Phân tích axit amin và vitamin c trong sinh khối nấm linh chi đen (amauroderma niger lloyd) nuôi cấy trên môi trường lỏng

664 TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA HÓA HỌC TRẦN THỊ HƢƠNG SEN PHÂN TÍCH AXIT AMIN VÀ VITAMIN C TRONG SINH KHỐI NẤM LINH CHI ĐEN (AMAURODERMA NIGER LLOYD) NUÔI CẤY TRÊN MÔI TRƢỜNG LỎNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Vinh – 2013 TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH KHOA HÓA HỌC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN TÍCH AXIT AMIN VÀ VITAMIN C TRONG SINH KHỐI NẤM LINH CHI ĐEN (AMAURODERMA NIGER LLOYD) NUÔI CẤY TRÊN MÔI TRƢỜNG LỎNG Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Trần Đình Thắng Sinh viên thực hiện: Trần Thị Hương Sen Lớp: 50K - Công nghệ thực phẩm Vinh – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập -Tự -Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Trần Thị Hương Sen Khóa : 50 MSSV : 0952040421 Ngành : Cơng nghệ thực phẩm 1.Tên đề tài: Phân tích axit amin vitamin C sinh khối nấm linh chi đen (Amauroderma niger Lloyd) nuôi cấy môi trƣờng lỏng Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Cán hướng dẫn : PGs- TS Trần Đình Thắng Ngày giao nhiệm vụ đồ án : Ngày tháng năm 2013 Ngày hoàn thành đồ án Ngày tháng năm 2013 : Ngày tháng năm 2013 Chủ nhiệm môn Cán hƣớng dẫn (Ký ghi rõ họ tên) (Ký, ghi rõ họ tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án vào ngày tháng năm 2013 Ngƣời duyệt (Ký ghi rõ họ tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Trần Thị Hƣơng Sen Khóa Mssv:0952040421 Ngành: Cơng nghệ thực phẩm : 50 Cán hướng dẫn : PGs- TS Trần Đình Thắng Cán duyệt : Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Nhận xét cán hƣớng dẫn: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Ngày tháng năm 2013 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Trần Thị Hƣơng Sen Khóa: Mssv: 0952040421 Ngành: Công nghệ thực phẩm 50 Cán hướng dẫn: PGs- TS Trần Đình Thắng Cán duyệt: Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Nhận xét cán duyệt: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Ngày tháng năm 2013 Cán duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an LỜI CẢM ƠN Đồ án thực phịng thí nghiệm Vi sinh, thí nghiệm Hóa thực phẩm Trung tâm Phân tích – Chuyển giao Công nghệ thực phẩm Môi trường, Trường Đại học Vinh Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp ngồi cố gắng thân nhận nhiều giúp đỡ cá nhân tập thể Trước hết tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS.Trần Đình Thắng – Phó trưởng khoa Hóa, Trường Đại học Vinh tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình thực đề tài viết luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Thầy Cô Bộ mơn Hóa thực phẩm, khoa Hóa, Trung tâm Thực hành Thí nghiệm - Trường Đại học Vinh tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tơi q trình học tập thực đề tài Qua xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân bạn bè khích lệ, động viên giúp đỡ tơi suốt thời gian qua Thay lời cảm ơn lần xin gửi đến Thầy Cô toàn thể anh chị bạn lời chúc tốt đẹp Vinh, tháng 01 năm 2014 Sinh viên Trần Thị Hƣơng Sen Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Đối tượng nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Nấm linh chi đen 1.1.1 Đặc điểm chung nấm linh chi đen 1.1.2 Vị trí phân loại .4 1.1.3 Chu trình sống điều kiện sống nấm linh chi đen 1.1.4 Thành phần hóa học hoạt chất sinh học nấm linh chi đen 1.1.5 Giới thiệu sơ lược số thành phần dinh dưỡng sinh khối nấm linh chi đen 1.1.6 Một số tác dụng nấm linh chi đen 14 1.2 Phân tích axit amin vitamin C sinh khối nấm linh chi đen phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) .17 1.2.1 Cơ sở lý thuyết .17 1.2.2 Nguyên tắc trình sắc ký cột 17 1.2.3 Phân loại 18 1.2.4 Cấu tạo hệ thống HPLC 19 1.2.5 Các đại lượng đặc trưng HPLC .22 1.2.6 Cách đo HPLC .24 Chƣơng 2: THỰC NGHIỆM 25 2.1 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất mơi trường sử dụng 25 2.1.1 Thiết bị 25 2.1.2 Dụng cụ 25 2.1.3 Hóa chất mơi trường sử dụng 25 2.2 Kỹ thuật thực nghiệm 26 2.2.1 Kỹ thuật nuôi cấy .26 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 2.2.2 Kĩ thuật phân tích 27 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Kết nuôi cấy .33 3.1.1 Sự sinh trưởng phát triển sinh khối nấm linh chi đen môi trường thạch PDA 33 3.1.2 Sự sinh trưởng phát triển sinh khối nấm linh chi đen loại môi trường lỏng 33 3.2 Kết phân tích 35 3.2.1 Axit amin .35 3.2.2 Vitamin C 44 KẾT LUẬN 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH SÁCH BẢNG BIỂU Trang Bảng 1.1 Điều kiện môi trường cần thiết cho phát triển nấm linh chi đen[1] Bảng 1.2 Các hoạt chất sinh học dẫn xuất nấm linh chi đen Bảng 1.3 Các hoạt chất triterpenoit có tác dụng chữa bệnh nấm linh chi (Lê Xuân Thám, 1996) Bảng 2.1 Thành phần môi trường sử dụng nuôi cấy 26 Bảng 3.1 : Khối lượng sinh khối sợi nấm tươi (tính gam: g) hai loại mơi trường lỏng (Mỗi mơi trường lấy bình song song) 34 Bảng 3.2 : Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ axit aspartic .37 Bảng 3.3 Nồng độ đo qua lần đo nồng độ khác 10pmol, 25pmol, 100pmol giá trị LOD, LOQ axit aspartic 40 Bảng 3.4 Giá trị LOD LOQ axit amin 41 Bảng 3.5 Hàm lượng axit amin 1g sinh khối nấm linh chi đen .43 Bảng 3.6 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ chuẩn vitamin C .47 Bảng 3.7 Nồng độ chuẩn vitamin C đo qua lần đo nồng độ khác 5ppm, 10ppm, 20ppm, 50ppm 48 Bảng 3.8 Giá trị LOD LOQ .48 Bảng 3.9 Hàm lượng vitamin C sinh khối nấm .49 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH SÁCH HÌNH VẼ Trang Hình 1.1 Hình thái thể nấm linh chi đen Hình 1.2 Chu trình phát triển nấm linh chi [1] Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC .19 Hình 3.1 Sự phát triển sinh khối nấm linh chi đen lan hết đĩa môi trường thạch PDA sau ngày .33 Hình 3.2 Sự phát triển sinh khối nấm linh chi đen loại môi trường lỏng sau 20 ngày 34 Hình 3.3 Khối lượng sinh khối trung bình sợi nấm linh chi tươi môi trường ME, PG + Khoáng + Pepton 34 Hình 3.4 Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin nồng độ 10pmol 35 Hình 3.5 Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin nồng độ 25pmol 36 Hình 3.6 Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin nồng độ 100pmol 36 Hình 3.7 Sắc đồ hỗn hợp 16 axit amin sinh khối nấm linh chi đen 42 Hình 3.8 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 5ppm 45 Hình 3.9 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 10ppm 45 Hình 3.10 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 20ppm 46 Hình 3.11 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 50ppm 46 Hình 3.12 Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic thu nồng độ chuẩn vitamin C 47 Hình 3.13 Sắc đồ vitamin C sinh khối nấm linh chi đen .49 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 10 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Glu: y = 62,69125x + 263,33105 Ser: y = 84,49167x + 193,64351 R2 = 0,99925 R = 0,99893 His: y = 61,99555x + 39,04232 Gly: y = 84,82661x + 137.90590 R2 = 0,99989 Thr: y = 88,61426x + 129,31682 R2 = 0,99957 Ala: y = 81,55369x + 153,46259 R2 = 0,99968 R2 = 0,99949 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 38 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Arg: y = 90,39369x + 279,05025 Tyr: y = 82,72156x + 131,60838 R2 = 0,99951 R2 = 0,99961 Cys – SS – Cys: y = 33,76513x + 35,36127 Val: y = 87,66077x + 261,1288 R2 = 0,99951 Met: y = 98,27722x + 264,61287 R2 = 0,99945 Phe: y = 65,24065x + 649,86865 R2 = 0,99960 R2 = 0,99627 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 39 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Ile: y = 87,61079x + 68,4958 Leu: y = 90,33318x + 261,08487 R2 = 0,99991 R2 = 0,99975 Lys: y = 31,78382x + 66,57235 Pro: y =53,82445x – 13,40806 R2 = 0,99975 R2 = 0,99894 Xác định giá trị LOD LOQ: Ta có giá trị LOD LOQ axit aspatic xác đinh sau: Bảng 3.3 Nồng độ đo qua lần đo nồng độ khác 10pmol, 25pmol, 100pmol giá trị LOD, LOQ axit aspartic Nồng độ Nồng độ đo đƣợc (Xi) Sy Lần Lần 10pmol 10,2864 9,9748 10,0034 0,1722 25pmol 25,9436 24,9978 25,0704 0,5263 100pml 99,4375 99,8432 100,843 0,7234 chuẩn Lần Sy(tb) LOD LOQ 0,4740 0,0270 0,0900 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 40 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Với: Độ lệch chuẩn Sy : Sy =  ( Xi  Xtb )2 Xtb = n 1  Xi , n Xi : nồng độ đo axit amin lần chạy thứ i Xtb : nồng độ trung bình n lần chạy n : số lần chạy lặp lại LOD = * Sy m LOQ = 10 * LOD m : hệ số góc phương trình hồi quy Tương tự ta có giá trị LOD LOQ 16 axit amin lại ta kết bảng sau : Bảng 3.4 Giá trị LOD LOQ axit amin TT Tên Axit amin LOD LOQ 10 11 12 13 14 15 16 Glu Ser His Gly Thr Ala Arg Tyr Cys-SS-Cys Val Met Phe Ile Leu Lys Pro 0,0250 0,0156 0,0240 0,0214 0,0207 0,0219 0,0158 0,0198 0,0455 0,0513 0,0146 0,0183 0,0159 0,0155 0,046 0,0285 0,0830 0,0520 0,0800 0,0713 0,0690 0,0730 0,0526 0,0660 0,1516 0,0510 0,0480 0,0610 0,0530 0,0516 0,1530 0,0950 Qua bảng số liệu ta thấy phương pháp có khoảng giới hạn phát khoảng định lượng nhỏ chứng tỏ thiết bị có độ nhạy cao, phát hàm lượng axit amin dạng vết có mẫu phân tích Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 41 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 3.2.1.2 Xử lý kết Kết thu sau: - Sắc đồ Hình 3.7 Sắc đồ hỗn hợp 16 axit amin sinh khối nấm linh chi đen Dựa vào kết sắc ký ta có: - Hàm lượng axit amin(µg/g) có sinh khối nấm tính theo cơng thức sau: C= Co x Vđm x f m Trong đó: C nồng độ axit amin có mẫu tính µg/g Co nồng độ axit amin dịch chiết tính từ đường chuẩn, tính theo (µg/l) m khối lượng mẫu lấy để phân tích (g) f hệ số pha lỗng Vđm: Thể tích dịch cuối (ml) Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 42 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Từ ta có hàm lượng axit amin(µg/g) có 1g sinh khối nấm linh chi đen sau: Bảng 3.5 Hàm lượng axit amin 1g sinh khối nấm linh chi đen TT Tên axit amin Co(pmol/µl) Co(µg/l) Hàm lƣợng C (µg/g) Asp 16,85538 2241,76554 112,0883 Glu 28,54612 4196,27964 209,814 Ser 10,66454 1119,7767 55,9888 His 2,57786 399,5683 19,9784 Gly 16,80777 1260,58275 63,0291 Thr 8,45974 1006,70906 50,3355 Ala 26,20765 2332,48085 116,264 Arg 9,89403 1721,56122 86,0780 Tyr 3,05919 553,71339 27,6856 10 Cys – ss – Cys 12,54139 1517,50819 75,8754 11 Val 9,37198 1096,52166 54,8260 12 Met 1,79443 267,37007 13,3675 13 Ile - - - 14 Phe 11,71592 1933,1268 96,6563 15 Leu 11,36963 1489,42153 74,4710 16 Lys 7,80760 1139,9096 56,9954 17 Pro 23,32151 2681,97365 134,0986 200,99474 24958,26895 1247,5519 Tổng Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 43 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng đổi đơn vị tính hàm lượng axit amin Axit amin Đơn vị Asp 1pmol/µl = 133 x 10-12 g/10-6l = 133µg/l Glu 1pmol/ µl = 147µg/l Ser 1pmol/ µl = 105 µg /l His 1pmol/ µl = 155 µg /l Gly 1pmol/ µl = 75 µg /l Thr 1pmol/ µl = 119 µg /l Ala 1pmol/ µl = 89 µg /l Arg 1pmol/ µl = 174 µg /l Tyr 1pmol/ µl = 181 µg /l Cys – ss – Cys 1pmol/ µl = 121 µg /l Val 1pmol/ µl = 117 µg /l Met 1pmol/ µl = 149 µg /l Ile 1pmol/ µl = 165 µg /l Phe 1pmol/ µl = 131 µg /l Leu 1pmol/ µl = 131 µg /l Lys 1pmol/ µl = 115 µg /l Pro 1pmol/ µl = 146 µg /l 3.2.2 Vitamin C 3.2.2.1 Xây dựng đường chuẩn biểu diễn phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ Để xác định đường chuẩn ta chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn biết xác nồng độ Cụ thể chuẩn bị dãy chuẩn vitamin C có nồng độ 5ppm, 10ppm, 20ppm, 50ppm Bơm vào máy HPLC cài đặt chương trình đo kết sau: Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 44 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 3.8 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 5ppm Hình 3.9 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 10ppm Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 45 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 3.10 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 20ppm Hình 3.11 Sắc đồ mẫu chuẩn có nồng độ 50ppm Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 46 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng 3.6 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ chuẩn vitamin C Nồng Diện tích pic độ Lần Lần Lần 78,05327 78,14250 77,98865 10 160,60375 160,63390 160,64068 20 346,72051 346,86193 346,76569 50 898,75709 898,87325 898,91066 chuẩn M B R2 18,325 - 18,319 0,9999 Dựa vào bảng ta có phương trình đường chuẩn xác định hàm lượng vitamin C sau: Phương trình hồi quy đường chuẩn theo diện tích pic có dạng: y = mx +b x nồng độ, y diện tích pic m = 18,325 b = - 18,319 Hệ số hồi quy tuyến tính R2 =0,9999 Ta có phương trình đường chuẩn vitamin C sau : y = 18,325x – 18,319, R2 =0,9999 Hình 3.12 Đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic thu nồng độ chuẩn vitamin C Xác định giá trị LOD, LOQ: Ta có giá trị LOD, LOQ vitamin C xác đinh sau: Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 47 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng 3.7 Nồng độ chuẩn vitamin C đo qua lần đo nồng độ khác 5ppm, 10ppm, 20ppm, 50ppm Nồng độ Nồng độ đo đƣợc (Xi) chuẩn Lần Lần Lần Sy 5,2590 5,2639 5,2555 0,00422 10 9,7639 9,7655 9,7659 0,00105 20 19,9203 19,9280 19,9228 0,00392 50 50,0450 50,0514 50,0534 0,00438 Sy(tb) 0,00339 Với: Độ lệch chuẩn Sy : Sy =  ( Xi  Xtb )2 Xtb = n 1  Xi n Xi : nồng độ vitamin C lần chạy thứ i Xtb : nồng độ trung bình n lần chạy n : số lần chạy lặp lại Giá trị LOD LOQ phương pháp qua lần đo nồng độ 5ppm, 10ppm, 20ppm, 50ppm ta kết bảng sau: Bảng 3.8 Giá trị LOD LOQ Giá trị Chuẩn vitamin C(ppm) LOD 0,00055 LOQ 0,00183 Với: LOD = * Sy m LOQ = 10 * LOD m : hệ số góc phương trình hồi quy Qua bảng số liệu ta thấy phương pháp có khoảng giới hạn phát khoảng định lượng nhỏ chứng tỏ thiết bị có độ nhạy cao, phát hàm lượng vitamin C dạng vết có mẫu phân tích Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 48 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 3.2.2.2 Xử lý kết Kết thu sau: - Sắc đồ: Hình 3.13 Sắc đồ vitamin C sinh khối nấm linh chi đen Từ giá trị diện tich pic đo từ đường chuẩn ta tính hàm lượng vitamin C ( Co mg/l) Sau ta tính hàm lượng vitamin C (mg/g) có mẫu nấm theo công thức sau: C= Co x Vđm x f m Trong đó: C: Hàm lượng axid ascorbic mẫu thử tính theo (mg/kg) Co: Nồng độ vitamin C dịch chiết tính từ đường chuẩn, tính theo (mg/l) m: khối lượng mẫu phân tích (g) Vđm: Thể tích dịch cuối (ml) Bảng 3.9 Hàm lượng vitamin C sinh khối nấm Diện tích pic Co (mg/l) 150.21054 8.90981 Khối lượng mẫu(g) 10 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 49 V(ml) C(mg/kg) 25 22,274 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an KẾT LUẬN Đề tài đạt đƣợc kết sau: - Khi nuôi cấy môi trường thạch PDA, hệ sợi nấm phát triển lan hết đĩa ngày - Khi nuôi cấy mơi trường ME, PG + Khống + Pepton ME thu nhận sinh khối lớn hơn, hệ sợi nấm phát triển nhanh Đối với môi trường ME, khối lượng sinh khối trung bình hệ sợi nấm tươi 23,452 (g) cịn mơi trường PG + Khống + Pepton 17,302 (g) - Phân tích thành phần axit amin, vitamin C sinh khối nấm linh chi đen nuôi cấy môi trường lỏng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) + Đã nghiên cứu quy trình xác định hàm lượng axit amin vitamin C + Đã xây dựng phương trình đường chuẩn 17 loại axit amin vitamin C + Phát thấy hàm lượng 16 loại axit amin sinh khối nấm linh chi đen, có 7/8 loại axit amin thiết yếu cần thiết cho người lớn + Hàm lượng axit amin tương đối lớn Cụ thể :  Tổng lượng axit amin 1g sinh khối nấm linh chi đen 1247,5519 µg/g  Loại axit amin có hàm lượng lớn axit Glutamic (209,814 µg/g)  Với loại axit amin thiết yếu phenylalanin có hàm lượng lớn (96,6563 µg/g ) + Phát thấy hàm lượng vitamin C : 22,274 (mg/kg) + Đã xác định giới hạn phát hiện, giới hạn xác định axit amin, vitamin C Hạn chế đề tài - Chưa nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh trưởng phát triển sinh khối nấm linh chi đen loại môi trường - Chưa tiến hành phân tích hàm lượng axit amin, vitamin C phương pháp phân tích khác - Mong muốn tiếp tục nghiên cứu đánh giá thành phần axit amin vitamin nhiều loại nấm linh chi khác để khẳng định giá trị loại nấm dược liệu Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 50 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Lân Dũng (2001) Công nghệ nuôi trồng nấm, tập Nhà xuất Nông nghiệp, Hà nội Nguyễn Hữu Đống Đinh Xuân Linh (2000) Nấm ăn nấm dược liệu - công dụng công nghệ nuôi trồng Nhà xuất Hà nội Nguyễn Hữu Đống, Nguyễn Thị Sơn Zani Federico (2002) Cơ sở khoa học công nghệ nuôi trồng Nhà xuất Nông nghiệp, Hà nội Trần Hùng (2004) Phương pháp nghiên cứu dược liệu Đại học Y Dược TP.HCM Trịnh Tam Kiệt (1983) Nấm lớn Việt Nam Trần Bích Lam, Thì nghiệm hóa sinh thực phẩm, Nhà xuất Đại hoc Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Phạm Luân (1999) Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu suất cao Đại học quốc gia Hà Nội Nguyễn Đức Lương, Thí Nghiệm cơng nghệ sinh học, Nhà xuất Đại hoc Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng (2003) Vi sinh học công nghiệp, tập Nhà xuất Đại học Quốc Gia TP.HCM 10 Trần Văn Mão (2004) Nuôi trồng chế biến nấm ăn nấm làm thuốc chữa bệnh Nhà xuất Nơng nghiệp, Hà nội 11 Hồng Minh Châu, Từ Vọng Nghi, Từ Văn Mặc Cơ sở hóa học phân tích Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật 12 Nguyễn Phước Nhuận (2001) Giáo trình sinh hố học, phần Nhà xuất Đại học Quốc Gia TPHCM 13 Lê Xuân Thám (1996) Nghiên cứu đặc điểm sinh học đặc điển hấp thu khoáng nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr).Karst Luận án phó tiến sỹ khoa học sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà nội, Việt nam 14 Lê Xuân Thám (1996) Nấm Linh chi - dược liệu quí việt nam Nhà xuất mủi cà mau Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 51 C.33.44.55.54.78.65.5.43.22.2.4 22.Tai lieu Luan 66.55.77.99 van Luan an.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.C.33.44.55.54.78.655.43.22.2.4.55.22 Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd 77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77.77.99.44.45.67.22.55.77.C.37.99.44.45.67.22.55.77t@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn