0048 tổng hợp tạp chất liên quan d (ethyl 5 amino 1h pyrazol 4 carboxylat) và tạp ethyl (

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ BỘ Y TẾ NGUYỄN NHẬT TOÀN TỔNG HỢP TẠP CHẤT LIÊN QUAN D (ETHYL 5AMINO-1H-PYRAZOL-4-CARBOXYLAT) VÀ TẠP ETHYL-(E/Z)-3-(2-CARBETHOXY-2CYANOETHENYL)AMINO-1H-PYRAZOL-4CARBOXYLAT CỦA ALLOPURINOL LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC CẦN THƠ – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN NHẬT TOÀN TỔNG HỢP TẠP CHẤT LIÊN QUAN D (ETHYL 5AMINO-1H-PYRAZOL-4-CARBOXYLAT) VÀ TẠP ETHYL-(E/Z)-3-(2-CARBETHOXY-2CYANOETHENYL)AMINO-1H-PYRAZOL-4CARBOXYLAT CỦA ALLOPURINOL LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC ThS LỮ THIỆN PHÚC TS ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ Cần Thơ – 2018 LỜI CẢM ƠN Sau chín tháng làm nghiên cứu Liên mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất, trải qua nhiều niềm vui, nỗi buồn, thuận lợi, khó khăn, cuối tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp khơng qn gửi lời cảm ơn chân thành đến người yêu quý Cảm ơn Cha, Mẹ, người kính trọng, yêu thương Cảm ơn Anh hai tiếp sức cho em vật chất lẫn tinh thần Cảm ơn thầy ThS Lữ Thiện Phúc, người hỗ trợ truyền đạt kiến thức cho em q trình làm nghiên cứu Thầy ln gương sáng cho em học hỏi để hoàn thiện Cảm ơn thầy TS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, người tạo điều kiện cho em nhiều để hồn thành nghiên cứu Thầy ln nguồn động lực cho hệ sinh viên tham gia nghiên cứu khoa học Cảm ơn thầy DS Nguyễn Mạnh Quân, người thầy người anh quan tâm, giúp đỡ em nhiều, truyền cho em nhiều kinh nghiệm quý giá để làm hành trang trường Cảm ơn cô Ngọc Vân, cô Trúc Ly, cô Đặng, anh Hiền hỗ trợ em thực đề tài nghiên cứu Cảm ơn chị Trang, chị Hường, chị Thảo, chị Thúy Ngọc, anh Hạnh, chị An, chị Xương, chị Như Ngọc, chị Mộng Ngọc, anh Thi, anh Phú, anh Dương, anh Truyền cho em nhiều lời khuyên bổ ích Em biết ơn quen biết anh, chị người tài giỏi Đặc biệt cảm ơn hai bạn Cẩm Nhung Duy Thái bên suốt trình làm đề tài, tin kỷ niệm quý thời sinh viên Và gửi lời cảm đến ơn thầy, mơn Dược liệu, Hóa dược bạn làm đề tài khóa 39 Cảm ơn người nhiều! LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học thầy ThS Lữ Thiện Phúc thầy TS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ Các kết quả, số liệu nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Cần Thơ, ngày 14 tháng năm 2018 Sinh viên Nguyễn Nhật Toàn i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ vi ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ALLOPURINOL .3 1.1.1 Tính chất lý hóa 1.1.2 Dược lực học 1.1.3 Dược động học 1.1.4 Tổng hợp allopurinol nghiên cứu .4 1.1.5 Các tạp chất allopurinol .5 1.2 TẠP D CỦA ALLOPURINOL 1.2.1 Tính chất vật lý 1.2.2 Nguồn gốc phát sinh 1.2.3 Độc tính 1.2.4 Các cơng trình nghiên cứu tạp D 1.2.5 Giới hạn tạp D allopurinol 1.3 TẠP ETHYL-(E/Z)-3-(2-CARBETHOXY-2-CYANOETHENYL)AMINO-1HPYRAZOL-4-CARBOXYLAT CỦA ALLOPURINOL 1.3.1 Tính chất vật lý 10 1.3.2 Nguồn gốc phát sinh 10 ii 1.3.3 Độc tính 10 1.3.4 Các cơng trình nghiên cứu tạp ethyl-(E/Z)-5-(2-carbethoxy-2cyanoethenyl)amino-1H-pyrazol-4-carboxylat 11 1.3.5 Kiểm nghiệm tạp ethyl-(E/Z)-5-(2-carbethoxy-2-cyanoethenyl)amino1H-pyrazol-4-carboxylat allopurinol 11 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 12 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .12 2.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 12 2.1.3 Nguyên liệu dùng nghiên cứu 12 2.1.4 Dụng cụ thiết bị 12 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.2.1 Tạp D allopurinol .13 2.2.2 Tạp ethyl-(E/Z)-5-(2-carbethoxy-2-cyanoethenyl)amino-1H-pyrazol-4carboxylat allopurinol 16 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20 3.1 TẠP D CỦA ALLOPURINOL 20 3.1.1 Kết tổng hợp tạp D allopurinol 20 3.1.2 Kết tinh chế tạp D 21 3.1.3 Kết sơ độ tinh khiết tạp D .21 3.1.4 Kết quy trình xác định độ tinh khiết tạp D HPLC-PDA 22 3.1.5 Kết xác định cấu trúc tạp D .25 3.1.6 Kết xác định độ tinh khiết tạp D HPLC-PDA 29 3.2 TẠP ETHYL-(E/Z)-5-(2-CARBETHOXY-2-CYANOETHENYL)AMINO-1HPYRAZOL-4-CARBOXYLAT (TẠP F – USP 38) CỦA ALLOPURINOL .31 iii 3.2.1 Tổng hợp sản phẩm trung gian ethyl-2-cyano-3-hydrazinylacrylat 31 3.2.2 Tổng hợp tạp ethyl-(E/Z)-5-(2-carbethoxy-2-cyanoethenyl)amino-1Hpyrazol-4-carboxylat allopurinol 34 Chương BÀN LUẬN 45 4.1 TỔNG HỢP TẠP D CỦA ALLOPURINOL 45 4.1.1 Cơ chế phản ứng .45 4.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng 45 4.1.3 Xác định tạp D phương pháp phổ nghiệm 48 4.1.4 Kiểm tra độ tinh khiết tạp D HPLC – PDA 49 4.2 TỔNG HỢP TẠP ETHYL-(E/Z)-5-(2-CARBETHOXY-2CYANOETHENYL)AMINO-1H-PYRAZOL-4-CARBOXYLAT (TẠP F – USP 38) CỦA ALLOPURINOL 52 4.2.1 Cơ chế phản ứng .52 4.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng 53 4.2.3 Xác định tạp F phương pháp phổ nghiệm 54 4.2.4 Kiểm tra độ tinh khiết tạp F HPLC – PDA .55 KẾT LUẬN 57 KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Chữ tắt ACN As BP CE DĐVN HLA-B HPLC 10 11 12 13 15 16 17 18 19 20 21 22 23 IR k’ MS N NMR PDA Rs RSD% S SKLM tR TFA USP UV – Vis WHO Chữ nguyên Acetonitril Asymmetric factor British Pharmacopoeia Capillary Electrophoresis Dược điển Việt Nam The human leukocyte antigen B High performance liquid chromatography Infrared Capacity factor Mass spectrometry Number of theoretical plate Nuclear Magnetic Resonance Photodiode arrays Resolution Relative standard deviation % Peak area Sắc ký lớp mỏng Retention time Acid trifluoroacetic United States Pharmacopeia Ultraviolet – Visible World Health Organization Ý nghĩa Hệ số bất đối Dược điển Anh Điện di mao quản Kháng nguyên bạch cầu B người Sắc ký lỏng hiệu cao Hồng ngoại Hệ số dung lượng Khối phổ Số đĩa lý thuyết Cộng hưởng từ hạt nhân Dãy diod quang Độ phân giải Độ lệch chuẩn tương đối Diện tích đỉnh Thời gian lưu Dược điển Mỹ Tử ngoại – khả kiến Tổ chức Y tế giới v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Các tạp chất liên quan allopurinol theo USP 38 1.2 Giới hạn tạp D dược điển Giới hạn tạp ethyl-(E/Z)-5-(2-carbethoxy-2-cyanoethenyl)amino1.3 11 1H-pyrazol-4-carboxylat dược điển Mỹ 41 2.1 Nguyên liệu dùng cho tổng hợp 12 2.2 Dụng cụ thiết bị sử dụng nghiên cứu 12 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ khảo sát đến phản ứng 3.1 20 dựa SKLM Kết khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu/hydrazin đến 3.2 20 phản ứng dựa khối phổ 3.3 Hiệu suất trình tổng hợp – tinh chế tạp D 21 So sánh độ dịch chuyển hóa học SPTH (tạp D) chuẩn tạp D 3.4 22 allopurinol 3.5 Tính tương thích hệ thống 27 Kết khảo sát ảnh hưởng thể tích hydrazin hydrat đến hiệu 3.6 31 suất tổng hợp 3.7 Kết khảo sát ảnh hưởng pH đến hiệu suất tổng hợp 31 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian phản ứng đến hiệu suất 3.8 31 tổng hợp Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất 3.9 31 tổng hợp Kết khảo sát ảnh hưởng lượng SPTG đến hiệu suất tổng 3.10 35 hợp Kết khảo sát ảnh hưởng thể tích ete đến hiệu suất tổng 3.11 35 hợp 3.12 Tính tương thích hệ thống 36 vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Hình vẽ Tên hình Trang 3.1 Tạp D 21 3.2 Độ tinh khiết tạp D SKLM 21 Overlay sắc ký đồ dung môi pha mẫu, dung môi pha động, tạp 3.3 23 D, nguyên liệu, hỗn hợp tạp D – nguyên liệu 250nm Overlay sắc ký đồ dung môi pha mẫu, dung môi pha động, tạp 3.4 23 D, nguyên liệu, hỗn hợp tạp D – nguyên liệu chế độ max plot 3.5 Hình ảnh 3D pic tạp D 24 3.6 Kiểm tra độ tinh khiết pic tạp D 24 3.7 Phổ UV – Vis tạp D 25 3.8 Phổ IR tạp D 25 3.9 Phổ MS tạp D chế độ ESI+ 26 3.10 Phổ MS chế độ daughter product ion tạp D 26 3.11 Phổ 13C – NMR tạp D 28 Công thức cấu tạo sản phẩm tổng hợp (tạp D 3.12 28 allopurinol) 3.13 Sắc ký đồ tạp D trước tinh chế chế độ Max plot 29 3.14 Hình ảnh 3D tạp D trước tinh chế 29 3.15 Sắc ký đồ tạp D sau tinh chế chế độ Max plot 30 3.16 Hình ảnh 3D tạp D sau tinh chế 30 3.17 SPTG 32 3.18 Độ tinh khiết SPTG SKLM 32 3.19 Phổ UV – Vis SPTG 33 3.20 Phổ IR SPTG 33 3.21 Phổ MS SPTG 34 3.22 Tạp F 35 3.23 Độ tinh khiết tạp F SKLM 35 Overlay sắc ký đồ dung môi pha mẫu, dung môi pha động, tạp 3.24 F, nguyên liệu, SPTG, hỗn hợp tạp F – nguyên liệu – SPTG 37 250nm Overlay sắc ký đồ dung môi pha mẫu, dung môi pha động, tạp 3.25 F, nguyên liệu, SPTG, hỗn hợp tạp F – nguyên liệu – SPTG 37 chế độ max plot PL - 36 DAD-CH1 250 nm Results Name Retention Time 1.493 4.467 Area 840508 84595588 Theoretical plates (USP) 542 2210 Capacity factor 0.49333 3.46667 Resolution (USP) 0.00000 9.34202 Capacity factor 0.49333 3.46667 Resolution (USP) 0.00000 9.77242 Asymmetry 1.31364 0.93400 Totals 85436096 Spectrum Max Plot Results Name Retention Time 1.493 4.467 Area 2356272 128511191 Totals 130867463 Theoretical plates (USP) 1090 1746 Asymmetry 1.28986 0.95183 PL - 37 5.2.4 Sắc ký đồ hỗn hợp mẫu thử External Standard Report Method Name: D:\ToanK39\ToanK39\Method\xlsl 3070.met D:\ToanK39\ToanK39\Data\1206 hon hop tdf.dat User: manhquan Acquired: 6/12/2018 4:49:41 PM Printed: 6/12/2018 8:58:03 PM 4.480 Data: 1000 6.480 0 mAU 9.487 2000 1000 1.500 mAU 2000 10 15 0 10 Minutes 15 mAU 1000 9.487 1000 6.480 2000 4.480 2000 1.500 mAU Minutes PL - 38 DAD-CH1 250 nm Results Name Retention Time 1.500 4.480 6.480 9.487 Area 900153 87328882 140492390 95148899 Theoretical plates (USP) 499 2129 3173 4523 Capacity factor 0.50000 3.48000 5.48000 8.48667 Resolution (USP) 0.00000 9.07096 4.71443 5.87028 Asymmetry Theoretical Capacity Resolution Asymmetry plates (USP) factor (USP) 1.11672 0.92371 0.95568 0.91195 Totals 323870324 Spectrum Max Plot Results Name Retention Area Time 1.500 2377605 1520 0.50000 0.00000 1.20628 4.480 131939094 1678 3.48000 10.07836 0.94136 6.480 143711270 3131 5.48000 4.44113 0.95650 9.487 154435747 4076 8.48667 5.68589 0.92208 Totals 432463716 PL - 39 5.2.5 Sắc ký đồ dung môi pha mẫu (ACN) External Standard Report Method Name: D:\ToanK39\ToanK39\Method\xlsl 3070.met Data: D:\ToanK39\ToanK39\Data\1206 ACN tham dinh F l2.dat User: manhquan Acquired: 6/12/2018 1:36:39 PM 2000 1000 1000 1.520 2000 mAU 6/12/2018 8:31:54 PM mAU Printed: 0 10 15 2000 1000 1000 0 10 Minutes 15 mAU 2000 1.520 mAU Minutes PL - 40 DAD-CH1 250 nm Results Name Retention Area Time Dung moi 1.520 860169 Theoretical Capacity Resolution plates (USP) factor (USP) 503 0.52000 0.00000 Theoretical Capacity Resolution plates (USP) factor Asymmetry 1.09983 Totals 860169 Spectrum Max Plot Results Name Retention Area Time Dung moi 1.520 2304434 Totals 2304434 1517 0.52000 Asymmetry (USP) 0.00000 1.20483 PL - 41 5.3 XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA TẠP F 5.3.1 Tạp F thu lượng diethyl ete sử dụng 10ml External Standard Report Method Name: D:\ToanK39\ToanK39\Method\xlsl 3070.met Data: D:\ToanK39\ToanK39\Data\1306 tap F ket tinh pp1 l2.dat User: manhquan Acquired: 6/13/2018 9:44:36 AM 6/13/2018 10:28:45 AM 17.02751 7.90667 750 500 4774 500 250 8.907 73301904 mAU 750 250 1000 0.94319 1000 mAU 0.49333 0.00000 1.21265 1939463 938169 1.13333 2.41873 0.77695 1.493 2.133 574 929 Printed: 0 10 15 20 25 30 35 17.57140 0.49333 0.00000 1.19500 1.13333 3.00894 0.89425 0.94833 Minutes mAU 4496 8.907 500 0 1000 122389701 500 1.493 2.133 2681946 7378032 1034 1268 1000 mAU 1500 7.90667 1500 10 15 20 Minutes 25 30 35 PL - 42 DAD-CH1 250 nm Results Name Retention Area Time Theoretical Capacity plates (USP) factor Resolution Asymmetry (USP) 1.493 938169 574 0.49333 0.00000 1.21265 2.133 1939463 929 1.13333 2.41873 0.77695 8.907 73301904 4774 7.90667 17.02751 0.94319 Theoretical Capacity Resolution Asymmetry plates (USP) factor (USP) Totals 76179536 Spectrum Max Plot Results Name Retention Area Time 1.493 2681946 1034 0.49333 0.00000 1.19500 2.133 7378032 1268 1.13333 3.00894 0.89425 8.907 122389701 4496 7.90667 17.57140 0.94833 Totals 132449679 PL - 43 5.3.2 Mẫu tạp F thu từ quy trình tối ưu External Standard Report Method Name: D:\ToanK39\ToanK39\Method\xlsl 3070.met Data: D:\ToanK39\ToanK39\Data\1306 tap F ket tinh pp3 l1.dat User: manhquan Acquired: 6/13/2018 8:43:50 AM Printed: 6/13/2018 9:23:18 AM 1500 19.34124 0.93519 0.49333 0.00000 1.21388 1500 mAU 7.98000 1000 4715 500 1.493 105583626 920128 500 566 mAU 1000 8.980 0 10 15 20 25 30 35 0.94514 2000 7.98000 1000 4069 1000 500 162626890 500 8.980 0 10 20 Minutes 30 mAU 1500 19.90705 1500 998 0.49333 0.00000 1.16898 2000 1.493 2737975 mAU Minutes PL - 44 DAD-CH1 250 nm Results Name Retention Area Time Theoretical Capacity Resolution plates (USP) factor (USP) Asymmetry 1.493 920128 566 0.49333 0.00000 1.21388 8.980 105583626 4715 7.98000 19.34124 0.93519 Totals 106503754 Spectrum Max Plot Results Name Retenti Area on Theoretical Capacity Resolution plates (USP) factor (USP) Asymmetry Time 1.493 2737975 998 0.49333 0.00000 1.16898 8.980 162626890 4069 7.98000 19.90705 0.94514 Totals 165364865 3500 E:\NHAT TOAN DB39\TAP F_21_04.0 TAP F_21_04 3000 2500 2000 Wavenumber cm-1 KBr Page 1/1 1500 1000 573.66 487.31 467.60 1712.65 1676.93 1635.16 1561.15 1512.97 1469.19 1429.01 1381.73 1362.43 1298.39 1258.98 1129.08 1068.13 1027.86 948.86 872.29 835.02 759.97 700.78 1866.25 2360.23 2340.43 2235.52 2981.72 2957.28 2924.99 2854.25 3084.18 3322.32 3250.03 3178.73 3438.74 20 Transmittance [%] 40 60 80 100 PHỤ LỤC XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA TẠP F 6.1 PHỔ IR CỦA TẠP F 500 21/04/2018 6.2 PHỔ MS – QTOF CỦA TẠP F 6.3 PHỔ 13C – NMR CỦA TẠP F 6.4 PHỔ DEPT – NMR CỦA TẠP F 6.5 PHỔ 1H – NMR CỦA TẠP F