1036 nghiên cứu thành phần hóa học trong cao ethylacetat ở ph 1 2 của nhân trần tía (adenosma bracreosum bonati scrophulariaceae)

BỘ Y TẾ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ LÂM SĨ PHÚ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CAO ETHYLACETAT Ở pH 1-2 CỦA NHÂN TRẦN TÍA (Adenosma bracteosum Bonati - Scrophulariaceae) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC CẦN THƠ - 2015 BỘ Y TẾ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ LÂM SĨ PHÚ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CAO ETHYLACETAT Ở pH 1-2 CỦA NHÂN TRẦN TÍA (Adenosma bracteosum Bonati - Scrophulariaceae) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC ThS NGUYỄN NGỌC THỂ TRÂN CẦN THƠ - 2015 LỜI CẢM ƠN Con xin cảm ơn cha mẹ gia đình thương yêu, quan tâm giúp đỡ chỗ dựa tinh thần vững cho bước Em xin cảm ơn cô ThS Nguyễn Ngọc Thể Trân ThS Nguyễn Ngọc Quỳnh tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em xuyên suốt trình thực nghiệm hồn thành luận văn tốt nghiệp Em khơng quên gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tập thể thầy cô, anh chị Liên môn Dược liệu - Dược cổ truyền - Thực vật dược: thầy ThS Lê Thanh Vĩnh Tuyên, cô ThS Thạch Trần Minh Uyên, cô ThS Nguyễn Thị Trang Đài, chị Nguyễn Vũ Phương Lan, chị Ngô Thị Kim Hương truyền đạt kiến thức, hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian làm đề tài Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bạn Dược khóa 36 ln đồng hành, khích lệ động viên Lâm Sĩ Phú LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan tất kết luận văn hồn tồn riêng tơi chưa cơng bố cơng trình Cần Thơ, ngày 12 tháng 06 năm 2015 Sinh viên ký tên Lâm Sĩ Phú i MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC i DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .ii DANH MỤC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ iii DANH MỤC HÌNH iv ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 1.1 TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC 1.1.1 Chi Adenosma 1.1.2 Nhân trần tía 1.2 TỔNG QUAN VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.2.1 Thành phần hóa học số loài thuộc chi Adenosma 1.2.2 Thành phần hóa học Nhân trần tía 1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ CƠNG DỤNG CỦA NHÂN TRẦN TÍA VÀ MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI ADENOSMA 12 1.3.1 Tác dụng sinh học cơng dụng số lồi thuộc chi Adenosma 12 1.3.2 Tác dụng sinh học công dụng Nhân trần tía 13 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 2.1 NGUN LIỆU, DUNG MƠI, HĨA CHẤT, TRANG THIẾT BỊ 16 2.1.1 Nguyên liệu .16 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 16 2.1.3 Trang thiết bị 16 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.2.1 Chiết xuất cao ethylacetat Nhân trần tía pH 1-2 17 ii 2.2.2 Phân tích thành phần hóa học cao ethylacetat Nhân trần tía 20 2.2.3 Phân lập, tinh chế 21 2.2.4 Kiểm tra độ tinh khiết sắc ký lớp mỏng 22 2.2.5 Xác định cấu trúc 23 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24 3.1 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HĨA HỌC CAO ETHYLACETAT NHÂN TRẦN TÍA 24 3.1.1 Phân tích sơ thành phần hóa học 24 3.1.2 Định tính xác định flavonoid Nhân trần tía phản ứng hóa học .24 3.2 PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 25 3.2.1 Phân lập 25 3.2.2 Khảo sát cấu trúc hợp chất phân lập 34 Chương BÀN LUẬN 36 4.1 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HĨA HỌC CAO ETHYLACETAT NHÂN TRẦN TÍA 36 4.1.1 Phân tích sơ thành phần hóa học 36 4.1.2 Định tính xác định flavonoid Nhân trần tía phản ứng hóa học .36 4.2 PHÂN LẬP 37 4.2.1 Phân lập P1 từ phân đoạn E4 (pH 1-2) .37 4.2.2 Phân lập P2 từ phân đoạn E5 39 4.3 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 40 4.3.1 Khảo sát cấu trúc P1 40 4.3.2 Khảo sát cấu trúc P2 40 KẾT LUẬN 45 KIẾN NGHỊ .46 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Từ gốc Ac Acetone COSY Correlated Spectroscopy d Doublet DEPT Distortionless Enhancement Ý nghĩa Đỉnh kép by Polarization Transfer DMSO Dimethyl sulfoxide EA Ethyl acetate HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation IR Infrared (Phổ) hồng ngoại m Multiplet Nhiều đỉnh MeOH Methanol nBA n-Butyl acetate NMR Nuclear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy PE Petroleum ether s Singlet t Triplet TT Thuốc thử SKLM Sắc ký lớp mỏng UV Ultra violet Tử ngoại VS Vanillin - sulfuric acid Thuốc thử Vanillin Đỉnh đơn Sulfuric iv DANH MỤC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Trang Bảng 1.1 Thử hoạt tính chống oxy hóa in vitro loại cao chiết 14 Bảng 2.1 Kết phân đoạn sau chiết phân bố pH khác [9] 19 Bảng 2.2 Tóm tắt phản ứng định tính thành phần hố học cao ethylacetat 20 Bảng 3.1 Kết phân tích thành phần hóa học cao ethylacetat Nhân trần tía 24 Bảng 3.2 Kết định tính xác định flavonoid Nhân trần tía 24 Bảng 3.3 Các hệ dung môi khảo sát cho sắc ký cột C1 25 Bảng 3.4 Kết phân đoạn từ sắc ký cột C1 27 Bảng 3.5 Các hệ dung môi khảo sát cho sắc ký cột C2 30 Bảng 3.6 Kết phân đoạn từ sắc ký cột C2 32 Bảng 4.1 Các nhóm chức đặc trưng P1 phổ IR 40 Bảng 4.2 Tóm tắt liệu phổ NMR P1 42 Bảng 4.3 Số proton độ dời hóa học tương ứng phổ 1H-NMR P2 44 Sơ đồ 2.1 Quy trình chiết xuất dược liệu Nhân trần tía [9] 18 Sơ đồ 2.2 Quy trình xử lý cao nước (E) Nhân trần tía [9] 19 v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Adenosma bracteosum Bonati Hình 1.2 Thân, (1) cụm hoa (2) Nhân trần tía Hình 1.3 Đặc điểm hình thái A bracteosum Bonati Hình 1.4 Cơng thức hóa học số flavonoid Nhân trần tía 10 Hình 1.5 Cơng thức hóa học stigmasterol (a) acid betulinic (b) 11 Hình 3.1 Phân đoạn E4 triển khai hệ S5 26 Hình 3.2 Sắc ký đồ phân đoạn sắc ký cột quan sát đèn UV 254nm UV 365nm 27 Hình 3.3 Sắc ký đồ phân đoạn sắc ký cột vết với thuốc thử VS FeCl3/EtOH 28 Hình 3.4 Tinh thể P1 hình kim, màu vàng 28 Hình 3.5 Sắc ký đồ P1 với hệ dung môi khác 30 Hình 3.6 Phân đoạn E5 triển khai hệ dung môi S4 31 Hình 3.7 Sắc ký đồ phân đoạn sắc ký cột quan sát đèn UV 365nm (1) phun TT VS (2) 31 Hình 3.8 Sắc ký đồ P2 với hệ dung môi khác 33 Hình 3.9 Phổ UV P1 34 Hình 3.10 Phổ IR P1 34 Hình 3.11 Cấu trúc dự kiến P1 35 Hình 4.1 Cấu trúc hóa học tương tác phổ NMR P1 43 ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm gan virus vấn đề sức khỏe mang tính cộng đồng Nó ảnh hưởng đến sống hàng triệu người năm toàn giới nguyên nhân hàng đầu thúc đẩy bệnh nhân viêm gan tiến đến giai đoạn xơ gan, ung thư gan, chí tử vong Theo ghi nhận Tổ chức y tế giới năm 2012, có khoảng 500 triệu người bị viêm gan mạn virus viêm gan B C; xấp xỉ triệu người chết năm (chiếm khoảng 2.7% ca tử vong) liên quan đến viêm gan virus Tổ chức y tế giới ước tính có khoảng 57% số ca xơ gan 78% số ca ung thư gan giai đoạn đầu lây nhiễm virus viêm gan B C [32] Ở Việt Nam, thống kê cho thấy tỉ lệ số người nhiễm virus viêm gan mức báo động với 8,1 triệu đáng lo ngại hơn, bệnh viêm gan phát đồng nhiễm với HIV/AIDS, điều làm tăng khó khăn gánh nặng cho q trình điều trị [28], [34] Trước thực trạng đó, thuốc tân dược điều trị viêm gan nhiều nhà bào chế công ty quan tâm nghiên cứu, cho thị trường song giá thành cao tác dụng phụ không mong muốn nên phần khiến người bệnh cân nhắc sử dụng Đứng góc độ Y học cổ truyền, quốc gia phương Đơng nói chung Việt Nam nói riêng từ lâu sử dụng nhiều loại dược liệu dân gian như: Actisô, Diệp hạ châu, Bồ bồ, đưa vào thuốc để điều trị bệnh gan mật [37] Trong số đó, Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati) tìm hiểu, nghiên cứu chứng minh có tác dụng tốt bệnh nhân gan mật, đặc biệt phối hợp với dược liệu khác Rau má, Diệp hạ châu [10] Các chế phẩm thuốc có thành phần nhân trần tía bào chế thành công lưu hành thị trường nhằm đáp ứng nhu cần điều trị hay hỗ trợ điều trị bệnh viêm gan [14], [36] Tuy Nhân trần tía biết đến sử dụng tương đối rộng rãi, song nghiên cứu sâu thành phần, hàm lượng hay cấu trúc hóa học nhóm hợp chất có tác 20 Lê Thị Minh Thảo (2005), Nghiên cứu thực vật học hóa học góp phần nâng cao tiêu chuẩn nhân trần, Luận văn thạc sỹ Dược học, Trường Đại học Y Dược TP.HCM, TP.HCM 21 Huỳnh Ngọc Thảo (2012), Nghiên cứu thành phần hoá học nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati – Scrophulariaceae, Luận văn tốt nghiệp dược sỹ đại học, Trường ĐH Y Dược Cần Thơ, Cần Thơ 22 Nguyễn Minh Anh Thơ (2013), Phân lập số nhóm hợp chất hóa học từ cao cồn Nhân trần tía (Adenosma bractesum Bonati – Scrophulariaceae), Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học 2013, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, Thành phố Cần Thơ 23 Đinh Cơng Tín (2013), Phân lập số nhóm hợp chất hố học từ cao ether dầu Nhân trần tía Adenosma bracteosum Bonati, Luận văn tốt nghiệp dược sỹ đại học, Trường ĐH Y Dược Cần Thơ, Cần Thơ 24 Nguyễn Thị Ngọc Trâm (2012), Nghiên cứu phân lập hợp chất hóa học từ Nhân trần tía (Adenosma bractesum Bonati – Scrophulariaceae), Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, Thành phố Cần Thơ 25 Nguyễn Viết Tựu, Phạm Duy Hùng, Phạm Tuấn Kiệt, Lư Kim Bích, Hồ Thị Kim Hòa (1986), “Bước đầu nghiên cứu số thuốc dân gian thuộc chi Adenosma có tên Nhân trần”, Kỷ yếu cơng trình nghiên cứu khoa học 19791985, Phân viện Dược liệu TP HCM, tr 34-37 26 Viện Dược Liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập I, Nxb Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội, tr 233-235 27 Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập II, Nxb Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội, tr 455-459 TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI 28 Leandro Sereno, Fabio Mesquita, Masaya Kato, David Jacka, Thi Thuy Van Nguyen, and Thien Nga Nguyen (2012), “Epidemiology, Responses, and Way Forward: The Silent Epidemic of Viral Hepatitis and HIV Coinfection in Vietnam”, Journal of the International Association of Physicians in AIDS Care 29 Md Nazrul Islam Bhuiyan, Farhana Akter, Jasim Uddin Chowdhury, Jaripa Begum (2010), “Chemical constituents of essential oils from aerial parts of Adenosma capitatum and Limnophila aromatic”, Bangladesh J Pharmacol, 5, pp 13–16 30 Premysl Landa, Ladislav Kokoska, Marie Pribylova, Tomas Vanek, Petr Marsik, 2009, “In vitro Anti-inflammatory Activity of Carvacrol: Inhibitory Effect on COX-2 Catalyzed Prostaglandin E2 Biosynthesis”, Archives of Pharmacal Research, 32(1), pp 75–78 31 Tsankkova, Elena T., Kuleva, Lii V, Le Thai Thanh (1994), “Composition of the essential oil of Adenosma bracteosum Bonati”, Journal of essential oil research, 6(3), pp 305-306 32 World Health Organization (2012), Prevention & control of Viral hepatitis infection: Framework for global action, pp TRANG WEB 33 The Plant List [truy cập 20/5/2015], http://www.theplantlist.org/tpl/ record/kew-2621876 34 Tổ chức Y tế giới, khu vực Tây Thái Bình Dương, Văn phịng đại diện,http://www.wpro.who.int/vietnam/mediacentre/releases/2013/worldhepati tisday2013/vi/ 35 Trung tâm liệu thực vật Việt Nam (20/08/2013) http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=edir&v=Adenosma%20bracteosum &list=species 36 http://www.mims.com/Vietnam/drug/info/Protecliv/ 37 http://www.ngon.edu.vn/2012/10/phong-ngua-benh-mat-bang-thao-duoc.html PL - PHỤ LỤC DANH MỤC PHỤ LỤC Trang PL01 Phổ IR P1 PL - PL02 Phổ UV P1 PL - PL03 Phổ 1H-NMR P1 PL - PL04 Phổ 1H-NMR dãn rộng P1 PL - PL05 Phổ 13C-CPD P1 PL - PL06 Phổ 13C-CPD dãn rộng P1 PL - PL07 Phổ 13C-DEPT P1 PL - PL08 Phổ HSQC P1 PL - PL09 Phổ HMBC P1 .PL - PL10 Phổ COSY P1 PL - 10 PL11 Phổ ROESY P1 .PL - 11 PL12 Phổ 1H-NMR P2 PL - 12 PL13 Phổ 1H-NMR dãn rộng P2 PL - 13 D:\Data\IR-Than\2-CLO\meas\Sample description.0 2500 2000 1500 Wavenumber cm-1 Sample description Sample Compartment Page 1/1 PL01 Phổ IR P1 PL02 Phổ UV P1 1120.86 1277.75 1397.04 1507.46 1732.06 3000 1652.30 2927.34 3500 2359.97 3445.40 40 50 Transmittance [%] 80 70 60 90 100 PL - 1000 500 10/06/2015 PL - PL03 Phổ 1H-NMR P1 PL - PL04 Phổ 1H-NMR dãn rộng P1 PL - PL05 Phổ 13C-CPD P1 PL - PL06 Phổ 13C-CPD dãn rộng P1 PL - PL07 Phổ 13C-DEPT P1 PL - PL08 Phổ HSQC P1 PL - PL09 Phổ HMBC P1 PL - 10 PL10 Phổ COSY P1 PL - 11 PL11 Phổ ROESY P1 PL - 12 PL12 Phổ 1H-NMR P2 PL - 13 PL13 Phổ 1H-NMR dãn rộng P2