Xác định hàm lượng các tạp chất liên quan d,e và hydrazin có trong thuốc allopurinol bằng phương pháp sắc ký lỏng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ NGUYỄN MẠNH QUÂN XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CÁC TẠP CHẤT LIÊN QUAN D, E VÀ HYDRAZIN CÓ TRONG THUỐC ALLOPURINOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc Độc chất Mã số: 60.72.04.10 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: Ts Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ Cần Thơ – Năm 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết luận văn hoàn tồn trung thực chưa cơng bố nghiên cứu Cần Thơ, ngày 16 tháng 04 năm 2019 Học viên Nguyễn Mạnh Quân LỜI CẢM ƠN Lời cảm ơn lời cảm ơn sâu sắc em xin gửi đến mẹ gia đình em ln quan tâm động viên em suốt trình học tập nghiên cứu Em xin gửi đến Thầy Ts Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ lời cảm ơn sâu sắc Những điều em học từ Thầy không kiến thức mà niềm đam mê nghiên cứu khoa học Thầy tận tình hướng dẫn em suốt trình nghiên cứu từ tảng kiến thức ban đầu Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy, Cô Liên mơn Hóa Phân Tích - Kiểm Nghiệm - Độc chất, động viên, khích lệ tinh thần tạo điều kiện thuận lợi thời gian em thực luận văn mơn Để hồn thành tốt luận văn này, khơng thể khơng kể đến giúp đỡ thành viên nhóm nghiên cứu từ ngày đầu: Thầy Ths Lữ Thiện Phúc, Ds Nguyễn Nhật Toàn, Ds Võ Thị Cẩm Nhung, bạn sinh viên Dược K40, sv Nguyễn Thị Thanh Tuyền, sv Đào Anh Dũng, sv Nguyễn Thị Hồng Phương, bạn sinh viên Dược K41, sv Phạm Thanh Châu, sv Nguyễn Mỹ Hân, sv Cao Thị Kim Tuyền MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, sơ đồ Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hoạt chất allopurinol tạp liên quan 1.1.1 Allopurinol 1.1.2 Tạp chất D E allopurinol 1.1.3 Tạp chất hydrazin allopurinol 1.2 Hệ thống sắc ký lỏng 1.3 Tình hình nghiên cứu .10 1.3.1 Tình hình nghiên cứu nước 10 1.3.2 Tình hình nghiên cứu giới 13 1.4 Thẩm định qui trình phân tích theo hướng dẫn ICH 17 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3 Đạo đức nghiên cứu 28 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 3.1 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng allopurinol, tạp D, E 29 3.1.1 Khảo sát lựa chọn pha tĩnh 29 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng dung môi pha mẫu 30 3.1.3 Khảo sát bước sóng phân tích 30 3.1.4 Khảo sát lựa chọn pha động 31 3.1.5 Thẩm định quy trình định lượng allopurinol, tạp D, tạp E 34 3.1.6 Ứng dụng quy trình 42 3.2 Xây dựng thẩm định qui trình xác định giới hạn tạp chất hydrazin 43 Chương BÀN LUẬN 49 4.1 Xây dựng thẩm định quy trình định lượng allopurinol, tạp D, E 49 4.1.1 Khảo sát lựa chọn pha tĩnh 49 4.1.2 Khảo sát lựa chọn pha động 50 4.1.3 Khảo sát ảnh hưởng dung môi pha mẫu 52 4.1.4 Khảo sát bước sóng phân tích 52 4.1.5 Thẩm định quy trình định lượng allopurinol, tạp D, tạp E 53 4.1.6 Ứng dụng quy trình 56 4.2 Xây dựng thẩm định qui trình xác định giới hạn tạp chất hydrazin 57 KẾT LUẬN 61 KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt DĐVN Chữ nguyên Ý nghĩa Dược Điển Việt Nam BZD Benzaldehyd Hóa chất CAS Chemical Abstracts Service Số đăng ký CTPT Công thức phân tử DMSO Dimethyl sulfoxide PDAB Paradimethylamino benzaldehyd FDA Food and Drug Administration FID Flame Ionization Detector HLA Human leukocyte antigen ICH IUPAC PDA TTC USP Dung môi hữu Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ Đầu dị ion hóa lửa Kháng ngun bạch cầu người International Conference on Hội nghị Quốc Tế Harmonization hài hòa International Union of Pure and Applied Chemistry Liên minh Quốc Tế hóa học túy hóa học ứng dụng Photo diod array Dãy diod quang Threshold of toxicological Ngưỡng nồng độ gây concerntration độc United States Pharmacopoeia Dược điển Mỹ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 So sánh tính chất tạp D, tạp E hydrazin Bảng 1.2 Quy định thẩm định theo ICH 17 Bảng 2.1 Một số tá dược thường dùng viên nén 21 Bảng 2.2 Quy trình xử lý mẫu sử dụng cột SPE 25 Bảng 2.3 Chất chuẩn dùng nghiên cứu 26 Bảng 2.4 Dung môi sử dụng 27 Bảng 2.5 Trang thiết bị dùng nghiên cứu 27 Bảng 3.1 Khảo sát thành phần pha động 31 Bảng 3.2 Khảo sát tỉ lệ dung môi 32 Bảng 3.3 Khảo sát pH pha động 33 Bảng 3.4 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống mẫu chuẩn 34 Bảng 3.5 Kết độ allopurinol, tạp D E nguyên liệu allopurinol 38 Bảng 3.6 Kết độ allopurinol, tạp D E viên nén allopurinol 39 Bảng 3.7 Kết độ xác, độ xác liên ngày allopurinol, tạp D E nguyên liệu 40 Bảng 3.8 Kết độ xác, độ xác liên ngày allopurinol, tạp D E viên nén 41 Bảng 3.9 Kết định lượng allopurinol, tạp D E mười chế phẩm (n=3) 42 Bảng 3.10 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống mẫu chuẩn (n=6) 46 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo số hợp chất có khung aminopyrazol Hình 1.2 Cơ chế hoạt động allopurinol oxypurinol hình thành axit uric Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng cột pha tĩnh As chất phân tích 29 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng cột pha tĩnh tR chất phân tích 29 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng cột pha tĩnh tR chất phân tích 30 Hình 3.4 Phổ UV-Vis allopurinol, tạp D tạp E 31 Hình 3.5 SKĐ minh họa ảnh hưởng thành phẩn pha động 32 Hình 3.6 SKĐ minh họa ảnh hưởng tỉ lệ pha động 32 Hình 3.7 SKĐ minh họa ảnh hưởng pH pha động 33 Hình 3.8 Sắc ký đồ tương thích hệ thống mẫu chuẩn 34 Hình 3.9 Overlay SKĐ chứng minh tính đặc hiệu 35 Hình 3.10 Độ tinh khiết hệ số phân giải allopurinol sản phẩm phân hủy môi trường NaOH 1N 36 Hình 3.11 Đồ thị tuyến tính allopurinol (trái), tạp D, E (phải) 37 Hình 3.12 Sắc ký đồ minh họa độ nguyên liệu 38 Hình 3.13 Sắc ký đồ minh họa độ thành phẩm viên nén 39 Hình 3.14 Kết định lượng allopurinol, tạp D E chế phẩm … .43 Hình 3.15 Sắc ký đồ xử lý mẫu quy trình 43 Hình 3.16 Sắc ký đồ xử lý mẫu chuẩn xử lý quy trình 44 Hình 3.17 Sắc ký đồ xử lý mẫu thử quy trình 44 Hình 3.18 Sắc ký đồ mẫu chuẩn (1) mẫu thử (2) điều kiện sắc ký chiết thích hợp 45 Hình 3.19 Overlay sắc ký đồ tính tương thích hệ thống mẫu chuẩn 46 Hình 3.20 Overlay độ đặc hiệu 47 Hình 3.21 Độ tinh khiết pic mẫu chuẩn 47 Hình 3.22 Độ tinh khiết pic mẫu thử 48 Hình 3.23 Overlay phổ UV mẫu thử mẫu chuẩn 48 Hình 4.1 Phản ứng phân hủy allopurinol môi trường NaOH 1N 52 Hình 4.2a Kiểm tra độ tinh khiết pic allopurinol 53 Hình 4.2b Kiểm tra độ tinh khiết pic tạp D 54 Hình 4.2c Kiểm tra độ tinh khiết pic tạp E 54 Hình 4.3 Kiểm tra độ tương thích phổ UV-Vis pic allopurinol, tạp D, tạp E mẫu thử so với mẫu chuẩn 55 Hình 4.4 Phản ứng benzaldehyd hydrazine 58 Hình 4.5 Cấu trúc cột SPE SCX/C8 .59 Sơ đồ 1.1 Một giai đoạn tổng hợp allopurinol với tham gia hydrazin làm tác chất ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày 07/05/2007, Thủ tướng phủ ký định số 61/2007/QĐTTg việc phê duyệt “Chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ trọng điểm quốc gia phát triển cơng nghiệp hóa dược đến năm 2020”, khuyến khích nghiên cứu phát triển nguồn nguyên liệu thuốc hóa dược nước nhằm chủ động sản xuất thuốc nước hạ giá thành sản phẩm Nhiều công trình nghiên cứu nhà khoa học nước cho đời nhiều sản phẩm tốt, có tính ứng dụng cao vào thực tiễn sản xuất Trong số phải kể đến nhóm thuốc tim mạch, thuốc kháng sinh, thuốc điều trị đái tháo đường thuốc điều trị bệnh gout [6] Allopurinol thuốc điều trị bệnh gout có tác dụng ức chế men xanthin oxidase FDA chấp thuận sử dụng Hoa Kỳ vào năm 1966, tên thương mại Zyloprim [26] Danh sách Thuốc thiết yếu Tổ chức Y tế Thế giới lần thứ 19 năm 2015 ghi nhận allopurinol số thuốc điều trị tăng uric máu thứ phát hóa trị bệnh bạch cầu hay ung thư với dạng bào chế viên nén 100mg 300mg bên cạnh tác dụng điều trị bệnh gout dạng viên nén 100mg [41] Tuy nhiên tạp chất sản phẩm phân hủy liên quan đến allopurinol sinh trình tổng hợp, sản xuất, bảo quản phân phối Chúng phát sinh từ thuốc phản ứng thuốc với môi trường, với tá dược… Trong đáng lưu ý tạp chất hữu hình thành gia tăng nguyên liệu ban đầu, sản phẩm phụ, sản phẩm trung gian, sản phẩm phân hủy, tác nhân phản ứng, chất xúc tác, đồng phân hình học đồng phân lập thể [38] Theo nghiên cứu tạp chất allopurinol cho thấy tạp chất trung gian D tạo trình tổng hợp, tạp chất E sản phẩm phụ hình thành từ sản phẩm trung gian D với chất tham gia phản ứng PL External Standard Report Page of Method Name: D:\DATA HPLC\MQUAN\Method\Allo, D,E\pH3_Met_AF_f1.met Data: D:\DATA HPLC\MQUAN\Data\Tham dinh QT\Phu luc\UNGDUNG\Mau thu X3_N3.dat vinhtho Acquired: 3/21/2019 5:04:45 PM Printed: 3/31/2019 10:09:18 PM mAU 100 100 DAD-CH1 258 nm Mau thu X3_N3 mAU User: -100 -100 10 20 30 Minutes DAD-CH1 258 nm Results Name Totals Retention Time Area 4.433 64128047 64128047 PL External Standard Report Page of Method Name: D:\DATA HPLC\MQUAN\Method\Allo, D,E\pH3_Met_AF_f1.met Data: D:\DATA HPLC\MQUAN\Data\Tham dinh QT\Phu luc\UNGDUNG\Mau thu X4_N3 User: vinhtho Acquired: 3/21/2019 8:05:32 PM Printed: 3/31/2019 10:13:40 PM 1000 DAD-CH1 258 nm Mau thu X4_N3 500 500 mAU mAU 1000 0 10 15 20 Minutes DAD-CH1 258 nm Results Name Totals Retention Time Area 4.193 60510161 60510161 PL External Standard Report Page of Method Name: D:\DATA HPLC\MQUAN\Method\Allo, D,E\pH3_Met_AF_f1.met Data: D:\DATA HPLC\MQUAN\Data\Tham dinh QT\Phu luc\UNGDUNG\Mau thu X5_N3 User: vinhtho Acquired: 3/22/2019 7:23:47 PM Printed: 3/31/2019 10:21:07 PM 1000 DAD-CH1 258 nm Mau thu X5_N3 500 500 mAU mAU 1000 0 10 20 30 Minutes DAD-CH1 258 nm Results Name Totals Retention Time Area 4.68 64421389 64421389 PL External Standard Report Page of Method Name: D:\DATA HPLC\MQUAN\Method\Allo, D,E\pH3_Met_AF_f1.met Data: D:\DATA HPLC\MQUAN\Data\Tham dinh QT\Phu luc\UNGDUNG\Mau thu X6_N3.dat vinhtho Acquired: 3/22/2019 9:43:42 PM Printed: 3/31/2019 10:27:34 PM mAU 1000 1000 DAD-CH1 258 nm Mau thu X6_N3 500 500 mAU User: 0 10 15 20 Minutes DAD-CH1 258 nm Results Name Totals Retention Time Area 4.547 65472671 65472671 PL External Standard Report Page of Method Name: D:\DATA HPLC\MQUAN\Method\Allo, D,E\pH3_Met_AF_f1.met Data: D:\DATA HPLC\MQUAN\Data\Tham dinh QT\Phu luc\UNGDUNG\Mau thu X7_N3.dat vinhtho Acquired: 3/23/2019 9:38:04 PM Printed: 3/31/2019 10:32:19 PM mAU 1000 1000 DAD-CH1 258 nm Mau thu X7_N3 500 500 mAU User: 0 10 20 30 Minutes DAD-CH1 258 nm Results Name Totals Retention Time Area 4.58 61003053 61003053 PL External Standard Report Page of Method Name: D:\DATA HPLC\MQUAN\Method\Allo, D,E\pH3_Met_AF_f1.met Data: D:\DATA HPLC\MQUAN\Data\Tham dinh QT\Phu luc\UNGDUNG\Mau thu X8_N3.dat vinhtho Acquired: 3/23/2019 11:44:10 PM Printed: 3/31/2019 10:36:16 PM mAU 1000 1000 DAD-CH1 258 nm Mau thu X8_N3 500 500 mAU User: 0 10 20 30 Minutes DAD-CH1 258 nm Results Name Totals Retention Time Area 4.60 54178475 54178475 PL External Standard Report Page of Method Name: D:\DATA HPLC\MQUAN\Method\Allo, D,E\pH3_Met_AF_f1.met Data: D:\DATA HPLC\MQUAN\Data\Tham dinh QT\Phu luc\UNGDUNG\Mau thu X11_N3.dat vinhtho Acquired: 3/31/2019 12:16:29 AM Printed: 3/31/2019 10:40:44 PM mAU 1000 1000 DAD-CH1 258 nm Mau thu X11_N3 500 500 mAU User: 0 10 20 30 Minutes DAD-CH1 258 nm Results Name Totals Retention Time Area 4.187 55965927 55965927 PL External Standard Report Page of Method Name: D:\DATA HPLC\MQUAN\Method\Allo, D,E\pH3_Met_AF_f1.met Data: D:\DATA HPLC\MQUAN\Data\Tham dinh QT\Phu luc\UNGDUNG\Mau thu X12_N3.dat User: vinhtho Acquired: 3/31/2019 2:16:33 AM Printed: 3/31/2019 10:44:46 PM 500 500 mAU 1000 mAU 1000 0 10 20 30 Minutes DAD-CH1 258 nm Results Name Totals Retention Time Area 4.220 47791693 47791693 PL External Standard Report Page of Method Name: D:\DATA HPLC\MQUAN\Method\Allo, D,E\Methanol _H2O 50_50.met Data: D:\DATA HPLC\MQUAN\Data\hydrazin\KQ_SPE SCX_C8\TDQT\tham dinh\TTHT\Chuan_TTHT-Rep1.dat User: vinhtho Acquired: 10/18/2018 11:17:51 AM Printed: 3/31/2019 8:22:35 PM DAD-CH1 300 nm C3_TTHT 200 200 mAU 400 mAU 400 0 10 Minutes DAD-CH1 300 nm Results Name Retention Area Time Theoretical Capacity Resolution plates (USP) factor (USP) Asymmetry Benzaldehyd 3.99 2272658 4472 2.99 3.65 1.28 Benzaldehyd 7.65 20701618 6522 6.65 11.83 1.26 azin Totals 23265860 PL External Standard Report Page of Method Name: D:\DATA HPLC\MQUAN\Method\Allo, D,E\ Methanol _H2O 50_50.met Data: D:\DATA HPLC\MQUAN\Data\hydrazin\KQ_SPE SCX_C8\TDQT\tham dinh\TTHT\Chuan_TTHT-Rep2.dat User: vinhtho Acquired: 10/18/2018 11:29:26 AM Printed: 3/31/2019 8:27:51 PM DAD-CH1 300 nm C3_TTHT 200 200 mAU 400 mAU 400 0 10 Minutes DAD-CH1 300 nm Results Name Retention Area Time Theoretical Capacity Resolution plates (USP) factor (USP) Asymmetry Benzaldehyd 3.99 2303456 4470 2.99 3.67 1.22 Benzaldehyd 7.57 20812009 6744 6.57 11.78 1.22 azin Totals 23403535 PL External Standard Report Page of Method Name: D:\DATA HPLC\MQUAN\Method\Allo, D,E\ Methanol _H2O 50_50.met Data: D:\DATA HPLC\MQUAN\Data\hydrazin\KQ_SPE SCX_C8\TDQT\tham dinh\TTHT\Chuan_TTHT-Rep3.dat User: vinhtho Acquired: 10/18/2018 11:41:06 AM Printed: 3/31/2019 8:30:52 PM DAD-CH1 300 nm C3_TTHT 200 200 mAU 400 mAU 400 0 10 Minutes DAD-CH1 300 nm Results Name Retention Area Time Theoretical Capacity Resolution plates (USP) factor (USP) Asymmetry Benzaldehyd 3.98 2430936 4362 2.98 3.89 1.17 Benzaldehyd 7.50 20887549 6610 6.50 11.54 1.21 azin Totals 23545348 PL External Standard Report Page of Method Name: D:\DATA HPLC\MQUAN\Method\Allo, D,E\ Methanol _H2O 50_50.met Data: D:\DATA HPLC\MQUAN\Data\hydrazin\KQ_SPE SCX_C8\TDQT\tham dinh\TTHT\Chuan_TTHT-Rep4.dat User: vinhtho Acquired: 10/18/2018 11:52:38 AM Printed: 3/31/2019 8:33:59 PM DAD-CH1 300 nm C3_TTHT 200 200 mAU 400 mAU 400 0 10 Minutes DAD-CH1 300 nm Results Name Retentio Area n Time Theoretical Capacity Resolution plates (USP) factor (USP) Asymmetry Benzaldehyd 3.98 2338154 4404 2.98 3.74 1.21 Benzaldehyd azin 7.46 20770668 6763 6.46 11.55 1.21 Totals 23309505 PL External Standard Report Page of Method Name: D:\DATA HPLC\MQUAN\Method\Allo, D,E\ Methanol _H2O 50_50.met Data: D:\DATA HPLC\MQUAN\Data\hydrazin\KQ_SPE SCX_C8\TDQT\tham dinh\TTHT\Chuan_TTHT-Rep5.dat User: vinhtho Acquired: 10/18/2018 12:04:11 PM Printed: 3/31/2019 8:47:59 PM DAD-CH1 300 nm C3_TTHT 200 200 mAU 400 mAU 400 0 10 Minutes DAD-CH1 300 nm Results Name Retention Area Time Theoretical Capacity Resolution plates (USP) factor (USP) Asymmetry Benzaldehyd 3.97 2240853 4510 2.97 3.86 1.14 Benzaldehyd 7.41 20712156 6757 6.41 11.65 1.22 azin Totals 23117174 PL External Standard Report Page of Method Name: D:\DATA HPLC\MQUAN\Method\Allo, D,E\ Methanol _H2O 50_50.met Data: D:\DATA HPLC\MQUAN\Data\hydrazin\KQ_SPE SCX_C8\TDQT\tham dinh\TTHT\CHUAN_TTHT-Rep6.dat User: vinhtho Acquired: 10/18/2018 12:45:09 PM Printed: 3/31/2019 8:51:23 PM DAD-CH1 300 nm C3_TTHT 200 200 mAU 400 mAU 400 0 10 Minutes DAD-CH1 300 nm Results Name Retention Area Time Theoretical Capacity Resolution plates (USP) factor (USP) Asymmetry Benzaldehyd 3.96 2284754 4455 2.96 3.51 1.20 Benzaldehyd 7.33 20679651 6742 6.33 11.48 1.21 azin Totals 23238948 PL External Standard Report Page of Method Name: D:\DATA HPLC\MQUAN\Method\Met_H2O_50_50.met Data: D:\DATA HPLC\MQUAN\Data\hydrazin\KQ_SPE SCX_C8\TDQT\tham vinhtho Acquired: 11/6/2018 4:15:22 PM Printed: 4/7/2019 6:29:59 PM mAU User: 100 100 50 50 0 mAU dinh\LOQ.dat 10 Minutes DAD-CH1 300 nm Results Retention Time Name S/N (ASTM) 4.00 Benzaldehyd 0.00 7.33 Benzaldehyd azin 10.31 Totals ... tạp chất liên quan D, E hydrazin có thuốc allopurinol phương pháp sắc ký lỏng? ?? Mục tiêu đề tài Xây dựng quy trình định lượng allopurinol, tạp chất liên quan D, E hydrazin allopurinol Thẩm định. .. nén phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Tạp hydrazin quy định riêng xác định phương pháp sắc ký lỏng [2], [10], [38] Việc nghiên cứu nhằm định lượng tạp D, E hydrazin có thành phẩm nguyên liệu allopurinol, ... Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hoạt chất allopurinol tạp liên quan 1.1.1 Allopurinol 1.1.2 Tạp chất D E allopurinol 1.1.3 Tạp chất hydrazin allopurinol