Nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam.

Nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam.Nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam.Nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam.Nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam.Nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam.Nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam.Nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam.Nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam.Nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam.Nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam.Nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam.Nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam.Nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam.Nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam.

Đặc điểm chung vikhuẩnacetic 4

Vi khuẩn acetic bao gồm 19 chi và 101 loài, là các vi khuẩn hiếu khí Gram âm, không sinh bào tử, thường được biết đến với vai trò ứng dụng trong lên men sản xuất giấm Tế bào vi khuẩn acetic có dạng hình que hoặc elip, với kích thước khoảng 0,4-1,2 µm x 0,8-4,0 µm Các tế bào này có thể đứng riêng lẻ, kết nối hoặc kết chuỗi và có khả năng di động nhờ hệ thống tiên mao ở cực hoặc chu mao.

Hầu hết vi khuẩn acetic có khoảng pH sinh trưởng tối ưu từ 5 đến 6,5 và sinh trưởng được trong khoảng từ pH3 đến pH4 [3, 4].

Vi khuẩn acetic là những vi khuẩn hiếu khí sử dụng oxygen làm chất nhận điện tử cuối cùng, có hoạt tính catalase dương và oxidase âm Chúng có khả năng oxy hóa các nhóm đường và chức alcohol thành acid hữu cơ, aldehyde và ketone Khi oxy hóa ethanol, vi khuẩn acetic chuyển đổi nguồn cơ chất này thành acid acetic hoặc acetaldehyde, do đó thường được gọi là vi khuẩn acetic Đối với nguồn cơ chất là glucose, vi khuẩn này thường oxy hóa tạo thành các dạng acid gluconic khác nhau.

Vi khuẩn acetic thường xuất hiện trong tự nhiên tại các nguồn dinh dưỡng giàu carbohydrate như ethanol và đường Chúng thường sống trong hoa, quả, sáp dừa, mật ong, và các thực phẩm, đồ uống lên men như nước trái cây, rượu, giấm, bia, ca cao, rau củ muối chua, cũng như một số sản phẩm từ sữa và thạch dừa Gần đây, vi khuẩn acetic cũng đã được phát hiện trong đất và trong mô của một số loại cây trồng, cũng như trong các mẫu bệnh phẩm.

[7] và trong hệ tiêu hóa của một số loài côn trùng [8,9].

Sơ lược lịch sử hình thành nhóm vikhuẩnacetic 4

Vi khuẩn acetic, được biết đến với tên gọi "mẹ của giấm", đã có lịch sử nghiên cứu lâu dài Louis Pasteur đã mô tả chúng như là nguyên nhân chính trong quá trình lên men tạo ra acid acetic Năm 1898, Beijerinck lần đầu tiên đặt tên cho nhóm vi khuẩn này là Acetobacter, và chi vi khuẩn acetic đầu tiên Acetobacter Beijerinck 1898 được xác định với loài chuẩn.

Vào năm 1935, vi khuẩn acetic được chia thành hai chi là Acetobacter và Gluconobacter dựa trên khả năng oxy hóa ethanol và glucose Chi Acetobacter bao gồm các vi khuẩn di động bằng lông mao, có khả năng oxy hóa mạnh ethanol và oxy hóa hoàn toàn các muối acetate và lactate, nhưng không oxy hóa glucose Trong khi đó, chi Gluconobacter có đặc điểm di động bằng lông mao ở cực, oxy hóa mạnh glucose, nhưng không oxy hóa hoặc oxy hóa yếu ethanol và hoàn toàn không oxy hóa acetate cũng như lactate Mặc dù thông tin về Gluconobacter được công bố bằng tiếng Nhật, nhưng phải đến hơn 20 năm sau, chi này mới được xác nhận với loài chuẩn là G oxydans (Henneberg 1897) De Ley 1961.

Năm 1980, họAcetobacteraceaeđược đặt cho các vi khuẩn acetic và gồm hai chi làAcetobactervàGluconobacter[11] Ở thời điểm này, chiAcetobactergồm có 3 loàiA aceti, A pasteurianusvàA peroxydans ChiGluconobacterchỉ có duy nhất loài

Năm1989,cácvikhuẩnAcetobactercóđặctínhđặctrưngvềkhảnăngđồnghóa methanolđượcđềxuấthìnhthànhmộtchimớivớitênAcidomonas[12].Tuynhiên,chiAcidomonas Urakami et al 1989 chỉ được công nhận từ năm 1992 với loài chuẩnAc.methanolicusUlig et al 1986[13].

Năm 1984, chi Acetobacter được đề xuất có thêm chi phụ Gluconoacetobacter, phân biệt với các chủng Acetobacter nhờ thành phần ubiquinone chính là UQ-10, trong khi các chủng Acetobacter có UQ-9 Chi phụ này gồm hai loài là Gluconoacetobacter liquefaciens và Gluconoacetobacter xylinus Qua phân tích phát sinh loài một phần vùng trình tự 16S rDNA, chi phụ Gluconoacetobacter đã được xác định là một chi riêng biệt, được đặt tên là Gluconacetobacter theo Yamada et al 1998, với loài chuẩn là Ga liquefaciens (Asai 1935) Yamada et al 1998.

Từ năm 1999, phân tích phát sinh loài dựa trên trình tự 16S rDNA đã chỉ ra rằng các loài trong chi Gluconacetobacter tạo thành hai nhánh riêng biệt, bao gồm nhánh chứa Ga liquefaciens và nhánh chứa Ga xylinus Đến năm 2006, nhóm vi khuẩn này được xác định có những đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và sinh thái riêng biệt, cùng với vị trí phát sinh loài tách biệt Nhóm Ga liquefaciens có khả năng di động bằng lông mao, sinh 2,5-diketo-gluconate, ɤ-pyrone và tạo sắc tố nâu, thường xuất hiện trong các môi trường sinh thái liên quan đến thực vật như trái cây, hoa, cây mía và cây cà phê Ngược lại, nhóm Ga xylinus không có lông mao, không di động, không sinh 2,5-diketo-gluconate, không sinh ɤ-pyrone và không tạo sắc tố trong môi trường Các vi khuẩn thuộc nhóm này thường được phân lập từ các quá trình lên men acetic thực phẩm hay thứ cuống Nhóm thứ hai được phân loại vào chi mới Komagataeibacter với loài chuẩn là K xylinus.

Từ năm 2000, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện về đa dạng vi khuẩn acetic, bao gồm phân loại, định danh và đặt tên mới Các loài mới đã xuất hiện cùng với nhiều chi mới được xác định, như chi Asaia (Yamada et al 2000), chi Kozakia (Lisdiyanti et al 2002), chi Swaminathania (Loganathan và Nair 2004), chi Saccharibacter (Jojima et al 2004), chi Neoasaia (Yukphan et al 2006), chi Granulibacter (Greenberg et al 2006), chi Tanticharoenia (Yukphan et al 2008), chi Ameyamaea (Yukphan et al 2010), chi Neokomagataea (Yukphan et al 2011) và chi Endobacter (Ramírez-Bahena et al 2013).

Các chi và loài vikhuẩnacetic 6

Hiệnnay,vikhuẩnaceticthuộchọAcetobacteraceaeGillisvàDeLey1980[10], phânlớpAlphaproteobacteriaStackebrandtetal.1988[18].Acetobacteraceaelàmộthọ lớn gồm các vi khuẩn acetic và các vi khuẩn ưa acid[4].

Nhóm vi khuẩn acetic bao gồm các vi khuẩn chuyển hóa ethanol thành acid acetic, có nhiều điểm tương đồng về sinh lý và biến dưỡng Phân tích di truyền cho thấy vi khuẩn họ Acetobacteraceae thuộc cùng một nhánh lớn với giá trị bootstrap trên 95%, cho thấy sự ổn định trong phân loại học Trên cây phát sinh loài, các chi và loài thuộc nhóm vi khuẩn ưa acid có hình ảnh vị trí phát sinh loài gần nhánh (paraphyletic), trong khi đó, vi khuẩn acetic bao gồm các chủng thuộc chi Granulibacter và Endobacter.

Nguyenibacter, Gluconacetobacter, Komagataeibacter, Acidomonas, Neoasaia là các loài vi khuẩn có vị trí phát sinh đồng nhánh (homophyletic) với mức độ tin cậy về hình ảnh phân nhánh trên 95% Kết quả phân tích hình ảnh phân nhánh cho thấy sự tương đồng giữa các cây phát sinh loài được xây dựng theo phương pháp NJ và ML Điều này chứng tỏ vi khuẩn acetic là một nhóm lớn có tính đồng nhất cả về kiểu hình lẫn kiểu gen.

Hình 1.1 Cây phát sinh loài thể hiện mối quan hệ của các chi vi khuẩn họ

Cây phát sinh được xây dựng dựa trên trình tự 16S rDNA dài 1.219 bp cho 114 chủng thuộc họ Acetobacteraceae và Rhodospirillaceae Các vị trí phân nhánh có vòng tròn tô đậm thể hiện giá trị bootstrap trên 95% cho cả hai phương pháp NJ và ML Vòng tròn không tô thể hiện giá trị bootstrap trên 85% ở cả hai phương pháp Tỉ lệ thay thế được biểu thị bằng thanh ngang với giá trị 0,01 cho mỗi vị trí base.

Trong 19 chi vi khuẩn acetic, có 12 chi chỉ mới phát hiện được duy nhất 1 loài bao gồmAcidomonas, Kozakia, Swaminathania, Saccharibacter, Neoasaia,Granulibacter, Amayamaea, Endobacter, Nguyenibacter, Swingsia,

BombellavàCommensalibacter[19, 20] Ngoài ra, hai chiTanticharoeniavàNeokomagataeahiện chỉ gồm 2 loài ở mỗi chi Các khảo sát phân lập thường ít thu thập được vi khuẩn thuộc

14chinàynênvikhuẩnthuộccácchinàyđượcxemlàhiếmgặp.Cácchivikhuẩnacetic đều có thể phân biệt bởi một vài đặc điểm đặc trưng [4,19].

1.3.1 Các chi vi khuẩn acetic ítgặp

Các vi khuẩn acetic thường có nguồn phân lập khá đặc trưng Chẳng hạn, Ac methanolica được thu nhận từ bùn thải và mẻ lên men nấm men sử dụng methanol Vi khuẩn Swaminathania chịu mặn được phân lập từ cây lúa dại vùng ngập mặn, trong khi Saccharibacter được phân lập từ phấn hoa dưới áp suất thẩm thấu Granulibacter được tìm thấy từ khối u bệnh nhân, và Nguyenibacter phân lập từ khu vực canh tác lúa Cuối cùng, Bombella và Commensalibacter được phân lập từ ruột côn trùng.

Chi Acidomonas, được giới thiệu bởi Urakami, Tamaoka, Suzuki và Komagata vào năm 1989, đã được hiệu đính bởi Yamashita, Uchimura và Komagata vào năm 2000 Chi này thuộc nhóm vi khuẩn acetic và liên quan đến các chủng Acetobacter methanolicus được Uhlig et al ghi nhận vào năm 1986 Các chủng Acidomonas cũng được xem là vi khuẩn thuộc nhóm methyl hóa tùy ý Mặc dù được đề xuất từ năm 1989, tên chi Acidomonas chỉ được chấp nhận sau đó.

Năm 2000, các nhà nghiên cứu hệ thống học vi khuẩn acetic đã ứng dụng phương pháp phân tích phát sinh loài trình tự 16S rDNA để phân loại và nhận diện các chủng vi khuẩn có khả năng oxy hóa methanol Kết quả cho thấy các chủng này có vị trí phát sinh loài khác biệt so với các chi đã được xác định trước đó Hiện tại, Acidomonas được công nhận là chi đơn loài, với chủng chuẩn là Ac methanolica MB 58 T (= DSM).

Chi Kozakia, được mô tả bởi Lisdiyanti, Kawasaki, Widyastuti, Saono, Seki, Yamada, Uchimura và Komagata vào năm 2002, có vị trí phát sinh loài gần gũi nhất với hai chi Asai và Neoasa Tuy nhiên, chi này khác biệt về khả năng oxy hóa ethanol để tạo ra acid acetic và khả năng tạo ra lượng lớn chất nhầy giống như levulin từ sucrose Kozakia được xác định là chi đơn loài.

Chủng chuẩn làK baliensisYo-3 T (= DSM 14400 T = JCM 11301 T = NBRC 16664 T = NRIC

Chi Swaminathania, được mô tả bởi Loganathan và Nair vào năm 2004, bao gồm các chủng được phân lập từ đất xung quanh rễ, rễ và thân cây lúa dại gần vùng ngập mặn ở Ấn Độ Các chủng này phát triển trong môi trường sàng lọc LGI bán rắn với NaCl 250 nM ở pH 5,5 Swaminathania có vị trí phát sinh nằm trong nhánh tự 16SrDNA gần Asai, nhưng lại có những đặc điểm sinh trưởng khác biệt trong môi trường chứa acid acetic 0,35% (v/v), NaCl 3% (w/v) và KNO3 1% (w/v) Chi này gồm một loài duy nhất, với chủng chuẩn là S salitolerans PA51 T (LMG 21291 T = MTCC 3852 T).

Chi Saccharibacter, được mô tả bởi các nhà nghiên cứu Jojima, Mihara, Suzuki, Yokozeki, Yamanaka và Fudo vào năm 2004, bao gồm các chủng vi khuẩn được phân lập từ phấn hoa trồng tại Nhật Bản Những chủng này có vị trí phát sinh loài khác biệt so với các chi vi khuẩn acetic khác Saccharibacter là một loại vi khuẩn ưa áp suất thẩm thấu.

Tế bào của Saccharibacter không phát triển trong môi trường áp suất thông thường với 1% glutamate (w/v), nhưng lại sinh trưởng tốt trong môi trường chứa 7% glutamate (w/v) Về mặt phát sinh loài, chi Saccharibacter có mối quan hệ gần gũi với các chi Bombella, Neokomagataea, Swingsia và Gluconobacter Saccharibacter là chi đơn loài, với chủng chuẩn là Sa floricola S-877 T (= AJ 13480 T = DSM 15669 T = JCM 12116 T).

- Chi NeoasaiaYukphan, Malimas,Potacharoen,Tanasupawat,Tanticharoenvà

Yamada 2006:Vi khuẩn thuộc chiNeoasaiađược phân lập đầu tiên từ hoa của cây họ

Gừng, hay Alpinia purpurata, có mối quan hệ gần gũi với các chi Kozakia, Asaiavà Swaminathania Tuy nhiên, Neoasaiakhác biệt với các chi khác ở khả năng oxy hóa lactate và acetate Neoasai là chi đơn loài với N chiangmaiensis AC28 T (BCC 15763 T = NBRC 101099 T) là chủng chuẩn.

Granulibacter được phân lập từ khối u của bệnh nhân mắc u hạt mãn tính, cho thấy sự khác biệt về loài so với các chi vi khuẩn acetic khác Đặc điểm nổi bật của Granulibacter là khả năng sinh trưởng trong môi trường chứa methanol, với nhiệt độ tối ưu khoảng 35-37°C Chủng chuẩn của loài này là Gr.bethesdensisl, mang mã CGDNIH1 T (cũng được biết đến với mã ATCC BAA-1260 T và DSM 17861 T).

- Chi Tanticharoenia Yukphan, Malimas, Muramatsu, Takahashi, Kaneyasu, Tanasupawat, Nakagawa, Suzuki, Potacharoen và Yamada 2008:Tanticharoeniađược phân lập đầu tiên từ các mẫu đất thu thập ở Sakaerat,

Nakhon Ratchasima, Thái Lan, là nơi phát hiện một nhánh phát sinh loài đặc biệt, thuộc chi Tanticharoenia Chi này có khả năng sinh trưởng trong môi trường chứa 30% glucose (w/v) và không oxy hóa acetate hay lactate Hiện tại, chi Tanticharoenia gồm hai loài, trong đó loài chuẩn là T sakaeratensis, được mô tả bởi Yukphan et al vào năm 2008.

- Chi Ameyamaea Yukphan, Malimas, Muramatsu, Takahashi, Kaneyasu, Potacharoen,Tanasupawat,Nakagawa,Hamana,Tahara,Suzuki,Tanticharoenvà

Các chủng thuộc chi Ameyamaea được phân lập từ hoa của cây họ Gừng Alpinia purpurea tại Chiang Mai, Thái Lan, có mối quan hệ gần gũi với chi Tanticharoenia Điểm khác biệt giữa các chủng này và chi Tanticharoenia là khả năng oxy hóa yếu lactate và không tạo sinh khối trên môi trường thạch chứa glucose 30% (w/v) Ameyamaea là chi đơn loài với chủng chuẩn là Ameyamaea chiangmaiensis AC04 T (BCC 15744 T, NBRC 103196 T).

Chi Neokomagataea, được mô tả bởi Yukphan, Malimas, Muramatsu, Potacharoen, Tanasupawat, Nakagawa, Tanasupawat và Yamada vào năm 2011, bao gồm hai loài được phát hiện từ các mẫu hoa thu thập tại Thái Lan dựa trên mối quan hệ phát sinh loài Các chủng Neokomagataea có vị trí phát sinh loài gần nhất với các chủng Gluconobacter, nhưng không phát triển trong môi trường chứa 0,35% (v/v) acid acetic Loài chuẩn của chi này là Ne thailandica.

Các chi và loài vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởngthực vật 20

Với 19 chi và 101 loài được phát hiện, vi khuẩn acetic có sự hiện diện rộng rãi ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới Đặc điểm đa dạng của vi khuẩn acetic có thể được phân loại dựa trên các ứng dụng tiềm năng, bao gồm vi khuẩn acetic dùng để lên men giấm, tổng hợp cellulose, sản xuất hóa chất, và kích thích sinh trưởng thực vật Từ năm 1980, đã có 10 loài thuộc 5 chi Acetobacter, Gluconacetobacter, Swaminathania, Asaiavà Komagataeibacter được ghi nhận là có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật.

Gluconacetobacter có khuẩn lạc màu từ nâu nhạt đến nâu, khác biệt so với các chi vi khuẩn như Asaia và Neoasaia Tế bào của chúng có hình que, kích thước 0,5-0,9 x 1,2-2,0μm, Gram âm và thường di động nhờ chu mao Hệ thống chu mao giúp tế bào di động chỉ có ở Acetobacter, Asaia, Swaminathania và Nguyenibacter Ngoài hai chi Acetobacter và Komagataeibacter, Gluconacetobacter nổi bật với khả năng oxy hóa mạnh mẽ acetate và lactate, sản phẩm cuối cùng là CO2 và H2O Chúng phát triển tốt trong môi trường chứa glutamate, sinh acid 2,5-di-keto-gluconic và có ubiquinone chủ yếu là UQ-10, tạo nên sự khác biệt rõ rệt với Acetobacter.

14].GluconacetobactervàKomagataeibacterkhác nhau ở đặc điểm tiên mao và khả năng sinh 2,5-di-keto-gluconate từ D-glucose [17] Các loàiGluconacetobactercótỉlệG+CtrongthànhphầnDNAbộgenchiếm58đến65mol%

[4] Trong 10 loàiGluconacetobacter, ba loàiGa diazotrophicus,Ga azotocaptansv à

Ga johannaethuộc nhóm kích thích sinh trưởng thực vật [42].

Bảng 1.7 Đặc điểm phân biệt giữa các chi vi khuẩn acetic [19, 21]

Về phát sinh loài, ba loài Ga diazotrophicus, Ga azotocaptans và Ga johannae có vị trí hoàn toàn tách biệt và khác biệt với bảy loài còn lại trong chi Gluconacetobacter Hai loài Ga azotocaptans và Ga johannae có vị trí phát sinh loài gần nhau và có mối quan hệ gần nhất với chủng chuẩn của loài Ga tumulisoli Trong khi đó, chủng chuẩn của Ga diazotrophicus thuộc một nhánh riêng biệt, gần kề với nhánh lớn gồm các đại diện của các chi Ga liquefaciens và Ga sacchari.

Ga.takamatsuzukensis, Ga tumulicola, Ga aggerisvàGa.asukensis.

1.2.M ố i q u a n h ệ g i ữ a c á c l o à i t r o n g c h iG l u c o n a c e t o b a c t e r v à Komagagateibacterdựa trên vùng trình tự 16S rDNA [55]

Vi khuẩn thuộc loài Ga diazotrophicus có khuẩn lạc màu nâu đậm, tế bào hình que với kích thước khoảng 0,7-0,9 x 1,2-2,0μm và thuộc loại Gram âm Chúng di động bằng lông mao và có khả năng cố định đạm trong điều kiện vi hiếu khí Loài này sinh sắc tố tan màu nâu từ nguồn sucrose và không tạo dihydroxyacetone từ glycerol Ngoài ra, vi khuẩn còn có khả năng sử dụng D-glucose để tạo ra acid 2-keto-gluconic và 2,5-di-keto-gluconic.

Các chủng Ga diazotrophicus có khả năng sử dụng các nguồn carbohydrate như D-sorbitol, D-mannitol và D-xylose, nhưng không thể phát triển với myo-inositol và meso-ribitol Chúng phát triển tối ưu ở nhiệt độ 30°C và pH 5,5 Chủng chuẩn của loài này là Ga diazotrophicus PAl 5 T (ATCC 49037 T, CCUG 37298 T, CIP 103539 T, DSM 5601 T, LMG 7603 T), được phân lập từ rễ mía ở Alagoas, Brazil, với thành phần % G+C là 66,0 mol%.

Vi khuẩn Ga johannae là vi khuẩn Gram âm có hình dạng tế bào hình que, kích thước khoảng 0,5-0,6 x 1,5-1,9μm, có khả năng di động nhờ hệ thống chu mao Chúng có khả năng cố định đạm trong điều kiện vi hiếu khí và tạo ra 2,5-di-keto-gluconic nhưng không tạo được 2-keto-gluconic từ D-glucose Ga johannae có thể sử dụng D-xylose và D-galactose làm nguồn carbohydrate, nhưng không thể sử dụng D-sorbitol, myo-inositol, meso-ribitol và D-mannitol Chúng phát triển trong khoảng pH từ 4 đến 7 và không sinh trưởng trong môi trường có 1% NaCl Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng là 29°C, không thể sinh trưởng ở 37°C Chủng chuẩn của loài này là Ga johannae CFN-Ca55 T, được phân lập từ vùng rễ cây cà phê ở Chiapas, Mexico, với thành phần % G+C là 57,96mol%.

Vikhuẩn Ga azotocaptans là vi khuẩn Gram âm, có hình dạng tế bào hình que với kích thước khoảng 0,5-0,6 x 1,6-2,0 μm Đây là những vi khuẩn hiếu khí, di động nhờ hệ thống mao Chúng có khả năng cố định đạm trong điều kiện vi khí hậu Các chủng Ga johannae có khả năng tạo ra 2,5-di-keto-gluconic nhưng không tạo ra 2-keto-gluconic từ D-glucose Vikhuẩn này có thể sử dụng các nguồn carbohydrate như D-sorbitol, myo-inositol và meso-ribitol, nhưng không thể phát triển khi có D-xylose, D-galactose và D-mannitol Chúng sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 29℃ và pH trong khoảng 4 đến 7, nhưng không phát triển ở nhiệt độ 37℃ và trong môi trường có 1% NaCl Chủng chuẩn của loài này là Ga johannae CFN-Ca54 T (= ATCC).

700988 T = CIP 107161 T = DSM 13594 T ) Chủng này được phân lậptừ vùng rễ cây cà phê trồng ở Chiapas, Mexico [6] Thành phần G+C của chủng chuẩn là 64,01mol% [19].

Các đại diện trong chi Gluconacetobacter, thuộc nhóm kích thích sinh trưởng thực vật, có khả năng thúc đẩy sự phát triển của cây trồng thông qua nhiều cơ chế khác nhau Chúng có thể cố định đạm, sản sinh hormone kích thích sinh trưởng, chuyển hóa khoáng chất thành dạng hòa tan và nâng cao khả năng kháng bệnh cho cây chủ.

Ga diazotrophicus là vi khuẩn đầu tiên trong họ Acetobacteraceae được biết đến với khả năng cố định đạm và kích thích sinh trưởng thực vật, chủ yếu qua đặc tính cố định đạm Hoạt động này được điều hòa bởi hai nhóm gen nif và fix, trong đó gen nifHDK mã hóa cho enzyme nitrogenase Hoạt động cố định đạm của Ga diazotrophicus diễn ra bên trong mô thực vật chủ và vi khuẩn này không chỉ được phân lập từ mía mà còn có mặt ở nhiều loại cây trồng khác như cà phê, kê trân châu và dứa.

Các chủng Ga diazotrophicus được phân lập từ rễ cà rốt, củ cải đỏ, củ dền đỏ và cà phê trồng tại các khu vực nhiệt đới và bán nhiệt đới ở Ấn Độ đã được xác định có hoạt tính nitrogenase Ngoài ra, chủng Ga diazotrophicus cũng được tìm thấy ở cây lúa và có khả năng khuếch đại gen nifH từ chủng phân lập với hai mồi PolF/PolR Bên cạnh Ga diazotrophicus, hai loài Ga johannae và Ga azotocaptans cũng được xác định là vi khuẩn acetic cố định đạm, được phân lập từ môi trường vô đạm LGI và có hoạt tính khử acetylene.

Vi khuẩn thuộc hai loài được nghiên cứu về khả năng cố định đạm và ảnh hưởng tích cực đến cây trồng, đặc biệt là cây cà phê, trong môi trường bán rắn vô đạm LGI Các loài mới này có hoạt tính khử acetylene và được xác định là vi khuẩn acetic cố định đạm Mặc dù chưa có khảo sát cụ thể về khả năng cố định đạm, năm loài Ga tumulicola, Ga asukensis, Ga tumulisoli, Ga takamatsuzukensis và Ga aggeris cũng cho thấy khả năng sinh trưởng trong môi trường vô đạm LGI.

Hình 1.3 Các gen chính trong hệ gennifvàfixởGa diazotrophicus[56]

Hình 1.4 Khuẩn lạc các chủngGa diazotrophicusphân lập từ cà rốt (A), củ cải đỏ (B), củ dền đỏ (C) và cà phê (D) sau 74h nuôi cấy trên môi trường LGI [60]

Khả năng sinh tổng hợp IAA, hormone kích thích tạo rễ ở thực vật, đã được chứng minh ở vi khuẩn Ga diazotrophicus, cho thấy vi khuẩn này không chỉ hỗ trợ trực tiếp cho sự sinh trưởng của thực vật thông qua cơ chế cố định đạm Nghiên cứu của Pedraza et al chỉ ra sự hiện diện của enzyme AAT, tham gia vào quá trình chuyển hóa acid amin tạo hương, ở các chủng Gluconacetobacter như Ga diazotrophicus, Ga johannae và Ga azotocaptans Kết quả cũng cho thấy tất cả các chủng này đều có khả năng tạo IAA trong cả hai điều kiện có và không có L-tryptophan, tiền chất cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp IAA Ngoài ra, hormone gibberellin A1 và A3 cũng được phát hiện trong môi trường nuôi cấy của Ga diazotrophicus Pal5 T chứa 10% sucrose.

Hình 1.5 Vòng tan lân chung quanh khuẩn lạc chủngGa diazotrophicusPAl5 T trên môi trường chứa 5g/l muối lân (a) Ca3(PO4)2, (b) Ca5(PO4)3OH và (c) FePO4[39]

Chủng chuẩn PAl5 T và các chủng Ga.diazotrophicus phân lập từ một số cây trồng có khả năng chuyển hóa lân khó tan thành dạng hòa tan dễ hấp thu cho thực vật.

66] Đặc tính chuyển hóa kẽm khó tan về dạng dễ hấp thu đối với thực vật cũng được ghi nhận ở các chủngGa diazotrophicusPA15 T , R10 và L3 (Hình 1.6)[67].

Hình 1.6 Vòng tan kẽm của các chủngGa diazotrophicusR10, PA15 T và L3trênmôitrườngLGIchứa10g/1glucosebổsung(A)ZnO,(B)ZnCO 3hay (C)Zn3(PO4)2hàm lượng 0,1% (w/v)[67]

Ga diazotrophicus PAl5 T có khả năng tăng cường tính kháng cho thực vật chủ bằng cách sản xuất acid 5-ketogluconic, giúp chuyển hóa ZnO thành dạng hòa tan Zn²⁺ Ion kẽm hòa tan này có tác dụng tiêu diệt và giảm số lượng tuyến trùng rễ Meloidogyne incognita ở cây cà chua trồng trong nhà kính Khi kết hợp Ga diazotrophicus PAl5 T với các chủng Ralstonia pseudosolanacearum trong quá trình nảy mầm của Arabidopsis thaliana, vi khuẩn này đã kích thích tính kháng của cây đối với các chủng gây bệnh Một số chủng Ga diazotrophicus cho thấy khả năng kháng lại các vi sinh vật gây bệnh như nấm Colletotrichum falcatum và vi khuẩn Xanthomonas albilineans Bên cạnh đó, Ga diazotrophicus tiết lysozyme, hoạt động như một chất kháng khuẩn, ức chế Xanthomonas albilineans tạo ra hợp chất xanthan, giúp vi khuẩn gây bệnh dễ dàng xâm nhập vào mô cây mía khi cả hai cùng cạnh tranh để xâm nhiễm.

Các chủng Swaminathania được phân lập từ đất xung quanh rễ và thân cây lúa dại kháng mặn ở Ấn Độ, trong môi trường sàng lọc LGI bán rắn bổ sung NaCl 250nM ở pH 5,5 Các chủng này được xác định là loài mới, với khả năng sinh trưởng trong môi trường chứa acid acetic 0,35% (v/v), NaCl 3% (w/v) và KNO3 1% (w/v) Tế bào Swaminathania có hình dạng que thẳng, kích thước khoảng 0,7-0,9 x 1,9-3,1μm, thuộc nhóm Gram âm và di động Khuẩn lạc Swaminathania trên môi trường thạch LGI ban đầu có màu vàng, sau chuyển sang cam đậm, với bề mặt nhẵn và nhô cao Vi khuẩn này có khả năng sinh acid acetic từ ethanol, phát triển tốt trong môi trường trung tính và acid hóa, oxy hóa yếu acetate hay lactate thành CO2 và H2O Chúng cũng phát triển trên môi trường thạch mannitol và glutamate, không sử dụng methanol, và sinh sản tốt trong môi trường chứa glucose và CaCO3, có khả năng cố định đạm và chuyển hóa lân, sinh trưởng tốt trong môi trường chứa 0,35% acid acetic (v/v), 3% NaCl (w/v) và nguồn nitrogen trong môi trường chứa 1% KNO3 (w/v).

C18:1 ω7c/ω9t/ω12t,thànhphầnubiquinonechínhlàUQ-10vàthànhphần%G+Cchiếmkhoảng 57,6 đến 59,9mol%[4].

ChủngchuẩnS.salitoleransPA51 T vàchủngthamkhảoPA12đềubiểuhiệnhoạt tínhkhửacetylenevàchokếtquảkhuếchđạiđượcgennifD.Haichủngnàycũngtạo vòngtanlântrênmôitrườngPikovskaya[73].Vớicáckhảnăngcốđịnhđạmvàchuyển hóa muối lân về dạng hòa tan,Swaminathaniađược xác định là vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật [39,42].

Các phương pháp phân loại vikhuẩnacetic 33

Phân loại vi khuẩn là nghiên cứu nhằm làm rõ mối quan hệ nguồn gốc, xác định tên vi sinh vật và tạo ra cái nhìn tổng quát về mối quan hệ giữa các loại vi khuẩn.

Quá trình hình thành và phát triển của nhóm vi khuẩn acetic đã trải qua hơn 200 năm với nhiều thay đổi trong phân loại, dần ổn định nhờ vào các ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật trong phân tích Hiện nay, việc phân loại vi khuẩn acetic tuân theo các quy luật phân loại học vi sinh vật và được thực hiện theo cách đa chiều Phân loại này dựa vào đặc điểm kiểu gen và kiểu hình, từ kết quả khảo sát các đặc điểm thông qua các phương pháp nghiên cứu cổ điển và hiện đại.

Để phân loại vi khuẩn acetic, nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và áp dụng nhằm xác định và ghi nhận thông tin mô tả chính xác về đơn vị phát sinh loài Các phương pháp này được chia thành ba nhóm kỹ thuật phân tích: nhóm kỹ thuật phân tích đặc điểm kiểu hình cổ điển, nhóm kỹ thuật phân tích đặc điểm hóa học và nhóm kỹ thuật phân tích đặc điểm liên quan đến DNA Việc kết nối thông tin thu thập từ các kết quả nghiên cứu phân loại đa chiều là khá phức tạp, nhằm đạt được kết quả phân loại và định danh ổn định cho vi khuẩn nói chung và vi khuẩn acetic nói riêng Trong số nhiều phương pháp và kỹ thuật có thể ứng dụng, một số cần thiết cho nhóm phân loại này nhưng không phù hợp cho nhóm phân loại khác Do đó, các kỹ thuật phân loại cần được lựa chọn phù hợp với từng nhóm và cấp độ phân loại cụ thể theo yêu cầu và mục đích nghiên cứu.

1.4.1 Phân loại dựa vào các đặc điểm kiểuhình

Các phương pháp phân tích đặc điểm kiểu hình là công cụ quan trọng trong phân loại vi khuẩn, giúp nhận diện các đơn vị phân loại từ cấp độ loài đến cấp độ họ dựa trên tính đa dạng về hình thái, sinh thái, sinh lý và sinh hóa Để thu nhận chủng vi khuẩn acetic, thiết kế thí nghiệm cần dựa vào các đặc điểm kiểu hình, trong đó khả năng sinh trưởng ở pH 3,5 và sinh acid làm tan CaCO3 là những yếu tố chính để sàng lọc vi khuẩn thuộc họ Acetobacteraceae Quá trình phân lập vi khuẩn acetic thường cần giai đoạn tăng sinh, với môi trường có pH 3,5 chứa glucose, ethanol, peptone, cao nấm men và cycloheximide Nhiều đơn vị phân loại mới trong nhóm vi khuẩn acetic đã được phát hiện khi thay đổi thành phần môi trường nuôi cấy Việc sử dụng nguồn carbon khác nhau như sorbitol đã dẫn đến việc thu nhận loài mới As bogorensis, trong khi loài As siamensis được phát hiện từ các mẫu hoa với môi trường tăng sinh chứa sorbitol và ducitol Một số đơn vị phân loại mới kích thích sinh trưởng thực vật cũng được thu nhận từ môi trường LGI với các giá trị pH khác nhau.

[73] hayNg vanlangensistừ môi trường có pH3,5 [85]. Ởcấpđộchi,vikhuẩnaceticcóthểđượcphânloạivàđịnhdanhdễdàngcácđặc điểmk i ể u h ì n h c ổ đ i ể n [ 1 9 ] Y a m a d a v à Y u k p h a n n h ậ n đ ị n h c á c c h i đ a l o à i g ồ m

Các chi vi khuẩn như Acetobacter, Gluconobacter, Gluconacetobacter và Komagataeibacter có vai trò quan trọng trong sinh thái học và phân loại học Để xác định các chủng mới, cần thực hiện hai thử nghiệm chính: thử nghiệm oxy hóa acetate và lactate, cùng với thử nghiệm sinh acid acetic từ ethanol Acetobacter có khả năng oxy hóa mạnh mẽ, dẫn đến việc sản xuất nhiều acid acetic và làm giảm độ pH của môi trường, chuyển màu sang xanh dương đậm Ngược lại, Gluconobacter không oxy hóa được acetate và lactate, cho kết quả màu vàng Gluconacetobacter và Komagataeibacter có khả năng oxy hóa yếu hơn, do đó sự thay đổi màu sắc trong môi trường nuôi cấy không rõ rệt Hai chi này có thể phân biệt qua khả năng di động và khả năng sinh sắc tố nâu trong môi trường chứa glucose, men và CaCO3, trong khi Gluconacetobacter thường tạo sắc tố nâu và có tính di động, còn Komagataeibacter thì không.

Chi Asai được phân biệt với các chi Acetobacter, Gluconobacter, Gluconacetobacter và Komagataeibacter nhờ vào khả năng sinh acid acetic từ ethanol, trong khi vi khuẩn thuộc chi Asai hầu như không tạo ra hoặc chỉ tạo ra một lượng rất ít acid từ nguồn cơ chất này Trong thử nghiệm oxy hóa acetate và lactate, sự chuyển màu môi trường nuôi cấy sang xanh dương do hoạt động của vi khuẩn Asai diễn ra rất chậm Vi khuẩn Asai cũng thường được phân biệt trong quá trình phân lập và làm thuần do màu sắc khuẩn lạ, thường tạo màu hồng trên môi trường GECA Hai thử nghiệm xác định đặc tính sinh acid acetic từ ethanol và oxy hóa acetate và lactate rất hữu dụng khi phân loại và định danh đến cấp độ chi một số lượng lớn chủng phân lập vi khuẩn acetic.

Việc phân loại và định danh vi khuẩn acetic ở cấp độ loài dựa trên sự đa dạng về đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa là một công tác đòi hỏi thời gian, sự kỹ càng và chuẩn hóa theo các nghiên cứu đã công bố Các kết quả khảo sát cần được lặp lại ở các phòng thí nghiệm khác và vào các thời điểm khác nhau Asai et al đã phân loại vi khuẩn acetic thành hai chi chính là Acetobacter và Gluconobacter dựa trên nhiều đặc điểm kiểu hình khác nhau, bao gồm đặc điểm di động, khả năng sinh sắc tố tốt trong môi trường, khả năng sinh trưởng trong các môi trường thạch chứa mannitol hoặc glutamate, khả năng đồng hóa ammonia, và khả năng sinh acid từ các nguồn carbohydrate khác nhau.

Hình 1.8 Hình ảnh hiển vi chùm tiên mao ở các chủngGluconobacterdo Asai et al ghi nhận [86].

Các loài trong chi Ghi chú có những đặc điểm nhận diện không hoàn toàn giống nhau giữa các chi khác nhau Đặc điểm nhận diện loài mới As spathodea bao gồm khả năng oxy hóa acetate và lactate, khả năng sinh trưởng trong môi trường chứa D-glucose 30% (w/v) và acid acetic 0,35% (v/v), cùng với khả năng sinh acid trong môi trường cơ bản với các nguồn carbohydrate khác nhau Hai loài mới A orizyfementans và A ascendens có khả năng tạo các dạng acid keto-gluconic, sinh trưởng trong môi trường chứa ethanol 10% (v/v), và phát triển trong môi trường với các nguồn carbon như D-fructose, D-sorbitol hay glycerol, cũng như khả năng sinh acid từ L-arabinose, D-galactose, D-glucose, D-mannose hay D-xylose.

Bảng 1.8 Đặc điểm phân biệtAs spathodeaesp nov trong chiAsaia[87] Đặc điểm 1 2 3 4 5 6

Oxy hóa acetate và lactate w w w w w w

Sinh trưởng ở môi trường chứa

D-sorbitol w w w + w w dulcitol - - w - w w sucrose - w - - - - raffinose - - w - - - ethanol + + - w - w

Kiểu phân đoạn cắt giới hạn gen mã hóa16S rRNA bằng endonuclease

HpyAV Asp Asp Ab Ab Ab Ab

Thành phần % G+C trong DNA bộ gen (mol%) 59,7 59,8 60,2 59,3 60,3 60,8

1,As spathodeaeGB23-2 T ; 2,As spathodeaeGB23-3; 3,As bogorensisBCC 12264 T ; 4,As siamensisBCC 12268 T ;

+, dương tính; w, dương tính yếu; -, âm tính; Asp, 9 phân đoạn có kích thước 454, 350, 190, 196, 169, 152 và 99 bp; Ab, 9 phân đoạn có kích thước 454, 295, 190, 166, 151, 99 và 55 bp.

Bảng 1.9 Đặc điểm phân biệtA oryzifementanssp nov.,A ascendenssp nov., comb nov với các chủngAcetobactercó quan hệ họ hàng gần [88]

Chủng vi khuẩn Đặc điểm

Sinh trưởng trong môi trường chứa 10% ethanol (w/v) + + + - + - -

Sinh trưởng trong môi trường chứa

Chuyển hóa sinh acid từ

A.pasteurianusKACC13994 T (=LMG1262 T );6,A.acetiKCTC12290 T (=NCIMB8621 T );7,A.pomorumKCTC22319 T (=LHT 2458 T ); +, dương tính; -, âm tính; a , từ kết quả phân tích dữ liệu trình tự DNA bộgen.

1.4.2 Phân loại dựa vào đặc điểm hóahọc

Phân loại vi khuẩn acetic dựa vào đặc điểm hóa học liên quan đến thành phần hóa học của tế bào, trong đó các yếu tố quan trọng thường được xem xét bao gồm thành phần ubiquinone, lipid và acid béo Những đặc điểm hóa học này đóng vai trò như các marker trong cấu trúc tế bào, có giá trị và tính ổn định cao, góp phần quan trọng vào việc phân loại vi khuẩn theo nhóm Điều này đặc biệt cần thiết trong phân loại ở cấp độ chi, phù hợp với hệ thống phân loại đa chiều hiện nay.

Yamada và các cộng sự đã phân tích thành phần ubiquinone bằng sắc ký bản mỏng và sắc ký khối phổ, xác định rằng vi khuẩn thuộc chi Acetobacter có ubiquinone chính là UQ-9, trong khi chi Gluconobacter có UQ-10 là ubiquinone chủ yếu.

Yamada et al đã nhận thấy sự hiện diện của hai nhóm kiểuhình khác, bao gồm các chủng được Asai et al gọi là “Ga liquefaciens” với chủ yếu là ubiquinone UQ-10 và nhóm các chủng “A aurantius” có tiên mao ở cực với thành phần ubiquinone chính là UQ-8 Sau đó, A aurantius đã được sửa tên thành Frateuria aurantia (theo Kondo và Ameyama).

Năm 1958, Swing và cộng sự đã phân loại một số vi khuẩn không thuộc nhóm acetic hay họ Acetobacteraceae, mà thuộc lớp Gamma-Proteobacteria Đến nay, ngoài các chủng thuộc chi Acetobacter có thành phần ubiquinone chủ yếu là UQ-9, các chủng khác trong nhóm vi khuẩn acetic đều được công nhận có UQ-10 là thành phần ubiquinone chính trong chuỗi chuyển điện tử của cấu trúc tế bào.

Hình 1.9 Thành phần acid béo chính trong tế bào chủngG oxydansNCIB 9013(a) vàA acetiIFO 3283 (b) [92]

Phân tích thành phần acid béo bằng phương pháp sắc ký khí lỏng, Yamada et al.xác định hai chiGluconobactervàAcetobactercó thành phần acid béo chính là

C18:1 (Hình 1.9) là một thành phần quan trọng trong cấu trúc tế bào của vi khuẩn acetic, bên cạnh đó, C14:0 là đặc điểm riêng biệt của Acetobacter Việc sử dụng thành phần acid béo để phân loại vi khuẩn đã dẫn đến sự xuất hiện của các đơn vị phân loại mới, trong đó C18:1 ω7c được ghi nhận là thành phần acid béo chính trong các nghiên cứu về vi khuẩn acetic.

Gần đây, phương pháp sắc ký khối phổ MALDI-TOF (MALDI-TOFMS) đã được áp dụng để phân loại các chủng vi khuẩn thuộc họ Acetobacter, Gluconacetobacter và Gluconobacter từ giấm, cho thấy tính khả thi trong phân loại và hệ thống học vi khuẩn acetic Nghiên cứu của Ferrer et al đã khảo sát thành phần protein tế bào và đề xuất loài mới A musti Dữ liệu phân tích MALDI-TOF MS cũng được sử dụng để nghiên cứu các loài mới như A oryzifermentans, A ascendens và A oryzoeni.

1.4.3 Phân loại dựa vào đặc điểm kiểugen

Các phương pháp phân loại vi khuẩn dựa trên đặc điểm kiểu hình thường tốn thời gian và khó khăn trong việc phân biệt ở cấp độ loài Tuy nhiên, sự phát triển nhanh chóng của kỹ thuật sinh học phân tử và công cụ phân tích sinh tin học đã giúp cải thiện đáng kể khả năng phân loại dựa trên đặc điểm kiểu gen, đồng thời làm giảm chi phí phân tích, dẫn đến việc ứng dụng rộng rãi trong phân loại học.

Những nghiên cứu liên quan đến đa dạng vi khuẩn acetic ởViệt Nam 44CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU –PHƯƠNGPHÁP 49

Nghiên cứu vi khuẩn acetic tại Việt Nam chủ yếu tập trung vào việc phân loại dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa, với hầu hết các định danh dừng lại ở cấp độ chi Một nghiên cứu thu thập 33 mẫu giấm từ Đồng Nai, Lâm Đồng và Phan Thiết đã phân lập 95 chủng vi khuẩn acetic, trong đó 94 thuộc chi Acetobacter và một thuộc chi Gluconobacter Các chủng A xylinum đã được định danh lại thông qua khảo sát hình thái và sinh hóa, cho thấy khả năng oxy hóa ethanol thành axit acetic và sinh cellulose Nghiên cứu về vi sinh vật trong lên men cacao đã xác định sự hiện diện của vi khuẩn Acetobacter dựa trên khả năng làm tan CaCO3 Tương tự, nghiên cứu vi sinh vật trong trà Kombucha cũng thu thập vi khuẩn thuộc hai chi Acetobacter và Gluconobacter, xác định chủng A aceti có hoạt tính lên men cao thông qua so sánh trình tự 16SrDNA Một chủng vi khuẩn từ căn quyển và mô mía đã được xác định gần giống với các chủng thuộc chi Gluconacetobacter thông qua phân tích hình thái và khả năng cố định đạm.

NCS đã nghiên cứu đa dạng vi khuẩn acetic trong hơn mười năm, ghi nhận sự hiện diện của nhiều chi và loài khác nhau từ nhiều nguồn mẫu Qua quá trình này, nhóm cũng phát hiện ra những đơn vị phân loại mới.

Nghiên cứu đã thu thập các chủng vi khuẩn acetic sinh dihydroxyacetone từ mẫu hoa và quả tại thành phố Hồ Chí Minh, sàng lọc được 31 chủng từ 66 chủng vi khuẩn acetic phân lập Kết quả khảo sát cho thấy các chủng này có khả năng oxy hóa acetate và lactate, sinh acid acetic từ ethanol, và phát triển trong môi trường chứa.

0,35%acidacetic,sinhtrưởngtrênmôitrườngthạchchứaglutamatevàkhảnăngtiếttố, tanramôitrườngđãxácđịnhcósựhiệndiệncủavikhuẩnthuộc3chiAcetobacter,

GluconobactervàGluconacetobactertừ các chủng phân lập Ngoài ra, trong các chủng nàycũngcó6chủngGluconobacterkhôngthểxácđịnhloàidothuộc3nhánhriêngbiệt từ kết quả phân tích phát sinh loài trình tự và độ tương đồng vùng 16S rDNA[118].

Bảng 1.13 Nguồn phân lập và phân loại 100 chủng vi khuẩn acetic thu thập từ các mẫu thu tại khu vực canh tác và các mẫu hoa, quả [98]

Môi trường tăng sinh Chủng phân lập

HoaCassiasp Nha Trang EM1 VTH-AB02 2

EM2 EM2 EM2 EM2 EM2 EM2 EM2 EM2 EM2

3 BD39M 1 BD44M2 3 , BD44SO 3 BD46SO 2 BD47SO 3 B D5SO 2 BD9G 2 ,BD9M 3 BD49

M 3 HoaCrossandra infundibuliformis Đồng Nai EM1 VTH-AB10 2

EM2 EM2 EM2 EM2 EM2 EM2 EM2 EM2 EM2 EM2 EM2 EM2 EM2 EM2 EM2 EM2 EM2 EM2 EM2 EM2 EM2

VTH-AC01 6 , VTH-AD19 3 , VTH- AD51 3 VTH-AD55 3 , VTH-AD79 3 , VTH- AD80 3

VTH-AE18 2 , VTH-AH33 2 , VTH-AH34 2 , VTH-AH40 4 , VTH- AH42 4 , VTH-AH43 4 , VTH-AH44 1 , VTH-AH46 2

VTH-AE28 2 , VTH-AE39 1 ,VTH- AE76 1 VTH-AE40 2

VTH- AE41 2 VTH- AE44 2 VTH-AE57 2 ,VTH-AH56 2 VTH-AE65 2 , VTH-AE66 2 ,VTH- AE91 2 VTH-AE67 1 ,VTH-AE96 2 VTH-AE75 1 ,VTH-

AE83 2 VTH- AE94 1 VTH- AH36 3 VTH-AH37 1 , VTH-AH39 2 , VTH- AK04 2 VTH-AH55 1 , VTH-AH59 2 VTH-AH69 2

VTH-AH82 2 ,VTH- AK28 1 VTH-AK07 1 VTH-AK18 1 ,VTH- AK19 1 VTH-AK26 1 VTH-

VTH-AI12 1 , VTH-AI13 5 , VTH-AI14 1 , VTH- AI15 1 VTH-AI16 4

ThânOryza sativa Đất vùng rễOryza sativaĐất vùng rễSaccharumsp

Danh sách các mã sản phẩm bao gồm: VTH-AB56 (2), VTH-AI11 (5), VTH-AB63 (1), TN01LGI (6), VTH-AI04 (6), VTH-AI05 (6), VTH-AI06 (5), VTH-AI07 (5), VTH-AI08 (2), VTH-AI20 (6), VTH-AI21 (6), VTH-AI22 (6), VTH-AI23 (6), VTH-AI25 (6), VTH-AI26 (6), VTH-AI27 (6), VTH-AI28 (6), VTH-AI29 (6), VTH-AI32 (6), VTH-AI33 (6), VTH-AI51 (4), VTH-AI55 (6), VTH-AI59 (4), và VTH-AI60 (6).

VTH-AI30 6 , VTH-AI52 6 ,VTH-AI57 4 VTH-AI09 6 , VTH-AI10 6 , VTH-AI18 6 , VTH-AI24 6 ,VTH- AI31 6 ,VTH-AI54 6 , VTH-AI61 6

1 , thuộc chiAcetobacter; 2 , thuộc chiGluconobacter; 3 , thuộc chiAsaia; 4 , thuộc chiGluconacetobacter; 5 , thuộc chiTanticharoenia; 6 , chưa thể xác định chi dựa theo trình tự giải với mồi 800R vùng 16S rDNA.

Một trăm chủng vi khuẩn acetic đã được thu thập từ các mẫu hoa, quả và nguồn mẫu tại các khu vực canh tác ở thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh Nha.

Trong nghiên cứu về vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật, 100 chủng vi khuẩn đã được thu nhận từ môi trường tăng sinh vô đạm LGI, trong đó có 45 chủng được phân lập từ mẫu mô cây trồng và đất ở khu vực canh tác lúa và mía tại các tỉnh như Lâm Đồng, Bình Phước, Đồng Nai và Tây Ninh Những vi khuẩn này được đánh giá là thuộc nhóm vi khuẩn acetic, có khả năng thúc đẩy sự phát triển của cây trồng.

Hình 1.12 Các chủngAcetobacterVTH-AE75, VTH-AH37, VTH-Ai14 và VTH- Ai15 hình thành 3 nhánh riêng biệt có khả năng là 3 loài mới [98]

Phân tích định danh và phân loại dựa theo dữ liệu giải trình tự vùng gen 16S rDNA ghi nhận có sự hiện diện các chủng thuộc các chiAcetobacter,

Gluconobacter, Asaia, Gluconacetobacter, và Tanticharoenia là những chi vi khuẩn có nhiều chủng chưa được xác định Một số chủng, như Acetobacter sp VTH-Ai14 và VTH-Ai15, được thu thập từ môi trường vô đạm LGI, cho thấy sự tương đồng 98,6% với A nitrogenifigens Ngoài ra, Gluconacetobacter sp VTH-Ai51 có mối quan hệ gần gũi với Ga diazotrophicus Pal5 T, trong khi hai chủng Tanticharoenia sp VTH-Ai06 và VTH-Ai07 đã được mô tả và đặt tên là loài mới Tanticharoenia aidaesp nov., có khả năng chuyển hóa muối lân thành dạng hòa tan Các chủng chưa xác định chi được phân loại vào chi mới Nguyenibacter gen nov., với tiềm năng là vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật trong họ Acetobacteraceae, mặc dù chưa có nghiên cứu công bố về đặc tính này Các chủng Acetobacter sp và Gluconacetobacter sp vẫn chưa được nghiên cứu để xác định loài và các đặc điểm kích thích sinh trưởng thực vật.

Vậtliệu 49

2.1.1 Nguồn mẫu, chủng giống vi sinh vật và thực vật khảonghiệm

Mẫu đất từ vùng rễ, rễ, thân lá và hoa được thu thập từ ruộng mía và lúa tại các tỉnh Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Đắk Lắk, Gia Lai, Tây Ninh, Vĩnh Long, Đồng Tháp và Thành phố Hồ Chí Minh.

Các mẫu thu thập tại khu vực canh tác được bảo quản riêng trong các túi zipper, ghi chú và giữ lạnh trong quá trình vận chuyển Mẫu được gửi đến Phòng thí nghiệm Vi sinh, Bộ môn Vi sinh, Khoa Sinh học và Công nghệ Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP HCM để tiến hành phân lập vi khuẩn mục tiêu.

Hai chủngNg vanlangensisTN01LGI T và VTH-AC01, đại diện của chiNguyenibactervà loàiNg vanlangensis[85] được khảo sát xác định các đặc tính kích thích tăng trưởng thực vật.

Hai chủng vi khuẩnAcetobactersp VTH-Ai14 và VTH-Ai15 phân lập từ nguồn mẫuthuởruộngmíatạiBìnhPhướccóvịtríphátsinhloàiriêngbiệtvàgầnnhấtvớiA.nitrogenifigens RG1 T [98] được khảo sát đặc điểm phân loại nhằm xác định loàiAcetobactermới.

-Chủng chuẩn, chủng đối chứng và thực vật khảo nghiệm:

Chủng chuẩn:A acetiNBRC 14818 T (=IFO 14818 T ),A nitrogenifigensTBRC

15 T (=RG1 T ),Ga diazotrophicusBCC 20215 T (=PAl5 T ),Ga. liquefaciensBCC12274 T (=NBRC 12388 T ),G oxydansNBRC 14819 T ,As. bogorensis71 T ,N chiangmaiensisBCC 15763 T vàNg vanlangensisTN01LGI T

Chủng Bacillus sp được phân lập từ men tiêu hóa Bio.acimin Gold, sản phẩm của Công ty CP Dược Phẩm QD-Meliphar, đã được nghiên cứu tại Phòng thí nghiệm Vi sinh thuộc Bộ môn.

Vi sinh vật là một lĩnh vực quan trọng trong Khoa Sinh học và Công nghệ Sinh học tại Đại học Khoa học Tự nhiên, thuộc Đại học Quốc gia TP HCM Đặc biệt, chủng Escherichia coli DH5α được lấy từ Bộ Sưu tập chủng giống TBRC của NSTDA, đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng sinh học.

Thực vật khảo nghiệm Arabidopsis thaliana PR::GUS được nghiên cứu tại Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật và Chuyển hóa sinh học, thuộc Khoa Sinh học và Công nghệ Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM.

Các mồi dùng để khuếch đại và giải trình tự vùng gen 16S rDNA bao gồm 3 mồi xuôi (20F, 27F và 518F) và 3 mồi ngược (1500R, 800R và 1492R) Đối với gen dnaK, mồi sử dụng là dnaK-01-F và dnaK-02-R; gen groEL sử dụng groEL-10-F và groEL-11-R; gen rpoB sử dụng rpoB-01-F và rpoB-02-R Việc chọn mồi để khuếch đại và giải trình tự gen giữ nhà được căn cứ theo nghiên cứu của Cleenwerck et al.

Bảng 2.1 Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu

Mồi Trình tự mồi Vị trí

Vùng trình tự gen 16S rRNA [76] E coli(V00348)

1492R 5'- TACGGYTACCTTGT- TACGACTT-3' 1513-1492 dnaK [104] Bộ genG oxydans621H (CP000009) dnaK-01-F 5'-CTGCGCATCATCAACGAGCC-3' 925719–925738 dnaK-02-R 5'-CTCACGCTCGCCCTGATAGA-3' 926546–926527 groEL [104] groEL-10-F 5'-ACAAGTTCGAGAACATGGGC-3' 2083114–2083133 groEL-11-R 5'-TCCTTGCGCTCCTTCACCTC-3' 2084104–2084085 rpoB [104] rpoB-01-F 5'-GATAACGGCACCTTCATCAT-3' 405644–405625 rpoB-02-R 5'-AGATTGTCGATATCGTCGAT-3' 404620–404639

2.1.3 Hóa chất, enzyme và sinh phẩmkhác

Các hóa chất sử dụng trong các thí nghiệm của luận án bao gồm:

Indole-3-acetic acid (IAA), dihydroxyacetone (DHA), and L-tryptophan are key compounds used in various applications, alongside solvents such as acetone, acetic acid, diethyl ether, hexane, acetonitrile, sodium lactate, and formic acid Additionally, silica gel (Kiesel-gel 60F254) and high-performance thin-layer chromatography plates (HPTLC RP-18F254S) are essential for analytical procedures Other important reagents include KH2PO4, MgSO4·7H2O, KCl, and dyes like crystal violet and fuchsine, all of which are produced by Merck (Germany).

Merck (Germany) and Wako (Japan) produce a variety of carbohydrate sources, including D-arabinose, D-fructose, D-galactose, D-glucose, D-lactose, D-maltose, D-mannitol, D-mannose, D-sorbitol, D-xylose, dulcitol, ethanol, glycerol, L-arabinose, L-rhamnose, L-sorbose, methanol, melibiose, myo-inositol, raffinose, 1-propanol, and 2-propanol.

- Tím bromocersol, xanh bromothymol sản xuất bởi Scharlau (Tây BanNha).

- Cao nấm men, peptone sản xuất bởi Difco(Mỹ):

- Thang chuẩn 1kb và 50 bp sản xuất bởiBioline.

- Agarose, tris base, dNTP, Taq Buffer, MgCl 2 , Taq DNA polymerase, … sảnxuất bởi Bio Basics(Canada).

- Bộ kit tinh sạch QIAquick® sản xuất bởi QIAGEN(Đức).

- Bộ kit Yamasa GC Kit sản xuất bởi Yamasa Shoyu Co (NhậtBản).

-Mồi phản ứng PCR sản xuất bởi TBR Corp., Tp.HCM, Việt Nam.

2.1.4 Máy móc và thiết bịchính

Nồi khử trùng nhiệt ẩm ALP MC (Nhật Bản), tủ cấy vi sinh Shin saeing (Hàn Quốc), và tủ ủ vi sinh vật Memmert (Đức) là những thiết bị quan trọng trong phòng thí nghiệm Ngoài ra, tủ -30℃ và pH Sanyo (Nhật Bản) cùng với cân điện tử Ohaus (Mỹ) cũng đóng vai trò không kém Các thiết bị như máy ly tâm và ly tâm lạnh Memmert (Đức), quang phổ kế UV/VIS 230 (Canada), và máy vortex Scilogex (Trung Quốc) hỗ trợ đắc lực cho các nghiên cứu Bể ổn nhiệt Memmert (Đức), máy lắc mẫu GFL 3006 (Đức), và tủ sấy Memmert (Đức) giúp duy trì điều kiện tối ưu cho thí nghiệm Kính hiển vi quang học Olympus (Nhật Bản), máy PCR Bio-Rad (Mỹ), bộ điện di Mupid-EX (Nhật Bản), và máy soi gel TSF-20V (Mỹ) là những thiết bị không thể thiếu trong phân tích sinh học phân tử Cuối cùng, máy đo pH Hanna (Mỹ) và máy nanodrop (Bio-Rad Laboratories) hoàn thiện danh sách thiết bị hiện đại phục vụ nghiên cứu khoa học.

Phương pháp và bố tríthínghiệm 51

Ngoài việc phân lập tuyển chọn vi khuẩn mục tiêu và giải trình tự gen, tất cả các thí nghiệm xác định đặc tính đều được thực hiện từ 3 đến 5 lần Kết quả cuối cùng được xác định dựa trên số lần lặp lại nhiều nhất hoặc theo giá trị trung bình được tính bằng Excel.

2.2.1 Tuyển chọn vi khuẩn acetic theo định hướng kích thích sinh trưởng thựcvật Để phân lập tuyển chọn vi khuẩn acetic có khả năng thuộc nhóm vi khuẩn kích thích tăng trưởng thực vật, quy trình phân lập được thiết lập từ tham khảo các công bố của Yamada et al [83], Alam et al [120] và Cavalcante và Dửbereiner [40] Theo đú, trừ mẫu đất chung quanh vùngrễđược sử dụng trực tiếp, các mẫu rễ, thân, lá hay hoa đều được xử lý khử trùng bề mặt với ethanol 70% (v/v) trong 5 phút Rửa với nước cất vô trùng 5 lần Cắt nhỏ mẫu, nghiền và đồng hóa với dung dịch sucrose 10% (v/v) vô trùng.

Sử dụng 1 ml dung dịch sau đồng hóa hoặc 1g mẫu đất để tăng sinh trong 9 ml môitrườngbánrắnvôđạmLGI(10,0%sucrose,0,06%KH2PO4,0,02%K2HPO4,0,02%

MgSO 4 ,0,002%CaCl 2 ,0,001%FeCl 3 ,0,0002%Na 2 MoO 4và 0,2%agar,pH6,0)vàmôi trườngPikovskaya(0,25%Ca3(PO4)2,1,3%D-glucose,0,05%(NH4)2SO4,0,02%NaCl,

Sử dụng FeSO4.7H2O và 0,2% agar để sàng lọc vi khuẩn có khả năng cố định đạm hoặc chuyển hóa lân thành dạng hòa tan, vi khuẩn được nuôi cấy ở 30 o C trong 5 ngày Sau khi quan sát thấy sự xuất hiện của sinh khối, tiến hành chuyển sang môi trường lỏng pH 3,5 để tiếp tục tăng sinh vi khuẩn chịu acid ở 30 o C trong 5 ngày Để ức chế sự phát triển của vi nấm, nystatin (100mg/l) được thêm vào các môi trường chọn lọc.

Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường pH 3,5 với thành phần gồm 2,0% D-glucose, 0,5% ethanol, 0,3% peptone, 0,3% cao nấm men, 0,7% calcium carbonate và 1,5% agar Các khuẩn lạc tạo vòng tan CaCO3 được mô tả và tiếp tục thuần hóa Vi khuẩn thuần được kiểm tra khả năng sinh trưởng trong môi trường pH 3,5 với các thành phần tương tự và được điều chỉnh bằng HCl 1N để sàng lọc vi khuẩn acetic Ngoài ra, chủng thuần cũng được kiểm tra khả năng sinh trưởng trong môi trường vô đạm LGI bán rắn và khả năng chuyển hóa lân thành dạng hòa tan trên đĩa thạch Pikovskaya để xác định vi khuẩn có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật.

2.2.2 Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh lý và sinhhóa

Tùy thuộc vào các khảo sát khác nhau, các chủng chuẩn và chủng đối chứng được đề cập ở mục 2.1.1 sẽ được sử dụng làm chủng đối chứng tương ứng với chủng khảo sát.

- Quan sát hình thái khuẩn lạc và tếbào:

Tế bào vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường thạch GECA ở nhiệt độ 30C Khuẩn lạc vi khuẩn được quan sát và mô tả đặc điểm sau 36-48 giờ nuôi cấy Hình thái khuẩn lạc và đặc tính Gram của tế bào vi khuẩn được nghiên cứu sau 18-24 giờ, sử dụng kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1.000x sau khi thực hiện nhuộm đơn hoặc nhuộm Gram.

Nuôi cấy tĩnh vi khuẩn trong môi trường lỏng chứa 2,5% D-glucose, 2,0% ethanol, 0,3% peptone và 0,3% cao nấm men ở 20°C khoảng 18-24h.

Quansátvớikínhhiểnviquanghọc(x40)xácđịnhkhảnăngdiđộngcủavikhuẩn bằng phương pháp giọt treo dựa theo bản dịch của Nguyễn Lân Dũng[121].

Tiên mao của tế bào được nhuộm bằng phương pháp Forbes, với lam kính được làm sạch và để khô trước khi nhỏ giọt huyền phù lên Sau khi nghiêng lam để tạo vết bôi, lam kính được để khô tự nhiên Các bước nhuộm tiên mao được thực hiện, và sau khi nhuộm, lam kính được quan sát để xác định đặc điểm của tiên mao bằng vật kính dầu với độ phóng đại 1.000x.

Tế bào vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường có pH 3,5 và nhiệt độ 30°C, với thời gian quan sát sự sinh trưởng kéo dài 7 ngày.

Sử dụng hệ thống ống môi trường bán rắn của Hugh và Leifson chứa bromothymol xanh dương với hàm lượng 0,003% (w/v) làm chất chỉ thị Tạo điều kiện yếm khí cho ống môi trường cấy vi khuẩn bằng cách thêm một lớp paraffin lỏng khoảng 2cm và ủ ở 30°C trong 7 ngày Ghi nhận sự acid hóa của môi trường do hoạt động chuyển hóa carbohydrate của vi khuẩn trong cả điều kiện hiếu khí và yếm khí để xác định khả năng oxy hóa hoặc lên men của chủng khảosát.

Cấytếbàovikhuẩnvàotrongmôitrườnglỏngchứa 0,3% peptone, 0,2% cao nấm men và 0,2% sodium acetate hoặc sodium lactate, cùng với 0,002% xanh dương bromothymol làm chất chỉ thị, pH 6,4, được ủ ở 30°C trong 7 ngày Sự oxy hóa cơ chất khác nhau của vi khuẩn dẫn đến việc môi trường bị kiềm hóa, thể hiện qua sự đổi màu từ acid hóa sang kiềm hóa màu xanh dương Khảo sát này được thực hiện đồng thời với môi trường cơ bản chỉ chứa peptone và cao nấm men.

- Sinh trưởng trong môi trường chứa 0,35% acidacetic:

Quan sát sự sinh trưởng của vi khuẩn trong 7 ngày nuôi cấy ở 30°C trong môi trường chứa 1,5% D-glucose (w/v), 0,5% ethanol (v/v), 0,3% peptone, 0,3% cao nấm men(w/v) và 0,35% acetic acid (v/v) có pH3,5 [16].

- Sinh trưởng trong môi trường chứa 1,0%KNO 3 :

Quan sát sự sinh trưởng của vi khuẩn trong 7 ngày nuôi cấy ở 30°C trong môitrường chứa 1,5% D-glucose (w/v), 0,5% ethanol (v/v) và 1,0% KNO 3 (w/v) [74].

To cultivate levan-forming polysaccharides, prepare a medium containing 0.3% peptone, 0.3% yeast extract, 1.8% agar, and either 3.5% or 5% of one of the following: D-glucose, D-fructose, D-mannitol, ethanol, glycerol, lactose, D-sorbitol, 1-propanol, or 2-propanol Incubate the culture at 30°C for 7 days to observe the formation of polysaccharides.

- Sinh sắc tố tan màunâu:

Quan sát sự tạo thành sắc tố tan màu nâu trong môi trường GECA và GYC sau 10 ngày nuôi cấy vi khuẩn 30°C [123].

- Sinh trưởng trên môi trường chứa 1,5% và 30%D-glucose:

Quan sát sự sinh trưởng của vi khuẩn trong 7 ngày nuôi cấy ở 30°C trong môi trường chứa 1,5% hay 30% D-glucose và 0,3% cao nấm men [123].

- Sinh trưởng trên môi trường thạch chứa glutamate haymannitol:

Khảnăngsinhtrưởngtrênmôitrườngcósựhiệndiệncủaglutamatehaymannitol được đánh giá qua sự sinh trưởng của vi khuẩn trong 10 ngày ở 30°C trên môi trường chứa0, 5% s o d i u m g lu ta mat e, 1 , 0 % D - g lu cose, 0, 1 % K H2PO4,0, 02 % Mg S O4.7H2O,

0,01%KClvà2,0%agar(w/v),pH7,2vàmôitrườngchứa2,5%mannitol,0,5%cao nấm men, 0,3% peptone và 2,0% agar (w/v), pH 6,0 [86, 123].

- Sinh trưởng trong môi trường có hàm lượng ethanol khácnhau:

Quan sát sự sinh trưởng của vi khuẩn trong 7 ngày nuôi cấy ở môi trường chứa 0,0%, 0,5%, 1,0%, 3,0% hay 30% D-glucose và 0,3% cao nấm men (w/v) với nhiệt độ nuôi cấy là 30°C [123].

- Sinh-pyrone từ D-glucose vàD-fructose:

Nghiên cứu cho thấy nuôi cấy lắc tế bào vi khuẩn trong 14 ngày ở 30°C với môi trường chứa 1,0% cao nấm men, 3,0% CaCO3 và 5,0% D-glucose hoặc D-fructose đã ghi nhận sự tạo thành -pyrone, thể hiện qua sự xuất hiện kết tủa đen khi thêm dung dịch FeCl3 vào môi trường sau nuôi cấy.

-Sinh trưởng trong môi trường không chứa vitamin có (NH 4 ) 2 SO 4 và nguồncarbohydrate là ethanol:

Theo dõi sự sinh trưởng của vi khuẩn trong môi trường pH6,8 chứa 0,3% (NH 4 ) 2 SO 4 , 0,3% KH 2 PO 4 , 0,2% MgSO 4 7H 2 O và 0,5% ethanol (v/v) Thời gian nuôi cấy là 7 ngày ở 30°C [123].

Nuôi cấy lắc vi khuẩn trong môi trường chứa 3% glycerol (v/v), 0,5% cao nấm men và 1,0% peptone (w/v) với pH 6,0 trong khoảng thời gian từ 7 đến 14 ngày Sự hình thành dihydroxyacetone được xác định qua kết tủa nâu đỏ xuất hiện khi thêm dung dịch thuốc thử Fehling vào môi trường sau nuôi cấy.

Cấy vi khuẩn vào môi trường lỏng với 0,3% D-glucose và 0,3% cao nấm men, sau đó nuôi lắc trong 7 ngày ở 28°C Tiến hành ly tâm thu dịch nổi và thực hiện sắc ký trên bản mỏng nhôm và cellulose (Merck) với hệ dung môi ethyl acetate/acid formic/acid acetic/H2O (18:1:3:4, v/v) Xử lý bản mỏng bằng dung dịch chứa 0,5g o-phenylenediamine, 3,75ml H2O, 0,81ml HCl và ethanol tuyệt đối đủ 25ml Sấy ở 105°C trong 2-3 phút để hiện màu các dạng acid ketogluconic và ghi nhận kết quả so với mẫu chuẩn.

- Sinh acid từ các nguồn carbon khácnhau:

Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường có pH 6,8 với 0,5% cao nấm men và 1% các nguồn carbon khác nhau, sử dụng chỉ thị màu tím bromocresol với hàm lượng 0,002% (w/v) Quá trình nuôi cấy diễn ra ở nhiệt độ 30°C trong 7 ngày, ghi nhận sự chuyển màu của môi trường từ tím sang vàng do vi khuẩn chuyển hóa carbon sinh acid Các nguồn carbon được sử dụng bao gồm D-arabinose, D-fructose, D-galactose, D-glucose, D-lactose, D-maltose, D-mannitol, D-mannose, D-sorbitol, D-xylose, dulcitol, ethanol, glycerol, L-arabinose, L-rhamnose, L-sorbose, methanol, melibiose, myo-inositol, raffinose, 1-propanol và 2-propanol.

- Sinh trưởng trong môi trường chứa các nguồn carbon khácnhau:

Thu thập và phân loại vi khuẩn acetic theo định hướng kích thích sinh trưởng thực vật 65 1 Thuthập,phânlậpvàchọnlọcvikhuẩnaceticcókhảnăngthuộcnhómkíchthích sinh trưởngthựcvật 65

Tại các khu vực canh tác lúa và mía ở các tỉnh như Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Dak Lak, Gia Lai, Tây Ninh, Vĩnh Long, Đồng Tháp và Thành phố Hồ Chí Minh, mẫu đất từ vùng rễ, rễ, thân, lá và gié hoa đã được thu thập để thực hiện quá trình tăng sinh Môi trường tăng sinh vô đạm LGI được sử dụng để tuyển chọn vi khuẩn có khả năng cố định đạm, trong khi môi trường tăng sinh Pikovskaya cũng được áp dụng trong nghiên cứu này.

Ca 3 (PO 4 ) 2 được dùng để tuyển chọn vi khuẩn có khả năng chuyển hóa lân về dạng tan

Các chủng vi khuẩn acetic được phân lập và sàng lọc khả năng kích thích sinh trưởng thực vật thông qua môi trường thạch LGI và môi trường Pikovskaya với vòng tan Ca3(PO4)2 Sau đó, DNA bộ gen của các vi khuẩn mục tiêu được tách chiết, giải trình tự và phân tích phát sinh loài của vùng gen mã hóa 16SrRNA.

3.1.1 Thu thập, phân lập và chọn lọc vi khuẩn acetic có khả năng thuộc nhóm kíchthích sinh trưởng thựcvật

Vi khuẩn acetic có đặc điểm sinh acid, giúp hòa tan CaCO3 trong môi trường thạch GECA Chúng có hình dạng tế bào hình que, thuộc loại Gram âm, không sinh bào tử, và có khả năng sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí với pH 3,5 Quá trình phân lập và thuần hóa đã thu được 141 chủng mực tiêu biểu với những đặc điểm riêng biệt của vi khuẩn acetic.

Hình 3.1 thể hiện đặc tính của một đại diện chủng phân lập VTH-Ai96, là một loại vi khuẩn Gram âm, tế bào hình que, có khả năng oxy hóa trong môi trường thạch GECA, nhưng không phát triển trong môi trường Hugh và Leifson Bảng 3.1 trình bày các đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào và các đặc điểm đặc trưng của vi khuẩn acetic từ 141 chủng thu thập được.

Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy có tổng cộng 141 chủng vi khuẩn acetic được thu thập chọn lọc, với đặc điểm khuẩn lạc tròn, rìa trơn, bề mặt nhẵn, bóng và trong suốt, kích thước khoảng 1mm sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường GECA ở 30°C Vào ngày nuôi cấy thứ 3, trên môi trường thạch GECA, 41 chủng phân lập có khuẩn lạc lạ màu kem hoặc kem nhạt, là đặc điểm thường gặp ở nhiều chủng vi khuẩn acetic, bao gồm các chi con như Lactic.

Acetobacter, Gluconobacter, Gluconacetobacter và Komagataeibacter là những chi vi khuẩn quan trọng Trong số này, có 40 chủng có màu đậm ở tâm khuẩn lạc, đặc trưng cho chi Nguyenibacter Ngoài ra, 60 chủng còn lại có màu hồng, thường gặp ở hai chi Asaia và Neoasaia, bao gồm chủng chuẩn của loài G roseus và một số chủng thuộc chi hiếm gặp Acidomonas.

Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc, tế bào và đặc điểm đặc trưng vi khuẩn acetic của

Hình thái khuẩn lạc trên môi trường GECA

Hình thái tế bào Chủng phân lập

STT Kích hấp thước (mm)

1 VTH-AN04 LGI Kem, tâm nâu đậm Tròn, lồi, nhẵn, trong suốt 0,8-1,0 Que 0,8-1,1 x 2,1-2,4 Âm Hiếu khí + - +

2 VTH-AN07 LGI Kem hồng Tròn, lồi, nhẵn, trong suốt 0,6-1,0 Que 0,8-1,1 x 2,0-2,1 Âm Hiếu khí + - +

5 VTH-AN14 LGI Kem Tròn, lồi, nhẵn, trong suốt 0,8-1,0 Que 0,7-1,0 x 1,4-2,0 Âm Hiếu khí + - +

6 VTH-AN17 P Kem hồng Tròn, lồi, nhẵn, trong suốt 0,8-1,0 Que 1,0-1,1 x 1,1-2,2 Âm Hiếu khí + - +

14 VTH-AN31 P Kem Tròn, lồi, nhẵn, trong suốt 1,0-1,2 Que 0,8-1,1 x 1,9-2,2 Âm Hiếu khí + - +

25 VTH-AN43 LGI Kem hồng Tròn, lồi, nhẵn, trong suốt 1,0-1,2 Que 1,0-1,1x 1,6-2,6 Âm Hiếu khí + - +

34 VTH-AN53 LGI Kem, tâm nâu đậm Tròn, lồi, nhẵn, trong suốt 0,4-0,6 Que 1,0-1,1 x 2,1- 2,5 Âm Hiếu khí + - +

39 VTH-AN58 P Kem, tâm nâu đậm Tròn, lồi, nhẵn, trong suốt 0,4-0,6 Que 0,7-1,0 x 1,6-2,4 Âm Hiếu khí + - +

40 VTH-AN59 P Kem hồng Tròn, lồi, nhẵn, trong suốt 0,8-1,0 Que 0,8-1,1x 2,1-2,9 Âm Hiếu khí + - +

Mẫu 41 VTH-AN60 LGI Kem có màu nâu đậm, hình dạng tròn, lồi, nhẵn và trong suốt, kích thước từ 0,4-0,6 cm Que có kích thước 1,0-1,1 x 1,8-3,0 cm Đây là loài vi sinh vật hiếu khí, sinh trưởng tốt trong môi trường có độ pH 3,5, có khả năng sinh bào tử và tạo vòng tan CaCO3 Kết quả kiểm tra cho thấy mẫu này có tính dương tính (+) và âm tính (-) với các yếu tố khác.

141 chủng phân lập (tiếp theo)

Hình thái tế bào Chủng phân lập

STT Kích hấp thước (mm)

55 VTH-AN83 P Kem hồng Tròn, lồi, nhẵn, trong suốt 0,8-1,0 Que 0,9-1,1 x 1,6- 2,0 Âm Hiếu khí + - +

90 VTH-AN136 LGI Kem, tâm nâu đậm Tròn, lồi, nhẵn, trong suốt 0,4-0,6 Que 1,0-1,3x 1,8-2,8 Âm Hiếu khí + - +

Kem hồng VTH-AN141 LGI là một loại vi khuẩn có hình dạng tròn, lồi, nhẵn và trong suốt, kích thước từ 1,0-1,2 µm Vi khuẩn này có que dài từ 0,8-0,9 x 1,7-2,5 µm và sống trong môi trường hiếu khí Nó phát triển tốt trong điều kiện pH 3,5, có khả năng sinh bào tử và tạo vòng tan CaCO3 Kết quả kiểm tra cho thấy vi khuẩn này có đặc tính dương tính (+) và âm tính (-) trong một số điều kiện nhất định.

141 chủng phân lập (tiếp theo)

(2 ngày) Hình thái tế bào Chủng phân lập

99 VTH-Ai70 LGI Kem, tâm nâu đậm Tròn, lồi, nhẵn, trong suốt 1,0-1,2 Que 1,0-1,1 x 1,6-2,4 Âm Hiếu khí + - +

103 VTH-Ai74 LGI Kem Tròn, lồi, nhẵn, trong suốt 1,0-1,2 Que 1,0-1,1x 1,8-2,4 Âm Hiếu khí + - +

104 VTH-Ai75 LGI Kem Tròn, lồi, nhẵn, trong suốt 1,0-1,2 Que 0,8-1,0 x 1,7-2,5 Âm Hiếu khí + - +

111 VTH-Ai82 LGI Kem nhạt Tròn, lồi, nhẵn, trong suốt 1,5-2,0 Que 0,8-0,9 x 1,2-2,3 Âm Hiếu khí + - +

124 VTH-Ai103 LGI Kem, tâm nâu đậm Tròn, lồi, nhẵn, trong suốt 0,4-0,6 Que 1,0-1,1x 2,2-2,6 Âm Hiếu khí + - +

128 VTH-Ai107 LGI Kem hồng Tròn, lồi, nhẵn, trong suốt 1,0-1,2 Que 0,9-1,2 x 1,5-2,8 Âm Hiếu khí + - +

131 VTH-Ai110 P Kem Tròn, lồi, nhẵn, trong suốt 1,0-1,2 Que 1,0-1,1 x 2,0-2,7 Âm Hiếu khí + - +

136 VTH-Ai115 LGI Kem Tròn, lồi, nhẵn, trong suốt 1,0-1,2 Que 1,0-1,1 x1,7-2,7 Âm Hiếu khí + - +

141 VTH-Ai121 LGI là loại vi sinh vật có hình dạng tròn, lồi, nhẵn, và trong suốt, kích thước từ 1,0-1,2 micromet Chúng có kích thước que từ 1,0-1,1 x 2,0-2,5 micromet và sống trong môi trường hiếu khí Vi sinh vật này sinh trưởng tốt trong môi trường có độ pH 3,5, có khả năng sinh bào tử và tạo vòng tan CaCO3 Kết quả thử nghiệm cho thấy chúng có tính dương tính (+) và âm tính (-) trong các điều kiện khác nhau.

Chủng VTH-Ai96 được quan sát trên môi trường GECA, cho thấy khả năng làm tan CaCO3 (a) Hình ảnh trạng thái Gram của chủng này được ghi nhận qua kính hiển vi quang học với độ phóng đại x100 (b) Ngoài ra, đặc tính oxy hóa và lên men của chủng cũng được phân tích (c).

3.1.2 Phân tích phát sinh loài phân loại chủng vi khuẩn phânlập

Phân tích phát sinh loài đã được áp dụng để định danh và phân loại vi khuẩn acetic, dẫn đến việc đề xuất chi Gluconoacetobacter trong họ Acetobacteraceae dựa trên kết quả giải trình tự và phân tích mối quan hệ phát sinh loài của gen 16S rRNA Việc khảo sát trình tự gen này là cần thiết để đánh giá khả năng hình thành đơn vị phân loại mới và đề xuất các loài hoặc chi vi khuẩn acetic mới từ các chủng phân lập Để nghiên cứu sàng lọc đơn vị phát sinh loài mới, phương pháp giải trình tự Sanger với mồi 800R đã được áp dụng, qua đó phát hiện loài Ng vanlangensisi thuộc chi Nguyenibacter và loài T aidae trong chi Tanticharoenia.

Sử dụng DNA bộ gen của 141 chủng vi khuẩn, nghiên cứu đã khuếch đại vùng trình tự 16S rDNA và thực hiện giải trình tự với mồi 800R để xác định vị trí phân loại Trình tự 800R cho thấy 41 chủng vi khuẩn có khuẩn lạc màu kem liên quan gần gũi nhất với các chủng chuẩn thuộc 3 chi Acetobacter, Gluconacetobacter và Tanticharoenia Tất cả 41 chủng này có khuẩn lạc màu kem có mức độ tương đồng cao với chủng chuẩn của loài Nguyenibacter Trong số 60 chủng phân lập có khuẩn lạc màu hồng, 59 chủng cho thấy mối quan hệ gần nhất với các chủng chuẩn thuộc chi Asaia, trong khi chủng màu hồng còn lại, VTH-Ai107, có mối quan hệ gần gũi với chi Neoasaia.

Nghiên cứu đã phân tích mối quan hệ giữa năm chủng VTH-Ai77, VTH-Ai113, VTH-Ai121, VTH-AN25 và VTH-AN31 với các loài Acetobacter thông qua việc xây dựng cây phát sinh loài dựa trên vùng trình tự gen 16S rRNA Kết quả cho thấy cả năm chủng đều thuộc chi Acetobacter, với VTH-Ai113 nằm trong nhánh cùng với chủng chuẩn NRIC 0313 T của A indonesiensis (bootstrap 95%) Hai chủng VTH-AN25 và VTH-AN31 có vị trí gần nhau với chủng chuẩn JCM 25077 T, cho thấy khả năng thuộc A peroxydans (bootstrap 96%) Chủng VTH-Ai77 gần nhánh với A nitrogenifigens RG1 T, trong khi VTH-Ai121 có giá trị bootstrap 88% Nhánh phát sinh loài lớn gồm VTH-Ai77, VTH-Ai121 và RG1 T gần gũi với hai chủng Acetobacter VTH-Ai14 và VTH-Ai15, được phân lập vào năm 2016 với bootstrap 99%.

Các chủng VTH-Ai77, VTH-Ai121, VTH-AN25 và VTH-AN31 đã được giải trình tự toàn bộ gen mã hóa 16S rRNA bằng ba mồi 27F, 518F và 1492R Cây phát sinh loài toàn bộ vùng trình tự 16SrRNA được xây dựng bằng phương pháp ML với độ dài 1.306 bp Hình ảnh cây phát sinh loài cho thấy chủng Sa floricola S-877 T là chủng ngoài nhóm, trong khi hai chủng VTH-AN25 và VTH-AN31 tiếp tục thuộc cùng một nhánh phát sinh loài với chủng chuẩn A peroxydans Kết quả phân tích này nhấn mạnh mối quan hệ gần gũi giữa các chủng.

Độ tương đồng trình tự 16S rDNA giữa hai chủng VTH-AN25 và VTH-AN31 đạt 100%, và cả hai chủng này cũng có độ tương đồng 100% với chủng chuẩn JCM 25077 T Hai chủng VTH-Ai77 và VTH-Ai121 hoàn toàn tương đồng với nhau ở vùng trình tự 16S rDNA (1.359 base), tạo thành một nhánh phát sinh loài riêng biệt, có mối quan hệ họ hàng gần nhất với A nitrogenifigens và hai chủng Acetobactersp VTH-Ai14 và VTH-Ai15 Trình tự gen 16S rRNA (1.359 base) của VTH-Ai77 tương đồng 99,8% với VTH-Ai14 và VTH-Ai15, cũng như 98,6% với A aceti (NBRC14818 T), 98,2% với A nitrogenifigens (RG1 T), A musti (Bo7 T) và 98,9% với A estunensis (LMG1626 T).

Hình 3.2 Quan hệ phát sinh loài của các chủng phân lập liên quan đến chi

Xác định đặc tính kích thích sinh trưởngNguyenibactervanlangensis 91

Ng.vanlangensis, một loài thuộc chi Nguyenibacter, được phát hiện từ các mẫu ở khu vực canh tác lúa tại Tây Ninh và TP HCM Các chủng này được thu thập từ môi trường bán rắn vô đạm LGI Mặc dù chưa được xác định là vi khuẩn cố định đạm, chi Nguyenibacter có tiềm năng là vi khuẩn acetic thúc đẩy sinh trưởng thực vật trong họ Acetobacteraceae Để làm rõ vai trò của chi Nguyenibacter trong việc kích thích sinh trưởng thực vật, chủng chuẩn TN01LGI T và chủng VTH-AC01 đại diện cho loài Ng vanlangensis đã được khảo sát về các đặc tính cố định đạm, chuyển hóa lân và kẽm sang dạng hòa tan, sinh hormone auxin, cũng như tăng cường khả năng kháng bệnh cho thực vật.

3.2.1 Cố định đạm Để định tính khả năng cố định đạm củaNg vanlangensisTN01LGI T và VTH- AC01,haichủngnàyđượckhảosátkhảnăngsinhtrưởngởmôitrườngvôđạmLGIqua nhiều lần cấy chuyền như trình bày ở mục 2.2.5 Các chủng đối chứng sử dụng trong khảo sát gồmGa. diazotrophicusBCC 20215 T (=PAl5 T ) là vi khuẩn cố định đạm đầu tiên được biết đến trong họAcetobacteraceaevàA acetiNBRC 14818 T không có khả năngcốđịnhđạmphântử.Kếtquảnuôicấychuyền4lầntrongmôitrườngbánrắnLGI pH4,5chothấycácốngnghiệmchứabachủngBCC20215 T ,TN01LGI T vàVTH-AC01 có sự xuất hiện các vệt sinh khối màu vàng ở tất cả các lần cấy chuyền Chủng NBRC

Chủng vi sinh vật 14818 T không thể tạo sinh khối trong cả 4 lần nuôi cấy trên môi trường bán rắn LGI, mặc dù sinh khối sử dụng ở mỗi lần cấy chuyển đều là sinh khối phát triển ở ngày thứ 2 trên môi trường GECA Sinh khối từ các lần cấy chuyển của các chủng BCC20215 T, TN01LGI T và VTH-AC01 đều sinh trưởng được trên môi trường thạch LGI, với khuẩn lạc màu vàng cam đặc trưng Ngược lại, chủng đốichứng NBRC14818 T không sinh trưởng được trên đĩa thạch LGI Kết quả khảo sát khả năng sinh trưởng ở môi trường vô đạm LGI chứng minh hai chủng Ng vanlangensis có đặc tính cố định đạm tự do.

Khảo sát hoạt tính cố định đạm của hai chủng TN01LGI T và VTH-AC01 thông qua hoạt tính khử acetylene trong môi trường lỏng LGI chứa 5% sucrose cho thấy TN01LGI T khử acetylene tạo ethylene với hàm lượng 21,61 nmol C2H4 h-1, trong khi VTH-AC01 đạt 9,11 nmol C2H4 h-1 Kết quả này khẳng định đặc tính cố định đạm của hai chủng được khảo sát.

Hình 3.12 Sinh khối màu vàng cam đặc trưng ở thạch LGI của hai chủng TN01LGI T và VTH-AC01

Chủng TN01LGI T và VTH-AC01 thuộc họ Acetobacteraceae đã được xác nhận có khả năng cố định đạm, cùng với các loài khác như A nitrogenifigens, A peroxydans, Ga diazotrophicus, Ga azotocaptans, Ga johannae, As bogorensis, As siamensis, S salitolerans, Ko hansenii và Ko kakiaceti Nghiên cứu của Reis và Teixeira đã chỉ ra rằng đa số vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật đều có đặc tính cố định đạm Với việc xác định Ng vanlangensis là loài cố định đạm, chi đơn loài Nguyenibacter cũng được ghi nhận trong họ Acetobacteraceae với đặc tính tương tự.

3.2.2 Chuyển hóa khoáng lân và kẽm về dạng hòatan Để xác định đặc tính chuyển hóa hợp chất chứa lân và kẽm về dạng hòa tan, hai chủngNg.vanlangensisTN01LGI T vàVTH-AC01đượcnuôicấykhảosátkhảnăngtạovòng tan

Kết quả khảo sát cho thấy cả hai chủng TN01LGIT và VTH-AC01 đều tạo ra vùng tan Ca3(PO4)2 trong môi trường thạch Khả năng chuyển hóa muối lân sang dạng hòa tan diễn ra trong môi trường chứa D-glucose và sucrose Cụ thể, chủng TN01LGIT tạo vòng tan lân kích thước 17,33mm vào ngày thứ 3 trong môi trường LGI với 1% D-glucose và 0,1% Ca3(PO4)2, trong khi chủng VTH-AC01 tạo vòng tan lân kích thước 15,33mm trong cùng điều kiện Trên đĩa thạch LGI chứa 1% sucrose, cả hai chủng không chỉ tạo vùng tan muối lân mà còn sản xuất polysaccharide dạng nhầy, gây hiện tượng tràn trên bề mặt môi trường và đẩy đĩa giấy cấy vi khuẩn ra khỏi vị trí ban đầu, do đó không thể xác định vòng tan Ca3(PO4)2 Những kết quả này chứng minh khả năng chuyển hóa lân sang dạng hòa tan của hai chủng Ng.vanlangensis TN01LGIT và VTH-AC01.

Hình3.13.Vùngtanlântrênđĩathạchbổsung0,1%Ca3(PO4)2tạobởihaichủngTN01LGI T và VTH-AC01 ở ngày nuôi cấy thứ3

Chủng TN01LG T được nuôi trong môi trường LGI với 1% D-glucose, trong khi chủng VTH-AC01 phát triển trong môi trường LGI với 1% glucose Ngoài ra, chủng TN01LG T cũng được thử nghiệm trong môi trường LGI với 1% sucrose, và chủng VTH-AC01 được nuôi trong môi trường LGI với 1% sucrose.

Trên đĩa petrimôitrường LGI, việc bổ sung 0,1% ZnO đã tạo ra các vùng tan ZnO xung quanh vị trí sinh khối hình thành từ hai chủng TN01 LGI T và VTH-AC01 Vòng kẽm do chủng TN01 LGI T và VTH-AC01 tạo thành trên đĩa thạch LGI với sự hiện diện của 1% D-glucose cho thấy kích thước lần lượt là 36,67mm và 36,00mm (Hình 3.14a,b).

Trong môi trường LGI chứa sucrose (1%, w/v), cả hai chủng vi sinh vật đều tạo ra vùng tan ZnO, tuy nhiên không thể xác định kích thước vòng tan do sự hình thành nhày polysaccharide dạng levan lan rộng trên bề mặt thạch Kết quả này chứng minh rằng hai chủng khảo sát có khả năng chuyển hóa kẽm thành dạng hòa tan.

Hình 3.14 Vùng tan kẽm trên đĩa thạch bổ sung 0,1% ZnO tạo bởi hai chủng TN01LGI T và VTH-AC01 ở ngày nuôi cấy thứ 3

Chủng TN01LG T và VTH-AC01 trong môi trường LGI với 1% D-glucose và sucrose đã cho thấy khả năng chuyển hóa lân cao nhất trong môi trường lỏng Pikovskaya, với hàm lượng lân lần lượt là 230,95 mg/l và 230,66 mg/l Tuy nhiên, hàm lượng lân này giảm dần vào ngày nuôi cấy thứ tư và thứ năm, cho thấy khả năng tái hình thành muối lân kết tủa trong giai đoạn sau của quá trình nuôi cấy Ngoài ra, một số chủng Ga diazotrophicus và PAl5 T đã được xác định có khả năng chuyển hóa lân và kẽm thành dạng hòa tan dễ hấp thu cho thực vật khi nuôi cấy trên đĩa thạch môi trường vô đạm LGI bổ sung D-glucose hoặc sucrose với hàm lượng 1% và 10% Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng chủng Ga azotocaptans DS1 có khả năng tạo vòng tan lân sau 14 ngày trong môi trường NBRIP, và S salitolerans có khả năng chuyển hóa lân về dạng tan Các chủng T.sakaeratensis BCC15772 T, T.aidae VTH-Ai06 T và T.aidae VTH-Ai07 cũng cho thấy khả năng tương tự trong môi trường Pikovskaya, khẳng định rằng vi khuẩn Ng vanlangensis và chi Nguyenibacter là những thành viên mới trong họ Acetobacteraceae, có khả năng hỗ trợ sinh trưởng thực vật thông qua chuyển hóa lân và kẽm.

Hình 3.15 Đồ thị chuyển hóa lân thành dạng tan của hai chủngNg.vanlangensisTN01LGI T và VTH-AC01 trong 5 ngày nuôi cấy ở môi trường lỏng Pikovskaya chứaCa 3 (PO4)2(0,5%,w/v)

Dovikhuẩn acetic có khả năng oxy hóa D-glucose để tạo ra các sản phẩm acid đa dạng như acid D-gluconic, acid 2-keto-D-gluconic và acid 2,5-diketo-D-gluconic, giúp vi khuẩn này kích thích sinh trưởng thực vật và chuyển hóa lân, kẽm không tan thành dạng hòa tan trong đất Hai chủng vi khuẩn Ng vanlangensis TN01LGI T và VTH-AC01, trong môi trường chứa sucrose, có khả năng chuyển hóa nguồn carbon từ đường thành polysaccharide dạng levan, đồng thời vẫn có thể chuyển hóa lân và kẽm Sự hiện diện của lipopolysaccharide hỗ trợ tạo sinh khối cho vi khuẩn, giúp chúng di chuyển đến bề mặt rễ nhờ vào áp suất thẩm thấu Ng vanlangensis đã được tìm thấy ở đất quanh rễ, cho thấy rằng polysaccharide nhầy do vi khuẩn tạo ra có thể tăng tính cạnh tranh trong việc phát triển sinh khối ở rễ và xâm nhiễm mô thực vật, mở ra hướng nghiên cứu mới cho phân bón vi sinh từ vi khuẩn Ng vanlangensis.

3.2.3 Tạo hormone thực vậtauxin Đểxácđịnhđặctínhchuyểnhóasinhhọctạochấtkíchthíchsinhtrưởngthựcvật auxin, hai chủng TN01LGI T và VTH-AC01 được nuôi cấy trong môi trường lỏng LGI chứa nguồn carbon là D-glucose hay sucrose Khảo sát được thực hiện với các lô thí nghiệm bổ sung L-tryptophan với tỉ lệ 0%, 0,005%, 0,01%, 0,02% và 0,05% (w/v) và đánh giá hàm lượng IAA tạo thành trong môi trường ở ngày nuôi cấy thứ 2, 3 và 5 theo phương pháp so màu với thuốc thử Salkowski như trình bày ở mục 2.2.5 Kết quả khảo sát ghi nhận ở Bảng 3.6 cho thấy cả hai chủngNg vanlangensisđều tạo được IAA với hàm lượng khác nhau trong các môi trường có bổ sung L-tryptophan Trong cả hai loạt môi trường LGI chứa D- glucose hay sucrose, hàm lượng IAA do TN01LGI T và VTH- AC01tổnghợpđềutăngtỉlệthuậnvớihàmlượngL-tryptophanbổsungvàomôitrường banđầu.LượngIAAtíchlũytrongmôitrườngđềugiảmvàongàynuôicấythứ5.Trong cácmôitrườngkhôngbổsungL-tryptophan,cảhaichủngkhảosátđềukhôngsinhtổng hợpIAA.

Việc sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn có thể diễn ra qua nhiều con đường khác nhau, theo nghiên cứu của Spaepen et al., có tổng cộng 7 con đường chuyển hóa sản sinh IAA, trong đó có 5 con đường phụ thuộc vào tiền chất L-tryptophan và 2 con đường không phụ thuộc Vi khuẩn Ga diazotrophicus PA15 T cùng một số chủng khác từ cà rốt, củ cải đỏ, củ dền đỏ và cà phê tại Ấn Độ đều có khả năng sinh IAA trong môi trường LGI bổ sung 1% D-glucose hoặc 1% sucrose với sự hiện diện của L-tryptophan Đặc biệt, chỉ có chủng PA15 T sản sinh IAA ngay cả khi không có L-tryptophan, mặc dù lượng IAA trong môi trường không có L-tryptophan chỉ đạt khoảng 1/3 so với môi trường có L-tryptophan Điều này cho thấy Ga diazotrophicus có khả năng tổng hợp IAA theo cả hai con đường phụ thuộc và không phụ thuộc vào L-tryptophan Kết quả khảo sát cũng chỉ ra rằng hai chủng Ng vanlangensis sinh tổng hợp IAA qua con đường phụ thuộc L-tryptophan và có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật thông qua cơ chế tạo hormone auxin.

Bảng 3.6 Hoạt tính sinh tổng hợp IAA của hai chủngNg vanlangensis

TN01LGI T và VTH-AC01

Môi trường LGI bổ sung

Lượng IAA tạo thành (àgml -1 )

Ngày 2 Ngày 3 Ngày 5 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 5 Nguồn carbon 1% D-glucose và

3.2.4 Tăng cường sự biểu hiện gen pr-1, gen kháng bệnh ở thựcvật

Vi khuẩn Ng vanlangensis TN01LGI T và VTH-AC01 thể hiện khả năng cố định đạm, chuyển hóa hợp chất chứa lân và kẽm thành dạng hòa tan, hỗ trợ sự sinh trưởng và trao đổi chất ở thực vật thông qua các cơ chế tác động trực tiếp và gián tiếp Mặc dù nghiên cứu về cơ chế gián tiếp của vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật còn hạn chế, nhưng một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chủng Ga diazotrophicus và Ga azotocaptans có khả năng kháng bệnh Theo Bashan và de Bashan, vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật theo cơ chế gián tiếp, được gọi là vi khuẩn kiểm soát sinh học, có thể làm giảm khả năng gây hại của tác nhân gây bệnh bằng cách điều chỉnh môi trường và hạn chế các chất cần thiết cho sự sinh trưởng của chúng Đồng thời, vi khuẩn kiểm soát sinh học cũng có thể tăng cường tính đề kháng của thực vật đối với các tác nhân gây bệnh thông qua việc kích thích hoạt động của các gen kháng bệnh.

Định danh và đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật của chủng phân lậpNeoasaia sp.VTH-Ai107 100

Trong các vi khuẩn acetic có tiềm năng kích thích sinh trưởng thực vật, chủng VTH-Ai107 thuộc chi Neoasaia đã được xác định và có nguồn gốc từ hoa gừng đỏ Từ khi phát hiện vào năm 2005, chi Neoasaia được xem là hiếm gặp do không có nhiều chủng được ghi nhận Chủng VTH-Ai107 có vị trí phát sinh tách biệt so với chủng chuẩn AC28 T, cho thấy khả năng là đại diện của một loài Neoasaia mới Ngoài ra, chủng này cũng được xem là tiềm năng trong việc kích thích sinh trưởng thực vật nhờ vào quá trình tăng sinh trong môi trường vô đạm LGI từ mẫu thân mía Do đó, VTH-Ai107 được ưu tiên cho các nghiên cứu tiếp theo để xác định xem đây có phải là loài mới hay không, đồng thời khảo sát khả năng cố định đạm và sinh hormone IAA để đánh giá vai trò của nó trong việc kích thích sinh trưởng thực vật.

3.3.1 Phân loại theo đặc điểm vật chất ditruyền

Phân tích mối quan hệ sinh loài của chủng Neoasaiasp VTH-Ai107 với chủng chuẩn AC28 T của loài N chiangmaiensis và các loài thuộc chi Asaiakêcận được thực hiện thông qua các phương pháp xây dựng cây phát sinh loài như NJ, MP và ML Phương pháp NJ dựa trên ma trận khoảng cách di truyền, trong khi phương pháp ML tập trung vào khả năng xảy ra của các nucleotide Phương pháp MP phân tích sự tối thiểu hóa thay đổi tiến hóa giữa các trình tự Các cây phát sinh loài NJ, MP và ML được xây dựng từ dữ liệu trình tự dài 1.393bp, cho thấy mối quan hệ rõ ràng giữa các chủng.

Khoảng cách nhánh giữa VTH-Ai107 và AC28 lớn hơn khoảng cách giữa các chủng chuẩn của hai loài Asai, trong đó As.spathodeaev và As.siamensis có mối quan hệ gần nhất Do đó, chủng phân lập VTH-Ai107 có thể đại diện cho loài Neoasai thứ hai.

Hình 3.17 Quan hệ phát sinh loài của chủngNeoasaiasp VTH-Ai107 Câyphát sinhloàiđượcxâydựngtheophươngphápNJ(a),MP(b)vàML(c)với1.393basegen mã hóa 16SrRNA

Chú thích: Giá trị boostrap từ 1.000 lần lặp lại Chủng ngoài nhóm làA acetiNBRC 14818 T

Bảng3.7.Sosánhkhoảngcáchnhánhphátsinhloàitínhtừđiểmphânnhánhgiữa chủng VTH- Ai107 và AC28 T với S 60-1 T và GB 23-2 T trên các cây phát sinh loài theo phương pháp NJ,

Cây phát sinh loài theo phương pháp

Khoảng cách nhánh phát sinh loài tính từ điểm phân nhánh giữa chủng VTH-Ai107 và AC28 T

NJ(giá trị trung bình nucleotide thay thế ởmỗi vị trí) 0,001 và 0,001 0,000 và 0,000

MP(trung bình số nucleotide khác biệt trêntrình tự) 1,000 và 2,000 1,000 và 0,000

ML(giá trị trung bình các nucleotide thaythế ở mỗi vị trí) 0,001 và 0,001 0,001 và 0,000

Bảng3.8.MứcđộtươngđồngDNA-DNAbộgengiữachủngNeoasaiasp.VTH- Ai107 vớiN chiangmaiensisAC28 T (=TBRC 1 T ) vàK baliensisNBRC16664 T

% tương đồng khi lai với với DNA bộ gen đánh dấu huỳnh quang chủng VTH-Ai107 TBRC 1 T NBRC 16664 T

Dựa trên mối quan hệ phát sinh loài từ trình tự 16S rDNA, bộ gen của chủng Neoasaiasp VTH-Ai107 và N chiangmaiensis AC28 đã được thu nhận theo phương pháp trình bày trong mục 2.2.4.2 Điều này nhằm chuẩn bị cho thí nghiệm lai DNA-DNA để đánh giá mức độ tương đồng về DNA giữa chủng VTH-Ai107 và chủng chuẩn TBRC.

Chủng chuẩn Kozakia baliensis NBRC 16664 T có mối quan hệ phát sinh loài gần nhất với chi Neoasia, trong khi chi Neoasia là chi đơn loài và Kozakia là chi kế cận Neoasia Kết quả lai DNA-DNA cho thấy độ tương đồng cao về trình tự DNA giữa chủng phân lập VTH-Ai107 và chủng chuẩn của loài Neoasia duy nhất, với tỷ lệ tương đồng lần lượt là 87,67% và 99,83% Mức độ tương đồng này vượt xa giá trị phân định 70% giữa hai loài khác nhau Do đó, chủng phân lập VTH-Ai107 được xác định là thuộc loài N chiangmaiensis.

3.3.2 Một số ghi nhận về đặc điểm N chiangmaiensis AC28 T vàVTH-Ai107

Mặc dù chủng VTH-Ai107 được xác định thuộc loài N chiangmaiensis, nhưng trong quá trình khảo sát đột biến DNA, một số đặc điểm hình thái đã được nghiên cứu và ghi nhận sự khác biệt giữa hai chủng AC28 T (=TBRC1 T) và VTH-Ai107, cũng như sự khác biệt so với công bố của Yukphan et al Do đó, luận án trình bày các kết quả khảo sát ghi nhận những khác biệt này.

Khuẩn lạc của chủng N chiangmaiensis VTH-Ai107 có hình dạng tròn, rìa trơn và sáng bóng, với màu sắc từ kem đến kem hồng, tương tự như chủng chuẩn TBRC 1 T Tuy nhiên, sắc hồng của VTH-Ai107 nhạt hơn so với chủng chuẩn Điều này cho thấy hình thái khuẩn lạc của chủng N chiangmaiensis thu thập tại Việt Nam có sự khác biệt so với chủng chuẩn được thu thập tại Thái Lan.

Hình 3.18 Hình thái khuẩn lạc chủngN chiangmaiensisTBRC 1 T (a) và VTH- Ai107 (b) sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường GECA ở 30C

N chiangmaiensis, loài duy nhất trong chi Neoasaia, được mô tả bởi Yukphan et al là không có khả năng di động Tuy nhiên, khảo sát nhuộm tiên mao cho thấy cả chủng chuẩn N chiangmaiensis TBRC 1 T và chủng phân lập VTH-Ai107 đều có hệ thống mao, chứng tỏ rằng loài này thực sự có khả năng di động thông qua chu mao, khác với mô tả ban đầu.

Hình 3.19 trình bày tế bào chủng N chiangmaiensis TBRC 1 T (a) và VTH-Ai107 (b) được quan sát qua kính hiển vi quang học với độ phóng đại x100 Trong hình, mũi tên màu xanh chỉ tiên mao, trong khi mũi tên màu đỏ chỉ tế bào.

- Đặc điểm tạo polysaccharide nhày dạnglevan

Khảo sát đặc tính tạo levan trên môi trường thạch chứa 3,5% sucrose (w/v) đối với chủng VTH-Ai107 được thực hiện cùng các chủng chuẩnN chiangmaiensisTBRC

Hình 3.20 So sánh đặc tính sinh polysaccharide dạng levan giữa chủng VTH- Ai107 (Ai107),N chiangmaiensisTBRC 1 T (TBRC 1),A acetiNBRC 14818 T (AA25) vàNg. vanlangensisTN01LGI T (TN01) ở ngày nuôi cấy thứ 3 (a) và thứ 5(b)

Kết quả khảo sát cho thấy, ngoại trừ chủng NBRC 14818 T không sinh nhày dạng levan, ba chủng còn lại đều tạo ra lượng nhày và lượng nhày này tích lũy nhiều hơn theo thời gian nuôi cấy Kết quả báo cáo trong luận án là từ 5 lần lặp lại Yukphan et al không ghi nhận sự tạo nhày của loài N chiangmaiensis trong môi trường chứa sucrose, tuy nhiên, khảo sát trong luận án cho thấy cả chủng chuẩn và chủng phân lập N chiangmaiensis đều sinh ra khá nhiều polysaccharide nhày.

- Đặc điểm sinh sắc tố tan màunâu

Khảo sát đặc tính sinh sắc tố tan màu nâu trong môi trường thạch GYC đối với chủng VTH-Ai107 được thực hiện cùng các chủng chuẩnN chiangmaiensisTBRC

1 T ,Ga diazotrophicusPAl T vàNg vanlangensisTN01LGI T

Hình 3.21 trình bày sự so sánh đặc tính sinh sắc tố tan màu nâu của các chủng VTH-Ai107 (Ai107), N chiangmaiensis TBRC 1 T (TBRC 1), Ga diazotrophicus PAl5 T (A05) và Ng vanlangensis TN01LGI T (TN01) vào ngày nuôi cấy thứ 3 và thứ 5.

Kết quả khảo sát cho thấy, chủng VTH-Ai107 tạo sắc tố màu nâu tan trong môi trường với độ đậm tương đương chủng TN01LGI T và nhạt hơn chủng PAl1 T Trong khi đó, chủng TBRC 1 T không xuất hiện màu nâu tan trong môi trường Đặc tính không sinh sắc tố tan màu nâu trong môi trường GYC ở chủng chuẩn N.chiangmaiensis tương tự công bố của Yukphan et al Như vậy, chủng N.chiangmaiensis có đặc tính sinh sắc tố nâu tan khác biệt so với chủng chuẩn.

3.3.3 Một số đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật của N chiangmaiensis TBRC

Nuôi cấy hai chủng N chiang maiensis TBRC 1 T và VTH-Ai107 trong môi trường bán rắn LGI đã được thực hiện qua bốn thế hệ Sau đó, sinh khối được cấy ria và tiếp tục phát triển trong môi trường bán rắn trên đĩa thạch LGI.

Hình 3.22 Sinh khối hai chủngN chiangmaiensisVTH-Ai107 và TBRC 1 T trên đĩa thạch LGI sau 7 ngày ủ ở30C

Chủng N chiangmaiensis VTH-Ai107, phân lập từ thân mì, và chủng chuẩn TBRC 1 T, phân lập từ hoa riềng đỏ, đều có khả năng cố định đạm Đặc biệt, N chiangmaiensis là loài duy nhất trong chi Neoasai, thuộc họ Acetobacteraceae, và được xác định là chi tiếp theo trong nhóm kích thích sinh trưởng thực vật.

- Sinh tổng hợp hormone thực vậtauxin

Khảo sát đặc tính sinh tổng hợp hormone IAA hai chủngN chiangmaiensisTBRC

Nghiên cứu về hai chủng N chiangmaiensis T và VTH-Ai107 đã được thực hiện trong bốn loại môi trường khác nhau, với thành phần chính là môi trường LGI chứa D-glucose hoặc sucrose và L-tryptophan với nồng độ 0 àg/ml hoặc 200 àg/ml Sau 7 ngày nuôi cấy ở 30°C, hàm lượng IAA được xác định trong môi trường Kết quả cho thấy cả hai chủng đều sản sinh auxin trong môi trường có L-tryptophan, trong khi không có auxin được sinh ra trong môi trường không chứa L-tryptophan Điều này chứng tỏ rằng cả hai chủng đều có khả năng tổng hợp auxin theo con đường phụ thuộc vào tryptophan, góp phần làm rõ thêm đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật của N chiangmaiensis thông qua việc sản xuất hormone auxin.

Bảng3.9.HàmlượngIAAdochủngN.chiangmaiensisVTH-Ai107vàTBRC1 T sinh ra sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường LGI

Mụi trường LGI chứa Hàm lượng IAA (àg/ml) sinh ra do chủng

ĐặcđiểmphânloạihaichủngAcetobactersp.VTH-Ai14vàVTH-Ai15;loàimới

Ngoài chủng Neoasaiasp VTH-Ai107, hai chủng Acetobactersp VTH-Ai14 và VTH-Ai15 được phân lập từ thân mía tại tỉnh Bình Phước đã được chọn để nghiên cứu khả năng hình thành loài mới và đặc tính kích thích sinh trưởng thực vật.

3.4.1 Mối quan hệ phát sinh loài và trình tự gen 16S rRNA và tổ hợp gen dna K ,gro EL và rpo B

- Mối quan hệ phát sinh loài và trình tự gen 16SrRNA

Bài viết tiến hành xây dựng cây phát sinh loài dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rRNA của hai chủng Acetobacter sp VTH-Ai14 và VTH-Ai15, so sánh với 28 chủng chuẩn đã biết trong chi Acetobacter Các cây phát sinh loài được xây dựng bằng phương pháp NJ, ML và MP, sử dụng chuỗi trình tự dài 1.275 bp đã được sắp xếp theo cột Cả ba cây đều bao gồm các chủng chuẩn như G oxydans NBRC 14819 T, Ne tanensis BCC 25711 T, Sw samuiensis AH83 T và Sa floricola S-877 T làm chủng ngoài nhóm.

Hình 3.23 Mối quan hệ phát sinh loài của hai chủngAcetobactersp VTH-Ai14 và VTH-Ai15 trong chiAcetobacter

Cây phát sinh loài được xây dựng dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rRNA bằng phương pháp ML, với các chủng ngoài nhóm là chủng chuẩn của G oxydans, Sa floricola, Ne tanensis và Sw samuiensis Kết quả boostrap từ 1.000 lần lặp lại được thể hiện ở các vị trí phân nhánh.

Thanh ngang biểu diễn mức độ khác biệt trình tự 0,02

Bảng 3.10 trình bày độ tương đồng của trình tự gen mã hóa 16S rRNA giữa hai chủng VTH-Ai14 và VTH-Ai15 so với các chủng chuẩn, được phân tích trên cây phát sinh loài gần nhất theo phương pháp ML.

Chủng Độ tương đồng trình tự 16S rDNA (%)

Trên các cây phát sinh loài được xây dựng bằng phương pháp NJ, MP và ML, hai chủng Acetobacter sp VTH-Ai14 và VTH-Ai15 nằm trên cùng một nhánh, tách biệt hoàn toàn với nhánh của chủng chuẩn gần nhất là A nitrogenifigens RG1 T Giá trị bootstrap cho thấy mức độ tin cậy về mối liên hệ giữa các nhánh này rất cao, từ 99% đến 100% Hình ảnh phát sinh loài từ các phương pháp NJ, MP và ML cũng chỉ ra rằng cả ba chủng RG1 T, VTH-Ai14 và VTH-Ai15 thuộc về một cụm phát sinh loài gần gũi với cụm của hai chủng A aceti NBRC.

Hai chủng Acetobacter VTH-Ai14 và VTH-Ai15 có giá trị bootstrap 67%, cho thấy sự ổn định và đáng tin cậy trong mối quan hệ phát sinh loài giữa chúng và các loài đã biết Khoảng cách nhánh phát sinh loài của hai chủng này so với chủng chuẩn A.nitrogenifigens là 0,005, cao hơn so với khoảng cách 0,004 giữa chủng chuẩn của A.acetiv và A.sicerae Độ tương đồng trình tự 16S rDNA giữa hai chủng khảo sát và A.nitrogenifigens RG1 T đạt 99,65%, đây là giá trị cao nhất giữa các chủng trong chi Acetobacter Hai chủng VTH-Ai14 và VTH-Ai15 hoàn toàn tương đồng về trình tự 16S rDNA Trong khi đó, các loài A.lovaniensis, A.fabarum, A.cerevisiae và A.malorum có độ tương đồng cao nhất là 99,8%, vượt trội hơn so với hai chủng khảo sát Các giá trị này được tính toán dựa trên trình tự dài 1.331bp đã được sắp xếp.

Kết quả phân tích gen 16SrRNA cho thấy hai chủng VTH-Ai14 và VTH-Ai15 không thuộc bất kỳ chủng nào đã được công nhận trong chi Acetobacter, mà là một loài mới có mối quan hệ gần nhất với hai loài A nitrogenifigens và A aceti.

Mối quan hệ phát sinh loài giữa các tổ hợp gen dnaK, groEL và rpoB được khảo sát trong vi khuẩn acetic nhằm phân tích phân loại và định danh Nghiên cứu năm 2010 đã xác định vị trí phân loại của G xylinus LMG 18788 và khảo sát 37 chủng vi khuẩn thuộc chi Gluconacetobacter cùng 38 chủng vi khuẩn acetic khác Từ 10 gen giữ nhà, bao gồm recA, dnaK, rpoB, atpD, groEL, glnA, thrC, gyrA, gltA và infB, tổ hợp vùng trình tự được chọn đánh giá với ít nhất 3 gen để tránh hiện tượng chuyển ngang và tái tổ hợp Kết quả cho thấy tổ hợp gen dnaK, groEL và rpoB có khả năng phân nhánh tốt, với phần trăm tương đồng cao hơn nhiều so với các gen riêng lẻ, từ đó đề xuất sử dụng tổ hợp này trong phân tích phát sinh loài vi khuẩn acetic.

Hai chủng VTH-Ai14 và VTH-Ai15 đã được giải trình tự một phần gen giữ nhà như dnaK, groEL và rpoB Trình tự tổ hợp một phần của các gen này từ 16 chủng chuẩn Acetobacter và hai chủng ngoài nhóm Ga liquefaciens LMG 1381 T đã được phân tích.

Granulibacter besthedensis CGDNIH1 T được tải từ Genbank, theo mã tra khảo trong các công bố của Cleenwerck et al., Li et al., và Pitiwittayakul et al Sau khi sắp xếp theo cột, trình tự tổ hợp một phần gendnaK đã được thực hiện.

Cây phát sinh loài được xây dựng dựa trên ba gen: 528 bp của gen bp, 579 bp của gen groEL và 573 bp của gen rpoB, sử dụng phương pháp ML để phân tích mối quan hệ phát sinh loài giữa VTH-Ai14 và VTH-Ai15 với các loài Acetobacter có mối quan hệ gần gũi (Hình 3.24).

Hình 3.24 Vị trí phát sinh loài hai chủng VTH-Ai14 T và VTH-Ai15 trong chi

Acetobacterở cây phát sinh loài tổ hợp một phần gendnaK,groEL vàrpoB

Cây phát sinh loài được xây dựng từ 1.676 bp bằng phương pháp ML, với chủng chuẩn của Ga liquefaciens và Granulibacter bethesdensis là chủng ngoài nhóm Các chữ số ở đầu các nhánh thể hiện phần trăm giá trị bootstrap từ 1.000 lần lặp lại, trong khi thanh ngang biểu thị sự khác biệt 0,05% trong trình tự.

Kết quả phân tích phát sinh loài cho thấy hai chủng VTH-Ai14 và VTH-Ai15 thuộc cùng một nhánh phát sinh loài với giá trị bootstrap 100% Hai chủng này nằm trong cùng cụm lớn phát sinh loài với các loài A aceti, A sicerae, A estunensis, A oeni và A nitrogenifigens Đặc biệt, hai chủng khảo sát có mối quan hệ gần nhất với A nitrogenifigens, tương tự như các cây phát sinh loài được xây dựng dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rRNA.

23498 T là100%.PhântíchphátsinhloàidựatrêntrìnhtựtổhợpgendnaK,groELvà rpoB tiếp tục cho thấy hai chủng VTH-Ai14 và VTH-Ai15 sẽ hình thành loài

TrìnhtựthunhậntừkếtquảgiảitrìnhtựmộtphầncácgendnaK,groELvàrpoB đượctiếnhànhthủtụcnộpvàongânhàngdữliệuGenbankvàđượccấpcáccácmãtrình tự trình bày ở Bảng3.11.

Bảng 3.11 Mã trình tự các gendnaK,groEL vàrpoB của hai chủngAcetobacter sp VTH-Ai14 và VTH-Ai15 do ngân hàng dữ liệu Genbank cấp

Trình tự gen Mã tra khảo trên GenBank

Chủng VTH-Ai14 Chủng VTH-Ai15 dnaK MK751131 MK751132 groEL MK751133 MK751134 rpoB MK751135 MK751136

3.4.2 Độ tương đồng DNA-DNA bộ gen và phần trăm thành phầnnucleotide

Khảo sát độ tương đồng trình tự DNA giữa hai chủng VTH-Ai14 và VTH-Ai15 với chủng chuẩn của A aceti và A nitrogenifigens nhằm khẳng định khả năng hình thành loài Acetobacter mới Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích bộ gen các chủng A aceti NBRC để xác định mối quan hệ gần gũi giữa chúng.

Hai chủng Acetobacter VTH-Ai14 và VTH-Ai15, cùng với chủng 14818 T, A nitrogenifigens TBRC 15 T, được thu nhận theo phương pháp mô tả trong mục 2.2.4 Sau khi tách chiết và tinh sạch, các sản phẩm DNA bộ gen được sử dụng cho các phương pháp lai DNA-DNA Kết quả cho thấy độ tương đồng DNA bộ gen giữa hai chủng VTH-Ai14 và VTH-Ai15 đạt trên 70%, bao gồm cả khi đánh dấu huỳnh quang DNA bộ gen của từng chủng Điều này chứng tỏ rằng hai chủng Acetobacter này thuộc cùng một loài Mức độ tương đồng DNA bộ gen giữa VTH-Ai14 và VTH-Ai15 với NBRC cũng được ghi nhận.

Tiêu đề	Nghiên cứu phát sinh loài, phân loại và đặc điểm các chủng vi khuẩn acetic kích thích sinh trưởng thực vật phân lập tại các tỉnh phía nam Việt Nam
Tác giả	Vũ Thị Lan Hương
Người hướng dẫn	PGS. TS. Lê Thanh Bình, GS. TS. Naoto Tanaka
Trường học	Học viện Khoa học và Công nghệ
Chuyên ngành	Công nghệ Sinh học
Thể loại	Luận án Tiến sĩ
Năm xuất bản	2022
Thành phố	Tp. Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	252
Dung lượng	9,5 MB