Nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime pcr phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh

Tìnhhìnhvàcănnguyênvikhuẩngây nhiễmkhuẩnbệnh viện…

Lịchsửpháthiệnvànghiêncứuvềnhiễmkhuẩnbệnhviện

Trong thời kỳ trung cổ, các bệnh viện đã đƣợc thành lập để điều trị các nạnnhân bệnh dịch hạch và sau đó là các bệnh viện với các nhân viên y tế đang phục vụxã hội nhƣ hiện nay Năm 1869, Sir James Young Simpon đã thực hiện nghiên cứudịch tễ học bệnh viện với hơn 4000 bệnh nhân ở Scotlen và Anh, và ông nhận thấytỷ lệ tử vong cao hơn ở những bệnh nhân đã đƣợc ở lại trong bệnh viện điều trị hậuphẫu Ông đã sử dụng thuật ngữ “hospitalism” cho sự rủi ro liên quan đến chăm sóctại bệnh viện Sau nhiều năm các công trình nghiên cứu chuyên sâu của các tác giảOliver Wendell Holmes, Ignaz Philipp Semmelweis, Louis Pasteur, Josheph Listervà Rober Koch đã xác định đƣợc các yếu tố nguy cơ liên quan đến nhiễm khuẩnbệnhviệnvàgiớithiệucácnguyêntắckhắcphụcchínhnhƣrửatayvàkhửtr ùngcácdụngcụtrongphẫu thuậtgiảmsự lantruyềncủabệnhvàtử vong [1].

Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), nhiễm khuẩn bệnh viện đƣợc định nghĩanhƣ sau:“Nhiễm khuẩn bệnh viện là những nhiễm khuẩn mắc phải trong thời gianngười bệnh điều trị tại bệnh viện và nhiễm khuẩn này không hiện diện cũng nhưkhông nằm trong giai đoạn ủ bệnh tại thời điểm nhập viện Nhiễm khuẩn thườngxuấthiệnsau48giờ kểtừ khingườibệnhnhậpviện”[2] (Hình1.1).

Hình1.1 Thời gianxảyranhiễmkhuẩnbệnhviện[2] ĐểchẩnđoánNKBVngườitathườngdựavàođịnhnghĩavàtiêuchuẩnchẩnđoánchotừn gvịtríNKBV.Vídụnhiễmkhuẩnvếtmổsauphẫuthuật,nhiễmkhuẩnmáu có liên quan đến dụng cụ đặt trong lòng mạch, nhiễm khuẩn đường tiếtniệu.Dựatrêncác tiêu chuẩnlâmsàng và sinhhọccácnhà khoa học đã xácđịnh có khoảng50loạinhiễmkhuẩnbệnhviệnkhácnhaucóthểxảyratạibệnhviện.

NKBV dẫn đến nhiều hệ luỵ cho người bệnh và hệ thống y tế như tăng biếnchứngvàtửvongchongườibệnh,kéodàithờigiannằmviệntrungbìnhtừ7đến

15 ngày, tăng sử dụng kháng sinh dẫn đến tăng sự kháng thuốc của vi sinh vật vàtăngchiphíđiềutrị[3],[4].

Tìnhhìnhnhiễmkhuẩnbệnhviện hiệnnay

Tại Châu Âu (2016-2017), tỷ lệ NKBV của khu vực là 6,3% trong đó cácnhiễm khuẩn (NK) thường gặp nhất là: nhiễm khuẩn hô hấp (41,8%), nhiễm khuẩntiêu hoá (20,8%), nhiễm khuẩn tiết niệu (18,4%), tiếp đến là nhiễm khuẩn sau khiphẫuthuật, nhiễmkhuẩndavàmômềmvàmộtsốnhiễmkhuẩn khác[5],[6].

Theo báo cáo của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật Châu Âu(ECDC), tỷ lệ các vi khuẩn gây NKBV (2017) tại một số nước Châu Âu và tỷ lệchungchocả khuvực[7]thểhiệntrênBảng1.1.

Vikhuẩn Bỉ(%) Pháp(%) Ý(%) UK(%) ChâuÂu(%)

Nghiên cứu tại bệnh viện Đại học Truyễn Nhiễm và bệnh Nhiệt đới Serbia, (từ 7/2016 đến 7/2018), tỷ lệ các loại vi khuẩn gây NKBVK. pneumoniae(14%),A.baumannii(13,2%),P aeruginosa(10,8%),E. coli(1,2%),S.aureus(1,6%)[8].

NK đường tiêu hoá,NKtạichỗphẫuthuậ t.

NKtiếtniệu31,9%Vi êm phổi: 23,4%NKvết mổ: 20,2%

NK đường hô hấp dưới18,2%

Nghiêncứucủabệnhviện(BV)BệnhNhiệtđớiTrungươngvàVINAREX(2013)khảosáttrên3671bệnhnhâncủa15khoaHồisứctíchcựctại15BVcủa3 miềnc h o t h ấ y t ỷ l ệ N K B V l à 2 7 , 3 % v à t ỷ l ệ c á c l o ạ i v i k h u ẩ n t h ƣ ờ n g g ặ p :

A baumannii(31%),P.ae ru gi nos a (18%), K.p neu mo ni ae (12%)vàS aureus( 6%)

NKBV có tỷ lệ caonhất

2106 BVTWQuânĐội108[17] 3,86% NKvết mổ:37,25%. 2016-2017 BVĐaKhoaNinhThuận[18] 2,4% NKhôhấp:40,6%

TỷlệNKBVởViệtNamtươngđươngvớicác kếtquảnghiêncứucủaWHOvới qui mô vùng, quốc gia và liên quốc gia, tỉ lệ này dao động từ 2,7% đến 10%người bệnh nhập viện, trong đó các vi khuẩn gây NKBV chủ yếu là các trực khuẩnGram âm với tỷ lệ gần 70% với các vi khuẩn:A baumannii, P aeruginosa, K.pneumoniae, E coli, các vi khuẩn Gram dương chiếm khoảng 30% chủ yếu làS.aureus.

Têncácbệnhviện Ac Pa Kp Ec Sa

Ac:Acinetobacterbaumannii,Pa:Pseudomonasaeruginosa,Kp:Klebsiellapneumoniae,Ec:Escherichiacoli,Sa: Staphylococcus aureus.

Cănnguyênvikhuẩn gâynhiễmkhuẩnbệnh viện

Cáct á c n h â n g â y NKB V b i ế n đ ổ i t h e o n h ó m c ộ n g đ ồ n g d â n c ƣ , c á c c h u y ê n khoađiềutrị khácnhauvàcósự khácnhaugiữacác quốc gia.

S aureuslà vi khuẩn Gram dương hàng đầu gây nhiều bệnh khác nhau từbệnh nhẹ về da, nhiễm trùng đa dạng ở phổi, xương, tim, nhiễm khuẩn huyết vàđóng vai trò quan trọng trong NKBV liên quan đến truyền dịch, ống thở, nhiễmkhuẩn vết bỏng và nhiễm khuẩn vết mổ.S aureuskháng methicillin (MRSA) vàS.aureusmẫn cảm với methicillin (MSSA) là nguyên nhân gây NKBV dẫn tới điều trịkhókhăn[24].

Trong thập kỷ qua các trường hợp nhiễm MRSA ngày càng gia tăng, MRSAgây NKBV và NK mắc phải từ cộng đồng bao gồm viêm nội mạc tim, viêm tuỷxương, hội chứng sốc nhiễm độc, viêm phổi, ngộ độc thực phẩm và nhọt độc [25].MRSA kháng methicillin ở tụ cầu qua trung gian PBP2a, đây là một loại proteinđƣợc gọi là protein liên kết penicillin (78 kDa) Protein này có ái lực thấp với nhómkháng sinh β-lactam GenfemAmã hoá cho protein PBP2a kháng methicillin, do đógennàyđƣợcsửdụngnhƣmộtmarkerphântửpháthiệnMRSA[26],[27].

A.baumanniilàcầutrựckhuẩn,Gramâm,hiếukhí,khônglênmenglucose, được tìm thấy phổ biến trong đất, nước và môi trường.A baumanniicó khả năngthích ứng với điều kiện và môi trường sống đa dạng, tồn tại lâu trong môi trườngbệnh viện, đặc biệt trên những dụng cụ y tế Nhờ khả năng tạo màng sinh học(biofilm) với tính bám dính cao, vi khuẩnA baumanniicó thể gắn chặt vào bề mặt.Loài này đƣợc chỉ ra là nguyên nhân gây các loại nhiễm trùng khác nhau ở bệnhviện bao gồm: nhiễm trùng do viêm phổi, nhiễm trùng máu, nhiễm trùng đường tiếtniệu[28].

Theo các công trình công bố gần đâyA baumanniiđã và đang trở thành vikhuẩnsiêukhángthuốc,nổilênnhƣtácnhânhàngđầugâyNKBVtạicácbệnhviệntrên thế giới. Trước đây, carbapenem thường được sử dụng để điều trị các bệnhnhiễm khuẩn doA baumannii,đặc biệt đối với các chủng kháng thuốc nhƣng hiệnnay không còn hiệu quả bởi sự xuất hiện của các chủng đa kháng hoặc đa khángthuốc phổ rộng Nhiều cơ chế kháng liên quan đến tính kháng carbapenem ởA.baumanniinhƣ sản xuất carbapenemase, bất hoạt kháng sinh, các protein màng bịbiến đổi, tăng biểu hiện các bơm màng hay sự mất các kênh màng, thay đổi tínhthấm của màng Tính kháng với carbapenem ởA. baumanniiliên quan chủ yếu tớisựb i ể u h i ệ n c ủ a β - l a c t a m a s e , c a r b a p e n e m a s e;t r o n gk h i n h ữ n g c ơ c h ế k h á c c h ỉ đóngvait ròthứyế u Bêncạnhđó,carbapenemase phổbiếnnhấtởA.baumanniilà β- lactamasem ã h o á b ở i b l a - O X A Trong mộtn g h i ê n c ứ u c ủ a

G a d s b y N J v à cộng sự (2015) đã sử dụng gen bla-OXA-51 like để phát hiệnA baumanniigâynhiễm trùngđườnghôhấpdưới[29].

K pneumoniaelà vi khuẩn Gram âm, bắt màu đậm ở hai cực, vi khuẩn cónhiều hình thể, có khi nhƣ cầu khuẩn, có khi lại hình dài, có vỏ, không di động,khôngsinhnhabào.Dễmọctrên môitrườngnuôicấythôngthườngnhưthạchdinhdưỡnghaythạchmáu,khuẩnlạclầynhầy, màuxám.

K pneumoniaethường gây bệnh nhiễm khuẩn đường hô hấp, một loại vikhuẩn phát triển rất tốt trong đường hô hấp của người, là mầm “bệnh cơ hội” chiếm10%t ỷ l ệ n h i ễ m k h u ẩ n b ệ n h v i ệ n , l à n g u y ê n n h â n p h ổ b i ế n t r o n g n h i ễ m k h u ẩ n đường tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi ở bệnh nhân suy giảm miễn dịchđồngthờilàtácnhângâybệnhchủyếugâynhiễmkhuẩncộngđồng [30].

Mối nguy hiểm củaK pneumoniaetrong các cơ sở y tế đang gia tăng do khảnăngkhángkhángsinhphổrộngbeta-lactamcủachúng.Cácnghiêncứuchỉrarằng

K pneumoniaek h á n g k h á n g s i n h p h ổ r ộ n g c ó x u h ƣ ớ n g đ a k h á n g t h u ố c d ẫ n đ ế nkhả năng thất bại trong điều trị [31].K. pneumoniaeđã kháng lại tất cả các loạikháng sinh bao gồm cả các kháng sinh mạnh nhất hiện nay nhƣ cephalosporin vàcarbapenem Gadsby NJ và cộng sự(2016)trongm ộ t n g h i ê n c ứ u đ ã c h ọ n g e n citrate synthase (gtlA) để phát hiện vi khuẩn này do gây nhiễm khuẩn đường hô hấpdưới[32].

P.aeruginosa(Trựckhuẩnmủxanh)làtrựckhuẩnGramâm,nhỏ,đứngriênglẻ, thành đôi, có khi xếp thành chuỗi, di động nhờ một lông duy nhất ở một cực, cópili, không có bào tử, là vi khuẩn hiếu khí, phát triển tốt trên các môi trường thôngthường,nhiệtđộ30–

P aeruginosaphát hiện thấy có mặt ở nhiều nơi trong bệnh viện nhƣ: nềnnhà, giường, chăn, đệm, tay nhân viên y tế, dụng cụ y tế Loài này được biết thuộcnhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội thường gây nhiễm khuẩn có mủ ở vết thương, vếtmổ, vết bỏng, từ vết thương vi khuẩn có thể vào máu gây nhiễm khuẩn huyết và cácbệnh nhân nhiễm khuẩn doP aeruginosathường gặp nhiều ở các khoa Hồi sức cấpcứu, khoa Bỏng, khoa Tiết niệu, khoa Chăm sóc bệnh nhân sau phẫu thuật.P.aeruginosac ũ n gl à m ộ t t r o n g n h ữ n g v i k h u ẩ n k h á n g k h á n g s i n h m ạ n h n h ấ t h i ệ n nay, cũng trong cùng một nghiên cứu Gadsby NJ và cộng sự (2016) đã chọn genmục tiêu là DNA gyrase subunit B (gyrB) để phát hiệnP aeruginosagây nhiễmkhuẩn đường hô hấp dưới, bởi vì gen này có tỷ lệ phát hiện cao hơn và đặc hiệu[32].

E colilà vi khuẩn Gram âm phổ biến nhất gây nhiễm khuẩn bệnh viện vàchúng đượctìmthấyvớitầnsuất caoở nhiễmkhuẩn đườnghôhấp vànhiễmkhuẩn đường tiết niệu Cả hai loàiE colivàP aeruginosađều là các tác nhân gây nhiễmkhuẩn bệnh viện nghiêm trọng ở các đơn vị chăm sóc y tế và nhiễm khuẩn cộngđồng[33].

Nhiều nghiên cứu trong nước và quốc tế đã khẳng định vi khuẩnE. coligâynhiễm khuẩn chủ yếu trên đường tiết niệu, sinh dục của phụ nữ và nhiễm khuẩn vếtmổ[34].

Họvikhuẩnđườngruột(Enterobacteriaceae)thườngcưtrútrênđườngtiêuhóa của người và động vật đang là mối quan tâm lớn trong NKBV do có khả năngkháng cao với các nhóm kháng sinh amiglycoside, β-lactam và có khả năng truyềntính kháng qua plasmid Gadsby NJ và cộng sự (2016) đã sử dụng genYccTđể pháthiệnsựcómặtcủavikhuẩnE.coligâynhiễmkhuẩnđườnghôhấpdưới[32].

Mộtsốkỹthuậtpháthiệnvikhuẩn gây nhiễmkhuẩnbệnhviện…

Cấymáuvàxétnghiệmsinhhoá

Phương pháp này dựa vào việc nuôi cấy một mẫu máu trên môi trường giầudinhdƣỡngsauđónhậndiệnvàkiểmtratínhmẫncảmcủacáctácnhângâybệnhs ử dụng các xét nghiệm hóa sinh tiêu chuẩn Cấy máu hiện đang đƣợc cho là tiêuchuẩn vàng để chẩn đoán mầm bệnh trong nhiễm khuẩn bệnh viện Quy trình cấymáuđƣợcthựchiệntrongcáchệthốngkhépkíncótíchhợphệthốngđoliêntụ ccác hằng số hoá lý Sự có mặt của vi sinh vật đƣợc chỉ thị một cách gián tiếp thôngquacácthamsốhoálýnhƣđộđục,sựchuyểnmàucủachai nuôicấy,sựthayđổiápsuấttrongbìnhnuôicấyhaysựbiếnđổinồng độCO2[35].The ocác hướngdẫnmới nhất của các hiệp hội nghề y quốc tế có uy tín thì lượng máu lấy ra phải đảmbảo đủ cho 2 quy trình cấy máu chẩn đoán vi sinh vật hiếu khí và kị khí với thể tíchmẫu bệnh phẩm cho mỗi quy trình cấy máu là 20-30 ml [36] Đây là một khó khănkhi phải tiến hành lấy một lƣợng máu lớn từ các bệnh nhân sơ sinh Một hạn chếkhác của cấy máu đó là phải tiến hành nuôi cấy ngay khi có bệnh phẩm nhằm tránhhiện tƣợng dương tính giả do tạp nhiễm vi sinh vật trong các mẫu bệnh phẩm đượclưu giữ lâu Đặc biệt, quy trình thực hiện cấy máu thường kéo dài từ 48-72 giờ mớicó kết quảvì thếđểkhắc phục tìnhtrạng nhiễmkhuẩn bệnh nhânthường đượcđiều trịtrướcbằngkhángsinhphổrộngnêngâyảnhhưởngkhôngnhỏđếnhiệuquảđiềutrị cũng như làm tăng tính kháng kháng sinh của vi sinh vật gây bệnh ở người bệnh.Kết quả nghiên cứu cho thấy chỉ từ 14,5% đến 25% bệnh nhân được xác địnhnguyênnhângâynhiễmkhuẩnhuyếtbằngcấymáu[37],[38].

Kỹthuậtxác định sựcómặt củaDNA

Việcp h á t h i ệ n s ự c ó m ặ t D N A c ủ a v i k h u ẩ n t r o n g b ệ n h p h ẩ m c ủ a b ệ n h nhân được cho là một phương pháp có độ nhậy cao, thực hiện nhanh, có giá trị hỗtrợ cho cấy máu để chẩn đoán nhiễm khuẩn Các quy trình chẩn đoán NKBV dựatrên sự có mặt của DNA vi khuẩn thường hướng tới việc phát hiện các đoạn DNAđặc trưng của loài như các đoạn riboxom 16S, 5S, 23S, các gen đặc hiệu của vikhuẩn[39].

PCR là một kỹ thuật cho phép khuếch đại các trình tự DNA đặc hiệu Mặc dùkỹ thuật được phát minh vào năm 1985 bởi nhà hoá sinh học người Mỹ KarryMullis và đựơc phát triển bởi Saiki và cộng sự nhưng nguyên lý của phản ứng đãđược mô tả trước đó hàng thập kỷ bởi Khorana và đồng nghiệp [40] Kỹ thuật đãđượcứngdụngrộngrãirấtnhiềuvềlĩnhvựchìnhsự,môbệnhhọc,chấnđoántrướcsinh và chẩn đoán các mầm bệnh Kỹ thuật thường được áp dụng nhất cho các pháthiệncủamầmbệnhtừcấymáudươngtính[41].

Hỗ trợ cho phương pháp nuôi cấy, phương pháp PCR đã được sử dụng đểpháthiệnvikhuẩn trongmáu[42],dịchxươngkhớp[43],dịch não[44],mô tim

PCR là một trong những kỹ thuật phổ biến hiện nay trong nghiên cứu vàđƣợc sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán Tuy nhiên PCR đơn mồi có nhƣợc điểm làchỉ thực hiện đƣợc phản ứng riêng lẻ, chỉ phát hiện đƣợc một tác nhân vi khuẩn gâybệnh do đó sẽ mất rất nhiều thời gian để khảo sát nhiều mầm bệnh kéo theo giáthành rất cao Vì vậy để tăng cường khả năng chẩn đoán và bổ sung những hạn chếcủaPCR,ChamberlainvàcộngsựđãmôtảvàpháttriểnkỹthuậtmultiplexPCR vàonăm1988[47].

Các xét nghiệm multiplex PCR cho phép phát hiện nhanh chóng các tác nhângây bệnh trực tiếp từ máu Multiplex PCR khuếch đại nhiều DNA đích trong cùngmộtmẫu tại cùngmộtthời điểm sử dụngmột hỗn hợpmồi Kỹ thuật này thườngdựat r ê n s ự k h u ế c h đ ạ i D N A t r o n g v ù n g s a o c h é p c ủ a v i s i n h v ậ t Đ â y l à v ù n g không mã hoá của DNA có vị trí giữa các gen và có tính bảo thủ cao giúp phân biệtgiữacác loàivikhuẩn,nấmvàcácsinhvậtkhác.

Multiplex PCR nhắm mục tiêu tới hệ gen của nhiều tác nhân gây bệnh khácnhau liên quan tới nhiễm khuẩn bệnh viện Phương pháp này có độ nhậy cao, chínhxác,pháthiệnđƣợcnhiềutácnhân gâybệnhtrongkhoảngthời gianngắn.

Kỹ thuậtmultiplex realtime PCR chop h é p p h á t h i ệ n n h a n h v à đ ị n h l ƣ ợ n g sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứnghuỳnh quang trong đó sự gia tăng về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên củatín hiệu huỳnh quang Tín hiệu huỳnh quang đo đƣợc phản ánh số lƣợng sản phẩmđƣợc khuếch đại trong mỗi chu kỳ Tuỳ thuộc vào số lƣợng bản DNA đích ban đầucó trong ống phản ứng mà giá trị Ct (chu kỳ ngƣỡng) của các mẫu là khác nhau.Dựa vào các đặc điểm này có thể xác định số bản sao DNA đích có trong mẫunghiêncứudựatrên mẫuchuẩnđãbiếtrõsốlƣợngDNAđíchban đầu.

Phương pháp realtime PCR nhanh hơn so với PCR truyền thống và khôngcần thao tác sau khuếch đại cho việc xác định vi khuẩn Áp dụng các phương phápphân tử này đến nay đã đƣợc dùng trong việc phát hiện các loài vi khuẩn cụ thể từcác mô nhiễm trùng nhƣ viêm màng não do vi khuẩn Đối với các vi khuẩn gâyNKBV đã có rất nhiều nghiên cứu sử dụng realtime PCR để xác định các đối tƣợngnày[48],[49].

TrongphảnứngrealtimePCR,ngườitathườngsửdụngcáclạithuốcnhuộmliên kết DNA sợi đôi (SYBR Green I) để phát huỳnh quang và các mẫu dò hoặc mồiđặchiệutrìnhtựđƣợcđánhdấuhuỳnhquang(TaqmanPCR).

Thiếtbịổnnhiệtchukỳ(máyPCR)đặcbiệtđƣợcgắnvớimộtmodulepháttín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra Tín hiệuhuỳnhquangđođƣợcphảnánhsốlƣợngsảnphẩmkhuếchđạitrongmỗichukỳ.

 Thiếtkếtrìnhtựmồi vàmẫudò Để thiết kế một phản ứng multiplex Taqman, trước hết cần thiết kế từng thínghiệmTaqmanđơn.

Thiết kế tất cả các mồi với nhiệt độ Tm xấp xỉ nhau (55-60 o C), và tất cả cácmẫu dò với nhiệt độ Tm xấp xỉ nhau (khoảng 5-10 o C cao hơn mồi) Điều này quantrọng để đảm bảo rằng các bộ mồi và mẫu dò khác nhau không bổ sung lẫn nhau bởivìtấtcảchúngđềuhiệndiệntrongcùngmộtphảnứng.

Chương trình luân nhiệtrealtime PCR dùng mồi Taqman thường chỉ có haigiaiđoạnnhiệtđộlà:Biếntính94-95 o Ctrong15-

60giâyvàthiếtbịrealtimesẽhoạtđộngởgiaiđoạnnày. Ởgiaiđoạnnhiệtđộ60 o CthìmồiTaqmansẽbắtcặpsợiđíchtrướcvìđâylà nhiệt độ bắt cặp tốt nhất của mồi Taqman (thấp hơn Tm của mồi Taqman là65 o C-

60 o C)r ồ i s a u đ ó m ồ i mớibắtcặpvào.Chínhnhờvậy màkhimồiTaqmantổnghợps ợ i b ổ s u n g , enzymenàymớicócơhộithủygiảiđƣ ợcmồiTaqmancản đầunó Nếumồibắtcặpt r ƣ ớ c v à o s ợ i đ í c h t h ì s ẽ k h ô n g c ó c ơ h ộ i đ ể m ồ i T a q m a n b ắ t c ặ p v à o s ợ i đíchvànhƣvậy thìmồiTaqmansẽkhôngthểbịthủy giảikhienzymeTaqpolymeraset ổ n g h ợ p sợ i b ổ s u n g D o đ ó n ê n s ử d ụ n g p h ầ n m ề m t h ƣ ơ n g m ạ i v í dụ nhƣ Beacon Designer để đơn giản hoá việc thiết kế cả bộ mồi và mẫu dò chophảnứngmultiplex[50].

Phản ứng multiplex realtime PCR cần sử dụng các chất phát huỳnh quangkhácnhauchotừngphảnứngkhuếchđạiriêngbiệt.Đểphânbiệttừngphả nứng, chọn chất phát huỳnh quang với phổ kích thích cận nhau thấp nhất Chất huỳnhquangđượcchọncũng cầntươnghợpvớiđầulọcphátquangvàkíchthíchcủathiếtbị realtime PCR Dựa trên các thông số thiết bị của đơn vị để có một danh sách cácchất huỳnh quang tương ứng Ví dụ đối với phản ứng 5 mục tiêu trên hệ thống iQ5nênsử dụngFAM,HEX,Cy5,TAMRAvàTexasRed[51].

Chạy các phản ứng singleplex và multiplex cho gen mục tiêu trên cùng mộtbản mẫu và so sánh giá trị chu kì ngƣỡng Giá trị thu đƣợc từ một mục tiêu chotrước trong thí nghiệm đơn và đa mồi không được quá khác biệt Nếu giá trị chu kìngƣỡng từ các phản ứng đơn và đa quá khác biệt cần tối ƣu hoá lại phản ứng Điềunàycóthểthực hiệnbằngcácthayđổinồngđộcủa các thành phầnphảnứng.

Nếu một phản ứng multiplex không đƣợc tối ƣu hoá, sự khuếch đại của mụctiêu có hiệu suất thấp hay số lƣợng ít có thể bị ức chế bởi mục tiêu có hiệu suất cao,số lƣợng nhiều Điều này là do các thành phần phản ứng nhƣ DNA polymerase vànucleotide trở nên hạn chế trong các chu kỳ cuối và sự khuếch đại của mục tiêu cóhiệusuấtthấp,sốlượngítsẽbịảnhhưởng. ƯuđiểmcủaphươngphápmultiplexrealtimePCR

MultiplexrealtimePCRcóưuđiểmchínhsovớiPCRtruyềnthốnglàchophépchúngtađị nhlƣợngsốbảnsaokhởiđầucủakhuônmẫuvớiđộchínhxácvàđộnhạycaotrênmộtphạmviđộnghọ clớn.Cáckếtquảcủarealtimecóthểlàchấtlƣợng(sựcómặthoặckhôngcủatrìnhtựđích)hoặcđị nhlƣợng(sốbảnsaoDNA).RealtimePCRcóthểđánh giá mà không cần điện di gen, thời gian thí nghiệm đƣợc rút ngắn và số lƣợngnguyênliệuđƣợcđƣavàoquitrìnhtănglên.Cuốicùng,docácphảnứngđƣợcchạyvàsốli ệuđƣợcđánhgiátrongmộthệthốngkínnêncáccơhộinhiễmbẩnđƣợcgiảmthiểu vàsựcầnthiếtcủacácthaotáchậukhuếchđạiđƣợcloạibỏ.

Cácbáocáokếtquả đềuthốngnhấtchunglàcóthểsửdụngkỹthuậtsinhh ọc phân tử phát hiện vi khuẩn gây bệnh, các kỹ thuật này có độ nhạy, độ đặc hiệucao hơn so với kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật thông thường từ các 16S rARN, nhânbản,điệnditrêngelvàgiảitrìnhtự [52],[53].

Tình hình nghiên cứu ứng dụng multiplex realtime PCR xác địnhcácvikhuẩngây nhiễmkhuẩnbệnhviện …………………………… 15 1 Trênthếgiới

ỞViệtNam

HiệntạicácdựánphòngchốngnhiễmkhuẩnbệnhviệnđangtriểnkhaivàvấnđềNKBV được tập trung nghiên cứu Trước đây đa số các nghiên cứu thực hiện theophươngphápnuôicấyvisinhtruyềnthống,hiệnnay,đãcócácnghiêncứuứngdụng sinhhọcphântửtrongviệcxácđịnhcácđốitƣợnglâynhiễmcũngnhƣkhảnăngkhángkhángsinhc ủachúng.

Tác giả Phùng Thị Bích Thủy và cộng sự đã sử dụng bộ Kit realtime PCR đamồiSeptiFast(Roche)trongchẩnđoáncănnguyêngâynhiễmtrùnghuyếtởtrẻemtạiBệnh viện Nhi Trung ương: Áp dụng phương pháp realtime PCR đa mồi phát hiệnđược 43,3% dương tính trong khi phương pháp cấy máu truyền thống chỉ phát hiệnđược3,3%.TácnhângâynhiễmtrùnghuyếtthườnggặpnhấtlàK.pneumonia/oxytocacó tần số xuất hiện cao nhất ở 7 bệnh nhân (23,3%), tiếp sau làEnterobactercloacae/aerogenesvới2trườnghợp(6,6%)thêmvàođólàcácvikhuẩnvànấmk hácnhƣ:S.aureus,P.aeruginosa,Candidaparapsilosis,Aspegillusfumigatus,Candidaalbic ans,E.coli,Stenotrophomonasmaltophilia[5α9].

Hiện nay phương pháp multiplex realtime PCR đã được triển khai trên nhiềuloạibệnhphẩmkhácnhauđểchẩnđoáncácbệnhnhiễmtrùngkhácnhaunhƣtácnhângâ yviêmphổi(52tácnhân),nhiễmkhuẩnhuyết(50tácnhân),tiêuchảy(28tácnhân),truyềnquađƣ ờngtìnhdục(13tácnhân),HPV(20tácnhân),viêmmàngnãomủ(11tácnhân)[60].

Gầnđây,đềtài“Nghiêncứuchếtạobộsinhphẩmxácđịnhvikhuẩngâynhiễmkhuẩnhu yếtthườnggặpvàpháthiệngenkhángkhángsinh”,thuộcchươngtrìnhkhoahọc và công nghệ trọng điểm cấp Nhà nước giai đoạn 2011-2015 “Nghiên cứu ứngdụng và phát triển công nghệ tiên tiến phục vụ bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộngđồng”, chủ nhiệm đề tài là PGS.TS Lê Hữu Song, bệnh viện Trung ƣơng Quân đội108 với sự phối hợp của bệnh viện Bạch

Mai, bệnh viện Nhi Trung ƣơng, bệnh việnBệnhNhiệtđớiTrungương.Nhómnghiêncứuđãchếtạođượcbộsinhphẩmxácđịnhcác vikhuẩngâynhiễmkhuẩnhuyếtthườnggặp:ngưỡngpháthiệntrungbìnhcủabộsản phẩm là 10 CFU/ ml máu, sau 4 tháng bảo quản, độ nhạy kỹ thuật và độ đặc hiệucủa bộ sinh phẩm vẫn đảm bảo 10 CFU/ml và 100% Cùng với việc đó, đã chế tạođƣợcbộsinhphẩmpháthiệngenkhángkhángsinhcủacácvikhuẩngâynhiễmkhuẩnhuyếtt hườnggặpcáchọgensinhbetalactamephổrộng(ESBL:CTX-

M;TEM,SHV)genkhángkhángsinhcarbapenem(NDM,VIM,CMY),genkhángmethicilli n(MecA) củatụcầu,genkhángkhángsinhQuinolonevàgenđềkhángAminoglycosides.Sovớiphươn gphápcấymáuvàbộkitthươngmạitrênthịtrường,bộsinhphẩmđượctạoracóđộnhạy,độđặc hiệutươngđương.Khikếthợpbộsinhphẩmmớiđượctạoravớicấymáu,độ nhạyđãnânglên54%vàđộđặchiệuvẫnđạt100%.Sảnphẩmnàygiúpnângkhảnăngchẩnđoán mầmbệnhgâynhiễmkhuẩnhuyếtlên15%[61].

Ngày 3/3/2020, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam công bốchính thức chế tạo thành công bộ kit chẩn đoán Virus SARS-COV-2 do nhómnghiênc ứ u đ ứ n g đ ầ u l à P G S T S Đ ồ n g V ă n Q u y ề n v à P G S T S Đ i n h D u y K h á n g tại Viện Công nghệ sinh học thực hiện Bộ Kit chẩn đoán virus SARS-CoV-2 đãđƣợc thửn g h i ệ m t ạ i V i ệ n C ô n g n g h ệ s i n h h ọ c B ộ k i t đ ƣ ợ c n g o ạ i k i ể m , đ á n h g i á vềđộ nhạ y vàđộ đặc hiệ u b ở i ViệnYh ọc dựp h ò n g q uâ n đ ội -

BộQ uố cp hò ng Kếtquả đánh giá bướcđầu chothấy,bộkitchẩn đoánv i r u s S A R S - C o V - 2 c ủ a Viện Công nghệ sinh học có độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương với bộ kitrealtimeRT-PCR của Tổc h ứ c Y T ế t h ế g i ớ i , c ụ t h ể : đ ộ đ ặ c h i ệ u :

1 0 0 % , đ ộ nhạy:5copies/phảnứng,thờigianpháthiệnlà80phútkểtừkhinhận mẫuDNAcủabệnhnhân[62].

Khángsinhvà khángkhángsinhởvikhuẩn

Khángsinhvàcơ chếtácđộng

Khángsinh(antibiotics)lànhữngchấtkhángkhuẩn( a n t i b a c t e r i a l substan ces) đƣợc tạo ra bởi các chủng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, Actinomycetes),cótác dụngứcchếsự pháttriểncủacácvisinhvậtkhác[63].

Các nhóm kháng sinh đƣợc sắp xếp theo cấu trúc hoá học, từ đó chúng cóchungmột cơ chế tác dụng Theo cách phânl o ạ i n à y k h á n g s i n h đ ƣ ợ c c h i a t h à n h cácnhóm:nhómbeta- lactam(gồmcácpenicillin,cáccephalosporin,cácbeta-lactam khác, carbapenem,monobactam,cácchất ức chế beta-lactamase); nhómaminoglycosid, macrolid, licosamid,phenicol, tetracylin, peptid, quinolone và cácnhómkhángsinhkhác[63].

Sau khi vào tế bào, kháng sinh đƣợc đƣa tới đích tác động vào 4 thành phầncấutạocơbảncủatếbào vàpháthuytácdụngkìmhãmsự sinhtrưởngvàpháttriểnhoặctiêudiệtvikhuẩn,đặc biệtcóhiệuquảởcácvikhuẩnđ angsinhtrưởngvà pháttriểnmạnh,bằngcách:

Các kháng sinh nhóm beta-lactam, fosformycin và vancomycin ngăn cản sinhtổng hợp lớp peptidoglycan nên không tạo đƣợc khung murein- tức là vách không đƣợchìnhthành.Tếbàoconđƣợcsinhravừakhôngcóváchvừakhôngsinhsảnđƣợcvừadễbịtiêudiệ thoặcbịligiảiđặcbiệtởvikhuẩnGramdương.Nhưvậynhữngkhángsinhnàycótácdụngdiệtkh uẩnchỉvớinhữngtếbàođangpháttriển.

Chức năng đặc biệt quan trọng của màng bào tương là thẩm thấu chọn lọc,khi bị rối loạn các thành phần (ion) bên trong bị thoát ra ngoài và nước từ bên ngoàiồ ạt vào trong dẫn tới chết, ví dụ polymicin B, colistin Với cơ chế tác động này,polimycin có tác dụng diệt khuẩn tuyệt đối tức là giết cả tế bào đang nhân lên và cảtếbàođangở trạngthái nghỉ(khôngnhânlên).

Ứcchếsinhtổnghợpprotein:thamgiasinhtổnghợpproteinngoàiribosomcòncócácAR NthôngtinvàARNvậnchuyển.Điểmtácđộnglàribosom70Scủavikhuẩn: tại tiểu đơn vị 30S ví dụ nhƣ aminoglycosid (nơi ARN thông tin trƣợt qua),tetracylin(nơiARNvậnchuyểnmangaxitamintới)hoặctiểuphần50S(nơiaxitaminliên kếttạopolypeptid)nhƣerythromycin,cloramphenicol,clindamycin.Kếtquảlàcácphântửpr oteinkhôngđƣợchìnhthànhhoặcđƣợctổnghợpnhƣngkhôngcóhoạttínhsinhhọclàmngừngtrệq uátrìnhsinhtrưởngvàpháttriển.

NgăncảnsinhtổnghợpRNA,vídụgắnvàoenzymeARN- polymerasenhƣrifampicin. Ức chế sinhtổnghợp các chất chuyểnhoácầnthiết cho tế bào: quá trình sinh tổng hợp axit folic- coenzyme cần cho quá trình tổng hợp các purin và pirimidin (vàmộtsốaxitamin) bịngăncảnbởisulfamidvàtrimethoprim[63].

Nhƣ vậy mỗi kháng sinh chỉ tác động lên một vị trí nhất định trong thànhphần cấu tạo, ảnh hưởng đến một khâu nhất định trong các phản ứng sinh học khácnhau của tế bào vi khuẩn, dẫn đến ngừng trệ sinh trưởng và phát triển của tế bào vikhuẩndẫn đếnngừngtrệsinhtrưởng vàpháttriểncủatếbào.

Kháng sinh đã được con người phát hiện và đưa vào quá trình trị liệu từ giaiđoạn sơ khai của loài người Thuốc kháng sinh cơ bản đã được xác nhận bởi cơquan quản lý của Mỹ như là loại thuốc được sản xuất bởi một loài sinh vật để ứcchế sự tăng trưởng hoặc để giết chết một loài vi sinh vật khác Dưới tác dụng củakhángsinh,mộtsốchủngvikhuẩnđãdầnthíchnghivàkhánglạicáckhángsinh. Sựxuấthiệncủacácmầmbệnhkhángnhiềuloạithuốckhácnhauđãlàmgiatănglong ạivềnhữnghậuquảvàtácđộngcủahiệntượngnàylênsứckhỏeconngườivàquátrìnhđiềutrịbệ nhtrênngười.

Sự kháng thuốc đƣợc định nghĩa là sức đề kháng của vi khuẩn đối với mộttác nhân kháng khuẩn mà mà trước đây chúng chỉ biểu hiện sự nhạy cảm Đầu tiênhiện tƣợngkhángkháng sinhcủa vikhuẩnlà quá trình tiếnhóa tựn h i ê n , s a u đ ó hiện tƣợng kháng thuốc ngày càng gia tăng trong các loài vi sinh vật gây bệnh bởisử dụng sai thuốc kháng sinh và sự lây lan toàn cầu của vi khuẩn kháng thuốc, chủyếu ảnh hưởng đến bệnh nhân có hệ miễn dịch kém hoặc sức khỏe yếu Sự khángthuốc đã tiêu tốn nhiều chi phí hơn trong quá trình chữa trị và trong hoạt độngnghiên cứu vềngăn ngừa tình trạngkhángkháng sinh Một loạtcácl o ạ i t h u ố c khángsinhđãbịkhángbởicácvisinhvậtgâybệnhtrongnhữngthậpkỷgần đây,và nhân tố kháng thuốc có thể đƣợc tạo ra và lan truyền từ vi sinh vật này sang visinh vật khác, từ loài vi khuẩn này sang loài vi khuẩn khác theo nhiều cách khácnhau[64].

(DNA) di động có thể bắt giữ và mang các gen, đƣợc vận chuyển bởi các gen nhảy(transposon), cho phép các vi sinh vật gây bệnh trao đổi cơ chế kháng kháng sinh(Hình1.2).Mộttrườnghợpđềkhángtựnhiênđượcthấythườngxuyênbởicáctỷlệđột biến tự nhiên trong gen nằm trên nhiễm sắc thể mà sau đó nhân tố đột biến đƣợclan truyền bởi sự nhân lên của vi khuẩn Một trong những cơ chế kháng là sự tíchhợp của DNA trên hệ gen từ vi khuẩn chết và plasmid của các tế bào sống, mà cũngcó thể xảy ra với integrons đến từ thực khuẩn thể Đột biến xảy ra tất cả các thờiđiểm, thay đổi nucleotid duy nhất có thể làm thay đổi gen và chuyển gen kháng lênvi sinh vật Các plasmid từ một loại vi khuẩn, với bất kỳ integron, có thể dễ dàngchuyểnsangvikhuẩnkhácthôngquachuyển genngangbởisự tiếp hợp[64].

Vật liệu di truyền đƣợc trao đổi giữa các vi sinh vật qua ba tuyến đườngchính:

(i)TảinạpDNA,vídụ:từStreptococcusmitistosangStreptococcuspneumoniae, (ii)Biến nạp, ví dụ kháng Methycillin trongS aureusđã đƣợc phânlậptrongcácmẫuphânởcáctrangtrạivàcơsởgiếtmổ;và(iii)Sựtiếphợp,vídụlà các plamid chịu trách nhiệm cho sự phổ biến toàn cầu của các gen mã hóa enzymcarbapenemase hoặc β-lactamase,đặc biệt phổ biến trong các vi khuẩn Gram âm vàTụcầu(Hình1.3)[65].

Có rất nhiều cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn, trong số đó năm cơ chếthường thấy nhất là: enzym ức chế hoạt động của kháng sinh, biến đổi trong proteinliên kết penicillin (PBP), đột biến Porin, bơm đẩy kháng sinh ra khỏi tế bào và thayđổi mụctiêucủakhángsinh(thayđổithànhtếbào)(Hình1.4) [64].

Cơ chế kháng phổ biến nhất của vi khuẩn là enzym ức chế Cơ chế này đƣợcdựa trên một số chiến lƣợc để thay đổi cấu trúc của các hợp chất kháng khuẩn: thủyphân, một loại phản ứng xảy ra chủ yếu với các kháng sinh β-lactam; thay đổi cácnhómchứcnăng(acyl, phosphoryl,thiol, nucleotidil,ADP- ribosyl,glycosyl).

PBPslàproteinquantrọngcóliênquantrongviệcxâydựngcácpeptidoglycan, là thành phần chính của thành tế bào vi khuẩn Các enzym này xúctác các sợi glycan và liên kết ngang giữa các chuỗi glycan Các vị trí hoạt động củasợi glycan là mục tiêu của kháng sinh β-lactam Các hợp chất này bắt chước sợipeptit đôi D-Ala-D- Ala trong peptidoglycan và tạo thành một phức acyl-enzym rấtổn định, dẫn đến enzym bị bất hoạt Khi các PBPs thay đổi vị trí hoạt động, thì cáckháng sinh β- lactam sẽ để mất hoặc làm giảm ái lực của chúng với các protein mụctiêu,dẫnđếnsự khángthuốc.

VikhuẩnGramâmcómộtlớpmàngbênngoàiváchtếbào,màngngoài,trongđóbaogồm mộtlớplipidkép.Cácthànhphầnchínhcủalớpđôinàylàlipopolysaccharide,làhợpchấtkịn ướcnêncáchợpchấtưanướcrấtkhókhănđểđiqua Do đó, porins hoặc porins màng ngoài (OMP), là các protein hỗ trợ trong việcthôngquacácchấthòatanthấmquamànglipidkép.Nhiềuyếutốảnhhưởngđếnkhảnăngcủathuố cđểvượtquaporins,chẳnghạnnhưhìnhdạng,kíchthước.Cómộtsốporinsđiểnhình,chẳnghạnnhư OmpF,OmpC,vàOmpE.Mỗiloàivikhuẩnsảnxuấtcác porins cụ thể, và sự mất mát hoặc giảm hoạt động của một hoặc nhiều OMP làmột yếu tố góp phần phổ biến trong việc xây dựng sức đề kháng (ví dụ, mất OprD)củaP aeruginosađối với imipenem và meropenem Ở các loài khác, mất OmpF cóthể dẫn đến các sinh vật kháng với nhiều loại kháng sinh (đa kháng). Trong một sốchủng, sự giảm hoặc mất ái lực của thuốc với các protein (porin), dẫn đến mất khảnăngđểvƣợtquacácmàngngoàivàkhôngthểxâmnhậpvàotếbào.

Mộtc ơ c h ế h i ệ u q u ả c a o c ủ a k h á n g k h á n g s i n h l à s ự s ả n s i n h h ệ t h ố n g proteinb ơ m k h á n g s i n h r a k h ỏ i t ế b à o v i k h u ẩ n T ấ t c ả c á c t h à n h v i ê n c ủ a h ọ protein này bao gồm 3 dạng không thay đổi sau: Dạng A, đóng vai trò nhƣ cửa củatếbàochất,kiểmsoátsựdichuyểncủacácchấtnềnđếnvàđitừcáctếbàochất; dạng B, đó là tham gia vào các khớp nối năng lượng; và dạng C, định hướng vị trívàđềxuấthướngvận chuyển.

Tìnhhình khángkháng sinhcủavi khuẩn trênthếgiớivàởViệt Nam… 28 CHƯƠNG2.NGUYÊNVẬTLIỆUVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 35 2.1 Đốitƣợngnghiêncứu

Thựctrạngkhángkhángsinhđãmangtínhtoàncầu,đặcbiệtlàởcácnướcđangpháttriể nvớicácbệnhtruyềnnhiễmcònchiếmtỷlệcaotrongcơcấubệnhtật,làgánhnặng thực sự vì sự gia tăng chi phí do phải bắt buộc thay thế các kháng sinh cũ bằngcáckhángsinhmới đắttiền.Hiệnnaytìnhhìnhgâybệnhcủacácvikhuẩn Gramâm đangchiếmưuthế(A.baumannii,P.aeruginosa,E.coli,K.pneumoniae),cácvikhuẩnnày có thể sinh beta-lactamase phổ rộng đề kháng tất cả các kháng sinh nhóm beta- lactamtrừcarbapenemnhƣngđếnnaymộtsốchủngđãcókhảnăngtiếtracarbapenemase đề kháng carbapenem, ví dụ NDM1-New Deli Metalo-β- lactamase,nhiềuchủnglàđakháng,thậmtrímộtsốchủngA.baumannii,P.aeruginosalàkhángmở rộnghoặctoànkháng[63].

Tại Mexico (2007-2011), khi nghiên cứu về NKBV do vi khuẩn đa khángkháng sinh cho thấy trong 266 chủng đƣợc phân lập có 105 chủng là đa kháng(39,5%) Các vi khuẩn này đƣợc phân bố nhƣ sau: Gram âm (55,6%), Gram dương(32,3%) và nấm men (12,1%) Các sinh vật thường gặp nhất làE. coli(20%),S.aureus(12%),E.faecium(12%),P.aeruginosa(11%)vàA.baumannii(6%)[78].

Samuel A và cộng sự (2017) khi tiến hành giải trình tự toàn bộ hệ gen để xácđịnhvikhuẩnGramâmsinhESBLởbệnhnhânnhiễmkhuẩnhuyết,chothấycáctácnhânchính gồm:E.coli(38%),P.aeruginosa(19%),K.pneumoniae(14%).Tỷlệ kháng kháng sinh của các vi khuẩn này đối với một số kháng sinh thường dùng:E.colikhángceftazidime,Cefepime,Piperacillin/Tazobactamvàmeropenemlầnlƣợtlà:6 4,5%,58,1%;25,8%và 3,2%.K.pneumoniaek h á n glầnlƣợt là:66,75; 58,3%;

41,7%và25%;P.aeruginosakhánglầnlƣợtlà27,3%,45,5%,40,9%và63,3%[79].Theobáo cá o của E C D C (2 01 7) , t ỷ lệk h á n g k hán g s i n h của cá c v i k h uẩ n

Gram âm ở các nước miền Bắc và miền Tây thấp hơn so với các nước ở miền Namvà Đông Âu [80] Năm 2019, tỷ lệ kháng kháng sinh của vi khuẩnS. aureuskhángoxacillin 23,5%,P aeruginosakháng ceftazidim (26,5%), kháng cephalosporin thếhệ 3 củaE coli(15,9%), củaK pneumoniaelà (39,9%) Đối với kháng sinh nhómcarbapenemthìtỷlệkhángcủaK.pneumoniae,E.coli,P.aeruginosavàA.baumanni ilầnlƣợtlà: 15,2;1,7%;25,95 và63,9%[7].

Theo báo cáo của CDC (Centers for Disease Control and Prevention) tại Mỹ(2019),tìnhtrạngkhángkhángsinhvẫncòncaovớihơn2,8triệucanhiễmtrùngkhángkháng sinhvàhơn35000ngườichết[81].

TạiLiênminhChâuÂutìnhtrạngvikhuẩnkhángkhángsinhđãlàm25.000catửvongvớichip hívƣợttrộichochămsócsứckhoẻ,làmgiảmnăngsuấtlaođộnglêntới15000triệueuro[82].

Nếu kháng sinh đƣợc sử dụng càng nhiều sẽ càng tạo ra áp lực chọn lọcnhững dòng vi khuẩn đề kháng Khi vi khuẩn đề kháng gây bệnh thì bệnh cảnh lâmsàng càng nặng hơn, việc điều trị cũng khó khăn hơn rất nhiều và chi phí điều trị sẽtốnkémhơn[83].

Tại bệnh viện Tehran-Iran (2018) đã phân lập đƣợc 100 chủngA. baumanniithì có hơn 93% là chủng đa kháng Tỷ lệ kháng kháng sinh cao nhất và thấp nhất đãđƣợcghinhậnlàamoxicillin/clavulanic(98%),ceftriaxone(96%),cefotaxime(94%) và ceftazidim (93%) Tần số của các genblaTEM,blaCTX vàblaSHV lầnlƣợtlà52,1%,43,4%và21,7% [84].

Tại Việt Nam sự kháng kháng sinh củaA baumanniiđã ở mức báo động đỏ,theo báo cáo sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh tại 15 bệnh viện Việt Namnăm 2008-2009 trên 60% các chủngAcinetobacterphân lập tạimột số bệnhv i ệ n lớn nhƣ bệnh viện Bạch Mai, bệnh viện Chợ Rẫy và bệnh viện Bệnh Nhiệt ĐớiTrung Ƣơng là các chủng đa kháng Bệnh viện Xanh Pôn có tỷ lệ kháng cao nhấtvới4loạikhángsinhtrongđóceftazidimvàgentamicinbịkhánghoàntoànv àcótới hơn 80% các chủng không còn nhạy cảm với ciprofloxacin và imipenem [85].Khinghiêncứutìnhhìnhsửdụngkhángsinhkinhnghiệmvàđềkhángkhángsinh ở bệnh nhân viêm phổi liên quan đến thở máy tại khoa cấp cứu bệnh viện Bạch Maitừ tháng 1/2009 đến 12/2013 các tác giả nhận thấy vi khuẩnA baumanniichiếm tỷlệ cao nhất 49,3% hơn nữaA. baumanniiđã kháng lại nhiều loại kháng sinh thườngdùnghiệnnay,kháng100%vớicefoperazole,ciprofloxacinkhángtới80%,levoflo xacin 70%,đặcbiệt vớiv ớ i k h á n g s i n h p h ổ r ộ n g c a r b a p e n e m c ũ n g k h á n g gần70%,A.baumanniicũngkhángtrên80%vớiampicillin+sulbactamvàpipera cillin+tazobactam[86].

P.aeruginosakhángkhángsinhlàmộtvấnđềnghiêmtrọngtrêntoàncầu.Cáctrườnghợpnh iễmP.aeruginosacótiênlƣợngxấuhơncácvikhuẩnkhácdochúngcóđộctínhcaovàkhángvới nhiềuloạikhángsinh[87],[88].

TheobáocáocủaCDCMỹ(2017),cótới32.000canhiễmP.aeruginosalàm2700người chếtvàgâytốnkém767triệuUSD[81]. Ở Việt Nam, nghiên cứu về tình hình kháng kháng sinh củaP. aeruginosaphân lập đƣợc trên bệnh phẩm tại viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh

(2014), chothấyP aeruginosakháng với hầu hết các kháng sinh thường dùng trong điều trị.Mức độ kháng với các kháng sinh nhƣ sau: colistin (10,7%), fosfomycin (24%),aztreonam( 3 6 % ) , a m i k a c i n ( 4 2 , 9 % ) , c i p r o f l o x a x i n

( 4 8 , 2 % ) , c e f e p i m ( 4 5 , 8 % ) , imipenem( 4 6 , 2 % ) , g e n t a m i c i n ( 5 5 , 6 % ) , c e f o p e r a z o n ( 5 4 , 2 % ) , ticarcillin/ a.clavulanic(54,2%),tobramycin(54,2%),piperacillin( 6 0 , 7 5 ) , cefsulodin(62,5%),sulfalamid(64%).ĐiềunàychứngtỏsựđakhángthuốccủaP. aeruginosavà mức độ kháng kháng sinh củaP aeruginosalà tương đối cao

K pneumoniaelàtrực khuẩn Gram âm gây viêm phổimắc phảit ạ i b ệ n h viện Sự kháng thuốc củaK pneumoniaecực kỳ nguy hiểm bởi vì vi khuẩn này cókhả năng sinh đƣợc hai loại enzyme: beta-lactamase phổ rộng và carbapenemase,các enzyme này làm biến đổi, phá huỷ cấu trúc hoá học của kháng sinh beta-lactam,có khả năng phân giải hầu hết các loại kháng sinh thuộc nhóm beta-lactam đặc biệtđối với penicillin và các cephalosporin thế hệ thứ 3 Hơn nữaK pneumoniaecòn cókhả năng sản sinh đƣợc carbapenemase phân giải carbapemem nhƣ imipenem,meropenem… trong khi carbapenem đƣợc xem là cứu cánh cuối cùng trong lựachọnkhángsinhđểđiềutrị[90].

K pneumoniaeđã kháng lại tất cả các loại kháng sinh bao gồm cả các khángsinhmạnhnhấthiệnnaynhƣcephalosporinvàcarbapenem.Tỷlệkhángcephalospo rin củaK pneumoniaecao nhất ở các nước thuộc khu vực Đông Nam Á(53,3- 100%),tiếptheoởcácnướcChâuPhi(41-

Nghiên cứu về tình hình đề kháng kháng sinh củaK pneumoniaephân lậpđƣợc35chủngtừ680mẫubệnhphẩmtạiViệnPasteurthànhphốHồChíMinhkếtquảnhƣsa u:K.pneumoniaekháng cao nhất với ampicillin (94,29%), tiếp theo làtrimethoprim/sulfamethoxazole(79,31%),piperacillin(62,86%),ceftazidim(51,43%), vớimộttỷlệnhỏkhángcolistin,imipenem,meropenemvớitỷlệngangnhaulà2,86%và65,71

Họvikhuẩnđườngruột(Enterobacteriaceae)thườngcưtrútrênđườngtiêuhóa của người và động vật đang là mối quan tâm lớn trong NKBV do có khả năngkháng cao với các nhóm kháng sinh amiglycosid, β-lactam và có khả năng truyềntính kháng qua plasmid Đề kháng với cephalorporin thế hệ thứ 3 vì đây là khángsinhđườngtiêmđượcdùngphổbiếnkhiđiềutrịcácviêmnhiễmnặng.E.coli đề kháng bằng cách tiết ra enzyme beta-lactamase phổ rộng, các enzyme này phá huỷđƣợc rất nhiều kháng sinh nhóm beta-lactam Tỷ lệ đề kháng với cephalosporin thếhệ thứ 3 khác nhau ở các khu vực khác nhau trên thế giới: cao nhất ở khu vực ĐôngNam Á (20-61%), ở vùng Đông Địa Trung Hải (11-41%), Châu Phi (28-36%) thấpnhất ở châu Âu (3-43%) [92].E coliđề kháng với kháng sinh nhóm fluoquinolonevì đây là kháng sinh đường uống được sử dụng phổ biến trong cộng đồng Tỷ lệ vikhuẩn kháng fluoquinolone cao nhất ở Châu Phi (35-54%), Địa Trung Hải (15-53%),tỷlệnàythấphơn ởchâuÂu(0-47%)[91],[93].

TheobáocáocủaCDCMỹ(2017),họvikhuẩnđườngruộtsinhESBLđãg âybệnhcho197.400ngườivàlàmchết9.100ngườigâytốnkém1,2tỷUSD[81]. Ở Việt Nam khi nghiên cứu tình hình sử dụng kháng sinh kinh nghiệm và đềkháng kháng sinh ở bệnh nhân viêm phổi liên quan đến thở máy tại khoa cấp cứubệnh viện Bạch Mai từ tháng 1/2009 đến 12/2013 các tác giả nhận thấyE. colicònnhạy cảm với hầu hết các kháng sinh nhóm carbapenem, piperacillin+tazobactam.Tuynhiênkhánggần50%vớiceftriaxone,ceftazidim,ampicill in+subbactam,ciprofloxacinvàlevofloxacin[86].

Trần Xuân Chung khi nghiên cứu căn nguyên và tính kháng kháng sinh củamột số vi khuẩn ở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết điều trị tại bệnh viện Đa KhoaTrungươngHuế(2011-2015)chothấyhơn30chủngE.coligâynhiễmkhuẩnhuyếtđã đề kháng với ampicillin, ceftriaxone và ciprofloxacin, đa số còn nhạy cảm vớiimipenem, meropenemvàamikacin[94]. TụcầuStaphylococcusaureus

Hiện nayS aureuskháng methicillin kháng giống nhau đối với tất cả cácpenicillin hiện hành và các beta khác Từ sau thập niên 90 đã xuất hiện các trườnghợp nhiễm tại cộng đồng, những trường hợp này không có yếu tố nguy cơ nhiễmkhuẩn mắc phải tại bệnh viện Tỷ lệ MRSA cao nhất tại khu vực Châu Phi (52-95%), Châu Mỹ (43-45%), thấp hơn ở các nước Châu Á (37%) và thấp nhất ở cácnước Châu Âu (0,3-27%) [92] Nhiễm khuẩn này đang có xu hướng xảy ra ở nhữngngườit r ẻ , k h o ẻ m ạ n h v à g â y b ệ n h c h ủ y ế u ở d a v à m ô m ề m N h i ễ m k h u ẩ n d o

MRSA khó điều trị hơn so vớiS aureusnhạy cảm với methicillin, chỉ có một sốkhángsinhcònhiệuquảtốttrongtìnhhuốngnày.

TheoCDCMỹ(2017),có323.700trườnghợpmắcMRSAlàm10.600ngườichếtvà tốn1,7 tỷUSD[81].

Khitiếnhànhkhảosáttìnhhìnhkhángkhángsinhcủamộtsốvikhuẩngâybệnhviêm khớp nhiễm khuẩn tại bệnh viện Chợ Rẫy (2016), cho thấy 100% chủngStaphylococcusspp.cònnhạycảmvớikhángsinhvancomycin,teicoplanin,hơn90%nhạy cảm với trimethoprim/sulfamethoxazole và fosfomycin tuy nhiên có tỷ lệ đề khángcao(trên40%)vớioxacillin,ciprofloxacin,cefoxitin,clindamycin[95].

Nghiên cứu tình trạng đề kháng kháng sinh và tỷ lệ mang genmecAcủa cácchủngS aureusở bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đớiTrung ƣơng và bệnh viện Quân Y 103 tìnht r ạ n g k h á n g k h á n g s i n h

Các mẫubệnhphẩm

Địađiểmthuthậpmẫu:MẫubệnhphẩmđƣợcthuthậptạibệnhviệnThanhNhànvàBệ nhviệnĐức Giang-HàNội.

CáccabệnhđƣợcchẩnđoántrênlâmsàngbịNKBVsẽđƣợclấymẫutạicácvị trí nghi nhiễm khuẩn để làm xét nghiệm xác định các vi khuẩn gây NKBV theoquitrìnhnuôicấyvisinhvậtcủaBộYtế. Đối với mẫu bệnh phẩm của đường hô hấp dưới: tốt nhất nên lấy đờm vàobuổisáng sớmtrướckhibệnhnhândùngthuốc.

Mẫu bệnh phẩm máu: máu tĩnh mạch, thời điểm tốt nhất khi bệnh nhân đangớn lạnh, rét run trước khi bị sốt cao, trường hợp nghi NKBV bệnh nhân không sốtvẫnchocấymáu.

Mẫu bệnh phẩm nước tiểu: tốt nhất lấy vào buổi sáng sớm trước khi bệnhnhândùngthuốc.

Thời gian:Mẫu bệnh bệnh phẩm đƣợc thu thập trong khoảng thời gian từtháng1năm2016đếntháng12năm2018.

Cáchtínhcỡ mẫu nghiêncứu

TỉlệcácvikhuẩngâyNKBVtheonghiêncứucủaS.Cainrnsvàcộngsự(2008)trong các mẫu bệnh phẩm:S aureus9%,A baumannii24%,E. coli:11%,K.pneumoniae:20%vàPaeruginosa:17%[97].Dođócỡmẫunghiêncứucầnchomỗi loạivikhuẩnđƣợctínhtheocôngthức:N=1.96 2 *p(1-p)/d 2

Trongđó:N:cỡ mẫu p:tỷlệướctínhvikhuẩngâyNKBVd:độc hính xácmong muốn:0.05

Nguyênvậtliệu nghiêncứu

Nguyênvật liệu

1434 mẫu bệnh phẩm: mẫu đờm, dịch hút phế quản, nước tiểu, máu của bệnhnhân nhiễm khuẩn bệnh viện do bệnh viện Thanh Nhàn, bệnh viện Đức Giang-HàNộicung cấp.

Cácthiếtbị

Máy Nanodrop 1000, Máy AriaMx Realtime PCR System của hãng Aligent,máyPCRtốcđộcao(Model:MasterCyclerproS.HãngsảnxuấtEppendorf.Nướcsả nxuất:Đức),cácmáyPCRcủahãngABI,Rotor- geneQ(QIAgenĐức),hệthốngCobasTagman48(Roche),máylytâmEppendorf,tủlạnhthườn g,tủlạnhõmsõu-20 o C,tủấm37 o C,bộpipetman(10àl,20àl,100àl,200àl,1000àl),bểổnnhiệt…

Các thiết bị đƣợc đặt tại Khoa vi sinh, khoa Hoá sinh- bệnh việnThanhNhàn- Hà Nội Phòng Công nghệ tế bào động vật- Viện Công nghệ sinh học-ViệnHànlâmKHvàCNViệtNam.

Hoáchất

Bộ kit tách DNA QIAamp R DNA Mini Kit của QIAgen: QIAamp DNABlood Mini Kit tách DNA trong máu; QIAamp DNA Blood Mini Kit tách DNAtrong dịch và trong đờm hoặc tách trên máy tự động QIA cube Bộ Kit tách dòngPCR2.1 (invitrogen), vector tách dòng pBT (Viện Công nghệ sinh học); T4- ligase(Biolab,England);chủngE.coliDH5α α(Invitrogen);BộMastermixPCR(Prome ga); Bộ Master mix realtime PCR (IDT); Cao nấm men, trypton (Ấn Độ),McFarland 0,5 Các hoá chất tinh khiết khác: NaCl,EDTA, SDS, EtBr, agarose,…cungcấpbởihãngMerck,Invitrogen,PromegavàBioline.

Môi trường Mueller Hinton agar (MH), khoanh giấy kháng sinh: ampicillin,penicillin, chloramphenicol, clindamycin, doxycycllin, cephalosporin và methicillin,Amox/A.clavula, gentamicin, amikacin, cefepime, ciprofoxacin, levofloxacine, co- Trimoxazole,nitrofurantoin,cefuroxime,ceftriaxone,ceftazidim,piperacillin- tazobactam,imipenem,meropenem,ertapenem,tetracyclin,ciprofloxacin,vancomycin,poli mycinB vàcolistin.

Bảng2.1.Trìnhtựcáccặpmồi, mẫudòvàgenđíchcủacácchủng vi khuẩn

KpCy_probe 5’-/56-FAM/CGACCCAG/ZEN/

PaGyr_probe 5’/5Cy5/CCCACATGG/TAO/

SaNuc_probe 5’/56FAM/CGAAAGGGC/ZEN/

GAPDH_Probe 5’/5Cy5/CCCACATGG/TAO/CCTCCAAGGAGT

Bảng2.2.Trìnhtựmồicủagen16SrARNvà genmãhoá ESBL[98]

Phươngphápnghiêncứu

Nhómphươngphápvisinhtruyềnthống

Nuôi cấy, phân lập các vi khuẩn trên các loại môi trường thạch: Thạch máuColumbia, thạch chocolate, chai cấy ái khí của BioMerieux (Sử dụng máy cấy máutựđộngBacT/ALERT3D).

Quytrìnhnuôicấytừngloạibệnhphẩm:bệnhphẩmđườnghôhấp,nướctiểu,máu,dịch,mủ đƣợcthựchiệntheoquytrìnhthựchànhvisinhcủaBộYtế[99]. Định danh vi khuẩn dựa vào hình thái, tính chất sinh hóa, sử dụng bộ địnhdanh:Api20E,Api20NE, ApiStap(HãngBioMerieux),(Phụlục 2).

Bauer).SửdụngmôitrườngMuellerHintonagar(MH)vàkhoanhgiấykhángsinhcủaMast(Anh).K hángsinhsẽkhuếchtánramôitrườngxungquanh.Nếuvikhuẩnnhạycảmvớikhángsinhđóthì sẽkhông mọc xung quanh khoanh giấy Đo đường kính vòng vô khuẩn và đọc mức độkhángkhángsinhtheocácmức:nhạycảm(S:Sensitivity),kháng(R:resistant),trunggian(I:interme diate),theohướngdẫncủaCLSI(ClinicalandLaboratoryStandards

- ChuẩnbịdịchhuyềnphùcủacácchủngvikhuẩntrongNaCl0,9%tươngứn gvớiđộđục chuẩn0,5McFarland.

- Đểc á c đ ĩ a ở n h i ệ t đ ộ p h ò n g t r o n g v ò n g 1 5 p h ú t c h o k h á n g s i n h t ừ c á c khoanhgiấykhuếchtántrênmặtthạch.Ủấmở37 0 Ctrongvòng18-24giờ.

So sánh kích thước vòng vô khuẩn của chủng thử nghiệm với tiêu chuẩn đọckết quả đường kính vùng ức chế đối với vi khuẩn thử nghiệm theo tiêu chuẩn củaCLSI[100].

Phươngphápsinhhọcphântử

Các chủng vi khuẩnS aureus, A baumannii, E coli,K. pneumoniaevàP.aeruginosađược nuôi cấy trong môi trường đặc hiệu, thu tế bào và tiến hành táchchiết theo protocol của bộ kit tách DNA tổng số từ vi khuẩn của

QIAgen, thu lạiDNAtổngsốcủavikhuẩntrong50àLnướckhửionvụtrựng.Sảnphẩmđượcđiệndikiểmtra trêngelagarosevàxác địnhhàmlƣợngbằngmáynanodrop1000.

Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm cấy máu bằng phương pháp đun sôiBổ sung lysozyme nồng độ1 mg/mLvào1mLmẫu bệnh phẩmcấymáu,ủở

37 o C trong 30 phút Sau đó đun sôi mẫu ở 100 o C trong 10 phút rồi làm lạnh nhanhtrong nước đá 5 phút Ly tâm mẫu với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 5 phút để lấydịchnổi(chứaDNA).

- Hũatantếbàotrong180àlđệmlysischứaenzymelysozyme1mg/ mlvàủở37 o Ctrong30phút.

- Bổsung4àlenzymeRNase10mg/ml,ủmẫuởnhiệtđộphũngkhoảng5phỳt.

- Hútdịchlêncột,lytâmcột8000vòng/phút,1phút,bỏdịchquacột.

- Bổ dung500àl dungdịch AW1lờn cột, ly tõm 8.000vũng/phỳt trong

- Bổsung500àldungdịchAW2lờncột,lytõm12.000vũng/ phúttrong5phút,bỏdịch qua cột.

- Bổsung100àl nướckhửionvụ trùnglêncột,đểkhoảng1phút,sauđólytâm8000vòng/phútđểthuDNA.

DNA của vi khuẩn đƣợc làm giàu bằng cách nhân bản DNA với mồi randomhexamer trong số chu kì ngắn để tạo ra sản phẩm là các đoạn DNA có kích thướckhác nhau với số lượng lớn Thành phần phản ứng bao gồm Maxter mix: 12.5 àl;DNA khuụn: 5 àl; mồi random hexamer: 1 àl (10 pmol) và bổ sung nước khử trựngsao cho thể tớch cuối cựng bằng 25 àl. Đặt hỗn hợp trên vào máy PCR và chạy vớibước biến tính đầu tiên là 93 o C trong 3 phút và 20 chu kì tiếp theo với 93 o C: 45giây,50 o C:45giâyvà72 o C:1phút 30giây.

Nồng độ DNA mạch kép đƣợc xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở bướcsóng260nm(OD260)và280nm(OD280).

CDNA=OD260×50×d Trong đó d: độ pha loãng mẫu khi đoCDNA:nồngđộDNA

Nếu 1,8 ˂ OD260/OD280˂ 2 thì mẫu DNA đƣợc đánh giá là đạt yêu cầu về mức độtinhsạchchocácthínghiệmsinh họcphântử tiếptheo.

Kiểm tra các sản phẩm tách chiết DNA tổng số và sản phẩm PCR bằngphươngpháp điệnditrêngelagarosetheo Sambrookvàcộngsự.

- Chuẩn bị gel agarose 1%: cân 1 g agarose cho vào 100 ml dung dịch TAE1X, đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn Để nguội khoảng 50 o C rồi rótdung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn răng lƣợc Sau khoảng 30 phút, khigel đã đông, gỡ lƣợc ra, đặt bản gel vào bể điện di Rót đệm TAE 1X vào bể đểdungdịchngậpcáchmặtgel5mm.

- Tra mẫu DNA: Lấy mẫu DNA trộn với loading dye 6X rồi trav à o c á c giếngtrênbảngel.

- Chạy điện di ở điện thế 95 - 100V, trong thời gian khoảng 25 - 30 phút.DNA di chuyển từ cực âm đến cực dương Quan sát sự di chuyển màu bromophenolblueđểbiếtkhinàocầndừngđiệndi.

- Soi gel: Bản gel đƣợc lấy nhẹ nhàng ra khỏi khay và ngâm vào dung dịchEtBrnồngđộ2àg/mltrongkhoảng5phỳtrồirửalạibằngnước.HiểnthịkớchthướcDNA dưới ánh sáng đèn cực tím (UV) của máy soi gel Ước tính kích thước củaDNAbằngcáchđốichiếuvớithangDNAchuẩn.

Phương pháp PCR nhân bản gen 16S với mồi và thành phần phản ứng:Mồi16SF/R:1 àl;MasterMix:12.5àl; DNA khuụn:3 àl;bổ sungH20đủ25àl.

Chương trìnhchạy: 95 o C: 3 phút; 94 o C: 45g i â y ; 5 7 o C: 45 giây, lặp lại30chu kỳ; 72 o C: 1 phút; 72 o C: 8 phút Giữ sản phẩm ở: 8 o C Sản phẩm PCR đƣợc điệndikiểmtratrêngelagarose1%.

Thành phần phản ứng:Mồixuôi/ngƣợc:1/1 àlMaster Mix: 12.5 àlDNAkhuụn:3àl

PhươngphápPCRnhânbảncácgenkhángkhángsinhvàcácgenđíchphụcvụchoviệcphá ttriểnbộsinhphẩmmultiplexrealtimePCR.ChươngtrìnhphảnứngPCR:bước1:biếntính94 o Ctrong5phút;bước2:chutrìnhlặplại30chukỳ(94 o Ctrong30giây,55 o Ctrong30giây,72 o Ctro ng50giây),bước3:72 o Ctrong7phút.

Sau khi thu đƣợc sản phẩm PCR đặc hiệu, chúng tôi tiến hành xác định trìnhtựsảnphẩmPCRdựatrênphươngphápcủaF.Sangervàcộngsự. Đặc trưng của phương pháp này là ngoài những nucleotide thông thườngcòn sử dụng thêm 4 loại dideoxynucleotide trong đó thay nhóm 3’-OH bằng 3’-H.Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành liên kếtphotphodieste với các nucleotide tiếp theo, dẫn đến làm ngừng quá trình tổng hợpDNA.

Bước 1: Thực hiện phản ứng PCR với hỗn hợp thành phần phản ứng (15àl) baogồm: 3 àl Bigdye, 3 àl sản phẩm PCR, 1,275 àl mồi, 3 àl đệm 2,5 X, bổ sung nướcđến thể tớch 15àl Chu trỡnh nhiệt được thực hiện trờn mỏy PCR 9700(AppliedBiosystem).Bước1:96 o C,1phút,1chukỳ.Bước2:(96 o C10giây,50 o C5giây,

- Lytâm4500v ò n g / p h ú t trong45 ph út đểthu t ủ a

 Thiếtkếm ồ i vàm ẫu dòcho phảnứng m ul ti pl ex realtimeP C R

Cácm ồ i v à m ẫ u d ò đ ƣ ợ c t h i ế t k ế m ớ i , đ ƣ ợ c t ổ n g h ợ p b ở i h ã n g I D T v à kiểmtrabằngcôngcụBLAST(http://www.ncbi.nih.gov).

Mix2 : c ó đ ầ y đủt h à n h p h ầ n k h á c và h ỗ n h ợ p D N A đ í c h c ủ a c ả 5 c h ủ n g vi khuẩnvàDNAngười.

Chươngtrìnhchạy:95 o C:3phút;95 o C:15giây; 60 o C:60giây,lặplại40chukỳ.

Mix2:cóhỗnhợpmồi,mẫudòvàcácthànhphầnkháccùnghỗnhợpDNAđíchcủacả5chủngvikh uẩnvàDNAngười.

Thành phần củaphảnứng đượcthể hiện ở Bảng2.5 dướiđây

Bảng 2.5α Thành phần phản ứng multiplex realtime PCR kiểm tra độ đặc hiệu củahỗnhợpmồi,mẫudòvớiDNAđíchcủavikhuẩn

Mồixuôitừngvikhuẩn(10pM) 0,25 ×3 =0,75 0,25 ×3 =0,75 0,25×3 =0,75 Mồingƣợctừngvikhuẩn(10pM) 0,25 ×3 =0,75 0,25 ×3 =0,75 0,25 ×3 =0,75 Mẫudòtừngvikhuẩn(2,5pM) 0,5 ×3 =1,5 0,5 ×3 =1,5 0,5 ×3 =1,5

Sau khi kiểm tra mồi và mẫu dò là đặc hiệu ở những thí nghiệm trên, tiếp tụctiến hành phản ứng multiplex realtime PCR với các mẫu DNA chuẩn còn lại. Thànhphầncủa mộtphảnứngđượcthểhiệnởBảng2.6.dướiđây

Bảng2.6.Thànhphần phảnứng mutiplexrealtimePCR trêncácchủngchuẩn

2.3.3 Phươngphápkiểmtrađộnhạy,độđặchiệu,độổnđịnh,ngưỡngpháthiệncủabộsi nhphẩmmultiplexrealtimePCR

Panelđộnhạy:9 7 mẫuDNAđƣợctáchtừcácchủngđãđƣợcphânlậpvàđịnhdanhởtrên,khẳ ngđịnhlạibằngphântíchtrìnhtựgen16SrARN.

ChươngtrìnhphảnứngrealtimePCR:bước1:biếntính95 o Ctrong3phút;bước2:c hutrìnhlặplại40chukỳ(95 o Ctrong15giây,60 o Ctrong60giây).

Thành phần phảnứng Thểtớch(àl)

PhântíchkếtquảxácđịnhđộnhạytrênmẫuDNAchủngchuẩn Độ nhạy = (Số mẫu cho kết quả dươngtính/Tổng số mẫu panel độ nhạy)*100%Tiêuchuẩnđộnhạycủabộsinhphẩmtheotiêuchuẩncủanhàsảnxuất:đạt90-95%

Thựchiệntươngtựnhưđộnhạynhưngtrên30mẫuâmtính,độđặchiệuđượctínhnhưsau : Độđặchiệu=(Sốmẫuchokếtquảâmtính/Tổngsốmẫupanelđộnhạy)*100%

2.3.3.2 Xácđịnhđộnhạy,độđặchiệutrênmẫubệnhphẩm Độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ sinh phẩm sẽ đƣợc tính sau khi xác định đượcsố mẫu dương tính giả (FP) và âm tính giả (FN), cũng như mẫu dương tính thật(TP),vàâmtínhthật(TN)theocôngthứcsauđây:

2.3.3.3 Xácđịnh độnhậy,độđặchiệudựa vàođơnvịđộclập Đểđảm bảotínhchínhxác,bộsinhphẩmđƣợcgửiđánhgiáđộnhậy,độđặchiệutạiViệnKiểmđịnhVắc xinvàsinhphẩmytếquốcgia.

2.3.3.4 XácđịnhhệsốtươngđồngCohhen‟sKappa(sosánhkhảnăngpháthiện củabộsinh phẩmvới mộtphương phápphát hiệnkhác)

Phương pháp kiểm tra độ nhậy, độ đặc hiệu, độ ổn định, ngưỡng pháthiệncủabộsinhphẩmmultiplexrealtimePCR

Ngƣỡng pháth i ệ n l à n ồ n g đ ộ t ố i t h i ể u ( b ậ c p h a l o ã n g t ố i đ a ) m à t ạ i đ ó b ộ sinhp h ẩ m v ẫ n p h á t h i ệ n đ ƣ ợ c v i k h u ẩ n g â y NKBV.Đ ể x á c đ ị n h đ ƣ ợ c n g ƣ ỡ n g phát hiện của bộ sinh phẩm multiplexr e a l t i m e P C R , c h ú n g t ô i t i ế n h à n h t r ê n 2 nềnmẫu:

2 Cácchủngvikhuẩnđíchđƣợcphaloãngtừ1 0 2 /mlđ ế n 1 0 7 / mlp h a loãngvàomáu,táchDNAtổng sốvà sửdụngt h ự c hiệnphảnứng realtim ePCR

2.3.3.6 Xácđịnhđộổnđị nh củabộsin hphẩmm ul ti pl ex realtime PCR

2 0 o C,s a u m ỗ i thángđ ƣ ợ c l ấ y r a v à k i ể m t r a t r ê n m ẫ u đ ố i c h ứ n g d ƣ ơ n g v ớ i c ù n g t h à n h p h ầ n phảnứngvàchươngtrìnhchạynhưnhau,mẫuđượcđánhgiá sau6tháng.

Phươngphápthốngkê

Đạođứcnghiêncứu

- Tuân thủ theo quy định trong Quy chế hoạt động của Hội đồng đạo đứctrongn g h i ê n c ứ u y s i n h h ọ c b a n h à n h t h e o q u y ế t đ ị n h s ố 5 1 2 9 / 2 0

- Tránhtốiđacácsựcốtrongquátrìnhnghiêncứu. Định danh vi khuẩn

Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi và mẫu dò

Thiết kế mồi và mẫu dòLựa chọn và phân tích gen đích

Tối ƣu nhiệt độ bắt mồi, Master Mix

Xác định tính kháng kháng sinh của các VK đã phân lập

Xác định gen mã hoá ESBL của E. coli

Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu dựa vào đơn vị độc lậpXác định độ nhạy độ đặc hiêu trên các Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu trên các mẫu bệnhXác định độ ổn định của bộ sinh phẩmmẫu âm tính, dương

Xác định ngƣỡn g phát hiện

Các vi khuẩn gây NKBV Phân lập

Giải trình tự, so sánh độ tương đồng của các gen mã hóa ESBL của

Kếtquảphânlậpcácchủngvisinhvậtgâynhiễmkhuẩnbệnhviện…

Kếtquảphântíchgen16SrARNtừ cácchủngvikhuẩn phânlập

Hình 3.5α.Hình ảnh nhân bản gen 16S rARN từ DNA tổng số của một số chủng vikhuẩnE.coli,S.aureus,K.pneumoniae

(A),Đường chạy 1-5α:Sản phẩm PCR nhânb ả n g e n 1 6 S r A R N t ừ c á c c h ủ n g v i khuẩnE.coli,(B), Đường chạy6-10: Sản phẩm PCRn h â n b ả n g e n 1 6 S r A R N t ừ các chủng vi khuẩn S aureus Đường chạy 11-12: đối chứng âm Đường 13-15α: Sảnphẩm PCR nhân bản gen 16S rARN từ các chủng vi khuẩn K pneumoniae ĐườngchạyM:markerDNA1kb(Thermo).

Kết quả Hình 3.4 và Hình 3.5 cho thấy chúng tôi đã nhân bản thành công gen16S rARN từ các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc Sản phẩm gen 16S rARN của cácchủng vi khuẩn đƣợc xác định trình tự, kết quả xác định trình tự đƣợc thể hiện ởphụlục3(minhhoạmỗichủngvikhuẩn1trìnhtựgen16SrARN).Trình tựcác gen 16S rARN từ các chủng vi khuẩn đƣợc phân tích và so sánh với các trình tự gentrên ngân hàng gen thế giới bằng phần mềm Blast, kết quả các chủng đều tươngđồngcaovớiđộtương đồng99-100%(Phụlục3).

Nhƣ vậy, kết quả phân tích trình tự gen 16S rARN cho thấy tất cả 97 chủngđã phân lập và định danh là chính xác, hoàn toàn có thể sử dụng làm chủng chuẩnchocác nghiên cứutiếptheo.

Kết quả phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR xác địnhđồngthời 5tácnhân vikhuẩngây nhiễmkhuẩnbệnhviện

Kếtquảlựachọn,phântíchtrìnhtựgenđích

Lựa chọn gen đích cho phản ứng realtime PCR vô cùng quan trọng, các genđích đƣợc lựa chọn phải tồn tại trong suốt quá trình phát triển của vi khuẩn, các gencótínhổnđịnhcaotrongquátrìnhthực hiệnnhânbản.

S.a u r e u s , m d h v à C y t c ủ ac h ủ n gK p n e u m o n i a , g e n o p r L v à g y r B c ủ ac h ủ n gP aeruginosa, gltAvàbla OXA- 51-like của chủngA baumannii,và genphoAvàYccTcủa chủngE coliđƣợc lựa chọn để phân tích thiết kế mồi và mẫu dò cho phản ứngrealtimePCR.Cácgenđƣợcnhânbản,điệndikiểmtravàphântíchtrìnhtựphục vụ cho việc thiết kế mồi và mẫu dò Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gelagarose1% vàđƣợcthểhiệntrên Hình3.6vàHình3.7.

Kết quả điện di trên gel agarose ở Hình 3.6 cho thấy ở tất cả các giếng đềuxuấthiệncácbăngđậmrõnétcókíchthướctươngứngkhoảng296bp(đườngchạy1-3), 364 bp (đường chạy 4-6), 504 bp (đường chạy 7-9), 722 bp (đường chạy 10-12), 890 bp (đường chạy 13-15) phù hợp với tính toán lý thuyết về kích thước củacác genfemAcủa chủngS aureus, mdhcủa chủngK pneumonia,genoprLcủachủngP aeruginosa, gltAcủa chủngA. baumannii,và genphoAcủa chủngE coli.Kết quả PCR chứng tỏ tất cả các cặp mồi đã kiểm tra đều đặc hiệu với các sinh vậtđíchvìcácgendự đoánđềuđƣợckhuếchđại.

Hình 3.6.Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích của các chủng vikhuẩngâynhiễmkhuẩnhuyếttương ứng.

Cặp mồi EcF/R khuếch đại gen phoA (E coli), cặp mồi AbF/R khuếch đại gen gltA (A.baumannii), cặp mồi PaF/R khuếch đại gen oprL (P aeruginosa), cặp mồi KpF/R khuếchđại gen mdh (K pneumonia), cặp mồi SaF/R khuếch đại gen femA (S aureus). Đường chạy1-3: sản phẩm PCR gen femA (theo lý thuyết 296 bp), 4-6: sản phẩm PCR gen mdh (theo lýthuyếtl à 3 6 4 b p ) , 7 -

9 : s ả n p h ẩ m P C R g e n o p r L ( t h e o l ý t h u y ế t l à 5α 0 4 b p ) , 1 0 - 1 2 : s ả n phẩm PCR gen gtlA (theo lý thuyết là 722 bp), 13-15α: sản phẩm PCR gen phoA (theo lýthuyếtlà 890 bp),16: Marker1kb(Fermentas) 17:Đối chứng âm.

Hình3 7l à k ế t quả n hâ n bả ncác ge nbla OXA- 51-likec ủ aA ba um an ni i,ge n gyrBcủaP.aeruginosa,genYccTcủaE.coli,genNuccủaS.aureusvàgenCytcủa

K.pneumoniae.Kếtquảchothấyởtấtcảcácgiếngđềuxuấthiệncácbăngđậmrõ nét có kích thước tương ứng với genbla OXA- 51-like trong thiết kế là 825 bp (đườngchạy 1-3), genYcccó kích thước 663 bp (đường chạy 4-6), genNuccó kích thước646 bp (đường chạy 7-9), genGyrtrong thiết kế là 1523 bp (đường chạy 10- 12),genCytcó kích thước1284 bp (đường chạy 13) phù hợp với tính toán lý thuyết vềkíchthước củacácgen.

Hình3.7.KếtquảPCRnhânbảngenbla OXA- 5α1-likecủaA.baumannii,gengyrBcủa

P aeruginosa,genYccTcủaE coli,genNuc củaS aureusvà genCytcủaK.pneumoniae Đường chạy M: marker DNA 1kb (Thermo); gen bla OXA- 5α1-like 825α bp (đường chạy 1- 3),genYccc ók íc ht h ướ c 663 bp (đ ườ ng ch ạy 4-

6),g e n N uc có kí ch th ư ớ c 646bp (đ ườ ng chạy 7-9), gen Gyr có kích thước là 15α23 bp (đường chạy 10-12), gen Cyt có kích thước1284bp (đườngchạy13).

Sản phẩm PCR từ các chủng đƣợc tiến hành xác định trình tự Kết quả thuđƣợctrìnhbàyởphụlục 4.

Kết quả phân tích Blast cho thấy trình tự thu được có độ tương đồng cao vớicác trình tự của các chủng vi khuẩn tương ứng trên GenBank Các gen thu đượcđược so sánh với các gen trên ngân hàng gen thế giới và lựa chọn ra vùng bảo thủkhôngcóđộtbiến đểthiếtkếcácmồivà mẫudòchophảnứngrealtimePCR.

Kếtquảthiếtkếmồivà mẫudò

Sử dụng các phần mềm phân tích gen, thiết kế mồi và mẫu dò NTI- vector(Invitrogen), Primer 3 plus, PrimerPlex, PCR insilico(http://insilico.ehu.es/PCR/).Chúng tôi thiết kế thành công các cặp mồi và mẫu dò cho các gen đích thể hiện trênBảng3.3vàPhụlục5.Các mồivà mẫudòđƣợctổnghợpbởihãngIDT.

Vik huẩn Gen mục tiêu Mồivàmẫudò Trìnhtự(5’-3’)

AcOxa_probe /5HEX/CGACTTGGG/ZEN/

K KpCy_F 5’-CCAGTTAGCGACCGAATCTAAT-3’ 54,4 pneum oniae Citrate synthas KpCy_R 5’-CGGGTGATCTGCTCATGAAT-3’ 54,9 e

(gtlA) KpCy_probe 5’-/56-FAM/CGACCCAG/ZEN/

PaGyr_probe 5’/5Cy5/CCCACATGG/TAO/

SaNuc-probe 5’/56FAM/CGAAAGGGC/ZEN/

Gen GAPDH-F 5’-AGGGTGGTGGACCTCAT-3’ 55,6 nội chuẩn

XA- 5α1- like),P.aeruginosa(gyrB),E.coli(YccT),S.aureus(Nuc),K.pneumoniae(Cyt).Trongđó genOXA5α1làmộtgenmãhoáchoproteinOxacillinase, enzyme phân huỷ beta-lactam nhóm D, OXA 51 đƣợc một số nhàkhoah ọ c l ự a c h ọ n l à m g e n đ í c h đ ể p h á t h i ệ nA b a u m a n n i i.G e n n à y đ ặ c h i ệ u chothiếtkếmồipháthiệnnhanh.

Geng y r B l àm ộ t g e n m ã h o á c h o t i ể u đ ơ n v ị p r o t e i n B c ủ a D N A g y r a s e , gen này tồntạitrên nhiều loài nhƣng có sựkhác biệt lớn giữa cácl o à i , g e n đ ặ c hiệuchothiếtkếmồipháthiệnnhanhP.aeruginosa.

GenYccTmãhoáchomộtprotein chƣarõc h ứ c n ă n g c ủ aE c o l i,YccTđƣợckíchhoạttổnghợpnênproteinY c c T b ở i p r o t e i n C s g D đ i ề u h o à t r ê n màng.

GenN u c l àm ộ t g e n m ã h o á c h o n u c l e a s e b ề n n h i ệ t , g e n đ ặ c h i ệ u c h o s ự pháthiệnS.aureus,genCytđƣợcdùngđểpháthiệnK.pneumonia.

Sựl ự a c h ọ n n à y t ƣ ơ n g đ ồ n g v ớ i n g h i ê n c ứ u c ủ a G a d s b y N J v à c ộ n g s ự khinhóm sửdụngphươngphápm u l t i p l e x r e a l t i m e P C R c h ẩ n đ o á n c á c v i s i n h vậttrongviêm phổi cộngđồngtrênm ẫ u đ ờ m v à d ị c h h ú t p h ế q u ả n c ủ a 3 2 3 bệnhnhânvới26mầmb ệ n h k h á c n h a u :

S a u r e u s : T h e r m o s t a b l e n u c l e a s e(nuc);E.coli:proteinbảothủchƣabi ếtchứcn ă n g ( y c c T ) ; K p n e u m o n i a e : Citrate synthase(gltA); P. aeruginosa:gyrase subunit B(gyrB); A baumannii:OXA-5α1-likeò- lactamase( bla OXA-51-like)[ 3 2 ] H y e - y o u n g W a n g v à c ộ n g sự (2014) cũng đã sử dụng các gen đặc trƣng trên để phát hiện các vi khuẩn:S.aureus:Thermostablenuclease(nuc);E.coli:proteinbảot h ủ c h ƣ a b i ế t c h ứ c năng(yccT);K.pneumoniae:Citratesynthase(gltA);P a e r u g i n o s a : g y r a s esubunitB(gyrB);A b a u m a n n i i : O X A - 5α 1 - l i k e ò - l a c t a m a s e ( bla OXA-51-like)[5α8] Nomanpour B và cộng sự (năm 2011) đã sử dụng phương pháp realtimeTaqManP C R d ự a t r ê n t r ì n h t ự c ủ a b l a xoxa-

[56].H y e - y o u n g W a n g v à c ộ n g s ự ( 2 0 1 4 ) s ử d ụ n g m u l t i p l e x r e a l t i m e P C R đ ể pháthiệnnhanhcácS.aureuskhángM e t h i c i l i n t ừ c á c m ẫ u n u ô i c ấ y d ƣ ơ n g tính,cáctácgiảđãsửdụngđầudòTaqMangenđích16SrARNc h oStaphylococcussp p,gennucc h o S a u r e u s v àg e nM e c A k h á n gm e t h i c i l l i n [58].

Kếtquảkiểmtrađộđặchiệucủamồivà mẫu dòvớigenđích

Vớim ụ c t i ê u p h á t t r i ể n b ộ s i n h p h ẩ m m u l t i p l e x r e a l t i m e P C R c h ẩ n đ o á n đồng thời5loại vikhuẩn gây NKBVA.baumanni,K pneumoniae,E.c o l i ,

S aureusvàP aeruginosavà và gen nộichuẩn GADPHc ủ a n g ƣ ờ i Đ ể g i ả m g i á thànhv à p h ù h ợ p v ớ i n h i ề u l o ạ i t h i ế t b ị r e a l t i m e , c h ú n g t ô i t i ế n h à n h p h ả n ứ n g pháthiệnđồngthời5vikhuẩngâyNKBVtrongmộtcặpthínghiệm.

Thí nghiệm 1: gồm hỗn hợp mồi và mẫu dò để phát hiệnA baumanni,

Thínghiệm2:gồmhỗnhợpmồivàmẫud ò đ ể p h á t h i ệ nE c o l i , S aureu svàP.aeruginosa.

3.2.3.1 Độđặchiệucủatừngcặpmồivàmẫudòvớigenđích Đểkiểm tratínhđặc hiệu của từngc ặ p m ồ i v à m ẫ u d ò v ớ i D N A đ í c h , mỗic ặ p m ồ i và mẫ ud ò đ ƣ ợ c ti ến hàn hch ạy realtimeP CR vớichínhD NA đ í c h củachúngvàhỗnhợpDNAcủa5loạivikhuẩnvàDNAngười.

 Độđ ặ c h i ệ u c ủ a m ồ i v à m ẫ u d ò v ớ i g e n đ í c h c ủ a v i k h u ẩ nA b a u m a n n i , K.p neu mo ni ae và g e nnộichuẩnG A D P H ( H u )

Bảng3.4.Giátrịchukìngƣỡngkiểmtrađộđặchiệucủatừngcặpmồi,mẫudòvớiDNAđíchcủavi khuẩnA.baumannii,K.pneumoniaevàDNA người

STT Mẫu Giá trị chukìngƣỡ ng

2 DNAtổng sốcủaSa,Ec,Pa,Ac,Kp,Hu 15,43

Bảng 3.4 cho thấy giá trị chu kì ngƣỡng xuất hiện ở những chu kì sớm đốivớimẫuDNAtổngsốcủachủngA.baumanniivàmẫuhỗnhợpDNAtổngsốcủac ả 5 chủng vi khuẩn và DNA người (giá trị chu kì ngưỡng lần lượt là 14,65 và15,43); giá trị chu kì ngưỡng xuất hiện ở những chu kì sớm đối với mẫu DNA tổngsố của chủngK pneumoniaevà mẫu hỗn hợp DNA tổng số của cả 5 chủng vi khuẩnvà DNA người (giá trị chu kì ngưỡng lần lượt là 14,04 và 13,52); giá trị chu kìngƣỡng xuất hiện ở những chu kì sớm đối với mẫu DNA tổng số của người(Human)vàmẫuhỗnhợpDNAtổngsốcủacả5chủngvikhuẩnvàDNAng ƣời(giá trị chu kì ngƣỡng lần lƣợt là 25,31 và 25,69) Nhƣ vậy là sự bắt cặp của từngcặp mồi, mẫu dò và DNA đích của từng chủng vi khuẩn là đặc hiệu có khả năngnhânbảntốt.

 Độ đặc hiệu của mồi và mẫu dò với gen đích của vi khuẩnS. aureus,E.colivàP.aeruginosa.

Hình3.9.Biểuđồ khuếchđạiDNAcủavikhuẩn(A):S.aureus,(B):E.coli,

Bảng3.5α.Giátrịchukìngƣỡngkiểmtrađộđặchiệucủatừngcặpmồi,mẫudòvớiDNAđíchcủa vikhuẩnS.aureus, E.coli,P.aeruginosa

Dựa vào biểu đồ khuếch đại DNA của các vi khuẩn Hình 3.9 và Bảng 3.5chúng tôi nhận thấy các mẫu có DNA tổng số đều có tín hiệu huỳnh quang vƣợt tínhiệu huỳnh quang nền và có dạng tín hiệu của một phản ứng realtime PCR chuẩn.Mẫuđốichứngâmcótínhiệuthấphơntínhiệuhuỳnhquangnền.

Các đường khuếch đại DNA của vi khuẩnS aureus, E coli, P. aeruginosatrong các ống có DNA đều có tín hiệu huỳnh quang vƣợt tín hiệu huỳnh quang nềnvà có dạng của một tín hiệu realtime chuẩn Giá trị chu kì ngƣỡng của mỗi chủng vikhuẩn trong các ống phản ứng chứng minh sự đặc hiệu của mồi và mẫu dò với DNAđích Nhƣ mẫu S. aureusgiá trị chu kì ngƣỡng trong ống có 1DNA của vi khuẩnS.aureusvàống có hỗn hợp DNAđích của 5vi khuẩn vàD N A n g ƣ ờ i l ầ n l ƣ ợ t l à

1 3 6 5 và13.55đềukhôngcósựkhácbiệtnhiều,mẫuE.coligiátrịchukìngƣỡngtro ng ống có 1DNA của vi khuẩnE colivà ống có hỗn hợp 5 DNA đích của các vi khuẩnvà DNA người lần lượt là 12,98 và 13,61 Chứng tỏ các mồi và mẫu dò đƣợc thiếtkế đều đặc hiệu với gen đích đã lựa chọn Kết quả cho thấy giá trị chu kì ngƣỡng ởmẫuDNAđơnvàDNAhỗnhợpcókếtquảtươngđồng,nhưvậycóthểdùngbộmồivàmẫudòch ocácnghiêncứutiếptheo.

Phảnứ n g m u l t i p l e x r e a l t i m e P C R đ ƣ ợ c t h i ế t k ế d ự a t r ê n p h ả n ứ n g P C R cặpm ồ i đ ơ n v ớ i t ổ n g t h ể t ớ c h c ủ a m ộ t p h ả n ứ n g l à 1 0 à l b a o g ồ m m a s t e r m i x , mồi,mẫudò,khuônDNAvànướck h ử i o n T u y n h i ê n t r o n g p h ả n ứ n g multiplexr e a l t i m e P C R c ó b ổ s u n g t h ê m c á c c ặ p m ồ i v à m ẫ u d ò đ ể đ ồ n g t h ờ i phát hiệnnhiềugen khác nhau.Việcbổsungn à y l à m c h o n ồ n g đ ộ c á c t h à n h phầnthay đổisovớiphảnứngr e a l t i m e P C R c h u ẩ n , đ ồ n g t h ờ i c ó t h ể x ả y r a hiệnt ƣ ợ n g c á c c ặ p m ồ i ứ c c h ế , b ắ t c ặ p c h é o l ẫ n n h a u d ẫ n đ ế n k h ô n g p h á t h i ệ n đƣợcg e n đ í c h q u a n t â m D o đ ó s a u k h i k i ể m t r a đ ƣ ợ c s ự b ắ t c ặ p c ủ a t ừ n g c ặ p mồi,mẫu dò với DNAcủa cácchủngvi khuẩn nghiênc ứ u l à đ ặ c h i ệ u c h ú n g t ô i tiếnhànhchạy phảnứngmultiplexrealtimeP C R v ớ i t h à n h p h ầ n v à n ồ n g đ ộ nhƣđãtrìnhbà yởphầnphươngpháp.

DựavàokếtquảởHình3.10chothấykhôngx u ấ t h i ệ n t í n h i ệ u h u ỳ n h quang ở m ẫ u đ ố i c h ứ n g k h ô n g c ó D N A H ì n h 3 1 1 c h o t h ấ y c á c m ẫ u c ó D N A c ủa vi khuẩnA baumanni, K pneumoniaeđều có tín hiệu huỳnh quang vƣợt tínhiệuhuỳnhquangnềnvàcódạngtínhiệuc ủ a m ộ t p h ả n ứ n g r e a l t i m e P C R chuẩn.Đ ố i c h i ế u v ớ i b ả n g g i á t r ị c h u k ì n g ƣ ỡ n g ( B ả n g 3 6 ) c ó s ự b ắ t c ặ p đ ặ c hiệukhásớmvớichukỳlà12,93và10,93lầnlƣợtởA b a u m a n n i , K pneumon iae.Đ i ề un à y c h ứ n g t ỏ t r o n g p h ả n ứ n g m u l t i p l e x r e a l t i m e n à y c á c c ặ p mồivàmẫudòkhôngứcchếvàkhôngbắtcặpchéonhau.

Hình 3.10.Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với DNA đíchcủavi khuẩn:ốngđốichứngkhôngcóDNAđích

Bảng3.6.Giátrịchukìngƣỡngkiểmtrađộđặchiệucủahỗnhợpmồi,mẫudòvớiDNAđích củavikhuẩnA.baumanni,K pneumoniaevàgenGADPH

Hỗnhợp DNAđích5vi khuẩnvàDNAngười 14,91 18,48 23,92 ỞcácốngcóhỗnhợpmồivàmẫudòcùngvớiDNAcủamỗiloạivikhuẩnchúngtôithuđƣợckếtquả nhƣsau:

Hình3.11.BiểuđồkhảosátđộđặchiệucủahỗnhợpmồivàmẫudòvớiDNAđíchcủavikh uẩn:(A):A.baumanni,(B):K.pneumoniae,(C):DNAcủangười Để khẳng định chắc chắn về độ đặc hiệu của các cặp mồi và mẫu dò vớicác gen đích trong cùng một phản ứng multiplex realtime PCR chúng tôi trộn DNAcủa 5 chủng vi khuẩn khác nhau và DNA của người để tạo thành hỗn hợp DNAkhuôn và tiến hành phản ứng multiplex realtime PCR Kết quả sản phẩm của phảnứngmultiplexrealtimePCRxuấthiệncả3đườngtínhiệuhuỳnhquangvàkh ôngcóđườngphụ(Hình3.12).

Hình 3.12.Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò vớiDNAđíchcủavikhuẩnvớiống cóhỗn hợpcácDNAđích

Độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi, mẫu dò với DNA đích của vi khuẩnS.aureus,E.coli,P.aeruginosa.

Chúng tôi tiến hành thí nghiệm tương tự để xác định độ đặc hiệu của hỗnhợp mồi và mẫu dò với DNA đích của vi khuẩnS aureus, E coli, P. aeruginosavớithànhphầnphảnứng,chươngtrìnhchạynhưđãtrìnhbày.Kếtquảthuđược:

Hình3.13.BiểuđồkhảosátđộđặchiệucủahỗnhợpmồivàmẫudòvớiDNA đíchcủavi khuẩn: ốngđốichứngkhôngcóDNA

Hình 3.14 Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với DNA đíchcủavikhuẩn:(A):S.aureus,(B):E.coli;(C):P.aeruginosa

Bảng3.7.Giátrịchukìngƣỡngkiểmtrađộđặchiệucủahỗnhợpmồi,mẫudòvớiDNAđích của vikhuẩnS.aureus,E.coli,P.aeruginosa Ống Mẫu

Hình 3.15α.Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu của hỗn hợp mồi và mẫu dò với DNA đíchcủavi khuẩnốngcóhỗnhợpcácDNAđích.

Kết quả ở Hình 3.13 cho thấy ở mẫu đối chứng không có DNA đích của vikhuẩn thì không xuất hiện tín hiệu huỳnh quang.Hình 3.14 cho biết trong các mẫucóDNAcủavikhuẩnS.aureus,E.coli,P.aeruginosacóđềuxuấthiệntínhiệuhuỳnh quang vƣợt tín hiệu huỳnh quang nền và có dạng một tín hiệu của một phản ứngrealtimePCRchuẩn.

GiátrịchukìngƣỡngtrongcácốngchứaDNAcủavikhuẩnS.aureusvàtrongống chứa hỗn hợp DNA lần lƣợt là 22,48 và 23,36; ở ống chứa DNA củaE colilà17,78 và 17,00; Giá trị chu kì ngƣỡng trong các ống chứa DNA của vi khuẩnP.aeruginosavà trong ống chứa hỗn hợp DNA lần lƣợt là 20,99 và 21,17; kết quả nàychứng tỏ không có sự khác biệt nhiều về giá trị chu kì ngƣỡng trong phản ứngmultiplexrealtimePCR.ĐiềuđóchothấytrongphảnứngmultiplexrealtimePCRcáccặpmồiv àmẫudòrấtđặchiệuvớigenđích,cácmồivàmẫudòkhôngứcchếvàbắtcặpchéolẫnnhau.

Tươngtựđểkhẳngđịnhchắcchắnvềđộđặchiệucủacáccặpmồivàmẫudòvới các gen đích trong cùng một phản ứng multiplex realtime PCR chúng tôi trộnDNA của 5 chủng vi khuẩn khác nhau và DNA của người để tạo thành hỗn hợpDNA khuôn và tiến hành phản ứng multiplex realtime PCR Kết quả sản phẩm củaphản ứng multiplex realtime PCR xuất hiện cả

3 đường tín hiệu huỳnh quang vàkhôngcóđườngphụ(Hình3.15)

Nhƣ vậy với 6 cặp mồi và 6 mẫu dò đƣợc kiểm chứng hoàn toàn phù hợp đểphối hợp trong một phản ứng phát hiện đồng thời 5 vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnhviệnE.coli,S.aureus,P.aeruginosa,A baumannii,K.pneumoniae. Để khẳng định phản ứng multiplex realtime PCR này có thể sử dụng cho cáctrườnghợpnhiễm5loạivikhuẩnE.coli,S.aureus,P.aeruginosa,A.baumanni i,

K pneumoniaenên phản ứng multiplex realtime tiếp tục đƣợc kiểm chứng trên cácchủngchuẩn.

Kếtquảphảnứng multiplexrealtimePCR trêncácchủng chuẩn

Saukhikiểmtrađộđặchiệucủamồivàmẫudòvàcủahỗnhợpmồivàmẫudòởnhữngthínghiệ mtrênchúngtôitiếptụcthựchiệnphảnứngmultiplexrealtimePCRvớicácmẫuDNAtừcácchủngchu ẩnđượcphânlập,địnhdanhvàtáchDNAtổngsốcòn lại với thành phần phản ứng, chương trình chạy được trình bày ở phần phươngphápchúngtôithuđượckếtquả.

3.2.4.1PhảnứngmultiplexrealtimePCRtrêncácchủngchuẩnA.baumannii,K.pneumoniaevàcủang ƣời(Hu)

Hình 3.16.Biểu đồ khuếchđạiDNA của các chủng chuẩn (A):A.baumannii;(B):K.pneumoniae;(C):GADPHcủangười

Bảng3 8 G i át r ị c h u k ì n g ƣ ỡ n g c ủ a p h ả n ứ n g m u l t i p l e x r e a l t i m e P C R t r ê n c á c chủngchuẩnA.baumannii,K.pneumoniaevàcủangười(Hu) Ống Mẫu

HEX(tín hiệu mẫudò Ac)

FAM(tín hiệu mẫudò Kp)

CY5(tín hiệu mẫudò Hu)

Kết quả Bảng 3.8 cho thấy kết giá trị chu kì ngƣỡng của các mẫu trong cùngloạivikhuẩnkhôngcósựkhácbiệtđángkể.ỞvikhuẩnK.pneumoniaegiátrịchukìngƣỡng trongcácchủng2Kp,3Kp,4Kplầnlƣợtlà14,24;14,26;14,14.ỞvikhuẩnA.baumanniigiátrịchu kìngƣỡnglầnlƣợtởcácchủng2Ac,3Ac,4Aclà:15,23;13,92và15,59.Cònởmẫu2Hu,3Huvà4H ugiátrịchukìngƣỡnglầnlƣợtlà22,55;25,22và24,81.Điềunàychứngtỏbộsinhphẩmmultiplexre altimePCRđƣợctạoralàđặchiệu có thể sử dụng để kiểm chứng các mẫu bệnh phẩm để có thể đánh giá đƣợc độnhạyvàđộđặchiệu.

Chúngtôitiếnhànhthínghiệmtươngtựvớithànhphầnphảnứngvàchutrìnhnhiệtnhưtrênđ ốivớicácchủngchuẩnE.coli,S.aureus,P.aeruginosa.KếtquảthểhiệntrongHình3.17vàBảng3.9.

Hình 3.17.Biểu đồ khuếch đại DNA của các chủng chuẩn(A):E.coli,(B):S.aureus,(C):P aeruginosa

Bảng3 9.G i á t r ị c h u k ì n g ƣ ỡ n g c ủ a p h ả n ứ n g m u l t i p l e x r e a l t i m e P C R t r ê n c á c chủngchuẩnE.coli,S.aureus,P.aeruginosa Ống Mẫu

Dựa vào biểu đồ khuếch đại (Hình 3.17) các mẫu DNA chuẩn đều có tín hiệuhuỳnh quang vƣợt qua tín hiệu huỳnh quang nền và có dạng của một tín hiệurealtime PCR chuẩn, đối chiếu vào bảng giá trị chu kì ngƣỡng (Bảng 3.9) nhận thấychu kỳ ngƣỡng của các ống phản ứng khá đồng đều nhau, nhƣ mẫu 2Ec, 3Ec, 4Ecgiá trị chu kì ngƣỡng lần lƣợt là 13,85; 13,01; 13,36, mẫu 2Sa, 3Sa, 4Sa là 13.79,14,34 và 15,33 Mẫu 2Pa, 3Pa, 4Pa lần lƣợt là: 11,96, 11,10 và 10,87.Từ các kếtquả trên chúng tôi khẳng định bộ sinh phẩm multiplex realtime PCR đã xây dựng làđặc hiệu có thể sử dụng để kiểm chứng các mẫu bệnh phẩm để có thể đánh giá đƣợcđộnhạy,độ đặc hiệucủa chúng.

KếtquảtốiưuphảnứngrealtimePCR

Nhiệt độ gắn mồi là một trong các yếu tố ảnh hưởng lớn đến phản ứngrealtime PCR vì thành phần phản ứng này gồm nhiều cặp mồi và mỗi cặp mồi lại cónhiệtđộbắtmồikhácnhau.Dođónhiệtđộgắnmồiđượctốiưuđểtránhcácsản phẩm không đặc hiệu và đảm bảo các gen đích đã chọn đều đƣợc khuếch đại chínhxác Dựa trên nhiệt độ của mồi và mẫu dò cũng nhƣ các kết quả khảo sát sơ bộ ởtrên, phản ứng realtime PCR đƣợc khảo sát ở 3 nhiệt độ bắt mồi là 58 o C, 60 o C và62 o C,kếtquảnhƣ sau:

Bảng 3.10 cho thấy giá trị chu kì ngƣỡng của phản ứng realtime PCR ở cácnhiệtđộ58 o C,60 o Cvà62 o Clàkhácnhautrongđóởnhiệtđộ60 o Ccả6mẫuDNAđềuxuấthiệngiátr ịchukìngƣỡngvàcácgiátrịnàycóýnghĩatrongchẩnđoán.Điềunàychứngtỏ60 o Clànhiệtđộthíchhợp chophảnứngmultiplexrealtimePCR.

3.2.5α.2 Kếtquảtốiưu Mastermix ĐểtốiưuthànhphầnkhácthamgiavàophảnứngrealtimePCR,chúngtôilựa chọn 2 master mix: master mix của IDT (hãng tổng hợp mồi và mẫu dò) vàmaster mix của hãng Hàn Quốc (HQ).Thông thường thành phần cơ bản của mastermix bao gồm buffer, dNTPs, MgCl2.Tuy nhiên, dNTPs, MgCl2của mỗi hãng cónồng độ khác nhau Hơn nữa, nồng độ của các thành phần này ảnh hưởng rất lớnđến độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứngPCR Do đó, chúng tôi khảo sát 2 loạimaster mix trong phản ứng realtime PCR nhiều gen đích để lựa chọn master mix.Kết quả thể hiện ở Bảng 3.11 cho thấy trong các trường hợp master mix của hãngHQ đều cho giá trị Cq chậm hơn master mix của IDT từ 3 chu kỳ, chính vì vậychúngtôilựachọn mastermixcủaIDTchocácphảnứng multiplexrealtimePCR.

Nhƣ vậy, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ bắt mồi và mẫu dò là 60 o C và mastermixIDTchophảnứngmultiplexrealtimePCR.

Ngƣỡngpháthiệnlànồngđộtốithiểu(bậcphaloãngtốiđa)màtạiđóbộsinhphẩmvẫnphá thiệnđƣợccácvikhuẩn.Đểxácđịnhđƣợcngƣỡngpháthiệncủabộsinhphẩmmultiplexrealti mePCR,chúngtôithựchiệnbằngcáchnuôicấycácvikhuẩngâynhiễmkhuẩnbệnhviện,đếmsốl ƣợngchiaracácmẫukhácnhau,cácmẫunàyđƣợctáchchiếtDNAvàchạyrealtimePCR.Kếtquảthể hiệnởBảng3.12nhƣsau:

Kết quả cho thấy ở các nồng độ đã nghiên cứu đường tín hiệu huỳnh quangđều vượt qua đường tín hiệu nền và có dạng của một đường realtime PCR chuẩn.Tuy nhiên ngay ở nồng độ 10 3 CFU/mL giá trị chu kì ngưỡng xuất hiện trước chukỳ 35, các tín hiệu huỳnh quang rõ nét, do đó ngƣỡng phát hiện của phản ứngmultiplex realtime PCR của chúng tôi là 10 3 CFU/mL vi khuẩn mỗi loại Theo YangQ và cộng sự trộn chủngAcinetobacter sppkháng carbapenem vào mẫu đờm vàphânthìngƣỡngpháthiệnlà10 2 CFU/mL[105].

Nhân bản gen Cyt : DNA tổng số của chủng vi khuẩnK. pneumoniaeđƣợctiếnhànhPCRvớicặpmồiđặc hiệu.

3’;KpCytR:5’-CGGGTGATCTGCTCATGAAT-3’ với chu trình nhiệt tương ứng Sau đó phân tích điện di trên gel agarose, kếtquảđƣợcthể hiệntrênHình3.18:

Hình 3.18.Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản gen

CytcủachủngK.pneumoniae Đườngchạy 1: Sản phẩm PCR đối chứng âm (không khuôn); đường chạy 2: Sảnphẩm PCR nhân bản gen Cyt của chủng K pneumoniae bằng cặp mồi KpCytF/R; ĐườngchạyM: Thang DNA chuẩn 100 bp (Thermo )

Kết quả cho thấy sản phẩm PCR thu được có kích thước và hàm lượng đảmbảochoquátrìnhgắnvàovectortáchdòng.

Sản phẩm PCR đƣợc gắn vào vector tách dòng pCR2.1 (Invitrogen) theo quytrình đã trình bày ở phần phương pháp Sau đó, sản phẩm gắn được biến nạp vào tếbàokhảbiếnE.coliDH5αα.

Vi khuẩnE colichủng DH5α sau khi xử lý CaCl2, màng tế bào trở nên xốp,giúp cho vector pCR2.1 (đã gắn sản phẩm PCR) có thể xâm nhập vào tế bào mộtcách dễ dàng hơn Giai đoạn sốc nhiệt kế tiếp (42 o C trong 60 giây) để kích thích sựbiến nạp plasmid vào trong tế bào Sau đó tế bào đƣợc cấy trải lên môi trườngdưỡng chất, giúp cho tế bào hồi phục, nhờ sự trợ giúp của bộ máy tổng hợp trong tếbào mà plasmid tiến hành sao mã, phiên mã và dịch mã tạo nên các protein tươngứng Gen kháng kháng sinh đƣợc chọn làm dấu hiệu chọn lọc để phân biệt những tếbào có tiếp nhận DNA plasmid trong số những tế bào không tiếp nhận Toàn bộ quátrình tiến hành thực hiện nhƣ đã trình bày trong phần phương pháp Kết quả biếnnạpđượcthể hiệnởHình3.19:

Hình3.19.Kết quảbiếnnạpvectorpCR2.1(đãgắnsảnphẩmPCR)vàotếbào

E.colichủngDH5α Để tiến hành chọn dòng, chúng tôi sử dụng phương pháp PCR từ khuẩn lạc,chọn ngẫu nhiên 15 khuẩn lạc để tiến hành PCR với cặp mồi KpCytF/R và chu trìnhnhiệtphùhợpkếtquảthểhiệnở Hình3.20.

1– 15α: Sản phẩm PCR với cặp mồi KpCytF/R từ các khuẩn lạc số 1-15α tương ứng;GiếngM: Thang DNA 100 bp

Kết quả điện di Hình 3.20 cho thấy trong 15 khuẩn lạc đã chọn để tiến hànhPCR, các khuẩn lạc đều cho sản phẩm PCR có kích thước khoảng hơn 100 bp. Nhƣvậy,khảnăng15dòngtếbàonàyđềuchứaplasmidtáitổhợpmanggenđích.Từđó,tiếnhànhtá chchiếtplasmidvàgiảitrìnhtựcácgenđãthuđƣợc.

Dòng khuẩn lạc 1, 4, 7 được chọn nuôi cấy trong môi trường LB có bổ sungkháng sinh ampicillin 100 μg/ml hoặc kanamycin 50 μg/ml và nuôi lắc 37g/ml hoặc kanamycin 50 μg/ml hoặc kanamycin 50 μg/ml và nuôi lắc 37g/ml và nuôi lắc 37 o C, 200vòng/phút để nhân lên với số lƣợng lớn Sau khi tách chiết plasmid theo quy trìnhnhƣ đã trình bày ở phần phương pháp, kiểm tra trên gel agarose 0,8% Kết quả điệndiđược thểhiệnởHình 3.21:

Hình 3.21.Kết quả điện di plasmid tái tổ hợp mang gen

Kết quả sau khi chạy điện di cho thấy 3 băng đậm, rõ nét, thể hiện3 t r ạ n g thái khác nhau của plasmid Điều này chứng tỏ quá trình chiết tách và tinh sạchDNAplasmid đãthànhcông,loạibỏhoàntoànRNAvàthuplasmid.

Tiếnhànhgiảitrìnhtự 3dòngplasmidtáitổhợptrên.Cáctrìnhtựđƣợcphântích và so sánh bằng phần mềm bioedit và NTIvector, kết quả các trình tự giốngnhauvàchínhlàvùnggenCytđãdùngthiếtkếmồivàmẫudò,cụthểnhƣsau:

Nhưvậy,chúngtôiđãtạothànhcôngđốichứngdươnglàplasmidpCR2.1/KpCyt mang gen đích Cyt của chủngK pneumoniaedùng trong phản ứngmultiplexrealtimePCR.

CGTTATCTGTTTGTGATG, gắn sảnphẩmvàovectortáchdòngpBT,chọn dòngvàxácđịnh trìnhtự.Kết quả trình tự thu đƣợc chính là vùng gen đƣợc thiết kế mồi và mẫu dò của chủngS.aureus Như vậy đã có đối chứng dương mang vùng gen đíchNuccủa chủng vikhuẩnS.aureus.

GTCGTCCTTGATGTACTG, gắn sản phẩm vào vector tách dòng pBT, chọn dòng và xác định trình tự Kết quảtrình tự thu đƣợc chính xác là vùng gen đƣợc thiết kế mồi và mẫu dò của chủngP.aeruginosa Như vậy đã có đối chứng dương mang vùng gen đíchGyrcủa chủng vikhuẩnP.aeruginosa.

Thực hiện tương tự chúng tôi đã tạo thành công đối chứng dương là plasmidpCR2.1/AcOxa mang gen đích Oxa của chủngA baumannidùng trong phản ứngmultiplexrealtimePCR.

Kết quả xác định trình tự cho thấy các dòng plasmid tái tổ hợp thu đƣợc đềumang đoạn genYccđảm bảo làm đối chứng dương trong phản ứng multiplexrealtimePCRxácđịnh cácđốitƣợng nhiễmkhuẩnbệnh viện.

Tương tự các đối chứng dương, genGADPHcũng được nhân bản, gắn vàovectortáchdòng,chọndòngvàkiểmtralạibằngxácđịnhtrìnhtự,kếtquảchú ngtôi đã thu đƣợc dòng plasmid mang genGADPHphục vụ cho việc làm đối chứngdươngvớigennộichuẩn.

3.2.8 Kếtquảxácđịnhđộnhạy,độđặchiệucủabộsinhphẩmmultiplexrealtimePCRpháthi ện5tácnhânvikhuẩnthườnggặpgâynhiễmkhuẩnbệnhviện Để xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, chúng tôi tiến hành trên 97 mẫu có kết quảnuôi cấy dương tính phù hợp với 5 loại vi khuẩn nghiên cứu và 30 mẫu âm tính sau7ngàynuôicấy.

Sau khi đã tối ƣu đƣợc nhiệt độ gắn mồi và mẫu dò, lựa chọn đƣợc mastermix, chúng tôi tiến hành thử nghiệm phản ứng multiplex realtime PCR trên

97 mẫuchuẩn đã đƣợc phân lập, và định danh, khẳng định lại bằng phân tích trình tự 16S ởmục 3.1 Các mẫu này đã đƣợc tách chiết DNA tổng số Chúng tôi thực hiện trêncác mẫu chứng âm là nước không chứaDNasevàRNase, mẫu chứng dương là cácplasmid mang các gen đích đã đƣợc tách dòng, kết quả của phần 3.2.7.Chúng tôitiến hành rã đông hỗn hợp thành phần của bộ sinh phẩm, trộn đều bằng cách đảongượchoặcvoltex,spindowntrướckhisửdụng.Tiếnhànhphảnứngtheoquytrình với thành phần phản ứng nhƣ sau: Thể tớch của một phản ứng là 10àl bao gồm 5àlmaster mix, 0,25àl mồi xuụi 10 pmol/àl, 0,25àl mồi ngƣợc 10 pmol/àl, 0,5àl mẫudũ (2,5p/àl), 2àl DNA khuụn, bổ sung đủ 10àl Chương trỡnh phản ứng realtimePCR:b ƣ ớ c 1 : b i ế n t í n h 9 5 o Ct r o n g 3 p h ú t ; b ƣ ớ c 2 c h u t r ì n h l ặ p l ạ i 4 0 c h u k ỳ (95 o C trong 15 giây;6 0 o C trong 60 giây).M ộ t p h ầ n k ế t q u ả t h ể h i ệ n t r ê n H ì n h 3.22,Hình3.23.

Hình3.22.BiểuđồkhuếchđạiDNAcủamộtsốchủngchuẩn K.pneumoniae,A.baumanniivà GADPH

Kếtquảtạocácđốichứngdương