tố hạn chế đáng kể suất nông nghiệp an ninh lương thực Tình trạng xâm nhập mặn lan rộng toàn cầu với tốc độ tăng nhanh làm tăng nguy an ninh lương thực số quốc gia Các khu vực đồng Ấn Độ, Myanmar Bangladesh vùng sản xuất lúa gạo lớn giới phải đối mặt với mối đe dọa nghiêm trọng an ninh lương thực đất ven biển bị nhiễm mặn Ở Việt Nam, xâm nhập mặn xuất không theo chu kỳ vùng ven biển vùng Đồng sông Cửu Long, gây thiệt hại lớn cho sản xuất nông nghiệp đặc biệt lúa nước Theo thống kê năm 2015, ước tính có khoảng 35,5% diện tích trồng lúa tỉnh ven biển bị ảnh hưởng Xâm nhập mặn tăng kỷ lục năm 2016 gây thiệt hại 139.000 lúa đồng sơng Cửu Long với ước tính suất giảm 30-70% Năm 2020, xâm nhập mặn gây thiệt hại khoảng 34.600 thuộc tỉnh Cà Mau, Kiên Giang, Bến Tre Sóc Trăng với suất ước tính giảm từ 30-70% Có nhiều phương pháp khắc phục xâm nhiễm mặn xây dựng hệ thống ngăn mặn-lấy ngọt-tiêu úng, tạo giống lúa chịu mặn gia tăng rừng ngập mặn ven biển… Những phương pháp địi hỏi nhiều thời gian kinh phí Gần đây, giới có nhiều nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật chịu mặn kích thích sinh trưởng thực vật (PGPB) để giảm thiểu tác hại yếu tố stress sinh học phi sinh học khác thực vật Kết cho thấy PGPB với khả sinh axit indole3-acetic (IAA), 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (ACCD), cố định nitơ, phân giải phosphate sinh siderophores… hỗ trợ cho trồng chống chịu với stress mặn, sử dụng để cải tạo, nâng cao suất hệ sinh thái nông nghiệp vùng đất nhiễm mặn Ở Việt Nam, việc sử dụng PGPB chịu mặn để tăng khả chống chịu mặn lúa chưa ý Các nghiên cứu tập trung vào phân lập chủng vi sinh vật có hoạt tính sinh học cố đinh nitơ, phân gải phosphate sinh IAA… Chưa có nghiên cứu đánh giá hiệu vi sinh vật chịu mặn sinh IAA sinh ACC deaminase việc hỗ trợ lúa sinh trưởng phát triển điều kiện nhiễm mặn, đồng thời, chưa có nghiên cứu biểu gen liên quan đến đáp ứng mặn lúa hỗ trợ vi sinh vật Vì vậy, luận án: “Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn chịu mặn có đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật tác động đến biểu gen liên quan đến đáp ứng mặn lúa.” thực với mục tiêu nội dung sau: Mục tiêu nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn chịu mặn sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA, ACC deaminase, phân giải phosphate, phân giải cellulose, cố định nitơ siderophores nghiên cứu biểu gen liên quan đến đáp ứng mặn lúa Nội dung nghiên cứu Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn chịu mặn có khả sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA, ACC deaminase, phân giải phosphate, phân giải cellulose, cố định nitơ siderophores; Đánh giá khả hỗ trợ lúa chịu mặn chủng vi khuẩn chọn lọc; Nghiên cứu biểu gen liên quan đến đáp ứng với stress mặn lúa hỗ trợ chủng vi khuẩn chọn lọc; Giải trình tự hệ gen chủng khuẩn chọn lọc xác định gen liên quan đến khả chịu mặn sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Đề tài luận án phân lập chủng vi khuẩn chịu mặn có khả sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật, từ lựa chọn chủng vi khuẩn có khả hỗ trợ lúa sinh trưởng phát triển điều kiện nhiễm mặn Kết đề tài luận án có ý nghĩa phục vụ cơng tác tạo chế phẩm sinh học, nâng cao hiệu sản xuất lúa vùng trồng bị nhiễm mặn Kết đề tài luận án bổ sung làm giàu thêm nguồn gen vi sinh vật hữu ích cung cấp thông tin gen chịu mặn lúa kích thích chủng vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật CHƯƠNG TỔNG QUAN 1 Tổng quan vi sinh vật k h th h sinh tr ởng thự vật 1.1.1 Khái niệm vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật 1.1.2 Đặc điểm vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật t t s 1.1.2.5 s t t s CC d m s siderophores s hế hỗ trợ thự vật hịu mặn nhờ 1.2 Vi sinh vật chịu mặn PGPB 1.2.1 Vi sinh vật chịu mặn 1.2.2 chế hỗ trợ thực vật chịu mặn nhờ PGPB tt mt 1.2.2 u 1.2.2.2 C i thiện h p thu ch t d 1.2.2 t 1.2.2 t CC d m dưỡng s 1.2.2.5 Exo-polysacaride t 1.2.2 ệ m ường biểu hiệ 1.2.2.7 Sự đ p ứng với str ss ặn ê qu ế ứng mặn a 1.3.1 Ảnh hưởng stress mặn lên lúa 1.3.2 chế dung nạp muối lúa 1.3.2.1 Cân nội môi ion 1.3.2.2 Cân áp su t th m th u 1.4 Tình hình nghiên cứu PGPB chịu mặn hỗ trợ trồng chịu mặn 1.4.1 Trên giới 1.4.2 Tại Việt Nam 1.15 Ph ng ph p ph n t h hệ gen cơng nghệ giải trình tự gen hệ CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Ngu n vật iệu 2.1.1 Nguyên liệu Tổng số 66 mẫu gồm 36 mẫu đất quần đảo Trường Sa, 12 mẫu đất nước ven biển, mẫu rễ lúa, mẫu rễ đước 2.1.2 óa ch t m i trường thiết bị Ph ng ph p nghi n ứu 2.2.1 Phư ng pháp l y mẫu 2.2.2 Ph n lập chủng vi khuẩn chịu mặn 2.2.3 Sàng lọc chủng vi khuẩn có khả n ng sinh 2.2.4 àng lọc chủng vi khuẩn có khả n ng tổng hợp ACC deaminase 2.2.5 àng lọc chủng vi khuẩn có khả n ng ph n giải phosphate 2.2.6 àng lọc chủng vi khuẩn có khả n ng cố định nit 2.2.7 àng lọc chủng vi khuẩn có khả n ng ph n hủ cellulose 2.2.8 Khả n ng sinh siderophore 2.2.9 Phân loại vi sinh vật X P ặ nh s ểm hình thái sinh hố i trình tự 16S RNA 2.2.10 Ảnh hưởng số yếu tố đến sinh trưởng tổng hợp IAA chủng vi khuẩn chọn lọc 2.2.10.1 Ả ưởng pH nhiệt ộ ế s trưởng chủng vi khu n chọn lọc Ả ưở uồ t ế s trưởng sinh IAA chủng vi khu n chọn lọc Ả ưở ộ L-tr t ế s trưởng sinh IAA chủng vi khu n chọn lọc Ả ưở uồ rb ế s trưởng sinh IAA chủng vi khu n chọn lọc 2.2.10.5 Ả ưởng nồ ộ mu ế s trưởng t ng h p IAA chủng vi khu n chọn lọc P nh chlorphyll 2.2.12 Đánh giá khả n ng hỗ trợ lúa chịu mặn chủng vi khuẩn chọn lọc 2.2.13 Đánh giá biểu gen liên quan đến đáp ứng mặn ởc lúa hỗ trợ chủng vi khuẩn chọn lọc 2.2.13.1 Tách chiết RNA t ng h p cDNA 2.2.13.2 Kỹ thuật RT-PCR 2.2.14 Phân tích hệ gen chủng vi khuẩn chọn lọc phư ng pháp giải trình tự gen hệ 2.2.14.1 Tách chiết, tinh s ch t t v ện DNA 2.2.14.2 Phân tích hệ gen vi khu n 2.2.15 Phân tích thống kê 2.2.16 Địa điểm nghiên cứu CHƯƠNG KẾT QU VÀ TH O LUẬN Ph n ập tu ển chọn hủng vi khuẩn khả hịu ặn sinh hất k h th h sinh tr ởng thự vật 3.1.1 Ph n lập tu ển chọn chủng vi khuẩn tổng hợp IAA Đã phân lập 423 chủng vi khuẩn chịu mặn từ 66 mẫu, 185 chủng vi khuẩn từ 36 mẫu đất quần đảo Trường Sa, 21 chủng vi khuẩn từ mẫu rễ lúa, 25 chủng từ mẫu rễ đước 202 chủng từ 12 mẫu đất nước biển Sàng lọc khả sinh IAA từ 423 chủng phân lập, kết thu 65 chủng vi khuẩn có khả sinh IAA, 39 chủng từ mẫu đất Trường Sa, chủng từ mẫu rễ lúa, chủng từ mẫu rễ đước 10 chủng từ mẫu đất nước biển Mười chủng phân lập từ mẫu đất nước biển có hàm lượng IAA khoảng từ 19 đến 44 µg/mL, số chủng có khả sinh tổng hợp IAA cao chủng C7 (44,17 µg/mL), B7 (36,53 µg/mL) B9 (40,43 µg/mL) Chín chủng phân lập từ rễ đước có khả sinh IAA với hàm lượng khoảng từ 14 đến 38 µg/mL có chủng DM10 cho hàm lượng IAA cao (38,78 µg/mL) Các chủng có khả sinh IAA phân lập từ mẫu đất quần đảo Trường Sa, với hàm lượng khoảng từ 11 đến 38 µg/mL, số chủng có khả sinh IAA cao STĐ2.1.3 35,54 µg/mL , STT1.1.2 35,71 µg/mL , D1.2.2 (38,71 µg/mL), D3.2.3 (32,33 µg/mL), NY4.2.3 (30,17 µg/mL), NY4.3.1(33,54 µg/mL) STT3.2.3 (28,50 µg/mL Bẩy chủng sinh IAA từ rễ lúa có hàm lượng khoảng từ 23 đến 46 µg/mL, chủng RL5, RL6 RL7 có hàm lượng IAA cao 44,83; 35,95 46,50 µg/mL Từ 65 chủng sinh IAA này, luận án tiếp tục sàng lọc khả sinh ACC deaminase, phân giải phosphate, cố định nitơ phân huỷ cellulose 3.1.2 Sàng lọc chủng vi khuẩn sinh ACC deaminase Trong số 39 chủng phân lập từ đất Trường Sa có chủng sinh ACC deaminase với chủng STT1.1.2, STT3.2.3 NY4.3.1 có hoạt tính cao 128,70; 38,45 40,37 nmol α-ketobutyrate/mg/h Có 5/9 chủng phân lập từ rễ đước có khả sinh ACC deaminase, hai chủng có hoạt tính DM10 (133,80 nmol α-ketobutyrate/mg/h) DM20 65,45 nmol α-ketobutyrate/mg/h ) Có 4/7 chủng từ rễ lúa có khả sinh ACC deaminase, chủng RL5, RL6 RL7 có hoạt tính cao 44,83; 35,95 45,40 nmol αketobutyrate/mg/h Như vậy, kết thúc q trình sàng lọc chủng có khả sinh ACC deaminase lựa chọn chủng gồm DM10, RL5, RL6, RL7, STT 1.1.2 NY 4.3.1 có hoạt độ ACC deaminase cao, chủng có khả sinh IAA cao 3.1.3 Sàng lọc chủng vi khuẩn có hoạt tính cố định nit Kết sàng lọc chủng cố định nitơ cho thấy có 25/65 chủng có khả cố định nitơ 22 chủng phân lập từ đất quần đảo Trường Sa chủng nội sinh rễ lúa Chủng sinh phân lập đất nước biển chủng nội sinh rễ đước khơng có khả cố định nitơ Ba chủng nội sinh từ rễ lúa RL9, RL10 RL18 có khả cố định nitơ với hàm lượng amoni 17,65, 12,63 15,32 mg/L Các chủng phân lập từ đất quần đảo Trường Sa có khả tổng hợp nitơ tương đối cao với hàm lượng amoni khoảng từ 5,78 đến 19,11 mg/L Trong đó, chủng STT2.6.2 cho hàm lượng amoni cao 19,11 mg/L Kết sàng lọc khả cố định nitơ cho thấy tất chủng có khả cố định đạm khơng có khả sinh ACC deaminase Các chủng có khả sinh ACC deaminase IAA cao DM10, RL5, RL6, RL7, STT 1.1.2 NY 4.3.1 khơng có khả cố định nitơ 3.1.4 Sàng lọc chủng vi khuẩn hoà tan phosphate Kết sàng lọc 29/65 có khả mọc cho vịng phân giải CaCO3 mơi trường NBRIP agar Mười tám chủng phân lập từ đất Trường Sa có khả phân giải phosphate với hàm lượng PO43trong khoảng từ 65 đến 342 mg/L, đặc biệt có chủng có hàm lượng PO43- giải phóng cao STT1.1.2 191,16 mg/L , STĐ2.1.3 (287,69 mg/L), STT3.5.2 (309,37 mg/L), D3.2.3 (342,06 mg/L), D1.2.2 (375,39 mg/L) NY4.3.1 (286,45 mg/L) Sáu chủng phân lập từ rễ đước PO43- khoảng từ 147 đến 338 mg/L, có chủng DM10 cho hàm lượng PO43- cao 338,71 mg/L Năm chủng phân giải phosphate từ rễ lúa có hàm lượng PO43- khoảng từ 116 đến 312 mg/L, chủng RL5, RL6 RL7 cho hàm lượng PO43cao 304,53; 201,14 312,64 mg/L 3.1.5 Sàng lọc chủng vi khuẩn phân giải cellulose Kết 20/65 chủng có khả sinh trưởng tạo vòng phân giải CMC trường CMC agar Mười lăm chủng phân lập từ đất Trường Sa có hoạt độ cellulase khoảng từ đến U/ml, chủng STĐ2.1.3 có hoạt độ cellulase cao 9,25 U/ml Năm chủng 10 Cây phát sinh chủng loại chủng vi khuẩn chọn lọc 3.3 Nghiên cứu yếu tố ảnh h ởng đến sinh tr ởng tổng hợp IAA số chủng vi khuẩn chọn lọc 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ p đến khả n ng sinh trưởng chủng vi khuẩn chọn lọc Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng phát triển chủng C7 DM10 30-34 oC, chủng RL7, STT1.1.2 RL5 34 oC, chủng D1.2.2 34-37 oC pH thích hợp cho sinh trưởng phát triển chủng RL7, D1.2.2, STT1.1.2 DM10 7, chủng RL5 6,57,5, chủng C7 7,5 3.3.2 Ảnh hưởng nguồn nit đến khả n ng sinh trưởng tổng hợp IAA chủng vi khuẩn chọn lọc Cao nấm men chọn làm nguồn nitơ để tiến hành thí nghiệm 3.3.4 Ảnh hưởng L-tr tophan đến đến khả n ng sinh tổng hợp IAA chủng vi khuẩn chọn lọc 11 Hàm lượng tryptophan thích hợp lựa chọn đế làm thí nghiệm cho chủng C7, RL7, STT1.1.2, D1.2.2 RL5 g/L, chủng DM10 g/L 3.3.5 Ảnh hưởng nguồn carbon đến khả n ng sinh trưởng tổng hợp IAA chủng vi khuẩn chọn lọc Nguồn carbon thích hợp làm môi trường sinh IAA chủng RL5, RL7, D1.2.2 STT1.1.2 glucose, chủng DM10 sucrose 3.3.6 Ảnh hưởng nồng độ Na l đến khả n ng sinh trưởng sinh tổng hợp IAA chủng vi khuẩn chọn lọc Chủng C7 (Hình 3.12 a): Chủng C7 có sinh trưởng tăng dần nồng độ NaCl tăng từ đến 5%, nồng độ NaCl tối ưu 4% sinh trưởng giảm dần nồng độ mối tăng từ 6% đến 20% Không sinh trưởng nồng độ NaCl 0% lớn 20% Hàm lượng IAA cao 192,17±1,14 µg/mL 1% NaCl, giảm dần tăng nồng độ NaCl không sinh IAA nồng độ NaCl lớn 15% Chủng DM10 (Hình 3.12 b): Nồng độ NaCl có ảnh hưởng lớn đến khả sinh IAA chủng DM10 Lượng IAA sinh tỷ lệ nghịch với nồng độ muối Chủng DM10 sinh trưởng phát triển tăng dần nồng độ NaCl tăng từ đến 12,5% sau giảm dần Mặc dù chủng DM10 sinh trưởng cao nồng độ muối 12,5% lượng IAA (318,18±3,14 µg/mL) cao khơng có mặt NaCl Tuy nhiên nồng độ muối cao (15%) khả sinh IAA chủng DM10 cao (48,07%) Chủng RL7 (Hình 3.12 c): Sự sinh trưởng tối ưu nồng độ muối từ đến 1%, giảm dần nồng độ muối tăng từ đến 10%, không sinh trưởng nồng độ NaCl lớn 11% Hàm lượng IAA sinh cao nồng độ muối 1% 139,22±3,10 135,81±1,05 12 µg/mL Khi nồng độ muối lớn 5% chủng RL7 khả sinh IAA Chủng RL5 (Hình 3.12 d): Ảnh hưởng muối lên sinh trưởng tổng hợp IAA chủng RL5 tương tự chủng RL7 Sự sinh trưởng tối ưu nồng độ muối từ đến 1%, giảm dần nồng độ muối tăng từ đến 10%, không sinh trưởng nồng độ NaCl lớn 11% Hàm lượng IAA sinh cao nồng độ muối 1% 124,21±2,40 120,1±1,70 µg/mL Khi nồng độ muối lớn 5% chủng RL5 khơng có khả sinh IAA Chủng D1.2.2 (Hình 3.12 e): Ảnh hưởng muối lên sinh trưởng tổng hợp IAA chủng D1.2.2 tương tự chủng RL7 RL5 Sự sinh trưởng tối ưu nồng độ NaCl từ đến 1%, sau giảm dần nồng độ muối tăng từ đến 10%, không sinh trưởng nồng độ NaCl lớn 10% Hàm lượng IAA sinh cao nồng độ muối 1% 110,31±1,12 109,20±2,30 µg/mL Chủng STT1.1.2 (Hình 3.12 f): Sự sinh trưởng tăng dần nồng độ muối tăng từ đến 4%, thích hợp từ đến 3%, sau giảm dần nồng độ muối tăng đến 10%, không sinh trưởng nồng độ muối lớn 10% Mặc dù, sinh trưởng khơng có NaCl, khả sinh IAA lại cao (121,81±2,70 µg/mL) .4 Đ nh gi khả giả t động stress mặn lúa số chủng vi khuẩn chọn lọc 3.4.1 Lựa chọn nồng độ nuối để gây stress mặn lúa Nồng độ NaCl 200 mM nồng độ trung gian trạng thải khỏe mạnh stress tăng trưởng lựa chọn nồng độ nuối để gây stress mặn 3.4.2 Đánh giá khả n ng làm giảm tác động stress mặn lúa số chủng vi khuẩn chọn lọc 13 B ng 3.9 Ảnh hưởng chủng vi sinh vật chọn lọc lên phát triển lúa bị nhiễm mặn Chủng RL7 DM10 STT1.1.2 RL5 D1.2.2 ĐC Chiều dài thân (cm) Chiều dài rễ (cm) Khối lượng khô (g) 12,76d 11,97c 11,19b 11,51bc 10,94b 9,96a 4,03d 3,76c 3,53b 3,70c 3,46b 3,23 a 0,557 d 0,510c 0,480b 0,503c 0,470b 0,419a Chl a (mg/g) 0,076d 0,072c 0,068bc 0,074c 0,066b 0,058a Chl b (mg/g) 0,038c 0,036c 0,033b 0,035b 0,032a 0,030a Chl tổng(mg/g) 0,114c 0,108b 0,101a 0,109b 0,098a 0,088a (Các chữ t ường hàng gi ng khác biệt không ý ĩ t ng kê vớ ộ tin cậy 95%) Kết thu cho thấy, lúa nhiễm chủng RL7, DM10, STT1.1.2, RL5 D1.2.2 làm tăng chiều dài thân, chiều dài rễ, trọng lượng khô hàm lượng chlorophyll so với mẫu đối chứng Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% Chủng RL7 DM10 có khả hỗ trợ lúa chịu mặn cao lựa chọn để tiến hành đánh giá khả làm giảm tác động stress mặn nghiên cứu biểu gen liên quan đến khả chịu mặn 3.5 Nghiên cứu biểu g n i n quan đến đ p ứng mặn a d ới hỗ trợ chủng RL7 DM10 3.5.1 Ảnh hưởng chủng RL7 DM10 đến sinh trưởng lúa bị nhiễm mặn 3.5.1.1 Ả ưởng chủng RL7 14 B ng 3.11 Ảnh hưởng chủng RL7 đến khả sinh trưởng lúa bị nhiễm mặn Chỉ tiêu C C +NaCl RL7 RL7+ NaCl Thân (cm) 18,40±0,76 Rễ (cm) 5,93±0,22b 5,33±0,31a 7,33±0,34c 7,1±0,24c Khối lượng khô (g) 0,73±0,06b 0,66±0,04a 0,97±0,05c 0,90±0,08d b 15,23±0,42 a 23,26±0,41 c 20,63±0,57d Chlorophyll a (mg/g) 0,082±0,005b 0,071±0,004a 0,096±0,006c 0,089±0,005b Chlorophyll b (mg/g) 0,033±0,006b 0,027±0,004a 0,042±0,004b 0,038±0,003b Chlorophyll (mg/g) 0,099±0,005a 0,138±0,018d 0,128±0,021c 0,115±0,016b (Giá tr trung bình ± SD, chữ biệt k ô ý t ường hàng gi ng khác ĩ t ng kê vớ ộ tin cậy 95%) Cây lúa nhiễm chủng RL7 có chiều dài thân, chiều dài rễ, trọng lượng khô hàm lượng chlorophyll tổng số tăng 26,45%; 29,89 %; 31,08% 19,99% so với đối chứng C Khi bị stress mặn, lúa nhiễm chủng RL7 có chiều dài thân, chiều dài rễ, trọng lượng khô tăng hàm lượng chlorophyll tổng số tăng 27,10%; 30,67%; 31,06% 34,73% so với đối chứng C NaCl Sự khác biệt chiều dài thân, chiều dài rễ, trọng lượng khơ, hàm lượng chlorophyll nghiệm thức có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% 3.5.1.2 Ả ưởng chủng DM10 Cây lúa nhiễm chủng DM10 có chiều dài thân, chiều dài rễ, trọng lượng khô hàm lượng chlorophyll tổng số tăng 16,60%; 21,14%; 21,38% 22,87% so với đối chứng C Khi bị nhiễm mặn, lúa nhiễm chủng DM10 có chiều dài thân, chiều dài rễ, trọng lượng khô tăng hàm lượng chlorophyll tổng số tăng 19,55%; 29,6%; 21,71% 25,73% so với đối chứng C NaCl Sự khác biệt chiều dài thân, chiều dài rễ, trọng lượng khô hàm lượng chlorophyll nghiệm thức có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% 15 B ng 3.12 Ảnh hưởng chủng DM10 đến khả sinh trưởng lúa bị nhiễm mặn Chỉ tiêu C Chiều dài thân (cm) 16,86±0,54b Chiều dài rễ (cm) 5,73±0,37b Khối lượng khô (g) 0,65±0,05b Chlorophyll a (mg/g) 0,058±0,007b Chlorophyll b (mg/g) 0,032±0,005b Chlorophyll (mg/g) 0,083±0,012b (Giá tr trung bình ± SD, chữ biệt k ô ý C +NaCl DM10 DM10 + NaCl 13,83±0,36a 19,67±0,28c 17,15±0,31d 5,06±0,21a 7,06±0,51c 6,56±0,40d 0,55±0,04a 0,85±0,03c 0,71±0,02d 0,048±0,003a 0,070±0,002c 0,064±0,005b 0,029±0,003a 0,040±0,004b 0,035±0,002b 0,074±0,008a 0,110±0,013d 0,100±0,017c t ường hàng gi ng khác ĩ t ng kê vớ ộ tin cậy 95%) 3.5.2 Nghiên cứu biểu gen liên quan đến đáp ứng mặn c lúa tác động chủng RL7 DM10 3.5.2.1 Sự biểu củ t ê qu ế ứng mặn lúa ộng chủng RL7 Sự biểu gen bao gồm SOS1, NHX1, MYC2, PR1, NADPMe2, CAT SOD bốn nghiệm thức xác định phương pháp RT-PCR Kết thể hình 3.27 Nhiễm mặn làm tăng cường biểu gen MYC2, NHX1, NADPMe2, SOS1, SOD, PR1 CAT 1,34; 1,66;1,89; 2,16; 2,23; 2,57; 3,07 lần so với đối chứng C Ở điều kiện không bị nhiễm mặn, chủng RL7 không làm thay đổi biểu gen so với đối chứng C Khi bị nhiễm mặn, chủng RL7 làm tăng cường biểu gen MYC2, SOD, NADP-Me2, SOS1, PR1, CAT NHX1 1,24; 1,29; 1,31; 1,35; 1,38; 1,46; 1,53; 1,55 1,59 lần so với mẫu 16 (C+NaCl) Sự khác biệt mức độ biểu cac gen nghiệm thức có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% Hình 3.22 Sự biểu gen liên quan đến stress mặn hỗ trợ chủng RL7 3.5.2.2 Sự biểu củ ê qu ế ứng mặn lúa t ộng chủng DM10 Với chủng DM10, gen đánh giá biểu gồm MYC2, CAT, NADPMe2, SOD PR1, kết thể hình 3.28 c Hình 3.23 Sự biểu gen liên quan đến stress mặn hỗ trợ chủng DM10 17 Kết cho thấy sress mặn làm tăng cường biểu gen MYC2, CAT, NADPMe2, SOD PR1 từ lần 1à 1,45; 1,82; 2,18; 2,42; 2,44 2,57 lần so với đối chứng C Ở điều kiện không bị stress mặn, chủng DM10 làm tăng biểu gen PR1 1,24 lần , không làm thay đổi biểu gen lại so với đối chứng C Trong môi trường nhiễm mặn, chủng DM10 làm tăng cường biểu gen MYC2, SOD,, NADPMe2, CAT PR1 1,19;1,25; 1,38; 1,46; 1,47; 1,50 1,51 lần so với mẫu (C+NaCl) Sự khác biệt mức độ biểu cac gen nghiệm thức có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% Qua kết nghiên cứu trên, chế làm tăng khả chịu mặn lúa qua trung gian chủng RL7 DM10 tóm tắt Hình 2.24 Hình 3.24 Tóm tắt số đường làm tăng khả chịu mặn lúa với hỗ trợ chủng RL7 DM10 Cây lúa chịu mặn thơng qua hai chế cân ion nội môi cân áp suất thẩm thấu Khi bị nhiễm mặn gen liên quan đến hai đường tăng cường biểu Nhiễm chủng 18 RL7 DM10 làm tăng cường biểu gen liên quan đến hai chế giúp lúa chống chịu với mặn Các gen MYCs đóng vai trị quan trọng việc phản ứng với stress phi sinh học sinh học Ở lúa, gia tăng biểu gen MYC2, C v C mơi trường có nồng độ muối cao ghi nhận [180] Các nghiên cứu phiên mã sinh hóa lồi Arabidopsis cho thấy MYC2 điều hịa âm q trình sinh tổng hợp proline Proline cần thiết để khả chịu đựng stress mặn, nhiên, tích tụ mức gây độc cho Gen MYC2 liên quan đến đường truyền tín hiệu axit jasmonic- loại hormon giúp điều hòa loạt trình thực vật, từ tăng trưởng quang hợp đến phát triển sinh sản [181] Khi bị stress mặn, nhiễm chủng RL7 DM10 làm tăng cường biểu gen MYC2 hỗ trợ lúa chịu stress mặn Một số loài vi sinh vật nội sinh ngoại sinh làm tăng cường biểu gen pathogenesis-related protein (PR1) dẫn đến làm tăng khả miễn dịch đặc biệt khả kháng nấm bệnh) [182], bị stress mặn nhiễm chủng RL7 DM10 làm tăng cường biểu gen PR1 2,2 2,75 lần so với đối chứng tương ứng Điều cho thấy vai trò chủng vi sinh nội sinh RL7 DM10 việc làm giảm tác động stress mặn Những kết nghiên cứu biển đổi biểu gen MYC2 PR1 luận án minh chứng vai trò MYC2 PR1 điều kiện stress mặn Stress mặn gây loạt chất oxi hoá ROS , cụ thể H2O2, O OH- làm phá huỷ DNA, RNA protein Các hợp chất ROS 2- gây phá hủy chất diệp lục làm gián đoạn hoạt động mơ phân sinh rễ Các enzyme chống oxy hóa superoxide dismutase, catalase ascorbate peroxidase, peroxidase, glutathione reductase