Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu phát triển bộ sinh phẩm multiplex realtime pcr phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện và khảo sát tính kháng kháng sinh

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần đƣợc công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần lại chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tơi xin đảm bảo tính khách quan kết xử lý số liệu nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Loan năm 2022 ii LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Lã Thị Huyền, Trƣởng phịng Cơng nghệ tế bào động vật- Viện CNSH PGS.TS Nguyễn Minh Hiền, Trƣởng khoa Sinh hoá - Bệnh viện Thanh Nhàn ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu Các Cô bảo cho nhiều ý kiến hƣớng dẫn qúy báu, động viên giúp đỡ tơi giải khó khăn vƣớng mắc trình thực luận án tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn tới tập thể cán nghiên cứu phịng Cơng nghệ tế bào động vật - Viện CNSH - Viện Hàn Lâm KH CN Việt Nam giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho q trình thực nghiên cứu Tơi xin trân trọng cảm ơn anh chị khoa Sinh hố, khoa Vi sinh, khoa Hồi sức tích cực, bệnh viện Thanh Nhàn, khoa Hồi sức tích cực bệnh viện Đức Giang, đặc biệt em Nguyễn Trọng Linh ln đồng hành tơi q trình nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô khoa CNSH - Học viện KH CN, thầy hội đồng nghiên cứu sinh nhiệt tình dạy bảo giúp đỡ tôi, cho ý kiến q báu để sửa chữa hồn thiện luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình ln hỗ trợ tạo điều kiện tốt cho tơi chun tâm làm việc hồn thành luận án Cuối xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, đồng nghiệp Khoa NôngLâm trƣờng Đại học Hoa Lƣ động viên giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập, nghiên cứu công tác Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Tác giả NCS Nguyễn Thị Loan iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan …………………………………………………………………… i Lời cảm ơn……………………………………………………………………… ii Mục lục ……………………………………………… ………… iii Danh mục kí hiệu, chữ viết tắt ………………………………………… v Danh mục bảng …………………………………………………… ……… vi Danh mục hình……………………………………………………… viii MỞ ĐẦU………………………………………………………………… CHƢƠNG TỔNG QUAN Tình hình nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện … 1.1.1 Lịch sử phát nghiên cứu nhiễm khuẩn bệnh viện …… 1.1.2 Tình hình nhiễm khuẩn bệnh viện …………………………… 1.1.3 Căn nguyên vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện …………………… Một số kỹ thuật phát vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện … 10 1.2.1 Cấy máu xét nghiệm sinh hoá ……………………………………… 10 1.2.2 Kỹ thuật xác định có mặt DNA …………… ………………………… 11 1.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng multiplex realtime PCR xác định 1.1 1.2 vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện …………………………… 15 1.3.1 Trên giới …………………………………………………………… 15 1.3.2 Ở Việt Nam …………………………………………………………… 17 Kháng sinh kháng kháng sinh vi khuẩn …………….………… 19 1.4.1 Kháng sinh chế tác động ………………………………………… 19 1.4.2 Kháng kháng sinh vi khuẩn chế kháng kháng sinh ………… 21 1.4.3 Tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn giới Việt Nam… 28 CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 1.4 Đối tƣợng nghiên cứu …………………………………………… 35 2.1.1 Các mẫu bệnh phẩm…… …………………………………………… 35 2.1.2 Cách tính cỡ mẫu nghiên cứu ………………………………………… 35 Nguyên vật liệu nghiên cứu ………………………………………… 36 2.2.1 Nguyên vật liệu ………………………………………………………… 36 2.1 2.2 iv 2.2.2 Các thiết bị …………………………………………………………… 36 2.2.3 Hoá chất……………………………………………………………… 36 Phƣơng pháp nghiên cứu …………………………………… …… 38 2.3.1 Nhóm phƣơng pháp vi sinh truyền thống …………………………… 38 2.3.2 Phƣơng pháp sinh học phân tử ………………………………………… 39 2.3.3 Phƣơng pháp kiểm tra độ nhậy, độ đặc hiệu, độ ổn định, ngƣỡng phát sinh phẩm multiplex realtime PCR ……………………… 2.3.4 Phƣơng pháp thống kê ………………………………………………… 46 Đạo đức nghiên cứu …………………………………………………… 48 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ……………………………… 50 Kết phân lập chủng vi sinh vật gây nhiễm khuẩn bệnh viện … 50 3.1.1 Kết phân bố xét nghiệm theo loại bệnh phẩm ………………… 51 3.1.2 Tỉ lệ loại vi sinh vật phân lập đƣợc ………………………………… 52 3.1.3 Kết phân tích gen 16S rARN từ chủng vi khuẩn phân lập …… 53 Kết phát triển sinh phẩm multiplex realtime PCR xác định đồng thời tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện ……… 3.2.1 Kết lựa chọn, phân tích trình tự gen đích ………………………… 55 3.2.2 Kết thiết kế mồi mẫu dò ………………………………………… 58 3.2.3 Kết kiểm tra độ đặc hiệu mồi mẫu dị với gen đích ……… 60 3.2.4 Kết phản ứng multiplex realtime PCR chủng chuẩn …… 71 3.2.5 Kết tối ƣu phản ứng realtime PCR ………….…………………… 75 3.2.6 Kết xác định ngƣỡng phát …………………………………… 77 3.2.7 Kết tạo đối chứng dƣơng …………………….………………… 78 3.2.8 Kết xác định độ nhạy, độ đặc hiệu ……………………………… 82 3.2.9 Kết xác định độ ổn định …………………………………………… 87 Kết kháng sinh đồ chủng vi khuẩn nghiên cứu gen mã hoá beta-lactamase mở rộng vi khuẩn E coli ………………… 3.3.1 Kết kháng sinh đồ ………………………………………………… 91 3.3.2 Kết xác định gen mã hoá beta-lactamase phổ rộng E coli …… 98 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……………………………………… ……… 105 2.3 2.4 3.1 48 3.2 55 3.3 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 92 v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Phần viết đầy đủ Phần viết tắt Ac Acinetobacter baumannii BV Bệnh viện Ct Thresold cycle (chu kì ngƣỡng) CTX-M Cefotaxime- Munich DNA Deoxyribonucleic Axit Ec Escherichia coli ECDC European Centre for Disease Control and Prevention (Trung tâm kiểm sốt phịng ngừa dịch bệnh Châu Âu) ESBL Extended-Spectrum Beta-lactamase (beta-lactamase phổ rộng) FN Fall Negative (âm tính giả) FP Fall Positive (dƣơng tính giả) GADPH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase HAI Hospital Aquired- Infections Hu Human I Intermediate (trung gian) Kp Klebsiella pneumoniae MRSA Methicillin- Resistant Staphylococcus aureus MSSA Methicillin- Susceptible Staphylococcus aureus NK Nhiễm khuẩn NKBV Nhiễm khuẩn bệnh viện Pa Pseudomonas aeruginosa PCR Polymerase Chain Reaction S Sensitivity (nhạy cảm) Sa Staphylococcus aureus R Resistant (đề kháng) VSV Vi sinh vật WHO World Healthy Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Tỷ lệ tác nhân vi khuẩn gây NKBV ……………………………… Bảng 1.2 Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện loại nhiễm khuẩn thƣờng gặp ……… Bảng 1.3 Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện loại nhiễm khuẩn có tỷ lệ cao … Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi, mẫu dị gen đích chủng vi khuẩn …… Bảng 2.2 Trình tự mồi 16S rARN gen mã hoá ESBL ……………………… 38 Bảng 2.3 Thành phần chƣơng trình chạy phản ứng PCR ………………… 42 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng mutiplex realtime PCR kiểm tra độ đặc hiệu 37 mồi mẫu dò với DNA đích ………………… 44 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng mutiplex realtime PCR kiểm tra độ đặc hiệu mồi mẫu dò với DNA đích vi khuẩn …………………………… 45 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng multiplex realtime PCR chủng chuẩn … 45 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng realtime PCR mẫu chủng chuẩn ………… 46 Bảng 3.1 Tỷ lệ xét nghiệm tỷ lệ cấy dƣơng tính theo loại bệnh phẩm ……… 51 Bảng 3.2 Tỷ lệ phân lập vi sinh vật theo loại bệnh phẩm ……………………… 52 Bảng 3.3 Các mồi mẫu dò cho phản ứng realtime PCR ……………… 58 Bảng 3.4 Giá trị chu kì ngƣỡng kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi, mẫu dò với DNA vi khuẩn A baumannii, K pneumoniae DNA ngƣời ……… 62 Bảng 3.5 Giá trị chu kì ngƣỡng kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi, mẫu dò với DNA vi khuẩn S aureus, E coli, P aeruginosa………………… 64 Bảng 3.6 Giá trị chu kì ngƣỡng phản ứng multiplex realtime PCR kiểm tra độ đặc hiệu hỗn hợp mồi, mẫu dị với DNA đích vi khuẩn A baumannii, K pneumoniae gen GADPH ………………………… 66 Bảng 3.7 Giá trị chu kì ngƣỡng kiểm tra độ đặc hiệu hỗn hợp mồi, mẫu dò với DNA vi khuẩn E coli, S aureus, P aeruginosa ……………… Bảng 3.8 70 Giá trị chu kì ngƣỡng phản ứng multiplex realtime PCR chủng chuẩn A baumannii, K pneumoniae ngƣời (Hu) ……… 73 vii Bảng 3.9 Giá trị chu kì ngƣỡng phản ứng multiplex realtime PCR chủng chuẩn E coli, S aureus, P aeruginosa ……………………… 75 Bảng 3.10 Giá trị chu kì ngƣỡng phản ứng multiplex realtime PCR nhiệt độ khác ……………………………………… Bảng 3.11 Giá trị chu kì ngƣỡng phản ứng multiplex realtime PCR với Master mix IDT HQ ……………………………………………… Bảng 3.12 76 77 Giá trị chu kì ngƣỡng phản ứng multiplex realtime PCR với nồng độ pha loãng ………………………………………………… 77 Bảng 3.13 So sánh phƣơng pháp multiplex realtime PCR nuôi cấy theo mẫu bệnh phẩm ………………………………………………………… 86 Bảng 3.14 Kết phát loại vi sinh vật phƣơng pháp multiplex realtime PCR so sánh với phƣơng pháp cấy máu …………………… 87 Bảng 3.15 Giá trị chu kì ngƣỡng mẫu khảo sát thời gian bảo quản 88 Bảng 3.16 Tỷ lệ kháng kháng sinh P aeruginosa Acinetobacter sp ……… 93 Bảng 3.17 Tỷ lệ kháng kháng sinh E coli K pneumonia …………………… 94 Bảng 3.18 Tỷ lệ kháng kháng sinh S aureus …………………………………… 96 Bảng 3.19 Tính nhạy cảm kháng sinh chủng E coli ………………………… 98 Bảng 3.20 Các mẫu E coli có mang gen ESBLs ………………………… 100 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Định nghĩa nhiễm khuẩn bệnh viện ………………….…………… Hình 1.2 Nhân tố liên quan đến khả kháng kháng sinh vi khuẩn… 22 Hình 1.3 Cơ chế trao đổi vật chất di truyền vi sinh vật…………… 23 Hình 1.4 Cơ chế kháng thuốc phổ biến vi khuẩn……………………… 23 Hình 1.5 Bản đồ tình trạng kháng kháng sinh giới đến năm 2050 29 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu ………………………………………………… 49 Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn môi trƣờng thạch máu… 50 Hình 3.2 Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn mơi trƣờng Chapman… 54 Hình 3.3 Hình ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số chủng S aureus, A baumannii, E coli, K pneumoniae P aeruginosa ………… 54 Hình 3.4 Hình ảnh nhân gen 16S rARN từ DNA tổng số số chủng vi khuẩn A baumannii P aeruginosa ………………… 55 Hình 3.5 Hình ảnh nhân gen 16S rARN từ DNA tổng số số chủng vi khuẩn E coli, S aureus, K pneumoniae ……………… Hình 3.6 55 Kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi gen đích chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết tƣơng ứng ……………… 56 Hình 3.7 Kết PCR nhân gen bla OXA -51 like A baumannii, gyrB P aerruginossa, gen YccT E coli, gen Nuc S aureus gen Cyt K pneumoniae ……………………………… 57 Hình 3.8 Biểu đồ khuếch đại DNA vi khuẩn (A): A baumannii, (B): Klebsiella pneumoniae (C): GADPH ngƣời ……………… 61 Hình 3.9 Biểu đồ khuếch đại DNA vi khuẩn (A): S aureus, (B): E coli, (C): P aeruginosa ………………………………………………… 63 Hình 3.10 Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu hốn hợp mồi mẫu dị với DNA đích vi khuẩn: ống đối chứng khơng có DNA ……… 66 Hình 3.11 Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu hỗn hợp mồi mẫu dị với DNA đích vi khuẩn (A): A baumannii, (B), K pneumoniae (C) 67 DNA ngƣời ………………………………………………… ix Hình 3.12 Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu hỗn hợp mồi mẫu dò với DNA đích vi khuẩn: ống có hốn hợp DNA đích ………… 68 Hình 3.13 Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu hỗn hợp mồi mẫu dò với DNA đích vi khuẩn ống khơng có đối chứng ………………… 68 Hình 3.14 Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu hỗn hợp mồi mẫu dò với DNA đích vi khuẩn ………………………………………… 69 Hình 3.15 Biểu đồ khảo sát độ đặc hiệu hỗn hợp mồi mẫu dị với DNA đích vi khuẩn ống có hỗn hợp DNA đích ……… 70 Hình 3.16 Biểu đồ khuếch đại DNA chủng chuẩn (A): A baumannii, (B): K pneumoniae (C): GADPH ngƣời … 72 Hình 3.17 Biểu đồ khuếch đại DNA chủng (A): E coli, (B): S aureus P aeruginosa ………………………………… 74 Hình 3.18 Kết điện di sản phẩm PCR nhân gen Cyt chủng K pneumoniae ……………………………………………………… 78 Hình 3.19 Kết biến nạp vector pCR2.1 (đã gắn sản phẩm PCR) vào tế bào E coli chủng DH5α ……………………………………… 79 Hình 3.20 Kết PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi KpCytF/R ……… 80 Hình 3.21 Kết điện di plasmid tái tổ hợp mang gen Cyt ………………… 80 Hình 3.22 Biểu đồ khuếch đại DNA số chủng chuẩn K pneumoniae 83 Hình 3.24 Biểu đồ khuếch đại DNA mẫu đối chứng dƣơng chủng vi khuẩn S aureus, P aeruginosa, E coli sau thời gian bảo quản…… 89 Hình 3.25 Biểu đồ khuếch đại DNA mẫu đối chứng dƣơng chủng A baumannii, K pneumoniae, Hu sau thời gian bảo quản… 90 Hình 3.26 Hình ảnh kiểm tra khả kháng số loại kháng sinh vi khuẩn A baumannii, K pneumoniae, P aeruginosa, E coli S aureus……………………………………………………………… 92 Hình 3.27 Hình ảnh điện di sản phấm PCR xác định gen SHV, TEM …… 99 Hình 3.28 Hình ảnh điện di sản phấm PCR xác định gen CTX-M ………… 99 MỞ ĐẦU Nhiễm khuẩn bệnh viện (HospitalAquiredInfections-HAI) (NKBV) thách thức mối quan tâm hàng đầu công tác chăm sóc sức khoẻ Việt Nam nhƣ toàn giới NKBV làm tăng tỉ lệ tử vong, kéo dài thời gian nằm viện (7-15 ngày), tăng việc sử dụng kháng sinh dẫn tới làm tăng chi phí điều trị cao gấp 2-4 lần Ngồi NKBV cịn góp phần gây tình trạng kháng thuốc số vi khuẩn làm gia tăng việc xuất tác nhân gây bệnh Tác nhân gây NKBV có nhiều thay đổi vài thập kỷ qua Các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện vi khuẩn Gram dƣơng trực khuẩn Gram âm, nấm, kí sinh trùng Trong NKBV trực khuẩn Gram âm đa kháng thuốc kháng sinh trở thành tai họa thực cho bệnh viện Nuôi cấy vi sinh vật phƣơng pháp phổ biến tiêu chuẩn vàng để phát vi khuẩn gây bệnh máu dịch thể, nhiên phƣơng pháp nhiều hạn chế nhƣ: 1) đòi hỏi nhiều thời gian (1-5 ngày) tùy thuộc vi sinh vật gây bệnh; 2) kết cấy máu âm tính khơng loại trừ đƣợc nhiễm khuẩn bệnh viện; 3) khơng thể đầy đủ cộng đồng vi sinh vật vết thƣơng Việc phát DNA vi khuẩn mẫu bệnh phẩm bệnh nhân đƣợc cho phƣơng pháp có độ nhạy xác cao, thời gian phát nhanh, có ý nghĩa lớn chẩn đốn nhiễm khuẩn Trong năm gần có số cơng trình nghiên cứu sử dụng sinh phẩm nƣớc sản xuất để phát vi sinh vật máu dịch thể thu đƣợc nhiều thành công, nhiên chế tạo sinh phẩm để chủ động chẩn đốn, giảm chi phí, phù hợp với hệ vi khuẩn gây bệnh Việt Nam yêu cầu ngành y tế Với mong muốn phát triển sinh phẩm multiplex realtime PCR có độ nhạy độ đặc hiệu cao để xác định nhanh chóng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện, giúp bác sĩ điều trị sớm đƣa đƣợc định phù hợp nhằm tăng hội cứu sống bệnh nhân, giảm chi phí 501 AAACGAAGCT TTAGTTCGTC AAGGCTTGGC TAAAGTTGCT TATGTTTATA 551 AACCTAACAA TACACATGAA CAACTTTTAA GAAAAAGTGA AGCACAAGCG 601 AAAAAAGAGA AATTAAATAT TTGGAGCGAA GACAACGCTG ATTCAG PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN ĐÍCH CỦA CÁC VI KHUẨN VÀ KẾT QUẢ THIẾT KẾ MỒI, MẪU DỊ Trình tự gen Cyt vi khuẩn Klebsiella pneumoniae>KpCyt ATGTCTGATGCTAAAGCAAAAATCACCCTGGGTGGTGACACTGCTATTGAACTGGATGTGCTAAAAGGCACGCTCGGTCAGGATGTTATTGATATTCG TAGTCTTGGTTCAAAAGGCGTATTTACCTTTGACCCAGGTTTCACATCAACGGCTTCTTGTGAATCTAAAATTACGTTTATCGATGGTGACGAGGGGA TCCTGCTGCACCGCGGCTTCCCGATCGACCAGTTAGCGACCGAATCTAATTATCTTGAAGTCTGTTATATCCTGCTGTACGGCGAAAAGCCGACCCAG GCCGAATATGACGAATTCAAAACTACCGTCACCCGCCACACCATGATTCATGAGCAGATCACCCGTCTGTTCCACGCGTTCCGTCGCGATTCCCACCC GATGGCGGTGATGTGCGGGATCACCGGCGCGCTGGCGGCGTTCTATCATGATTCCCTCGACGTGAATAACCCGCGTCACCGCGAGATTGCCGCCTACC GTCTGCTGTCCAAAATGCCAACCATGGCAGCCATGTGTTACAAGTATTCTATCGGCCAGCCGTTTGTTTATCCGCGCAACGACCTCTCCTACGCCGGC AACTTCCTGCGCATGATGTTTGCGACACCGTGCGAAGAGTATGAAGTCAATCCGGTGCTGGAGCGCGCGATGGATCGTATTCTGATCCTGCACGCCGA TCACGAGCAGAACGCGTCGACCTCCACGGTACGTACCGCAGGCTCCTCCGGCGCTAACCCGTTCGCCTGTATCGCTGCGGGCATCGCCTCCCTGTGGG GACCGGCACACGGTGGCGCCAACGAAGCGGCGCTGAAAATGCTGGAAGAGATCAGCTCCGTTGAGCACATTCCGGAATTTGTTCGTCGTGCGAAAGAC AAGAATGACTCTTTCCGCCTGATGGGCTTCGGCCATCGTGTTTACAAAAACTACGATCCGCGCGCCACCGTGATGCGTGAAACCTGCCATGAAGTGCT GAAAGAGCTGGGCACCAAAGACGACCTGCTGCAGGTGGCCATGGAGCTGGAGCATATCGCGCTGAACGACCCGTACTTCATCGAGAAGAAACTGTATC CGAACGTCGACTTCTACTCCGGTATCATCCTGAAAGCGATGGGTATTCCGTCCTCCATGTTTACCGTTATCTTCGCCATGGCGCGTACCGTGGGCTGG ATTGCGCACTGGAACGAAATGCACAGCGATGGCATGAAGATCGCCCGTCCGCGTCAGCTGTATACCGGCTACGCCAAACGCGATTTCCAGTCCGACAT TAAGCGTTAA Amplicon Size: 135 bp KpCyt_For: CCAGTTAGCGACCGAATCTAAT KpCyt_Rev: CGGGTGATCTGCTCATGAAT Primer Tm: 62⁰C BLAST: Will align to multiple Klebsiellapneumonia Secondary structure: Okay Some minor, non-extendible, dimers are predicted to form Primer related SNPs: No SNPs annotated in region KpCyt_probe: /56-FAM/CGACCCAGG/ZEN/CCGAATATGACGAAT/3IABkFQ/ Tm 68⁰C Probe related SNPs: No SNPs annotated in region SaNuc ATGGCAATTGTTTCAATATTACTTATAGGGATGGCTATCAGTAATGTTTCGAAAGGGCAATACGCAAAGAGGTTTTTCTTTTTCGCTACTAGTTGCTT AGTGTTAACTTTAGTTGTAGTTTCAAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAGAAGTGGTTCTGAAGATCCAACAG TATATAGTGCAACTTCAACTAAAAAATTACATAAAGAACCTGCGACATTAATTAAAGCGATTGATGGTGATACGGTTAAATTAATGTACAAAGGTCAA CCAATGACATTCAGACTATTATTGGTTGATACACCTGAAACAAAGCATCCTAAAAAAGGTGTAGAGAAATATGGTCCTGAAGCAAGTGCATTTACGAA AAAAATGGTAGAAAATGCAAAGAAAATTGAAGTCGAGTTTGACAAAGGTCAAAGAACTGATAAATATGGACGTGGCTTAGCGTATATTTATGCTGATG GAAAAATGGTAAACGAAGCTTTAGTTCGTCAAGGCTTGGCTAAAGTTGCTTATGTTTATAAACCTAACAATACACATGAACAACTTTTAAGAAAAAGT GAAGCACAAGCGAAAAAAGAGAAATTAAATATTTGGAGCGAAGACAACGCTGATTCAG Amplicon Size: 140 bp SaNuc_For: AGGGATGGCTATCAGTAATGTTT SaNuc_Rev: CGCCGTTATCTGTTTGTGATG Primer Tm: 61⁰C/62⁰C BLAST: Aligns to multiple strains of S.aureus Secondary structure: Okay Primer related SNPs: No SNPs annotated in region SaNuc_probe: /56-FAM/CGAAAGGGC/ZEN/AATACGCAAAGAGGT/3IABkFQ/ Probe related SNPs: No SNPs annotated in region AcOxa Tm 67⁰C ATGAACATTAAAGCACTCTTACTTATAACAAGCGCTATTTTTATTTCAGCCTGCTCACCTTATATAGTGACTGCTAATCCAAATCACAGCGCTTCAAA ATCTGATGAAAAAGCAGAGAAAATTAAAAATTTATTTAACGAAGTACACACTACGGGTGTTTTAGTTATCCAACAAGGCCAAACTCAACAAAGCTATG GTAATGATCTTGCTCGTGCTTCGACCGAGTATGTACCTGCTTCGACCTTCAAAATGCTTAATGCTTTGATCGGCCTTGAGCACCATAAGGCAACCACC ACAGAAGTATTTAAGTGGGACGGGCAAAAAAGGCTATTCCCAGAATGGGAAAAGGACATGACCCTAGGCGATGCTATGAAAGCTTCCGCTATTCCGGT TTATCAAGATTTAGCTCGTCGTATTGGACTTGAACTCATGTCTAAGGAAGTGAAGCGTGTTGGTTATGGCAATGCAGATATCGGTACCCAAGTCGATA ATTTTTGGCTGGTAGGTCCTTTAAAAATTACTCCTCAGCAAGAGGCACAGTTTGCTTACAAGCTAGCTAATAAAACGCTTCCATTTAGCCCAAAAGTC CAAGATGAAGTGCAATCCATGTTATTCATAGAAGAGAAGAATGGAAATAAAATATACGCAAAAAGTGGTTGGGGATGGGATGTAGACCCACAAGTAGG CTGGTTAACTGGATGGGTTGTTCAGCCTCAAGGAAATATTGTAGCGTTCTCCCTTAACTTAGAAATGAAAAAAGGAATACCTAGCTCTGTTCGAAAAG AGATTACTTATAAAAGTTTAGAACAATTAGGTATTTTATAG Amplicon Size: 98 bp AcOxa_For: GAAGTGAAGCGTGTTGGTTAT AcOxa_Rev: GCCTCTTGCTGAGGAGTAAT Primer Tm: 61⁰C BLAST: Aligns to multiple strains of A.baumannii Secondary structure: Okay Primer related SNPs: No SNPs annotated in region AcOxa_probe: /YakYel/CGACTTGGG/ZEN/TACCGATATCTGCATTGC/3IABkFQ/ Probe related SNPs: No SNPs annotated in region PaGyr Tm 68⁰C ATGAGCGAGAACAACACGTACGACTCTTCCAGCATCAAGGTGCTGAAGGGGCTGGATGCCGTACGCAAGCGCCCCGGCATGTACATCGGCGACACCGA CGATGGCACCGGTCTGCACCACATGGTGTTCGAGGTGGTGGATAACTCCATCGACGAAGCGCTGGCCGGTTACTGCAGCGAAATCAGCATCACCATCC ATACGGATGAGTCGATCACTGTCCGCGACAATGGACGCGGTATTCCGGTGGATATCCACAAGGAAGAAGGGGTTTCTGCGGCGGAAGTGATCATGACC GTCCTCCACGCCGGCGGCAAGTTCGACGACAACACCTACAAGGTGTCCGGCGGCTTGCACGGTGTGGGCGTCTCGGTGGTGAACGCGCTGTCCCATGA ACTACGCCTGACCATCCGTCGCCACAACAAGGTCTGGGAACAGGTCTACCACCACGGCGTTCCGCAGTTCCCACTGCGCGAAGTGGGCGAGACCGATG GCTCCGGTACCGAAGTTCACTTCAAGCCGTCCCCGGAGACCTTCAGCAACATCCACTTCAGTTGGGACATCCTGGCCAAGCGCATCCGCGAGCTGTCC TTCCTCAACTCCGGCGTCGGCATCCTGCTGCGCGACGAGCGTACCGGCAAGGAGGAGCTGTTCAAGTACGAAGGCGGTCTGAAGGCCTTCGTCGAGTA CCTGAACACCAACAAGACCGCGGTGAACGAGGTATTCCACTTCAACGTCCAGCGTGAAGAGGACGGCGTGGGTGTGGAAGTCGCCTTGCAGTGGAACG ACAGCTTCAACGAGAACCTGCTCTGCTTCACCAACAACATCCCGCAGCGTGATGGCGGCACCCACCTGGCCGGTTTCCGTTCGGCGCTGACGCGTAAC CTGAACAACTACATCGAGGCCGAAGGCCTGGCGAAGAAATTCAAGATCGCCACCACCGGCGACGATGCCCGCGAAGGCCTCACCGCGATCATCTCGGT GAAGGTACCGGACCCGAAGTTCAGCTCGCAGACCAAGGACAAGCTGGTCTCCTCCGAGGTGAAGACTGCGGTGGAACAGGAGATGGGCAAGTACTTCG CCGACTTCCTGCTGGAGAATCCCAACGAAGCCAAGGCCGTGGTCGGCAAGATGATCGACGCCGCCCGTGCCCGCGAGGCCGCGCGCAAGGCGCGCGAG ATGACCCGCCGCAAGGGCGCGCTGGACATCGCCGGCCTGCCCGGCAAACTGGCCGATTGCCAGGAAAAGGACCCGGCGCTCTCCGAACTGTACATCGT GGAGGGTGACTCCGCGGGCGGTTCCGCCAAGCAGGGCCGCAATCGCCGGACCCAGGCGATCCTGCCGCTCAAGGGCAAGATCCTCAACGTCGAAAAGG CGCGCTTCGACAAGATGCTCTCCTCCCAGGAGGTCGGTACGCTGATCACCGCCCTGGGCTGTGGCATCGGCCGCGAGGAATACAACATCGACAAGCTG CGCTACCACAACATCATCATCATGACCGATGCTGACGTCGACGGTTCGCACATCCGCACCCTGCTGTTGACCTTCTTCTTCCGCCAGATGCCCGAGCT GATCGAGCGTGGCTACATCTACATCGCCCAGCCCCCGTTGTACAAGGTCAAGCGCGGCAAGCAGGAGCAGTACATCAAGGACGACCAGGCCATGGAAG AGTACATGACCCAGTCGGCCCTGGAAGACGCCAGCCTGCACGTCAACGAGCACGCTCCGGGCCTGTCCGGGGCGGCGCTGGAGAAACTGGTCAACGAG TATCGCGGGGTGATCGCCACCCTCAAGCGCCTGTCGCGCCTGTACCCCCAGGAGCTGACCGAGCACTTCATCTACCTGCCTACCGTGTCGGTGGACGA CCTGGCTAACGAGTCGGCCATGCAGGGCTGGTTGGAGAAGTTCCAGGCGCGCCTGACCGCCGCCGAGAAGTCCGGCCTGACCTACAAGGCCAGCCTGC GCGAAGACCGCGAGCGCCACCTGTGGCTGCCCGAGGTGGAACTGGTGGCCCACGGCCTGTCCAGCTACGTCACCTTCAACCGTGACTTCTTCGCCAGC AATGACTACCGCTCGGTGTCACTGCTCGGCGACCAGCTGAACAGCCTGCTGGAAGACGGCGCCTACGTGCAGAAGGGTGAGCGCAAGCGCCCGATCAG CGCCTTCAAGGACGGCCTGGACTGGCTGATGGCCGAAGGTACCAAGCGCCACAGCATCCAGCGATACAAGGGGCTGGGCGAGATGAACCCTGAGCAGC TGTGGGAAACCACCATGGATCCGAACGTCCGGCGCATGCTCAAGGTGACCATCGAGGACGCCATCGCCGCCGACCAGATCTTCAACACCCTGATGGGC GATGCCGTGGAGCCGCGCCGCGACTTCATCGAAAGCAACGCGCTGGCGGTGTCGAACCTGGACGTGTGA Amplicon Size: 127 bp PaGyr_For: CCTGCTGTTGACCTTCTTCT PaGyr_Rev: CTGGTCGTCCTTGATGTACTG Primer Tm: 62⁰C BLAST: Will align to multiple Pseudomonasaeruginosa Secondary structure: Good Primer related SNPs: No SNPs annotated in region PaGyr_probe: /5Cy3/CGAGCGTGGCTACATCTACATCGC/3IABkRQSp/ Probe related SNPs: No SNPs annotated in region Tm 68⁰C EcYcc ATGAAAACCGGCATCGTGACCACCTTGATTGCATTATGTTTGCCGGTATCCGTTTTTGCCACCACGCTGCGGCTTTCAACCGATGTCGATCTTCTGGTACT CGACGGCAAGAAGGTTTCCAGCTCTCTGCTGCGCGGTGCGGACAGCATTGAACTGGATAATGGACCGCATCAGTTAGTGTTTCGCGTTGAGAAGACGATTC ATCTTTCCAATAGTGAAGAACGGCTGTATATCTCCCCACCGCTGGTGGTCAGTTTTAATACCCAGCTCATCAACCAGGTCAATTTTCGCCTGCCTCGCCTG GAGAATGAGCGGGAAGCTAACCATTTTGATGCCGCGCCGCACCTTGAATTGTTGGATGGCGATGCGACGCCAATTCCGGTAAAGCTGGATATTCTCGCCAT TACCTCAACGGCAAAAACGATTGATTATGAGGTCGAGGTTGAACGCTATAACAAATCCGCGAAACGCGCTTCACTACCGCAATTTGCCACGATGATGGCAG ATGACAGTACGCTGCTTTCGGGTGTTTCCGAGCTGGATGCTATTCCACCGCAGTCTCAGGTGCTCACAGAACAACGGCTGAAGTATTGGTTTAAACTGGCT GACCCACAAACGCGAAATACTTTCCTGCAATGGGCGGAAAAACAACCATCTTCCTGA Amplicon Size: 99 bp EcYcc_For: CCAATTCCGGTAAAGCTGGATA EcYcc_Rev: GCGTTTCGCGGATTTGTTATAG Primer Tm: 62⁰C BLAST: Align to Escherichia coli Secondary structure: Okay Some minor, non-extendible, dimers are predicted to form Primer related SNPs: No SNPs annotated in region EcYcc_probe: TCTCGCCATTACCTCAACGGCAAA Tm 68⁰C Probe related SNPs: No SNPs annotated in region GADPH ATGACAACGAATTTGGCTACAGCAACAGGGTGGTGGACCTCATGGCCCACATGGCCTCCAAGGAGTAAGACCCCTGGACCACCAGCCCCAGCAAGAGCACA AGAGGAAGAGAGAGACCCTCACTGCTGGGGAGTCCCTGCCACACTCAGTCCCCCACCACACTGAATCTCCCCTCCTCACAGTTGCCATGTAGACCCCTTGA AGAGGGGAGGGGCCTAGGGAGCCGCACCTTGTCATGTACCATCAATAAAGTACCCTGTGCTCAACCAGTTA Amplicon Size: 87 bp GADPH_For: AGGGTGGTGGACCTCAT GADPH_Rev: CTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTG Primer Tm: 62⁰C Secondary structure: Okay Primer related SNPs: No SNPs in region with frequency >0.1% GADPH_probe: /5Cy5/CCCACATGG/TAO/CCTCCAAGGAGTAAG/3IABkRQSp/Tm 68⁰C Probe related SNPs: No SNPs in region with frequency >0.1% PHỤ LỤC 6.1 SO SÁNH KẾT QUẢ PHÁT HIỆN KHUẨN GÂY NKBV BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX REALTIME PCR VỚI PHƢƠNG PHÁP CẤY MÁU TRÊN MẪU BỆNH PHẨM DO BỆNH VIỆN THANH NHÀN CUNG CẤP ĐỢT Kết multiplex STT Mã bệnh nhân BN1 Âm tính Âm tính BN2 Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii BN3 Âm tính Cầu khuẩn Gr dƣơng BN4 Klebsiella pneumonia Klebsiella pneumonia BN5 Âm tính Âm tính BN6 Âm tính Âm tính BN7 Âm tính Trực khuẩn Gr dƣơng BN8 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus BN9 Âm tính Cầu khuẩn Gr dƣơng 10 BN10 Escherichia coli Escherichia coli 11 BN11 Âm tính Âm tính 12 BN12 Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa 13 BN13 Âm tính Trực khuẩn Gr âm 14 BN14 Âm tính Trực khuẩn Gr âm 15 BN15 Âm tính Nấm Candida knisie 16 BN16 Âm tính Cầu khuẩn Gr dƣơng 17 BN17 Âm tính Cầu khuẩn Gr dƣơng 18 BN18 Âm tính Âm tính realtime PCR Kết cấy máu Kết multiplex STT Mã bệnh nhân 19 BN19 Âm tính Cầu khuẩn Gr dƣơng 20 BN20 Âm tính Cầu khuẩn Gr dƣơng 21 BN21 Âm tính Citrobacter sp 22 BN22 Âm tính Âm tính 23 BN23 Âm tính Trực khuẩn Gr âm 24 BN24 Âm tính Cầu khuẩn Gr dƣơng 25 BN25 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 26 BN26 Âm tính Cầu khuẩn Gr dƣơng 27 BN27 Âm tính Streptococus pneumonie 28 BN28 Âm tính Cầu khuẩn Gr dƣơng 29 BN29 Âm tính Nấm Candida knisie 30 BN30 Âm tính Nấm Candida knisie 31 BN31 Escherichia coli Escherichia coli 32 BN32 Âm tính Cầu khuẩn Gr dƣơng 33 BN33 Âm tính Trực khuẩn Gr âm 34 BN34 Âm tính Cầu khuẩn Gr dƣơng 35 BN35 Âm tính Âm tính 36 BN36 Âm tính Trực khuẩn Gr âm 37 BN37 Âm tính Âm tính 38 BN38 Âm tính Streptococcus pneumonie 39 BN39 Âm tính Nấm Candida knisie 40 BN40 Âm tính Pseudomonas sp realtime PCR Kết cấy máu Kết multiplex STT Mã bệnh nhân 41 BN41 Âm tính Cầu khuẩn Gr dƣơng 42 BN42 Âm tính Trực khuẩn Gr âm 43 BN43 Âm tính Trực khuẩn Gr dƣơng 44 BN44 Âm tính Âm tính 45 BN45 Âm tính Citrobacter sp 46 BN46 Escherichia coli Escherichia coli 47 BN47 Escherichia coli Escherichia coli 48 BN48 Âm tính Cầu khuẩn Gr dƣơng 49 BN49 Escherichia coli Escherichia coli 50 BN50 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 51 BN51 Klebsiella pneumonia Klebsiella pneumonia 52 BN52 Escherichia coli Escherichia coli 53 BN53 Âm tính Tụ cầu da 54 BN54 Escherichia coli Escherichia coli 55 BN55 Âm tính Tụ cầu da 56 BN56 Âm tính Âm tính 57 BN57 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 58 BN58 Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa 59 BN59 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 60 BN60 Âm tính Tụ cầu da 61 BN61 Âm tính Trực khuẩn Gram âm 62 BN62 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus realtime PCR Kết cấy máu Kết multiplex STT Mã bệnh nhân 63 BN63 Âm tính Tụ cầu da 64 BN64 Escherichia coli Escherichia coli 65 BN65 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 66 BN66 Âm tính Tụ cầu da 67 BN67 Âm tính Âm tính 68 BN68 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus realtime PCR Kết cấy máu PHỤ LỤC 6.2 SO SÁNH KẾT QUẢ PHÁT HIỆN KHUẨN GÂY NKBV BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX REALTIME PCR VỚI PHƢƠNG PHÁP CẤY MÁU TRÊN MẪU BỆNH PHẨM DO BỆNH VIỆN THANH NHÀN CUNG CẤP ĐỢT Kết multiplex STT Mã NC Loại bệnh phẩm D1 Dịch phế quản Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae D2 Dịch phế quản Escherichia coli Escherichia coli D3 Dịch phế quản Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus D4 Dịch phế quản Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae D5 Dịch phế quản Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa D6 Dịch phế quản Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii D7 Dịch phế quản Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii D8 Dịch phế quản Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii D9 Dịch phế quản Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 10 D10 Dịch phế quản Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii 11 D11 Dịch phế quản Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa 12 D12 Dịch phế quản Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 13 D13 Dịch phế quản Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 14 D14 Dịch phế quản Âm tính Acinetobacter baumannii 15 D15 Dịch phế quản Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii 16 D16 Dịch phế quản Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii 17 D17 Dịch phế quản Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii 18 D18 Dịch phế quản Escherichia coli Escherichia coli 19 D19 Dịch phế quản Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii realtime PCR Kết nuôi cấy Kết multiplex STT Mã NC Loại bệnh phẩm 20 D20 Dịch phế quản Escherichia coli Escherichia coli 21 D21 Dịch phế quản Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii 22 D22 Dịch phế quản Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii 23 D23 Dịch phế quản Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii 24 D24 Dịch phế quản Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii 25 D25 Dịch phế quản Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 26 D26 Dịch phế quản Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 27 D27 Dịch phế quản Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 28 D28 Dịch phế quản Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii 29 D29 catheter Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa 30 D30 catheter Escherichia coli Escherichia coli 31 D31 catheter Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii 32 D32 catheter Klebsiella pneumonia Klebsiella pneumonia 33 D33 catheter Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus 34 M1 máu Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii 35 M2 máu Escherichia coli Escherichia coli 36 M3 máu Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii 37 M4 máu Âm tính Klebsiella pneumonia 38 M5 máu Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae 39 NT1 NT Escherichia coli Escherichia coli 40 NT2 NT Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa 41 NT3 NT Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae 42 NT4 NT Escherichia coli Escherichia coli realtime PCR Kết nuôi cấy Kết multiplex STT Mã NC Loại bệnh phẩm 43 NT5 NT Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa 44 NT6 NT Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae 45 Đờm Đờm Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae 46 Đờm Đờm Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii 47 Đờm Đờm Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii 48 Đờm Đờm Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa 49 Đờm Đờm 50 Đờm Đờm Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae 51 Đờm 12 Đờm Escherichia coli Escherichia coli realtime PCR Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii Kết nuôi cấy Staphylococcus aureus PHỤ LỤC 6.3 SO SÁNH KẾT QUẢ PHÁT HIỆN KHUẨN GÂY NKBV BẰNG PHƢƠNG PHÁP MULTIPLEX REALTIME PCR VỚI PHƢƠNG PHÁP CẤY MÁU TRÊN MẪU BỆNH PHẨM DO BỆNH VIỆN ĐỨC GIANG CUNG CẤP STT Mã NC Mẫu Kết multiplex realtime PCR Kết nuôi cấy DG1 Đờm Âm tính Âm tính DG2 Đờm DG3 Đờm DG4 Đờm DG5 Đờm DG6 Đờm Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii Klebsiella pneumoniae Âm tính Acinetobacter baumannii Acinetobacter baumannii Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii Klebsiella pneumoniae Âm tính DG7 Đờm Âm tính Âm tính DG8 Đờm Âm tính Âm tính DG9 Đờm Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae 10 DG10 Đờm 10 Âm tính Âm tính 11 DG11 Đờm 11 Âm tính Âm tính 12 DG12 Đờm 12 Escherichia coli Âm tính 13 DG13 Nƣớc tiểu Escherichia coli Klebsiella oxytoca 14 DG14 Nƣớc tiểu 15 DG15 Nƣớc tiểu 16 DG16 Nƣớc tiểu Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa Âm tính Escherichia coli Escherichia coli Âm tính 17 DG17 Nƣớc tiểu Âm tính Âm tính 18 DG18 Nƣớc tiểu Âm tính Âm tính 19 DG19 Nƣớc tiểu Âm tính Âm tính 20 DG20 Nƣớc tiểu Âm tính Âm tính 21 DG21 Nƣớc tiểu Âm tính Âm tính 22 DG22 Máu Escherichia coli 23 DG23 Máu Acinetobacter baumannii 24 DG24 Máu Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Acinetobacter baumannii Klebsiella pneumoniae