Chương Proteins Copyright © 2009 Pearson Education, Inc Nội dung • • • • • • • • • • 4.1 Giới thiệu Protein 4.2 Protein sản phẩm công nghệ sinh học 4.3 Cấu trúc protein 4.4 Sản xuất protein 4.5 Các phương pháp tinh protein 4.6 Kiểm tra 4.7 Bảo quản Protein 4.8 Tăng quy mơ q trình tinh protein 4.9 Phương pháp phân tích sau tinh 4.10 Proteomics Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.1 Giới thiệu protein sản phẩm sinh học • Các phân tử lớn cần thiết cho cấu trúc, chức điều hòa tế bào sống • 2000 NIH đưa Sáng kiến Cấu trúc Protein – Nỗ lực xác định cấu trúc protein người Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.2 Proteins sản phẩm Cơng nghệ sinh học • Sử dụng protein sản xuất công nghệ thời gian thử nghiệm – Nấu bia nấu rượu – Làm mát • Cơng nghệ DNA tái tổ hợp giúp sản xuất protein cụ thể theo yêu cầu – Enzyme: protein tăng tốc độ phản ứng hóa học – Nội tiết tố – Kháng thể Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.2 Proteins sản phẩm Cơng nghệ sinh học • Chế tạo thuốc công nghệ sinh học – Được sản xuất thông qua q trình lên men vi sinh vật ni cấy tế bào động vật có vú – Q trình phức tạp tốn thời gian – Phải tuân thủ nghiêm ngặt quy định FDA tất giai đoạn quy trình Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.2 Proteins sản phẩm Công nghệ sinh học • Các ứng dụng Protein – – – – – – – – Công nghiệp Ứng dụng y tế Chế biến thức ăn Hàng dệt may đồ da Chất tẩy rửa Sản xuất tái chế giấy Chất kết dính: keo tự nhiên Xử lý sinh học: xử lý nhiễm protein Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.3 Cấu trúc Protein • Protein – Là phân tử phức tạp xây dựng từ chuỗi axit amin – Có điện tích khiến chúng tương tác với nguyên tử phân tử khác • Ưa nước - ưa nước • Kỵ nước - ghét nước Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.3 Cấu trúc Protein • Sắp xếp cấu trúc - bốn cấp độ – Cấu trúc trình tự axit amin liên kết với – Cấu trúc bậc hai xảy chuỗi axit amin gấp xoắn điểm cụ thể • Các vịng xoắn alpha trang tính beta – Cấu trúc bậc ba hình thành cấu trúc thứ cấp kết hợp gắn kết với – Cấu trúc bậc bốn phức hợp ba chiều, hình cầu, độc xây dựng từ số polypeptit Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.3 Protein Structures Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.3 Protein Structures • Protein gấp – Cấu trúc chức protein phụ thuộc vào trình gấp protein – Nếu protein gấp không cách, chức mong muốn protein bị protein gấp sai gây bất lợi – 1951, hai cấu trúc thơng thường mơ tả • Các vịng xoắn alpha trang tính beta • Cấu trúc dễ vỡ; liên kết hydro dễ bị phá vỡ Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.5 Phương pháp tinh protein • Tách thành phần phần trích xuất – Sự khác biệt protein cho phép tách protein mục tiêu khỏi protein khác • Sắc ký - cho phép phân loại protein dựa kích thước cách chúng bám vào hòa tan chất khác Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.5 Phương pháp tinh protein • Tách thành phần dịch chiết – Sắc ký • Size exclusion chromatography (SEC) – sử dụng hạt gel với lỗ – Các protein lớn di chuyển xung quanh hạt protein nhỏ trượt qua lỗ di chuyển chậm qua hạt Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.5 Phương pháp tinh protein Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.5 Phương pháp tinh protein • Tách thành phần dịch chiết – Sắc ký • Ion exchange chromatography – phụ thuộc vào điện tích protein – Resin tích điện – Các protein tích điện trái dấu dính vào hạt nhựa – Có thể rửa giải cách thay đổi điện tích muối có nồng độ tăng dần Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.5 Phương pháp tinh protein Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.5 Phương pháp tinh protein • Tách thành phần dịch chiết – Sắc ký • Affinity chromatography dựa vào khả protein liên kết đặc biệt thuận nghịch với hợp chất có hình dạng độc đáo gọi phối tử Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.5 Phương pháp tinh protein • Tách thành phần dịch chiết – Sắc ký • Hydrophobic interaction chromatography (HIC) • Sắc ký tương tác kỵ nước (HIC) xếp protein sở lực đẩy nước chúng Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.5 Phương pháp tinh protein Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.5 Phương pháp tinh protein • Tách thành phần dịch chiết – Iso-electric focusing Tập trung đẳng điện sử dụng QC để xác định hai loại protein giống mà khó phân tách phương tiện khác • Mỗi protein có số lượng axit amin tích điện cụ thể bề mặt vị trí cụ thể • Tạo ký hiệu điện gọi điểm đẳng điện (IEP) nơi điện tích protein phù hợp với độ pH dung dịc Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.5 Phương pháp tinh protein • Tách thành phần phần trích xuất – Phương pháp phân tích • Sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC) - sử dụng áp suất cao để ép chất chiết qua cột thời gian ngắn • Khối phổ - phương pháp có độ nhạy cao sử dụng để phát nguyên tố vi lượng – Được sử dụng để kích thước đặc điểm nhận dạng hầu hết đoạn protein Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.6 Kiểm tra • Sự diện nồng độ protein quan tâm phải xác minh bước trình tinh chế – SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) – Western blotting – ELISA Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.7 Bảo quản Protein • Đông khô (đông khô) – Protein, thường sản phẩm lỏng, đông lạnh – Chân không sử dụng để đẩy nhanh bay nước từ chất lỏng – Sẽ trì cấu trúc protein bảo quản nhiệt độ phịng thời gian dài Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.8 Tăng quy mơ tinh protein • Các quy trình thường thiết kế phịng thí nghiệm quy mơ nhỏ • Phải mở rộng quy mơ sản xuất • Quy trình FDA phê duyệt phải đảm bảo quy trình phịng thí nghiệm mở rộng Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.9 Phương pháp phân tích sau tinh • Giải trình tự protein – Xác định cấu trúc sơ cấp, trình tự amino acids • X-ray Crystallography – Sử dụng để xác định cấu trúc phức tạp cấp cấp Copyright © 2009 Pearson Education, Inc 4.10 Proteomics • Một chuyên ngành khoa học dành riêng cho việc tìm hiểu mối quan hệ phức tạp bệnh tật biểu protein – Sử dụng vi phân tử protein để kiểm tra thay đổi biểu protein trạng thái khỏe mạnh bệnh tật Copyright © 2009 Pearson Education, Inc