Nghiên cứu thành phần hóa học trong cây thạch tùng phi lao (lycopodium casuarinoides spring ) theo hướng tác dụng kháng viêm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THỊ HỒNG HIỂU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÂY THẠCH TÙNG PHI LAO (LYCOPODIUM CASUARINOIDES SPRING.) THEO HƯỚNG TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM NGÀNH: DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ THỊ HỒNG VÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây công trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học TS Lê Thị Hồng Vân Các kết thu luận án hoàn toàn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tồn trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hồng Hiểu Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dược học – Khóa: 2020 – 2022 Chuyên ngành: Dược liệu – Dược học cổ truyền – Mã số: 8720206 Nghiên cứu thành phần hóa học thạch tùng phi lao (Lycopodium Casuarinoides Spring.) theo hướng tác dụng kháng viêm Học viên: Nguyễn Thị Hồng Hiểu Hướng dẫn khoa học: TS Lê Thị Hồng Vân Đặt vấn đề Theo y học cổ truyền, Thạch tùng phi lao (Lycopodium casuarinoides Spring.) dùng làm thuốc trị phong thấp, viêm khớp xương, gân cốt buốt đau, kinh nguyệt không đều, mồ hôi trộm, trẻ em bị ngoại cảm phát sốt, ngồi cịn dùng chữa qng gà hen suyễn Tuy nhiên, nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học Thạch tùng phi lao cịn tương đối Ở nước ta, có nghiên cứu thành phần hóa học năm 2014 Vì vậy, đề tài thực nhằm nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng kháng viêm hợp chất phân lập làm tiền đề cho phát triển dược liệu sau Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng Thạch tùng phi lao thu hái tỉnh Lâm Đồng (tháng 5/2021), sấy khô xay thành bột Chiết xuất phương pháp ngấm kiệt, chiết phân bố lỏng – lỏng phân lập kỹ thuật sắc ký cột, sắc ký rây phân tử tinh chế cách kết tinh dung môi thích hợp Cấu trúc hợp chất phân lập xác định phương pháp phổ MS, NMR so sánh với tài liệu tham khảo Khảo sát hoạt tính kháng viêm phương pháp ức chế NO dòng tế bào đại thực bào chuột RAW 264.7, kích thích lipopolysaccharid Kết bàn luận 10 kg bột Thạch tùng phi lao sau tiến hành chiết xuất phân lập xác định hợp chất α – onocerin (3D; 115 mg), huperzinin (E1; 226 mg); salcolin B (8E; 15 mg); salcolin A (9E; 31 mg); (2R,3R)-dihydrokaempferol (10E; 26 mg); acid trans-p coumaric (11E; 45 mg); apigenin (12E; 28 mg); lycocasuarinol A (14E; 18 mg) Thử nghiệm hoạt tính cao n-hexan - ethylacetat, cao ethylacetat cao nước cho thấy tác dụng kháng viêm với giá trị IC50 từ 65,56 – 46,15 µg/mL Các hợp chất α – onocerin, huperzinin có hoạt tính ức chế sinh NO với IC50 >100 µg/ml Các hợp chất acid trans-p-coumaric, salcolin B, salcolin A, (2R,3R)-dihydrokaempferol, apigenin có hiệu kháng viêm đáng kể mơ hình ức chế NO biết Hợp chất phân lập tự nhiên, lycocasuarinol A gây độc tế bào RAW264.7 với tỷ lệ tế bào sống 13,8% Kết luận Toàn Thạch tùng phi lao phân lập hợp chất Trong đó, hợp chất α – onocerin huperzinin có hàm lượng cao, hợp chất acid trans-p-coumaric, salcolin B, salcolin A, (2R,3R)-dihydrokaempferol, apigenin lần phân lập từ Thạch tùng phi lao Đặc biệt, hợp chất lycocasuarinol A lần phân lập tự nhiên Hợp chất α – onocerin, huperzinin tác dụng kháng viêm mơ hình ức chế sinh NO với IC50 >100 µg/ml Master’s thesis – Academic cours: 2020 – 2022 Speciality: Traditional medicine – Speciality code: 8720206 Study on the chemical composition of Lycopodium Casuarinoides Spring in the direction of anti – inflammatory effects Nguyen Thi Hong Hieu Supervisor: Dr Le Thi Hong Van Introduction According to traditional medicine, Lycopodium casuarinoides Spring is used as a medicine to treat rheumatism, arthritis, painful tendons, irregular menstruation, sweating, in addition to treating blindness chicken and asthma However, up to now, there were not many studies on the chemical composition as well as the biological activities of Lycopodium casuarinoides Spring In our country, there is currently only one study on the chemical composition of the plant in 2014 Therefore, the investigation of chemical composition as well as the anti-inflammatory effects was carried out The results will be a contribution of natural product development Materials and Methods Lycopodium casuarinoides Spring was collected at Lam Dong province in 2021, then dried and grind into powder Raw materials was extracted by percolation, and separation by open column chromatography, size exclusion chromatography and purification by recrystallization in suitable solvents The structures of the isolated compounds were identified by MS, NMR spectroscopy methods and compared with the known compounds in literature Investigation of anti – inflammatory activity by evaluating the inhibitory activity against the LPS – induced production of NO in RAW 264.7 cells Results and discussion 10 kg dried Lycopodium casuarinoides Spring was extracted, compounds were isolated and identified as α – onocerin (3D; 115mg), huperzinin (E1; 226 mg); salcolin B (8E; 15 mg); salcolin A (9E; 31 mg); (2R,3R)-dihydrokaempferol (10E; 26 mg); acid trans-p coumaric (11E; 45 mg); apigenin (12E; 28 mg); lycocasuarinol A (14E; 18 mg) n-Hexan – Ethylacetate, Ethylacetate and water fraction showed the anti – inflammatory activity with IC50 value from 65.56 - 46.15 µg/mL respectively Among these isolated compound, the compounds α - onocerin, huperzinin have the ability to inhibit NO production with IC50 >100 µg/ml The compounds acid transp-coumaric, salcolin B, salcolin A, (2R,3R)-dihydrokaempferol, apigenin had significant anti-inflammatory effects in a known NO inhibitory model The newly isolated compound in nature, lycocasuarinol A, was cytotoxic to RAW264.7 cells with a survival rate of 13.8% Conclusion From Lycopodium casuarinoides Spring., compounds were isolated Among them, acid trans-p-coumaric, salcolin B, salcolin A, (2R,3R)-dihydrokaempferol, apigenin compounds were isolated for the first time from Lycopodium casuarinoides Spring, compounds including α – onocerin huperzinin with high yield Especially, lycocasuarinol A compound were isolated for the first time in nature Compounds αonocerin, huperzinin did not show anti-inflammatory effects based on the NO production inhibition model with IC50 >100 µg/ml MỤC LỤC Trang Danh mục ký hiệu từ viết tắt i Danh mục hình, sơ đồ iii Danh mục bảng v MỞ ĐẦU .1 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm thực vật 1.2 Thành phần hóa học 1.3 Tác dụng sinh học hợp chất phân lập từ loài thạch tùng phi lao 13 1.4 Công dụng 16 1.5 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng viêm 16 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.2 Nơi thực 20 2.3 Hóa chất - trang thiết bị 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 21 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .27 3.1 Kết kiểm tra nguyên liệu 27 3.2 Chiết xuất, phân tách phân đoạn sàng lọc hoạt tính sinh học 35 3.3 Phân lập chất từ cao ethyl acetat 37 3.4 Phân lập hợp chất từ cao n-hexan – ethyl acetat 43 3.5 Phân lập hợp chất từ cao alcaloid toàn phần 46 3.6 Tổng kết trình phân lập hợp chất tinh khiết từ cao phân đoạn 49 3.7 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập 51 3.8 Kết đánh giá tác dụng kháng viêm hợp chất phân lập 66 Chương IV BÀN LUẬN 68 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 PHỤ LỤC 86 i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ nguyên AChE Acetylcholinesterase COX-2 Enzym cyclooxygenase COSY Correlation Spectroscopy (Phổ tương tác hai chiều 1H - 1H) CDCl3 CHCl3 thay hydrogen (H) deuterium (D) CD3OD CH3OH thay hydrogen (H) deuterium (D) DMSO Dimethylsulfoxide DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium d Doublet (tín hiệu đơi) dd Doublet of Doublet (tín hiệu đơi đơi) ESI – MS Electrospray Ionization - Mass Spectrometry (Phổ khối phun mù điện) FBS Huyết thai bò Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Tương quan dị hạt nhân qua nhiều liên kết) Heteronuclear Single Quantum Correlation (Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết) High Resolution – Electrospray Ionization – Mass Spectrometry (Phổ khối phân giải cao phun mù điện) HMBC HSQC HR – ESI – MS Hertz (đơn vị đo tần số) Hz IL-6 IC50 LOX LPS High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) Interleukin-6 (Chất miễn dịch phản ứng viêm) Inhibitory concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) Enzym 5-lipoxygenase Lipopolysaccharid L-NMMA NG-Methyl-L-arginine acetate MTT NMR NO (3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) Nitric oxid Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B (Phối tử kích hoạt thụ thể yếu tố nhân kappa-B) HPLC NF-κB ii PGE2 VS TNF-α RAW264.7 δ 13 C - NMR H - NMR 1D - NMR 2D – NMR s t q m ppm Prostaglandin E2 Thuốc thử vanillin / acid sulfuric Tumor Necrosis Factors (Yếu tố hoại tử khối u alpha) Dịng đại thực bào 264.7 Chemical shift (Độ dời hóa học) Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance Proton Nuclear Magnetic Resonance One Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Two Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Singlet (tín hiệu đơn) Triplet (tín hiệu ba) Quartet (tín hiệu bốn) Multiplet (tín hiệu đa) Parts per million (phần triệu