2494 khảo sát và phân biệt đặc điểm hình thái vi học và hóa học của nhóm dược liệu có tên hà thủ ô và một số loài thuộc chi curcuma

LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin chân thành cảm ơn cha, mẹ sinh thành, nuôi khôn lớn, ln quan tâm, chăm sóc, động viên khích lệ, tạo điều kiện tốt để có ngày hôm Trong suốt thời gian thực đề tài Bộ môn Dược liệu, nhờ quan tâm, giúp đỡ nhà trường, ban chủ nhiệm khoa thầy cô môn Dược liệu mà em có hội học tập trao dồi thêm nhiều kỹ vô quý giá Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Nguyễn Thị Trang Đài trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm để em hồn thành tốt luận văn Em xin cảm ơn tất thầy cô, anh chị môn Dược liệu: cô Nguyễn Ngọc Quỳnh, cô Thạch Trần Minh Uyên, thầy Lê Thanh Vĩnh Tuyên, anh Trần Bá Việt Q, chị Ngơ Thị Kim Hương, chị Nguyễn Vũ Phương Lan nhiệt tình hướng dẫn, tạo điều kiện cho em q trình hồn thành luận văn Ngoài ra, em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Hồng Ảnh, thầy Lê Minh Đạt (Bệnh viện Y học cổ truyền TP Cần Thơ), thầy Huỳnh Kỳ (Đại học Cần Thơ) dành thời gian hỗ trợ cho em, dạy em nhiều kiến thức bổ ích, sẵn sàng giải đáp thắc mắc có liên quan đến luận văn trình nghiên cứu Xin cảm ơn bạn nhóm làm đề tài, bạn lớp Dược B K36 em Dược K37 nhiệt tình giúp đỡ, động viên để tơi thực tốt đề tài Nguyễn Thị Ánh Ngoan LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan tất kết luận văn trung thực, hoàn toàn riêng chưa công bố cơng trình Cần Thơ, ngày 15 tháng 06 năm 2015 Sinh viên ký tên NGUYỄN THỊ ÁNH NGOAN i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH VẼ viii ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 HÀ THỦ Ô ĐỎ 1.1.1 Tên gọi 1.1.2 Vị trí phân loại thực vật 1.1.3 Phân bố sinh thái 1.1.4 Mô tả thực vật 1.1.5 Bộ phận dùng thu hái, chế biến 1.1.6 Thành phần hóa học 1.1.7 Tính vị cơng 1.1.8 Công dụng 1.2 HÀ THỦ Ô TRẮNG 1.2.1 Tên gọi 1.2.2 Vị trí phân loại thực vật 1.2.3 Phân bố sinh thái 1.2.4 Mô tả thực vật 1.2.5 Bộ phận dùng, thu hái chế biến 1.2.6 Thành phần hóa học 1.2.7 Tính vị cơng 1.2.8 Công dụng 1.2.9 Một số thuốc có sử dụng Hà thủ trắng 1.3 SƠ LƢỢC VỀ CHI CURCUMA 1.3.1 Giới thiệu chi Curcuma 1.3.2 Một số lồi Nghệ thuộc chi Curcuma có mặt Việt Nam 1.4 NGHỆ VÀNG 1.4.1 Tên gọi 1.4.2 Vị trí phân loại thực vật 10 ii 1.4.3 Phân bố sinh thái 10 1.4.4 Mô tả thực vật 10 1.4.5 Bộ phận dùng, thu hái chế biến 11 1.4.6 Thành phần hóa học 11 1.4.7 Tính vị cơng 12 1.4.8 Công dụng 12 1.4.9 Một số thuốc có sử dụng Nghệ vàng 13 1.5 NGHỆ XÀ CỪ 13 1.5.1 Tên gọi 13 1.5.2 Vị trí phân loại thực vật 13 1.5.3 Phân bố sinh thái 13 1.5.4 Mô tả thực vật 13 1.5.5 Bộ phận dùng 13 1.5.6 Thành phần hóa học 14 1.5.7 Tính vị cơng 14 1.5.8 Tác dụng dược lý 14 1.5.9 Một số thuốc có sử dụng Nghệ xà cừ 14 1.6 NGHỆ ĐEN 14 1.6.1 Tên gọi 14 1.6.2 Vị trí phân loại thực vật 14 1.6.3 Phân bố 15 1.6.4 Mô tả thực vật 15 1.6.5 Bộ phận dùng, thu hái chế biến 15 1.6.6 Thành phần hóa học 15 1.6.7 Tính vị cơng 16 1.6.8 Công dụng 16 1.6.9 Một số thuốc có sử dụng Nghệ đen 16 1.7 NGHỆ TRẮNG 16 1.7.1 Tên gọi 16 1.7.2 Vị trí phân loại thực vật 16 1.7.3 Phân bố sinh thái 17 1.7.4 Mô tả thực vật 17 1.7.5 Bộ phận dùng, thu hái chế biến 17 iii 1.7.6 Thành phần hóa học 17 1.7.7 Công dụng 18 1.7.8 Một số thuốc có sử dụng Nghệ trắng 18 1.8 PHƢƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA IN VITRO 18 1.8.1 Đại cương gốc tự 18 1.8.2 Các phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa in vitro 19 1.9 MARKER PHÂN TỬ VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN HỌ GỪNG 20 1.9.1 Marker phân tử ứng dụng nghiên cứu gen thực vật 20 1.9.2 Các nghiên cứu đa dạng di truyền họ Gừng giới 21 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 NGUYÊN LIỆU 22 2.1.1 Thu thập nguyên liệu 22 2.1.2 Xử lý nguyên liệu 22 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA DIỂM NGHIÊN CỨU 22 2.2.1 Hóa chất 22 2.2.2 Thiết bị 23 2.2.3 Địa điểm nghiên cứu 23 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật 23 2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa thực vật 26 2.3.3 Định tính phân biệt sắc ký lớp mỏng 27 2.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa DPPH 28 2.3.5 Phương pháp giải trình tự DNA để định danh dược liệu 30 2.3.6 Khảo sát thành phần hóa học tinh dầu phương pháp GC/MS 32 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34 3.1 MỘT SỐ DƢỢC LIỆU CĨ TÊN HÀ THỦ Ơ 34 3.1.1 Định danh 34 3.1.2 Hà thủ ô đỏ 34 3.1.3 Hà thủ ô trắng 37 3.2 MỘT SỐ DƢỢC LIỆU THUỘC CHI CURCUMA 39 3.2.1 Định danh 39 iv 3.2.2 Kết giải trình tự DNA định danh lồi Nghệ xanh Nghệ trắng 40 3.2.3 Nghiên cứu thực vật 42 3.2.4 Khảo sát phân biệt thành phần hóa học 45 3.2.5 So sánh hoạt tính chống oxy hóa tinh dầu lồi thuộc chi Curcuma 49 3.2.6 Định tính sắc ký lớp mỏng 49 Chƣơng BÀN LUẬN 51 4.1 PHÂN BIỆT MỘT SỐ DƢỢC LIỆU CÓ TÊN HÀ THỦ Ô 51 4.1.1 Phân biệt hai lồi có tên gọi Hà thủ 51 4.1.2 Phân biệt Hà thủ với Hà thủ tái chế có thị trường 54 4.2 MỘT SỐ DƢỢC LIỆU THUỘC CHI CURCUMA 55 4.2.1 Định danh 55 4.2.2 So sánh đặc điểm hình thái 56 4.2.3 Về đặc điểm vi phẫu đặc điểm vi học 57 4.2.4 So sánh thành phần hóa học 57 4.2.5 So sánh tác dụng kháng oxy hóa 59 KẾT LUẬN 64 KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt AFLP CTAB Chữ nguyên Ý nghĩa Amplified fragment length Đa hình đoạn cắt polymorphism khuếch đại Cetyltrimethylamonium bromide Dấu vân tay khuếch đại DAF DNA amplified fingerprint DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleotide triphosphate DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EtOH Ethanol GC Gas chromatography Sắc ký khí HPLC High perfomance liquid Sắc ký lỏng hiệu cao chromatography IC50 Inhibitory concentration Nồng độ ức chế 50% gốc tự ITS Internal transcribed spacer MeOH Methanol MS Mass spectrometry NCBI National Center for Vùng phiên mã bên Khối phổ Biotechnology Information PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp RAPD Random amplified Đa hình DNA nhân polymorphism DNA ngẫu nhiên vi Chữ viết tắt RFLP Chữ nguyên Ý nghĩa Restriction fragment length Đa hình chiều dài đoạn cắt polymorphism giới hạn SKLM Sắc ký lớp mỏng SSR Simple sequences repeat TAE Trisacetat EDTA UV Ultra violet Tử ngoại VNTR Variable number tandem repeat Đa hình số lượng Đoạn trình tự lặp lại đoạn lặp v/v Volume/volume Thể tích/ thể tích w/v Weigh/volume Khối lượng/ thể tích vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 - Trình tự cặp mồi ITS sử dụng phản ứng PCR 31 Bảng 2.2 - Thành phần thể tích hóa chất tiến hành cho phản ứng PCR 31 Bảng 3.1 - Kết soi bột Hà thủ ô đỏ 36 Bảng 3.2 - Kết soi bột Hà thủ ô trắng 38 Bảng 3.3 - Mô tả đặc điểm thực vật loài Nghệ 42 Bảng 3.4 - Đặc điểm vi phẫu loài Nghệ 43 Bảng 3.5 - Đặc điểm chung bột dược liệu loài Nghệ 44 Bảng 3.6 - Tính chất tinh dầu loài Nghệ 45 Bảng 3.7 - Thành phần hóa học tinh dầu loài Nghệ 45 Bảng 3.8 - Kết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa tinh dầu lồi Nghệ 49 Bảng PL1.1 - Kết định tính sơ Hà thủ ô đỏ PL-12 Bảng PL2.1 - Kết định tính sơ Hà thủ ô trắng PL-23 Bảng PL3.1 - Kết định tính sơ thân rễ Nghệ vàng Nghệ xà cừ PL-35 Bảng PL3.2 - Kết định tính sơ thân rễ Nghệ xanh, trắng, đen PL-36 Bảng PL7.1 - Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa tinh dầu Nghệ vàng PL-48 Bảng PL7.2 - Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa tinh dầu Nghệ xà cừ PL-49 Bảng PL7.3 - Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa tinh dầu Nghệ đen PL-49 Bảng PL7.4 - Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa tinh dầu Nghệ xanh PL-50 Bảng PL7.5 - Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa tinh dầu Nghệ trắng PL-50 Bảng PL7.6 - Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy vitamin C PL-51 viii DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 3.1 - SKLM dịch chiết methanol Hà thủ ô đỏ mẫu thị trường 36 Hình 3.2 - SKLM dịch chiết MeOH Hà thủ ô trắng mẫu thị trường 39 Hình 3.3 - Phổ điện di DNA sản phẩm PCR gel agarose 1% 40 Hình 3.4 - Phổ điện di sản phẩm PCR gel agarose 1,5% 40 Hình 3.5 - Kết so sánh trình tự gen Nghệ trắng 41 Hình 3.7 - SKLM dịch chiết Cồn 96% thân rễ lồi Nghệ chuẩn Curcumin 50 Hình 4.1 - Giá trị IC50 tinh dầu loài Nghệ 59 Hình 4.2 - Biểu đồ thể khả kháng oxy hóa Nghệ vàng 60 Hình 4.3 - Biểu đồ thể khả kháng oxy hóa Nghệ xà cừ 60 Hình 4.4 - Biểu đồ thể khả kháng oxy hóa Nghệ đen 61 Hình 4.5 - Biểu đồ thể khả kháng oxy hóa Nghệ trắng 61 Hình 4.7 - Biểu đồ thể khả kháng oxy hóa Nghệ xanh 62 Hình 4.8 - Biểu đồ thể khả kháng oxy hóa Vitamin C 62 Hình PL 1.1 - Đặc điểm hình thái Hà thủ ô đỏ PL-1 Hình PL 1.2 - Mẫu Hà thủ đỏ tái chế thu mua thị trường PL-2 Hình PL 1.3 - Tổng quát vi phẫu rễ Hà thủ ô đỏ PL-3 Hình PL 1.4 - Cấu tạo vi phẫu rễ Hà thủ ô đỏ PL-4 Hình PL 1.5 - Cấu tạo vi phẫu thân non Hà thủ ô đỏ PL-5 Hình PL 1.6 - Cấu tạo vi phẫu rễ già Hà thủ ô đỏ PL-6 Hình PL 1.7 - Tổng quát cấu tạo Hà thủ ô đỏ PL-7 Hình PL 1.8 - Cấu tạo gân PL-7 Hình PL 1.9 - Cấu tạo phiến Hà thủ ô đỏ PL-8 PL - 37 PHỤ LỤC PHỔ SẮC KÝ KHÍ (GC) CỦA TINH DẦU LỒI NGHỆ Hình PL 4.1 - Phổ GC tinh dầu Nghệ vàng Hình PL 4.2 - Phổ GC tinh dầu Nghệ xà cừ PL - 38 Hình PL 4.3 - Phổ GC tinh dầu Nghệ đen Hình PL 4.4 - Phổ GC tinh dầu Nghệ trắng PL - 39 Hình PL 4.5 - Phổ GC tinh dầu Nghệ xanh PL - 40 PHỤ LỤC DỮ LIỆU CÔNG THỨC VÀ PHỔ MS CÁC THÀNH PHẦN TRONG TINH DẦU NGHỆ Công thức cấu tạo Hợp chất Phổ MS CH3 α-Bergamoten CH3 H3C H3C α-Bulnesen α-Cadinol OH α-Cedren CH3 CH3 CH3 α-Curcumen H3C CH3 CH3 CH3 α-Humulen H3C PL - 41 α-Patchoulen CH3 α-Terpineol H3C OH CH3 α-Zingiberen H -Bisabolen -Elemen CH3 CH3 -Sesquiphellandren H H2C OH β-Bisabolol β-Farnesen CH3 PL - 42 γ-Elemen δ-Cadinen 1-isobutyl-2,5dimethylbenzen 2,4a,5,8aTetramethyl1,2,3,4,4a,7,8,8aoctahydro-1naphthalenyl acetat O O 4-Ethynyl-4hydroxy-3,5,5trimethyl-2cyclohexen-1-on OH O 4-Pentyl-1-(4propylcyclohexyl)1-cyclohexen 6-Isopropenyl-4,8adimethyl1,2,3,5,6,7,8,8aoctahydronapthalen-2-ol Aristolen HO PL - 43 Ar-Turmeron O CH3 CH3 Caryophyllen H2C H H CH3 CH3 O Curdion O Curlon O CH2 O Curzeren Cyclohexene, 1pentyl-4-(4propylcyclohexyl) D-Camphor O H H H Eremanthin H O O PL - 44 Germacren Germacron O Isocaryophyllen CH3 H H3C H3C H H2C O H3C CH3 Isolongifolon H3C CH3 O m-Toluic acidtridec-2-ynyl ester O Selina-6-en-4-ol H HO OH Spathulenol Turmeron O CH3 PL - 45 CH3 CH3 HO CH3 Xanthorrhizol H3C PL - 46 PHỤ LỤC TRÌNH TỰ DNA CỦA NGHỆ XANH VÀ NGHỆ TRẮNG Hình PL 6.1 – Trình tự ADN Nghệ trắng PL - 47 Hình PL 6.2 – Trình tự ADN Nghệ xanh PL - 48 PHỤ LỤC KẾT QUẢ KHẢO SÁT TÁC DỤNG KHÁNG OXY HÓA TINH DẦU CÁC LOÀI NGHỆ Bảng PL 7.1 – Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa tinh dầu Nghệ vàng Mẫu Độ hấp thu Lần Độ hấp thu Lần Độ hấp thu Lần TB 0,0976 0,1017 0,1026 0,1006 Thể tích tinh dầu MeOH lấy (ml) 2,5 0,0929 0,0934 0,0941 0,0935 0,0876 0,0866 0,0858 0,0784 0,0797 0,0667 Lượng tinh dầu (µl) %Kháng oxy hóa 25 43,0162 3,0 30 47,0744 0,0867 3,5 35 50,9249 0,0788 0,0790 4,0 40 55,2850 0,0726 0,0745 0,0713 4,5 45 59,6451 0,0684 0,0704 0,0699 0,0696 5,0 50 60,6078 0,0648 0,0646 0,0646 0,0647 5,5 55 63,3824 0,0592 0,0636 0,0626 0,0618 6,0 60 65,0057 0,0602 0,0588 0,0575 0,0588 6,5 65 66,6855 10 0,0549 0,0544 0,0546 0,0546 7,0 70 69,0638 Độ hấp thu DPPH chuẩn 0,1776 Nồng độ tinh dầu/MEOH 10ppm PL - 49 Bảng PL 7.2 – Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa tinh dầu Nghệ xà cừ Mẫu Độ hấp thu Lần Độ hấp thu Lần Độ hấp thu Lần TB Thể tích tinh dầu MeOH lấy (ml) 0,1614 0,1711 0,168 0,1668 24,7821 0,127 0,1299 0,1254 0,1274 10 42,5458 0,0976 0,0943 0,0964 0,0961 15 56,6727 0,0725 0,072 0,0716 0,0720 20 67,5233 0,0568 0,0568 0,0538 0,0558 25 74,8422 0,0457 0,0451 0,0459 0,0456 30 79,4560 0,0372 0,0348 0,0378 0,0366 35 83,4986 Độ hấp thu DPPH chuẩn 0,2218 Nồng độ tinh dầu/MEOH 5ppm Lượng tinh dầu (µl) %Kháng oxy hóa Bảng PL 7.3 – Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa tinh dầu Nghệ đen Mẫu Độ hấp thu Lần Độ hấp thu Lần Độ hấp thu Lần TB Thể tích tinh dầu MeOH lấy (ml) 0,1471 0,1519 0,1491 0,1494 10 35,8391 0,1333 0,1377 0,1200 0,1303 20 44,0149 0,1061 0,1339 0,1132 0,1177 30 49,4273 0,0937 0,0906 0,1016 0,0953 40 59,0636 0,0859 0,0938 0,0719 0,0839 50 63,9748 0,0649 0,0631 0,0643 0,0641 60 72,4656 0,0504 0,049 Độ hấp thu DPPH chuẩn 0,0475 0,2328 0,0490 70 78,9662 Nồng độ tinh dầu/MEOH 10ppm Lượng tinh dầu (µl) %Kháng oxy hóa PL - 50 Bảng PL 7.4 – Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa tinh dầu Nghệ xanh Mẫu Độ hấp thu Lần Độ hấp thu Lần Độ hấp thu Lần TB Thể tích tinh dầu MeOH lấy (ml) 0,1106 0,1049 0,1071 0,1075 40 38,1281 0,1067 0,0837 0,0830 0,0952 80 45,2244 0,0696 0,0822 0,0756 0,0822 120 52,7043 0,0843 0,0792 0,0704 0,0780 160 55,1400 0,0751 0,0700 0,0752 0,0734 200 57,7484 0,0702 0,0656 0,0611 0,0634 240 63,5501 0,0542 0,0542 0,0542 0,0542 280 68,8147 Độ hấp thu DPPH chuẩn 0,1738 Nồng độ tinh dầu/MEOH 40ppm Lượng tinh dầu (µl) %Kháng oxy hóa Bảng PL 7.5 – Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa tinh dầu Nghệ trắng Mẫu Độ hấp thu Lần Độ hấp thu Lần Độ hấp thu Lần TB 0,1729 0,1771 0,1769 0,1756 Thể tích tinh dầu MeOH lấy (ml) 0,1553 0,1491 0,1514 0,1519 0,1306 0,1366 0,142 0,1072 0,1071 0,1059 Lượng tinh dầu (µl) %Kháng oxy hóa 20 12,2272 40 24,0713 0,1364 60 31,8341 0,1296 0,1184 80 40,8546 0,1127 0,1093 0,1093 100 45,3773 0,0995 0,0907 0,0951 0,0951 120 52,4738 0,1006 0,0828 0,0839 0,0891 140 55,4723 Độ hấp thu DPPH chuẩn 0,2001 Nồng độ tinh dầu/MEOH 20ppm PL - 51 Bảng PL 7.6 – Kết khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa vitamin C Mẫu Độ hấp thu Lần Độ hấp thu Lần Độ hấp thu Lần TB Thể tích dung dịch Vitamin C (ml) 0,1028 0,1028 0,1028 0,1028 0,2000 0,0500 26,5714 0,084 0,0845 0,0844 0,0843 0,3000 0,0750 39,7857 0,0643 0,0645 0,0665 0,0651 0,4000 0,1000 53,5000 0,0511 0,0498 0,0496 0,0502 0,5000 0,1250 64,1667 0,031 0,0326 0,0357 0,0331 0,6000 0,1500 76,3571 0,0176 0,018 0,018 0,0179 0,7000 0,1750 87,2381 0,0063 0,0061 0,0061 0,0062 0,8000 0,2000 95,5952 Độ hấp thu DPPH chuẩn 0,1400 Nồng độ acid ascorbic/MeOH 10ppm Lượng Vitamin C (mg) %Kháng oxy hóa