Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime pcr phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh

BỘGIÁODỤC VÀĐÀOTẠO VIỆNHÀNLÂMKHOAHỌCV ÀCÔNGNGHỆVIỆTNAM HỌCVIỆNKHOAHỌCVÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄNTHỊLOAN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ SINH PHẨM MULTIPLEXREALTIMEPCRPHÁTHIỆNMỘTSỐTÁCNHÂN GÂYNHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN VÀ KHẢO SÁT TÍNHKHÁNGKHÁNGSINH LUẬNÁNTIẾNSĨ SINH HỌC HàNội,2022 NGUYỄNTHỊLOAN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN BỘ SINH PHẨM MULTIPLEXREALTIMEPCRPHÁTHIỆNMỘTSỐTÁCNHÂN GÂYNHIỄMKHUẨNBỆNHVIỆNVÀ KHẢOSÁT TÍNHKHÁNGKHÁNGSINH Chuyênngành:Côngnghệsinhhọc Mãsố:9420201 LUẬNÁNTIẾNSĨSINH HỌC NGƢỜIHƢỚNGDẪNKHOAHỌC: TS.LãThịHuyền PGS.TS.Nguyễn Minh Hiền Hà Nội,2022 LỜI CAMĐOAN Tôi xin cam đoan: cơng trình nghiên cứu tơi số kết quảcùngcộngtácvớicáccộngsự khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần đãđƣợc cơng bố tạp chí khoa học chun ngành với đồng ý cho phép củađồngtácgiả.Phầncịnlạichƣađƣợcaicơngbốtrongbấtkìcơngtrìnhnàokhác Tơix i n đ ả m b ả o t í n h k h c h q u a n v k ế t q u ả x l ý s ố l i ệ u t r o n g n g h i ê n cứunày HàNội,ngày tháng Nghiêncứusinh NguyễnThịLoan năm2022 LỜICẢMƠN Trƣớc tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tớiTS Lã Thị Huyền,Trƣởngphòng Công nghệ tế bào động vật- Viện CNSH vàPGS.TS Nguyễn Minh Hiền,Trƣởng khoa Sinh hoá - Bệnh viện Thanh Nhàn ngƣời trực tiếp hƣớngdẫn giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu Các Cơ bảo cho tơi nhiều ýkiếnhƣớngdẫnqúybáu,độngviênvàgiúpđỡtơigiảiquyếtnhữngkhókhănvƣớngmắc q trìnhthựchiệnluậnánvàtạomọiđiềukiệnchotơihồnthànhluậnánnày Tơi xin chân thành cảm ơn tới tập thể cán nghiên cứu phịng Cơng nghệ tếbàođộngvật-ViệnCNSH-ViệnHànLâmKHvàCNViệtNamđãgiúpđỡ,tạođiều kiện thuận lợi cho tơi q trình thực nghiên cứu Tơi xin trântrọng cảm ơn anh chị khoa Sinh hoá, khoa Vi sinh, khoa Hồi sức tích cực,bệnh viện Thanh Nhàn, khoa Hồi sức tích cực bệnh viện Đức Giang, đặc biệt emNguyễnTrọngLinhđãlnđồng hànhcùngtơitrongqtrìnhnghiêncứu Tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô khoaCNSH- H ọ c v i ệ n K H v C N , thầy cô hội đồng nghiên cứu sinh nhiệt tình dạy bảo giúp đỡ tơi, chotơicácý kiếnqbáuđểsửachữa hồn thiệnluậnánnày Tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình ln hỗ trợ tạo điều kiện tốt nhấtchotơichun tâmlàm việc hồn thànhluậnán Cuối tơi xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, đồng nghiệp Khoa NôngLâm trƣờng Đại học Hoa Lƣ động viên giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợichotôitrong trìnhhọc tập,nghiêncứuvàcơngtác HàNội,ngàyt h n g năm2022 Tácgiả NCS.NguyễnThị Loan MỤCLỤC Trang Trangphụ bìa Lờicamđoan…………………………………………………………………… i Lờicảmơn……………………………………………………………………… ii Mụclục……………………………………………… ………… iii Danh mụccáckíhiệu,cácchữviếttắt………………………………………… v Danhmụccácbảng…………………………………………………… ……… vi Danhmụccáchình……………………………………………………… viii MỞĐẦU………………………………………………………………… CHƢƠNG1.TỔNGQUAN 1.1 Tìnhhìnhvàcănnguyênvikhuẩngây nhiễmkhuẩnbệnh viện… 1.1.1 Lịchsửpháthiệnvànghiêncứuvềnhiễmkhuẩnbệnhviện…… 1.1.2 Tìnhhìnhnhiễmkhuẩnbệnhviện hiệnnay…………………………… 1.1.3 Cănnguyênvikhuẩn gâynhiễmkhuẩnbệnh viện…………………… 1.2 10 Mộtsốkỹthuậtpháthiệnvikhuẩn gây nhiễmkhuẩnbệnhviện… 1.2.1 Cấymáuvàxétnghiệmsinhhoá ……………………………………… 10 1.2.2 Kỹthuậtxác định sựcómặt củaDNA ……………………………………… 11 1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng multiplex realtime PCR xác địnhcácvikhuẩngây nhiễmkhuẩnbệnhviện 15 …………………………… 1.3.1 Trênthếgiới…………………………………………………………… 15 1.3.2 ỞViệtNam…………………………………………………………… 17 1.4 19 Khángsinhvà khángkhángsinhởvikhuẩn…………….………… 1.4.1 Khángsinhvàcơ chếtácđộng………………………………………… 19 1.4.2 Khángkhángsinh củavikhuẩnvàcơchếkhángkhángsinh………… 21 1.4.3 Tìnhhình khángkháng sinhcủavi khuẩn trênthếgiớivàởViệt Nam… 28 CHƢƠNG2.NGUYÊNVẬTLIỆUVÀPHƢƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 35 2.1 Đốitƣợngnghiêncứu…………………………………………… 35 2.1.1 Các mẫubệnhphẩm…… …………………………………………… 35 2.1.2 Cáchtínhcỡ mẫu nghiêncứu………………………………………… 35 Nguyênvậtliệu nghiêncứu………………………………………… 2.2 2.2.1 Nguyênvật liệu………………………………………………………… 36 36 2.2.2 Cácthiếtbị…………………………………………………………… 36 2.2.3 Hoáchất……………………………………………………………… 36 Phƣơngphápnghiêncứu…………………………………… …… 38 2.3.1 Nhómphƣơngphápvisinhtruyềnthống…………………………… 38 2.3.2 Phƣơngphápsinhhọcphântử………………………………………… 39 2.3.3 Phƣơng pháp kiểm tra độ nhậy, độ đặc hiệu, độ ổn định, ngƣỡng pháthiệncủabộsinhphẩmmultiplexrealtimePCR……………………… 2.3.4 Phƣơngphápthốngkê………………………………………………… 46 2.3 2.4 Đạođứcnghiêncứu…………………………………………………… CHƢƠNG3.KẾTQUẢVÀTHẢOLUẬN……………………………… 3.1 Kếtquảphânlậpcácchủngvisinhvậtgâynhiễmkhuẩnbệnhviện… 48 48 50 50 3.1.1 Kếtquả phânbốxétnghiệmtheoloạibệnhphẩm………………… 51 3.1.2 Tỉlệcácloạivisinhvậtphânlậpđƣợc………………………………… 52 3.1.3 Kếtquảphântíchgen16SrARNtừ cácchủngvikhuẩn phânlập…… 53 3.2 Kết phát triển sinh phẩm multiplex realtime PCR xác địnhđồngthời 5tácnhân vikhuẩngây nhiễmkhuẩnbệnhviện.……… 3.2.1 Kếtquảlựachọn,phântíchtrìnhtựgenđích………………………… 55 3.2.2 Kếtquảthiếtkếmồivà mẫudị………………………………………… 58 3.2.3 Kếtquảkiểmtrađộđặchiệucủamồivà mẫu dịvớigenđích ……… 60 3.2.4 Kếtquảphảnứng multiplexrealtimePCR trêncácchủng chuẩn…… 71 3.2.5 KếtquảtốiƣuphảnứngrealtimePCR………….…………………… 75 3.2.6 Kếtquảxácđịnhngƣỡngpháthiện…………………………………… 77 3.2.7 Kếtquảtạocácđốichứngdƣơng…………………….………………… 78 3.2.8 Kếtquảxácđịnhđộnhạy, độđặchiệu……………………………… 82 3.2.9 Kếtquảxácđịnhđộổn định…………………………………………… 87 55 3.3 Kết kháng sinh đồ chủng vi khuẩn nghiên cứu genmãhoábeta-lactamasemởrộngcủavikhuẩnE.coli………………… 3.3.1 Kếtquảkhángsinhđồ………………………………………………… 91 3.3.2 Kếtquảxácđịnhgen mãhốbeta-lactamasephổrộngcủaE.coli…… 98 KẾTLUẬNVÀKIẾN NGHỊ……………………………………… ……… 105 DANHMỤCCÁC CƠNGTRÌNHCỦATÁC GIẢ TÀILIỆUTHAMKHẢO PHỤLỤC 92 DANHMỤCCÁCKÝHIỆU, CÁCCHỮVIẾTTẮT Phầnviết tắt Phầnviết đầyđủ Ac Acinetobacterbaumannii BV Bệnhviện Ct Thresoldcycle(chukìngƣỡng) CTX-M Cefotaxime-Munich DNA DeoxyribonucleicAxit Ec Escherichiacoli ECDC EuropeanCentreforDiseaseControland Prevention(Trungtâm kiểmsốtvàphịngngừadịchbệnhChâu) ESBL Extended-SpectrumBeta-lactamase (beta-lactamasephổrộng) FN FallNegative(âmtínhgiả) FP FallPositive(dƣơngtínhgiả) GADPH Glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase HAI HospitalAquired-Infections Hu Human I Intermediate(trung gian) Kp Klebsiellapneumoniae MRSA Methicillin-ResistantStaphylococcusaureus MSSA Methicillin-SusceptibleStaphylococcusaureus NK Nhiễmkhuẩn NKBV Nhiễmkhuẩnbệnh viện Pa Pseudomonasaeruginosa PCR PolymeraseChainReaction S Sensitivity(nhạycảm) Sa Staphylococcusaureus R Resistant(đềkháng) VSV Visinhvật WHO WorldHealthyOrganization(TổchứcYtếThếgiới) DANHMỤCCÁCBẢNG Trang Bảng1.1 Tỷlệcác tácnhân vi khuẩngâyNKBV……………………………… Bảng1.2 Tỷlệnhiễmkhuẩnbệnhviệnvàloạinhiễmkhuẩnthƣờnggặp……… Bảng1.3 Tỷlệnhiễmkhuẩn bệnhviệnvàloạinhiễmkhuẩncótỷlệcaonhất… Bảng2.1 Trìnhtựcáccặp mồi, mẫudịvàgenđíchcủacácchủng vikhuẩn …… Bảng2.2 Trìnhtựmồi16SrARNvàgenmãhốESBL……………………… 38 Bảng2.3 ThànhphầnvàchƣơngtrìnhchạyphảnứngPCR………………… 42 Bảng2.4 ThànhphầnphảnứngmutiplexrealtimePCRkiểmtrađộđặchiệucủa mồivà mẫudịvớiDNAđích………………… Bảng2.5 37 44 ThànhphầnphảnứngmutiplexrealtimePCRkiểmtrađộđặchiệucủa mồivà mẫudịvớiDNAđíchcủavikhuẩn…………………………… 45 Bảng2.6 Thànhphần phảnứng multiplexrealtimePCRtrêncácchủngchuẩn… 45 Bảng2.7 Thànhphần phảnứngrealtimePCRtrên mẫu chủngchuẩn………… 46 Bảng3.1 Tỷlệxétnghiệmvà tỷlệcấydƣơngtínhtheoloạibệnhphẩm……… 51 Bảng3.2 Tỷlệphânlậpvisinhvậttheoloạibệnhphẩm……………………… 52 Bảng3.3 Cácmồivà mẫudịchophảnứngrealtime PCR……………… 58 Bảng3.4 Giátrịchukìngƣỡngkiểmtrađộđặchiệucủatừngcặpmồi,mẫudịvới DNAcủavikhuẩnA.baumannii,K.pneumoniaevàDNAngƣời… … … Bảng3.5 Giátrịchukìngƣỡngkiểmtrađộđặchiệucủatừngcặpmồi,mẫudị vớiDNAcủavikhuẩnS.aureus,E.coli,P.aeruginosa………………… Bảng3.6 62 64 GiátrịchukìngƣỡngcủaphảnứngmultiplexrealtimePCRkiểmtra độđặchiệucủahỗnhợpmồi,mẫudịvớiDNAđíchcủavikhuẩnA Bảng3.7 Bảng3.8 baumannii,K.p n e u m o n i a e vàgen GADPH ………………………… Giátrịchukìngƣỡngkiểmtrađộđặchiệucủahỗnhợpmồi,mẫudị 66 vớiDNA củavikhuẩnE.coli,S.aureus,P.aeruginosa……………… 70 GiátrịchukìngƣỡngcủaphảnứngmultiplexrealtimePCRt r ê n chủngchuẩnA.baumannii,K.pneumoniaevàcủangƣời(Hu)……… 73 Bảng3.9 GiátrịchukìngƣỡngcủaphảnứngmultiplexrealtimePCRt r ê n chủngchuẩnE.coli,S.aureus,P aeruginosa……………………… Bảng3.10 Bảng3.11 Bảng3.12 Bảng3.13 Bảng3.14 Bảng3.15 Giát r ị c h u k ì n g ƣ ỡ n g c ủ a p h ả n ứ n g m u l t i p l e x r e a l t i m e P C R ởcác nhiệtđộkhácnhau……………………………………… Giátrịc h u k ì n g ƣ ỡ n g c ủ a p h ả n ứ n g m u l t i p l e x r e a l t i m ePCRvới MastermixIDTvà HQ ……………………………………………… Giátrị chukìngƣ ỡ ng c ủ a phả nứ ng m u l t i p l e x rea ltime PC R với cá c nồngđộphaloãng………………………………………………… Sosá nh p h ƣ n g phá p m u l t i p l e x r e a l t i m e P C R n u ô i c ấ y theom ẫu bệnhphẩm………………………………………………………… Kếtquảp h t h i ệ n l o i v i s i n h v ậ t b ằ n g p h ƣ n g p h pmultiplex realtimePCRsosánhv i phƣơngphápcấymáu…………………… Giátrịchukìngƣỡngcủacácmẫukhảosátthờigianbảoquản 75 76 77 77 86 87 88 Bảng3.16 Tỷlệkhángkháng sinh củaP.aeruginosavàAcinetobactersp……… 93 Bảng3.17 Tỷlệkhángkháng sinh củaE.colivàK.pneumonia…………………… 94 Bảng3.18 Tỷlệkhángkháng sinh củaS.aureus…………………………………… 96 Bảng3.19 Tínhnhạycảmkhángsinhcủa 5chủngE coli………………………… 98 Bảng3.20 CácmẫuE colicómanggenESBLs………………………… 100 DANHMỤCCÁCHÌNH Trang Hình1.1 Địnhnghĩa nhiễmkhuẩnbệnhviện ………………….…………… Hình1.2 Nhântốliênquanđến khảnăngkhángkhángsinhcủavi khuẩn… 22 Hình1.3 Cơchếtraođổivật chấtditruyền giữacácvisinhvật…………… 23 Hình1.4 Cơchếkhángthuốc phổbiếncủavikhuẩn……………………… 23 Hình1.5 Bảnđồvềtìnhtrạngkhángkhángsinhtrênthếgiớiđếnnăm2050 29 Hình2.1 Sơđồnghiêncứu………………………………………………… 49 Hình3.1 Hìnhảnhkhuẩnlạccủacácvikhuẩntrênmơitrƣờngthạchmáu… 50 Hình3.2 HìnhảnhkhuẩnlạccủacácvikhuẩntrênmơitrƣờngChapman… 54 Hình3.3 HìnhảnhđiệndikiểmtraDNAtổngsốcủacácchủngS.aureus, A.baumannii,E.coli, K.pneumoniaevàP.aeruginosa………… Hình3.4 Hìnhả n h n h â n b ả n g e n S r A R N t D N A t ổ n g s ố c ủ a m ộ t s ố chủngvikhuẩnA baumanniivàP.aeruginosa………………… Hình3.5 Hình3.9 S aureusvà genCytcủaK.pneumoniae……………………………… Biểuđ k h u ế c h đ i D N A c ủ a v i k h u ẩ n ( A ) : A b a u m a n n i i , (B): 61 63 Biểuđ k h ả o s t đ ộ đ ặ c h i ệ u c ủ a h ố n h ợ p m i v m ẫ u d ị v i DNAđíchcủavikhuẩn:ốngđối chứngkhơngcóDNA……… Hình3.11 57 Klebsiellapneumoniaevà(C):GADPHcủangƣời……………… Biểu đồkhuếchđạiDNAcủavikhuẩn (A):S.aureus, (B):E.coli, (C):P.aeruginosa………………………………………………… Hình3.10 56 Kếtq u ả P C R n h â n b ả n g e n b l a O X A 51l i k e c ủ a A b a u m a n n i i , gyrBc ủ a P a e r r u g i n o s s a ,g e n Y c c T c ủ a E c ol i ,g e n N u c c ủ a Hình3.8 55 Kiểmtrat ín hđ ặ c h iệ uc cá c c ặ p mồ ivà c c g e n đíc h c c c chủngvikhuẩngâynhiễmkhuẩnhuyếttƣơngứng……………… Hình3.7 55 Hìnhả n h n h â n b ả n g e n S r A R N t D N A t ổ n g s ố c ủ a m ộ t s ố chủngvikhuẩnE coli, S.aureus, K.pneumoniae……………… Hình3.6 54 66 Biểuđ k h ả o s t đ ộ đ ặ c h i ệ u c ủ a h ỗ n h ợ p m i v m ẫ u d ò v i DNAđíchvi khuẩn(A):A baumannii,(B),K pneumoniaevà(C) 67 DNAngƣời…………………………………………………