GIÁO D C VÀ ÀO T O Y T TR NG I H C Y D C C N TH QU NG TH AN DUNG KH O SÁT, PHÂN BI T C M HÌNH THÁI, VI H C VÀ HÓA H C C A NHÓM D C LI U CÓ TÊN Ý D VÀ M T S LOÀI THU C CHI STEPHANIA LU N V N T T NGHI P[.]
GIÁO D C VÀ ÀO T O TR NG IH CYD YT C C N TH QU NG TH AN DUNG KH O SÁT, PHÂN BI T C VÀ HÓA H C C A NHÓM D VÀ M T S M HÌNH THÁI, VI H C C LI U CĨ TÊN Ý D LOÀI THU C CHI STEPHANIA LU N V N T T NGHI P D n Th - 2015 CS IH C BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ QUẢNG THỊ AN DUNG KHẢO SÁT, PHÂN BIỆT ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, VI HỌC VÀ HĨA HỌC CỦA NHĨM DƯỢC LIỆU CĨ TÊN Ý DĨ VÀ MỘT SỐ LỒI THUỘC CHI STEPHANIA LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC ThS NGUYỄN THỊ TRANG ĐÀI Cần Thơ - 2015 LỜI CẢM ƠN Con xin bày tỏ lịng biết ơn đến Cha Mẹ ln yêu thương động viên vượt qua khó khăn suốt thời gian làm đề tài Em xin gửi lời tri ân sâu sắc đến cô ThS Nguyễn Thị Trang Đài ln tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức quý báu, giúp đỡ em vượt qua khó khăn suốt q trình làm đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến cô ThS Nguyễn Ngọc Quỳnh, ThS Thạch Trần Minh Uyên, thầy ThS Lê Thanh Vĩnh Tuyên thầy DS Trần Bá Việt Quý động viên tinh thần, tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành đề tài Em xin gửi lời cảm ơn thầy TS Huỳnh Kỳ tận tình hướng dẫn, dạy nhiều kiến thức để em hồn thành đề tài Em khơng qn gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Vũ Phương Lan cô Ngô Thị Kim Hương tạo điều kiện thuận lợi thời gian em thực đề tài Con xin gửi lời cảm ơn đến họ hàng nội ngoại Trần Văn Đa tận tình giúp đỡ, động viên suốt trình thực đề tài Mình xin gửi lời cảm ơn đến bạn lớp Dược K36 quan tâm, chia sẻ giúp đỡ để hồn thành đề tài LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các kết luận văn trung thực, chưa cơng bố cơng trình khác Cần Thơ, ngày tháng năm 2015 Quảng Thị An Dung i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ SƠ ĐỒ viii ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ NHÓM DƯỢC LIỆU CÓ TÊN Ý DĨ 1.1.1 Thực vật học 1.1.1.1 Vị trí, đặc điểm thực vật, phân bố, sinh thái chi Coix 1.1.1.2 Đặc điểm thực vật, phân bố, sinh thái, thu hái Ý dĩ 1.1.1.3 Đặc điểm thực vật, phân bố, sinh thái Cao lương 1.1.1.4 Đặc điểm thực vật, phân bố, sinh thái Nga 1.1.2 Thành phần hóa học Ý dĩ 1.1.3 Tác dụng dược lý, công dụng Ý dĩ 1.1.3.1 Tác dụng dược lý 1.1.3.2 Công dụng 1.1.4 Một số phương pháp định tính, định lượng 1.1.4.1 Định tính 1.1.4.2 Định lượng 1.2 TỔNG QUAN VỀ CHI STEPHANIA 10 1.2.1 Thực vật học 10 1.2.1.1 Vị trí chi Stephania hệ thống thực vật 10 ii 1.2.1.2 Đặc điểm thực vật chi Stephania 10 1.2.1.3 Bộ phận dùng, thu hái, chế biến 13 1.2.2 Thành phần hóa học chi Stephania 13 1.2.2.1 Alkaloid 13 1.2.2.2 Flavonoid 15 1.2.3 Tác dụng dược lý, công dụng chi Stephania 15 1.2.3.1 Tác dụng dược lý 15 1.2.3.2 Công dụng 18 1.2.4 Một số phương pháp định tính, định lượng 18 1.2.4.1 Định tính 18 1.2.4.2 Định lượng 18 1.3 TỔNG QUAN PHÂN LOẠI THỰC VẬT DỰA VÀO TRÌNH TỰ VÙNG GEN ITS VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ ISSR 19 1.3.1 Vùng gen ITS 19 1.3.2 Chỉ thị phân tử ISSR 19 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 20 2.1.1 Nguyên liệu 20 2.1.1.1 Nhóm dược liệu có tên Ý dĩ 20 2.1.1.2 Các loài thuộc chi Stephania 20 2.1.2 Dụng cụ - Thiết bị 20 2.1.3 Dung mơi hóa chất 21 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.2.1 Phương pháp nghiên cứu nhóm Dược liệu có tên Ý dĩ 21 iii 2.2.1.1 Khảo sát thực vật 21 2.2.1.2 Phân tích trình tự vùng gen ITS thị phân tử ISSR 21 2.2.1.3 Khảo sát hóa học 24 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu số loài thuộc chi Stephania 24 2.2.2.1 Khảo sát thực vật 24 2.2.2.2 Khảo sát hóa học 24 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU NHÓM DƯỢC LIỆU CÓ TÊN Ý DĨ 29 3.1.1 Khảo sát thực vật 29 3.1.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật 29 3.1.1.2 Đặc điểm vi học 34 3.1.1.3 Xác định khối lượng làm khô 37 3.1.2 Phân tích trình tự vùng gen ITS thị phân tử ISSR 37 3.1.2.1 Phân tích trình tự vùng gen ITS 37 3.1.2.2 Phân tích thị phân tử ISSR 38 3.1.3 Khảo sát hóa học 39 3.1.3.1 Phân tích sơ thành phần hóa học 39 3.1.3.2 Định tính SKLM 39 3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI STEPHANIA 40 3.2.1 Khảo sát thực vật 40 3.2.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật 40 3.2.1.2 Đặc điểm vi học 48 3.2.1.3 Xác định khối lượng làm khô 50 3.2.2 Khảo sát hóa học 50 iv 3.2.2.1 Phân tích sơ thành phần hóa học 50 3.2.2.2 Định tính sơ thành phần alkaloid SKLM 51 3.2.2.3 Khảo sát phương pháp chiết xuất hoạt chất chính: alkaloid 51 3.2.2.4 Định tính thành phần alkaloid UV – Vis 52 3.2.2.5 Bán định lượng thành phần alkaloid mẫu Bình vơi khảo sát SKLM 53 3.2.2.6 Định lượng alkaloid tồn phần mẫu Bình vơi khảo sát 54 Chương BÀN LUẬN 55 4.1 BÀN LUẬN VỀ NHÓM DƯỢC LIỆU CÓ TÊN Ý DĨ 55 4.1.1 Khảo sát thực vật 55 4.1.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật 55 4.1.1.2 Đặc điểm vi học 56 4.1.2 Phân tích trình tự vùng gen ITS thị phân tử ISSR 57 4.1.3 Khảo sát hóa học 58 4.1.3.1 Phân tích sơ thành phần hóa học 58 4.1.3.2 Định tính SKLM 58 4.2 BÀN LUẬN VỀ MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI STEPHANIA 59 4.2.1 Khảo sát thực vật 59 4.2.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật 59 4.2.1.2 Đặc điểm vi học 59 4.2.2 Khảo sát hóa học 61 4.2.2.1 Phân tích sơ thành phần hóa học 61 4.2.2.2 Định tính sơ thành phần alkaloid SKLM 61 4.2.2.3 Khảo sát phương pháp chiết xuất hoạt chất chính: alkaloid 61 v 4.2.2.4 Định tính thành phần alkaloid UV – Vis 62 4.2.2.5 Bán định lượng thành phần alkaloid mẫu Bình vơi khảo sát SKLM 62 4.2.2.6 Định lượng alkaloid toàn phần phương pháp cân 63 KẾT LUẬN 64 KIẾN NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ gốc Ý nghĩa HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao High Performance Liquid Chromatography NH4OH Amoniac Amoniac CHCl3 Chloroform Chloroform CH2Cl2 Dichloromethan Dichlorometan ACN Acetonitril Acetonitril H2SO4 Acid sulfuric Acid sulfuric SKLM Sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng PDA Photo Diod Array Detector Đầu dò dãy diod quang UV-Vis Ultraviolet and Visible Tử ngoại khả kiến ITS Internal Transcribed Spacer Vùng chép nội NCBI National Center for Trung tâm Thông tin Công nghệ Biotechnology Information Sinh học Quốc gia Basic Local Alignment Search Công Tool PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp ISSR Inter-Simple Sequence Repeats Dấu phân tử lặp lại trình tự liên hồn CTAB Hexadecyltrimethylammonium- Hexadecyltrimethylammonium- bromide bromide DNA Deoxyribo Nucleic Acid Deoxyribo Nucleic Acid ME Mercaptro Ethanol Mercaptro Ethanol RNase Ribonuclease Ribonuclease EDTA Ethylen diaminetetra acetic acid Ethylen diaminetetra acetic acid TE Tris EDTA Tris EDTA TAE Tris Glacial Acetic Acid EDTA Tris Glacial Acetic Acid EDTA BLAST cụ tìm kiếm trình tự PL-2 Gỗ Libe Biểu bì Mơ cứng Tế bào bọt Mơ mềm đạo Vi phẫu Cao lương Gỗ Libe Mô cứng Lông che chở Biểu bì Mơ cứng Tế bào bọt Mơ mềm đạo Vi phẫu Nga PL-3 Biểu bì Mơ cứng Libe Gỗ Mô mềm đạo Vi phẫu thân Y1 Biểu bì Mơ cứng Libe Gỗ Mơ mềm đạo Vi phẫu thân Y2 PL-4 Mơ mềm đạo Biểu bì Mơ cứng Libe Gỗ Vi phẫu thân Biểu bì Mơ mềm khuyết Libe Gỗ Vi phẫu thân Nga PL-5 Suberoid Mô mềm vỏ Nội bì Trụ bì Lơng hút Mơ mềm tủy Gỗ Libe Vi phẫu rễ Y1 Suberoid Mô mềm vỏ Nội bì Trụ bì Mơ mềm tủy Gỗ Libe Vi phẫu rễ Y2 Lông hút PL-6 Suberoid Mô mềm vỏ Nội bì Mơ mềm tủy Lơng hút Gỗ Libe Vi phẫu rễ Cao lương Suberoid Mơ mềm vỏ Nội bì Mô mềm tủy Gỗ Lông hút Libe Vi phẫu rễ Nga PL 01 Hình ảnh vi phẫu lá, thân, rễ Y1, Y2, Cao lương, Nga PL-7 PL-8 PL 02 Kết giải trình tự vùng gen ITS Y1 PL-9 Nhóm hợp chất Cách thực hiện/ Thuốc thử Chất béo Nhỏ vài giọt lên giấy Bốc đến cắn H2SO4 Tinh dầu Carotenoid Triterpen tự Liebermann Burchard Alkaloid Anthraglycosid Thuốc thử chung alkaloid So đục hai dung dịch có HCl NaOH KOH 10% Flavonoid Mg/HCl đđ Coumarin Thuốc thử vòng lacton Thuốc thử đường 2- deoxy Anthocyanosid HCl KOH Proanthocyanidin HCl/t° Tanin FeCl3 Glycosid tim Triterpen thủy phân Saponin Acid hữu Chất khử Hợp chất polyuronic Gelatin muối LiebermannBurchard Lắc mạnh với nước Na2CO3 Fehling Pha loãng với cồn 900 Phản ứng dương Kết Kết tính định tính định tính Ý dĩ Cao lương Vết mờ ++ ++ Có mùi thơm Xanh dương hay xanh lục chuyển sang xanh dương Đỏ nâu – tím, lớp có màu xanh lục Kết tủa - - ++ ++ - - Dung dịch có NaOH - - Dd kiềm hồng tới đỏ Dd có màu hồng tới đỏ Tím - - - - - - Đỏ mận - - Đỏ Xanh Đỏ Xanh rêu/xanh đen Tủa bơng trắng Đỏ nâu- tím, lớp xanh lục Có bọt bền - - + + - - + + + + Sủi bọt Tủa đỏ gạch Tủa bơng trắngvàng nâu (-): Khơng có (+): Có (++): Có (+++): Có nhiều (++++): Có nhiều PL 03 Kết phân tích sơ thành phần hóa học Ý dĩ Cao lương PL-10 Biểu bì Mơ dày trịn Mơ mềm đạo Gỗ Mơ mềm giậu Libe Lơng tiết Mơ dày góc Mơ mềm khuyết Biểu bì Vi phẫu S dielsiana Biểu bì Mơ dày trịn Mơ mềm đạo Mơ mềm giậu Gỗ Mơ dày góc Biểu bì Libe Lông tiết Vi phẫu S dielsiana Mô mềm khuyết PL-11 Biểu bì Mơ mềm đạo Mơ mềm giậu Gỗ Libe Mơ mềm khuyết Biểu bì Vi phẫu S rotunda Biểu bì Mơ dày góc Mơ mềm đạo Gỗ Libe Mơ mềm giậu Biểu bì Lông tiết Vi phẫu S rotunda Mô mềm khuyết PL-12 Biểu bì Mơ dày phiến Vịng mơ cứng Mơ mềm đạo Libe Gỗ Vi phẫu cuống S dielsiana Biểu bì Mơ dày phiến Libe Gỗ Mơ mềm đạo Vịng mơ cứng Vi phẫu cuống S rotunda Biểu bì Mơ dày phiến Vịng mơ cứng Mơ mềm đạo Gỗ Libe Vi phẫu cuống S yunnanensis PL-13 Biểu bì Mơ dày phiến Gỗ Mơ mềm đạo Libe Vịng mơ cứng Vi phẫu thân S dielsiana Biểu bì Mơ dày phiến Mơ mềm đạo Gỗ Libe Vịng mơ cứng Vi phẫu thân S rotunda Biểu bì Mơ dày phiến Mơ mềm đạo Vịng mơ cứng Vi phẫu thân S venosa Gỗ Libe PL-14 Biểu bì Mơ dày phiến Vịng mô cứng Gỗ Mô mềm đạo Libe Vi phẫu thân S venosa Biểu bì Mơ dày phiến Mơ mềm đạo Gỗ Libe Vịng mơ cứng Vi phẫu thân S venosa Lông hút Lớp bần Gỗ Mô mềm đạo Mô cứng Libe Vi phẫu rễ S dielsiana PL-15 Lớp bần Gỗ Mô mềm đạo Libe Mô cứng Vi phẫu rễ S rotunda Lớp bần Gỗ Mô mềm đạo Libe Vi phẫu rễ S venosa Lông hút Lớp bần Gỗ Libe Mô mềm đạo Vi phẫu rễ S4 Lớp bần Mô mềm đạo Mô cứng Vi phẫu rễ S yunnanensis PL 04 Hình ảnh vi phẫu lá, cuống lá, thân, rễ loài S dielsiana, S rotunda, S venosa, S4, S yunnanensis Libe Gỗ PL-16 Nhóm hợp chất Chất béo Tinh dầu Carotenoid Triterpen tự Alkaloid Coumarin Anthraglycosid Flavonoid Glycosid tim Anthocyanosid Proanthocyanidin Tanin Cách thực hiện/ Thuốc thử Nhỏ vài giọt lên giấy Bốc đến cắn H2SO4 Phản ứng dương tính Vết mờ Có mùi thơm Xanh dương hay xanh lục chuyển sang xanh dương Liebermann - Burchard Đỏ nâu – tím, lớp có màu xanh lục Thuốc thử chung Kết tủa alkaloid So đục hai Dung dịch có NaOH dung dịch có HCl NaOH KOH 10% Dd kiềm hồng tới đỏ Mg/HCl đđ Dd có màu hồng tới đỏ Thuốc thử vịng lacton Tím Thuốc thử đường 2Đỏ mận deoxy HCl Đỏ KOH Xanh ° HCl/t Đỏ FeCl3 Xanh rêu/xanh đen Gelatin muối Tủa trắng Liebermann- Burchard Đỏ nâu- tím, lớp xanh lục Lắc mạnh với nước Có bọt bền Na2CO3 Sủi bọt Fehling Tủa đỏ gạch Pha lỗng với cồn 90 Tủa bơng trắng- vàng nâu Triterpen thủy phân Saponin Acid hữu Chất khử Hợp chất polyuronic (-): Khơng có (+): Có (++): Có (+++): Có nhiều Kết định tính + +++ ++++ + + ++ + ++ ++ ++ ++ ++ (++++): Có nhiều PL 05 Kết phân tích sơ thành phần hóa học mẫu Bình vơi