Nghiên cứu bào chế dược liệu tam thất chế (panax notoginseng)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH DƯƠNG DIỄM MAI NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ DƯỢC LIỆU TAM THẤT CHẾ (PANAX NOTOGINSENG) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC \ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH , NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH DƯƠNG DIỄM MAI NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ DƯỢC LIỆU TAM THẤT CHẾ (PANAX NOTOGINSENG) NGÀNH: DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ THỊ HỒNG VÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu, kết luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả luận văn Dương Diễm Mai TÓM TẮT Luận văn Thạc sĩ Dược học, khóa 2020-2022 NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ DƯỢC LIỆU TAM THẤT CHẾ (PANAX NOTOGINSENG) Dương Diễm Mai Người hướng dẫn: TS Lê Thị Hồng Vân Đặt vấn đề Nhiều cơng trình nghiên cứu cho thấy nhiệt độ thời gian hấp có ảnh hưởng rõ rệt biến đổi thành phần ginsenosid tác dụng kháng ung thư loài thuộc chi Panax, có Tam thất (Panax notoginseng(Buck) F.H.Chen) Tuy nhiên, chưa có quy trình bào chế cụ thể đưa cho dược liệu Tam thất chế Do đó, đề tài “ Nghtiên cứu bào chế dược liệu Tam thất chế” thực nhằm mục tiêu xây dựng quy trình chế biến thiết lập tiêu chuẩn sở cho dược liệu Tam thất chế Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng: Thân rễ rễ củ Tam thất (Panax notoginseng (Buck) F.H.Chen) khô thu mua Hà Giang, Lai Châu (Việt Nam) Trung Quốc Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát nguyên liệu đầu vào dựa tiêu DĐVN V Nghiên cứu quy trình bào chế Tam thất chế cách đánh giá thay đổi hàm lượng ginsenosid phương pháp UPLC/PDA đánh giá hoạt tính dựa vào thử nghiệm ức chế tế bào ung thư vú MDA-MB-231 Thiết lập tiêu chuẩn cho dược liệu Tam thất chế Kết quả: Đã xác định điều kiện chế biến Tam thất hấp 120 oC Đã chế biến xây dựng tiêu chuẩn sở cho nguyên liệu Tam thất chế với tiêu cảm quan, kiểm tinh khiết, chất chiết dược liệu, định tính định lượng Kết luận: Tam thất chế dược liệu tiềm hỗ trợ điều trị ung thư Việc nghiên cứu bào chế Tam thất sở để thực nghiên cứu bào chế thành phẩm từ dược liệu SUMMARY Final essay for the degree as a Master of Pharmacy-Academy year 2020-2022 RESEARCH ON THE PREPARATION OF PROCESSED NOTOGINSENG (PANAX NOTOGINSENG) Duong Diem Mai Instructor: Dr Le Thi Hong Van Introduction Many studies have shown that steaming time at high temperature have great impact on the changing of ginsenosides content and anti cancer effects of Panax species, including Panax notoginseng (Burk) F.H.Chen However, there is no specific preperation process for notoginseng Therefore, the study “Research on the preparation of processed notoginseng” was carried out with the aim of developing the steaming process and establishing the standard for processed notoginseng Materials and methods Materials: Dried and fresh Panax notoginseng rhizomes and roots were collected in Ha Giang, Lai Chau (Vietnam) and China Methods: Evaluate raw materials based on criteria in Vietnamese pharmacopoeia V Develop the notoginseng preparation process based on saponin content by UPLC/PDA method and evaluate the bioactivity with MDA-MB-231 breast cancer cell inhibition test Establish quaality control standards for processed notoginseng Results The processing conditions of notoginseng is steaming at 120 oC for hours Preprared and developed standards of processed notoginseng with the criteria of description, purity, extracted subtance content, qualitative and quantitative Conclusion Processed notoginseng is a potetial medicinal herb in anti-cancer treatment The research on the notoginseng preparation is the basis for carying out further studies on creating products from this medicinal herd MỤC LỤC CHƯƠNG TỔNG QUAN .2 1.1 Tổng quan Tam thất 1.1.1 Vị trí phân loại thực vật 1.1.2 Danh pháp 1.1.3 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Hoạt tính sinh học .6 1.2 Phương pháp định lượng saponin Tam thất 1.3 Chuyên luận Tam thất Dược điển nước 11 1.4 Các nghiên cứu phương pháp chế biến Tam thất 12 1.4.1 Phương pháp chế biến .12 1.4.2 Sự thay đổi thành phần hóa học qua q trình chế biến 12 1.4.3 Tác dụng sinh học 13 1.5 Độc tính Tam thất 14 1.6 Các chế phẩm từ Tam thất .14 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên vật liệu 16 2.1.1 Nguyên liệu .16 2.1.2 Chất chuẩn – dược liệu chuẩn 17 2.2 Hóa chất, thuốc thử 18 2.3 Thiết bị, dụng cụ 19 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Khảo sát nguyên liệu đầu vào 20 2.4.2 Xây dựng quy trình bào chế Tam thất chế 23 2.4.3 Xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu Tam thất chế 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ 36 3.1 Khảo sát nguyên liệu đầu vào 36 3.1.1 Cảm quan 36 3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết mẫu .36 3.1.3 Định tính sắc ký lớp mỏng .37 3.1.4 Định lượng saponin phương pháp HPLC 38 3.2 Xây dựng quy trình bào chế Tam thất chế .42 3.2.1 Đánh giá hàm lượng saponin Tam thất điều kiện chế biến khác phương pháp UPLC/PDA 42 3.2.2 Đánh giá hoạt tính độc tế bào Tam thất chế .44 3.2.3 Bào chế Tam thất chế 46 3.3 Xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu Tam thất chế 46 3.3.1 Xây dựng quy trình định lượng saponin Tam thất chế phương pháp HPLC/PDA .46 3.3.2 Đánh giá quy trình định lượng 50 3.3.3 Xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu Tam thất chế 58 3.3.4 Đề xuất tiêu chuẩn dược liệu Tam thất chế 61 3.3.5 Kiểm nghiệm lô chế biến khác 64 CHƯƠNG BÀN LUẬN 65 4.1 Khảo sát nguyên liệu đầu vào 65 4.2 Xây dựng quy trình bào chế Tam thất chế .65 4.3 Xây dựng đánh giá quy trình định lượng saponin Tam thất chế .67 4.4 Xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu Tam thất chế 68 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71 i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ý nghĩa Chữ viết tắt 5-FU Chữ nguyên ADP Adenosine diphosphat AMPA Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl4-isoxazolepropionic acid cAMP Cyclic adenosine monophosphate COX-2 Cyclo oxygenase-2 DMEM HPLC Dulbecco’s modified Eagle’s medium High Perfromance Liquid Chronatography iNOS Inducible Nitric Oxide Synthase IC50 Half – maximal inhibitor concentration Limit of Detection Nồng độ ức chế tối thiểu LOQ N-Ft1 Limit of Quantitation Giới hạn định lượng PAI Plasminogen activator inhibitor Photodiod Array LOD PDA PTFE 5- fluorouracil Chất truyền tin AMP vòng Sắc ký lỏng hiệu cao Giới hạn phát Notoginsengosid Ft1 Ức chế hoạt hoá plasminogen Dãy diod quang RSD Polytetrafluoroethylene Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SKLM TKPT Sắc ký lớp mỏng TNF α TXA2 UPLC UV Tinh khiết phân tích Tumor necrosis factors alpha Thromboxan A2 Ultra Performance Liquid Chromatography Ultraviolet Yếu tố hoại tử khối u alpha Sắc ký lỏng siêu hiệu Tử ngoại ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Cấu trúc số saponin có Tam thất Bảng 1.2 Hàm lượng (mg/g) trung bình saponin phận khác lồi Tam thất .4 Bảng 1.3 Một số công trình nghiên cứu định lượng saponin Tam thất 10 Bảng 1.4 So sánh chuyên luận Tam thất dược điển 11 Bảng 2.1 Các mẫu Tam thất nguyên liệu .16 Bảng 2.2 Các chất chuẩn sử dụng đề tài .18 Bảng 2.3 Hóa chất dung mơi dùng cho chiết xuất định tính, định lượng 18 Bảng 2.4 Hóa chất, thuốc thử dùng cho thử nghiệm sinh học 18 Bảng 2.5 Trang thiết bị phân tích 19 Bảng 2.6 Thiết bị, dụng cụ thử nghiệm sinh học .19 Bảng 2.7 Chương trình pha động định lượng saponin Tam thất 22 Bảng 2.8 Chương trình pha động xác định hàm lượng saponin Tam thất điều kiện chế biến khác phương pháp UPLC/PDA 23 Bảng 2.9 Yêu cầu thơng số sắc ký kiểm tra tính tương thích hệ thống 29 Bảng 2.11 Các tiêu kiểm tra giới hạn kim loại nặng bột Tam thất chế 35 Bảng 3.1 Kiểm tra độ ẩm độ tro mẫu dược liệu 36 Bảng 3.2 Kết định lượng số saponin mẫu Tam thất nguyên liệu 38 Bảng 3.3 Hàm lượng spaonin Tam thất điều kiện chế biến khác 42 Bảng 3.4 Chương trình rửa giải phân tích dịch chiết MeOH Tam thất chế 47 Bảng 3.5 Kết khảo sát dung môi chiết xuất 48 Bảng 3.6 Kết khảo sát nhiệt độ chiết xuất 48 Bảng 3.7 Kết khảo sát thời gian chiết xuất 49 Bảng 3.8 Kết khảo sát tỉ lệ dược liệu - dung môi chiết lần MeOh 80% 49 iii Bảng 3.9 Hàm lượng saponin chiết tỉ lệ dược liệu - dung môi khác .50 Bảng 3.10 Các thông số sắc ký chất cần định lượng mẫu thử .50 Bảng 3.11 Kết khảo sát độ đặc hiệu 51 Bảng 3.12 Tương quan nồng độ diện tích đỉnh chất phân tích 52 Bảng 3.13 Xử lý kết xác định tính tương thích phương trình hồi quy chất phân tích 53 Bảng 3.14 Giá trị LOD LOQ chất phân tích .54 Bảng 3.15 Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại (ngày 1) 55 Bảng 3.16 Kết khảo sát độ lặp lại (ngày 2) 55 Bảng 3.17 Kết khảo sát độ xác trung gian 56 Bảng 3.18 Kết khảo sát độ 56 Bảng 3.19 Kết thửmở tinh khiết bột dược liệu lô Tam thất chế 60 Bảng 3.20 Hàm lượng saponin Tam thất chế .60 Bảng 3.22 Chương trình pha động xác định hàm lượng saponin Tam thất chế .63 Bảng 3.23 Các tiêu kiểm tra giới hạn kim loại nặng bột Tam thất chế 63 Bảng 3.24 Kết kiểm nghiệm lô Tam thất chế 64 Bảng 4.1 So sánh tiêu chuẩn DĐVN V tiêu chuẩn đề xuất 69 iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Một số polyacetylen Tam thất Hình 1.2 Sắc ký đồ phân lập 11 saponin HPLC-DAD (I) UPLC-PDA (II) Notoginsenosid-R1 (1); Ginsenosid-Rg1 (2); G-Re (3); G-Rf (4), G-Rb1 (5), G-Rg2 (6), G-Rc (7), G-Rb2 (8), G-Rb3 (9), G-Rd (10) G-Rg3 (11) .11 Hình 1.3 Sắc ký đồ điển hình hỗn hợp chuẩn (A), Tam thất thô (B) Tam thất hấp 120 oC notoginsenosid R1 (1), ginsenosid-Rg1 (2), ginsenosid-Re (3), Rh1 (4), Rg2 (5), 20R-Rg2(6), Rb1 (7), Rc(8), Rb2 (9), Rb3 (10), Rd (11), Rg3 (12) Rh2 (13) 53 13 Hình 1.4 Các chế phẩm bào chế từ Tam thất thị trường Việt Nam 15 Hình 1.5 Các chế phẩm bào chế từ Tam thất chế .15 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình bào chế Tam thất chế 26 Hình 3.1 Sắc ký đồ SKLM lô Tam thất nguyên liệu đại diện .37 Hình 3.2 Sắc ký đồ định lượng saponin hỗn hợp chuẩn (A) mẫu Tam thất nguyên liệu đại diện HPLC (B) 41 Hình 3.3 Sắc ký đồ định lượng saponin Tam thất điều kiện chế biến khác 43 Hình 3.4 IC50 cao chiết Tam thất điều kiện chế biến khác 45 Hình 3.5 Kết khảo sát bước sóng phát 46 Hình 3.6 Sắc ký đồ khảo sát chương trình rửa giải phân tích dịch chiết MeOH Tam thất chế 47 Hình 3.7 Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống .51 Hình 3.8 Kết khảo sát độ đặc hiệu .52 Hình 3.9 Đường tuyến tính chuẩn đối chiếu 53 Hình 3.10 Giới hạn phát (LOD) chất đối chiếu .54 Hình 3.11 Sắc ký đồ khảo sát độ xác 55 Hình 3.12 Mơ tả hình dạng bên ngồi mặt cắt ngang rễ củ Tam thất chế 58 Hình 3.13 Bột dược liệu cấu tử quan sát kính hiển vi 59 v Hình 3.14 Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng Tam thất chế (lô đại diện) so sánh với chất chuẩn 59 MỞ ĐẦU Panax notoginseng (Burk.) F.H Chen (Araliaceae) thảo dược quý có nguồn gốc từ Trung Quốc, có nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe nhu cầu sử dụng cao, năm gần đây, với dự án chuyển đổi kinh tế trồng, khu vực tỉnh Hà Giang Lào Cai phát triển vùng trồng Tam thất với diện tích lên đến hàng chục hecta, để cung ứng nguồn nguyên liệu quý phát triển kinh tế nông nghiệp Rễ củ Tam thất sử dụng dạng thơ dạng chế biến có cơng dụng khác Dạng thô dùng để điều trị chứng xuất huyết, tiêu trừ huyết ứ, cải thiện lưu thông máu, giảm sưng đau dạng hấp sử dụng loại thuốc bổ máu tăng sản xuất dạng tế bào trình thiếu máu Ngoài ra, so với dạng chế biến Nhân sâm (Panax ginseng) Sâm Mỹ (Panax quinquefolius), Tam thất chế thể hoạt tính kháng ung thư cao Nhiều nghiên cứu thay đổi từ ginsenosid nguyên thủy thành dạng phân cực trình hấp Tam thất dẫn đến thay đổi tác dụng dược lý Trong đó, notoginsenosid-R1, ginsenosid-Rg1, Re, Rb1 Rd saponin diện Tam thất thô 20 (R/S)-ginsenosid-Rh1, Rk3, Rh4, Rg3, Rk1 Rg5 thành phần đặc trưng Tam thất qua chế biến 3,4 Hiện nay, thị trường Việt Nam bên cạnh sản phẩm dược liệu thô, Tam thất bào chế thành nhiều dạng khác như: viên nang, viên nén kết hợp với số dược liệu Nghệ, Đan sâm… Tuy nhiên, chưa có sản phẩm từ Tam thất qua chế biến cách hấp Trong trình hấp, nhiệt độ thời gian hấp yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng dược liệu Vì vậy, cách đánh giá thay đổi hàm lượng số ginsenosid tác dụng ức chế dịng tế bào ung thư vú MDA-MB231 dược liệu Tam thất chế biến điều kiện khác nhau, đề tài thực nhằm mục tiêu đưa điều kiện chế biến cụ thể xây dựng tiêu chuẩn sở cho dược liệu Tam thất chế CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Tam thất 1.1.1 Vị trí phân loại thực vật Theo hệ thống phân loại thực vật Takhtajan 5, vị trí phân loại Tam thất (Panax notoginseng (Burkill.) F.H Chen) sau: Giới Thực vật (Plantae) Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Cúc (Asteridae) Liên Thù du (Cornanae) Bộ Hoa tán (Apiales) Họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Chi Sâm (Panax) Lồi Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen 1.1.2 Danh pháp Tên khoa học: Panax notoginseng (Burkill) F.H.Chen, họ Araliaceae Tên khác: Kim bất hoán, Nhân sâm tam thất, Sâm tam thất 1.1.3 Đặc điểm thực vật phân bố Tam thất thuộc dạng thân thảo nhỏ, sống lâu năm, thân mọc thẳng, cao khoảng 40 cm Lá kép mọc vòng 3-4 lá, dài 3-6 cm, mang 3-7 chét hình mũi mác dài, đầu nhọn, mép có cưa nhỏ, cuống chét dài 0,6-1,2 cm Hoa tự hình tán mọc đầu cành mang hoa, có hoa đơn tính, có hoa lưỡng tính Lá đài 5, màu xanh, cánh màu xanh nhạt, bầu hạ ngăn Mùa hoa tháng Quả mọng hình thận, chín màu đỏ, có hạt hình cầu Mùa tháng 10 Cây Tam thất trồng hạt vùng núi cao 1200-1500 m Đồng Văn, Phó Bảng (Hà Giang), Mường Khương, Bát Sát (Lào Cai), Thông Nông (Cao Bằng), trồng sườn núi gió Tam thất cịn trồng Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Tây, Tứ Xuyên, Hồ Bắc, Giang Tây) 7,8 1.1.4 Thành phần hóa học Các nghiên cứu hóa thực vật tiến hành nhiều phận bao gồm rễ, thân, hoa Một số thành phần hóa học Tam thất tương tự với loài khác chi Panax ginseng Panax quinquefolius, saponin nhóm dammaran, polysaccharid flavonoid thành phần thể hoạt tính sinh học 10 1.1.4.1 Saponin Saponin Tam thất chủ yếu triterpen dammaran có hàm lượng chiếm tới 12% rễ 11 với khung 20(S)-protopanaxadiol (PPD) 20(S)- protopanaxatriol (PPT) khơng có diện saponin khung oleanan Chúng phân thành nhóm ginsenosid, notoginsenosid gypenosid với 80 saponin phân lập 12 Trong đó, saponin bao gồm notoginsenosid-R1, ginsenosidRb1, ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Rd ginsenosid-Re thành phần chính, NR1 saponin đặc trưng Tam thất, thành phần G-Rb1, G-Rg1 N-R1 chọn làm marker để đánh giá chất lượng Tam thất Thành phần saponin phận khác Tam thất có khác biệt lớn 13 Nụ hoa Tam thất chủ yếu chứa saponin nhóm PPD rễ diện saponin nhóm PPT PPD 14 G-Rb1 có nhiều rễ củ, thân rễ nụ hoa G-Rb3 diện nhiều nụ hoa 12 Bảng 1.1 Cấu trúc số saponin có Tam thất Saponin N-R1 G-Rg1 G-Re G-Rf G-Rb1 G-Rc G-Rb2 G-Rb3 G-Rd R1 H H H H O-glc2-1glc O-glc2-1glc O-glc2-1glc O-glc2-1glc O-glc2-1glc R2 O-glc2-1xyl O-glc O-glc2-1rha O-glc2-1glc H H H H H R3 O-glc O-glc O-glc OH O-glc6-1glc O-glc6-1araf O-glc6-1arap O-glc6-1xyl O-glc R4 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 Ghi chú: Viết tắc: Glc, glucose; Ara(f), arabinose dạng pyranose; Rha, rhamnose; Xyl, xylose 15 Bảng 1.2 Hàm lượng (mg/g) trung bình saponin phận khác loài Tam thất 12 N-R1 G-Rg1 G-Re G-Rb1 G-Rb2 G-Rb3 G-Rc G-Rd PPT PPD Rễ 2,76 ± 0,26 44,72 ± 6,30 6,22 ± 1,41 37,67 ± 8,13 0,79 ± 0,13 0,84 ± 0,32 3,11 ± 0,37 Thân rễ 3,64 ± 0,34 42,10 ± 3,13 9,27 ± 0,76 42,53 ± 9,34 0,27 ± 0,02 5,82 ± 0,53 9,96 ± 0,81 7,77 ± 0,55 Nụ hoa 1,30 ± 0,09 4,44 ± 0,44 1,06 ± 0,05 53,13 ± 4,67 21,08 ± 2,70 55,63 ± 9,39 32,02 ± 11,66 2,54 ± 0,07 1.1.4.2 Polyacetylen Có báo cáo thành phần polyacetylen Tam thất Đến nay, có 10 polyacetylen phân lập từ loài P.notoginseng 9, chẳng hạn panaxytriol, panaxynol, panaxydol, acid notoginsenic, β-sophoroside acid 10- hydroxydeca-4,6-diynoic, 10-βD-glucopyranosyl (1→2)-βD-glucopyranosid 16 Hàm lượng polyacetylen Tam thất khoảng 0,21% xem dấu để đánh giá chất lượng Tam thất 17 R= Glc (2-1) Glc-O-CH2 Hình 1.1 Một số polyacetylen Tam thất 1.1.4.3 Saccharid Saccharid Tam thất bao gồm monosaccharid, oligosaccharid polysaccharid Polysaccharid diện nhiều phận Tam thất, với hàm lượng cao rễ hàm lượng polysaccharid hoa cao gấp đôi 18 Sanchinan-A (phân tử khối 1,5 x 106) phân lập từ rễ P notoginseng có cấu trúc khung galactopyranosyl với liên kết β-D- (1 3) với điểm phân nhánh vị trí O6 mà chuỗi bên [chủ yếu -L-arabinofuranosyl phần β-Dgalactopyranosyl]-(16)-β-D-galactopyranosyl-(13)-β-D-galactopyranosyl gắn vào ba đơn vị galactosyl 19 polysaccharid PF3111, PF3112, PBGA11 PBGA12 phân lập từ loài Tam thất sau phân tích thành phần đường, chúng phân tử có trọng lượng phân tử từ 37 kD đến 760 kD, bao gồm glucose, galactose, arabinose, mannose xylose với tỷ lệ mol khác 20 Một polysaccharid 1MD3-G3 chứa cấu trúc homogalacturonan, rhamnogalacturonan I, glucuronoarabinoxylan, galactan arabinan 21 Ngoài ra, M.K Chan cộng chiết xuất xác định thành cơng cấu trúc polysaccharid cao nước, góp phần cung cấp sở cho việc nghiên cứu liên quan cấu trúc-tác động polysaccharid ứng dụng Y học 22 1.1.4.4 Flavonoid Một số flavonoid phân lập từ phận nụ hoa, lá, thân, rễ 2326 , Liu cộng chứng minh hàm lượng flavonoid hoa (1,43%) cao rễ 27 Các flavonoid phân lập chủ yếu flavonol, flavon glycosid chẳng hạn liquirigenin, quercetin, kaemferol-3-O-α-L-rhamnosid 1.1.4.5 Tinh dầu Tinh dầu Tam thất có cấu trúc terpen, alcol, aldehyd, olefin alkan Terpen thành phần quan trọng chiếm tỉ lệ tương đối cao Đến nay, 40 hợp chất xác định kỹ thuật sắc ký khí kết hợp đầu dị khối phổ 1.1.4.6 Thành phần khác Ngồi thành phần liệt kê, cịn có thành phần khác phân lập từ Panax notoginseng, bao gồm sterol, icarisid, guanosin hydrat, acid amin, acid béo, nguyên tố vơ muối khống 1.1.5 Hoạt tính sinh học Tam thất có nhiều cơng dụng y học cổ truyền cầm máu, làm tan cục máu đông, cải thiện lưu thông máu, làm tan vết bầm tím, làm xẹp vết sưng tấy giảm đau Ngồi Tam thất cịn thể nhiều tác dụng dược lý khác thử nghiệm mơ hình in vitro in vivo 1.1.5.1 Tác dụng chống kết tập tiểu cầu Sự gia tăng fibrinogen xem yếu tố nguy bệnh tim mạch Tam thất chứng minh làm giảm đáng kể nồng độ fibrinogen mơ hình chuột ni chế độ ăn giàu chất béo 28 Sự kết tập tiểu cầu gây ADP in vitro bị ức chế Tam thất Hơn nữa, Tam thất làm tăng tính lưu động màng tiểu cầu Quá trình tiêu sợi huyết điều khiển chất hoạt hóa plasminogen (PA) chất ức chế PA (PAI-1) N-R1 có khả điều tiết tissue type PA (tPA) mà không ảnh hưởng đến urokinasetype PA (uPA)và PAI-1 N-R1 làm tăng sản xuất tPA uPA tế bào trơn động mạch phổi ức chế biểu mức PAI-1 yếu tố hoại tử khối u alpha (TNF-α) gây 29,30 1.1.5.2 Tác dụng kháng viêm Trilinolein- triacylglycerol phân lập từ Tam thất ức chế đáng kể nitrit oxid (NO), TNF-α, interleukin-1 β (IL-1β) sản xuất IL-6 phụ thuộc nồng độ mơ hình đại thực bào chuột (RAW264.7) kích thích lipopolysaccharid 31 Saponin nhóm panaxadiol từ Tam thất chứng minh tác nhân bảo vệ thần kinh giúp chống lại bệnh Parkinson cách tăng cường hoạt động chống oxi hóa, điều hịa q trình viêm ức chế suy giảm trình chết tế bào thần kinh qua trung gian ti thể 32 Cao chiết n-butanol từ Tam thất có khả ức chế TNF-α, IL-1β NO in vitro làm chậm khởi phát tiến triển chứng thấp khớp mơ hình chuột bị viêm khớp 33 Bệnh nhân bị viêm ruột nặng có nguy phát triển ung thư đại trực tràng Sử dụng mơ hình chuột bị viêm đại tràng AOM/DSS (Azoxymethane/Dextran Sulfate Sodium Mouse), Tam thất làm giảm đáng kể mức độ nghiêm trọng tình trạng viêm ruột biểu iNOS COX-2 Nghiên cứu Tam thất ứng viên ngăn ngừa điều trị viêm đại tràng chất sinh ung thư có liên quan đến viêm 34 1.1.5.3 Tác dụng cầm máu Dencichin, acid amin có rễ Tam thất có tác dụng rút ngắn thời gian chảy máu thông qua thụ thể AMPA (α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazol-propionic acid) tiểu cầu, tạo điều kiện đơng máu cách kiểm sốt dịng canxi tế bào tiểu cầu, sản xuất cAMP TXA2 35 Notoginsenosid-Ft1 chứng minh có khả gây đơng máu kết tập tiểu cầu phụ thuộc nồng độ N-Ft1 làm giảm số đông máu huyết tương, giảm thời gian chảy máu tăng sinh huyết khối cách kích hoạt mạng lưới tín hiệu trung gian thông qua thụ thể P2Y12 36 1.1.5.4 Tác dụng kháng ung thư So với loài Sâm Mỹ (P.quinquefolius) Nhân sâm (P ginseng), P notoginseng có khả kháng ung thư tốt hơn, hàm lượng saponin cao thành phần ginsenosid đa dạng 17 Cao cồn từ Tam thất chứng minh có khả ức chế phát triển khối u lách di gan mơ hình lách chuột C57BL/6 cấy khối u ác tính B16 37 Người ta chứng minh rằng, Tam thất không ức chế hiệu phát triển tế bào ung thư mà tăng cường hiệu chống tăng sinh 5-FU (một tác nhân dùng hóa trị liệu ung thư) Từ đó, giảm liều giảm tác dụng phụ 5-FU điều trị 38 Tế bào 4T1 dòng tế bào ung thư biểu mơ vú chuột có khả di cao Thử nghiệm in vitro cho thấy saponin Tam thất có tác động chọn lọc di cư xâm nhập dòng tế bào 4T1 Giả thuyết chứng minh mơ hình di 4T1 in vivo 39 Ở nghiên cứu khác, saponin phức hợp saponin-phospholipid từ rễ Tam thất thể hoạt tính kháng khối u ung thư phổi người (NCI-H460) dòng tế bào ung thư vú người (BT474) 40 1.1.5.5 Tác dụng khác Cao nước Tam thất tác nhân mạnh mẽ chống lại độc tính mạn ethanol gây tế bào gan thông qua việc ức chế sản xuất gốc oxi tự gây peroxy hóa lipid 10 Saponin từ Tam thất có tác dụng chống lại độc tính thận cisplatin gây ra, giảm thay đổi mô bệnh học thận tổn thương ty thể tế bào thận chuột 41 Ngoài ra, nhiều tác dụng dược lý khác Tam thất báo cáo làm giảm độ nhớt máu ức chế kết tập tiểu cầu 42, tác dụng giảm đau 43, làm chậm tiến triển bệnh thận đái tháo đường hoạt động bổ trợ miễn dịch 44 nhiều tác dụng khác 1.2 Phương pháp định lượng saponin Tam thất Tham khảo số cơng trình nghiên cứu tóm tắt Bảng 1.3, kỹ thuật sắc ký lỏng đại phương pháp phổ biến để xác định hàm lượng saponin Tam thất Mặc dù thành phần saponin Tam thất chế có thay đổi so với dạng ban đầu, phương pháp chuẩn bị mẫu điều kiện sắc ký khơng có khác biệt Như vậy, với mục tiêu định lượng saponin Tam thất qua chế biến, đưa số nhận định sau: - Đối tượng phân tích: Do thay đổi thành phần hóa học sau hấp, tùy theo dạng dược liệu (thô hay chế biến), lựa chọn ginsenosid làm đối tượng phân tích phù hợp Nhìn chung, mẫu thử Tam thất thô, nghiên cứu thường phân tích thành phần G-Rg1, G-Rb1, N-R1 G-Rd, dạng chế biến định lượng thêm thành phần G-Rg3 G-Rh1 - Phương pháp chuẩn bị mẫu: nhìn chung, điều kiện chuẩn bị mẫu nghiên cứu tương tự Mẫu xay thành bột đồng kích thước trước tiến hành chiết Dung môi chiết xuất thường MeOH 70-80% Có thể chiết siêu âm đun hồi lưu Đa phần nghiên cứu lựa chọn chiết siêu âm thao tác đơn giản hiệu chiết cao Thời gian chiết từ 20 - 60 phút Chiết siêu âm thường không gia nhiệt, nhiệt độ chiết trì khoảng 85 oC chiết đun hồi lưu - Điều kiện sắc ký: Hệ thống sắc ký UPLC HPLC, cột sắc ký thường cột pha đảo C18 Hệ dung môi pha động bao gồm nước dung dịch đệm nước (acid formic) acetonitril Chương trình rửa giải gradient với tăng dần nồng độ acetonitril áp dụng Bước sóng phát 203 nm 10 Bảng 1.3 Một số cơng trình nghiên cứu định lượng saponin Tam thất Đối tượng phân tích g bột dược liệu (30 mesh) chiết Cột UPLC BEH C18 (150x2,1 mm; 1,7 G-Rg1, Rg2, Rd, Rb1 Nđun hồi lưu 30 ml nước lần µm), tiền cột (2,1x5 mm; 1,7 µm) 30 phút, làm bay đến cắn, Pha động: ACN:H2O rửa giải gradient R1 Đầu dị PDA, bước sóng: 203 nm hòa tan cắn MeOH 45 0,5 g bột (0,3-0,45 mm), chiết N-R1, G-Rg1, ống thép không gỉ 11 ml Cột UPLC BEH C18 (150x2,1 mm; 1,7 Re, Rf, Rb1, MeOH , 150 oC 15 phút, dịch µm) Rg2, Rc, Rb2, chiết chuyển vào bình định Pha động: ACN:H2O rửa giải gradient Rb3, Rd mức 25 ml, bổ sung dung môi vừa Đầu dị PDA bước sóng: 203 nm Rg3 đủ thể tích 46 g bột dược liệu chiết với 10 ml Cột HPLC Water Symmertry C18 MeOH 70%, chiết siêu âm lần N-R1, G-Rg1, (250x4,6 mm; µm) 20 phút Làm bay dịch Re, Rb1, Rc Pha động: ACN:H2O rửa giải gradient chiết đến cắn sau hịa cắn Rd Đầu dị PDA bước sóng: 203 nm 10 ml MeOH 70% Agilent Zorbax SB-C18 (250x4,6 mm; 30 mg bột dược liệu (40 mesh) 5µm), tiền cột (20x4 µm; 5µm) N-R1, G-Rg1, chiết MeOH 80% với phương Pha động: ACN:0,001%HCOOH, Rb1, Rg2, pháp siêu âm 60 phút không rửa giải gradient Rh1 Rd gia nhiệt 47 Đầu dị PDA bước sóng: 203 nm N-R Cột Phenomenex (250 mm×4,6mm; 0,6 g bột dược liệu (65 mesh) chiết G-Rg1 , Re, 5  μm) siêu âm không gia nhiệt với 50 ml Rb1 , Rg2 , Rh1 , Pha động: ACN:H2O rửa giải gradient 48 MeOH 70% 40 phút Rd, 20S-Rg3 Đầu dị DAD bước sóng: 203 nm 20R-Rg3 Phương pháp chuẩn bị mẫu Điều kiện sắc ký 11 Hình 1.2 Sắc ký đồ phân lập 11 saponin HPLC-DAD (I) UPLC-PDA (II) Notoginsenosid-R1 (1); Ginsenosid-Rg1 (2); G-Re (3); G-Rf (4), G-Rb1 (5), G-Rg2 (6), G-Rc (7), G-Rb2 (8), G-Rb3 (9), G-Rd (10) G-Rg3 (11) 46 1.3 Chuyên luận Tam thất Dược điển nước Ngoài DĐVN V 49, chuyên luận Tam thất đề cập nhiều Dược điển tham chiếu Các tiêu đưa có tương đồng Dược điển (cảm quan, soi bột, kiểm tinh khiết), nhiên có số khác biệt yêu cầu thành phần mức tiêu saponin sử dụng định tính định lượng Do đó, dựa vào tiêu đưa cho dược liệu Tam thất, xây dựng tiêu chuẩn tương tự cho liệu Tam thất chế Bảng 1.4 So sánh chuyên luận Tam thất dược điển Dược điển Tên chuyên luận Định tính Định lượng DĐVN Tam thất (Rễ củ) G-Rb1, GRg1, N-R1 N-R1 ≥ 0,4% Tổng (GRb1, G-Rg1, N-R1) ≥ 5,0% USP-44 Tienchi Ginseng root and Rhizome G-Rg1, dược liệu đối chiếu (G-Rb1, G-Rd, G-Re, NR1, G-Rg1) Tổng (N-R1, G-Rg1, G-Re, GRb1, G-Rd)  5% EP-10 BP-2021 CP-2020 Notoginsseng root Notoginseng root Notoginseng radix et rhizoma Aescin, arbutin G-Rb1, G-Rg1, G-Rf Tổng (G-Rg1, G-Rb1)  3,8% G-Rg1, GRb1, G-Re, N-R1 Tương tự EP10.0 Tổng (G-Rg1, G-Rb1, NR1)  5% 12 1.4 Các nghiên cứu phương pháp chế biến Tam thất Mục đích trình chế biến: loại bỏ giảm bớt độc tính tác dụng phụ, thay đổi đặc tính dược liệu, thuận tiện cho việc bảo quản đảm bảo làm liệu Đối với Tam thất, việc hấp làm thay đổi đặc tính dược liệu 4,50-54 1.4.1 Phương pháp chế biến Rễ thân rễ Nhân sâm (P ginseng) thường sơ chế trước sử dụng cách làm khô sau bốc vỏ chế biến cách hấp, sau đem phơi khơ 55 Tùy theo phương pháp chế biến, tạo nhiều dạng khác Bạch sâm, Hồng Sâm hay Hắc sâm56,57 Tương tự với Nhân sâm, Tam thất qua chế biến dạng quan trọng dược liệu Tam thất hấp nước nhiệt độ cao sau sấy khơ để đạt độ ẩm thích hợp Nhiều nghiên cứu khảo sát biến đổi thành phần saponin tác dụng dược lý trình chế biến thực 1.4.2 Sự thay đổi thành phần hóa học qua trình chế biến Sau hấp, hàm lượng saponin phân cực notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, Rb1, Re, Rd giảm nồng độ saponin phân cực ginsenosid 20S-G-Rh1, 20R-Rh1, 20S-Rg3, 20R- Rg3, Rk3, Rh4, Rk1 Rg5 tăng lên 10 Người ta thấy rằng, biến đổi hóa học diễn nhờ q trình thủy phân, đồng phân hóa khử nước 58 Sự giảm ginsenosid Rg1, Rb1, Rd, Re notoginsenosid R1 quan sát rõ sau hấp Sau đó, mức độ biến đổi (phân hủy hình thành saponin tăng trình hấp 59 Q trình hấp có ảnh hưởng đáng kể đến biến đổi hàm lượng Rg3, chất kháng ung thư Trong nghiên cứu, hàm lượng Rg3 cao 5,23 lần rễ hấp 120 oC so với 100 o C lớn 3,22 lần hấp sơ với 120 oC 53 13 Hình 1.3 Sắc ký đồ điển hình hỗn hợp chuẩn (A), Tam thất thô (B) Tam thất hấp 120 oC notoginsenosid R1 (1), ginsenosid-Rg1 (2), ginsenosid-Re (3), Rh1 (4), Rg2 (5), 20R-Rg2(6), Rb1 (7), Rc(8), Rb2 (9), Rb3 (10), Rd (11), Rg3 (12) Rh2 (13) 53 1.4.3 Tác dụng sinh học Một số nghiên cứu cho rắng Tam thất qua chế biến thể đặc tính dược lý mạnh dạng thơ kháng khối u, chống kết tập tiểu cầu chống đông máu 60 Ginsenosid-Rg3 cho thành phần saponin có tác dụng sinh học mạnh nhất, thể hoạt động kháng ung thư diện rộng bao gồm ung thư đại tràng, phổi 61, ung thư vú 62, gan 63, tuyến tụy 64 thông qua chế thúc đẩy chu trình apoptosis ức chế tăng sinh, di xâm lấn tế bào ung thư Để xác định thành phần chịu trách nhiệm cho tác dụng ức chế khối u, người ta tiến hành thử nghiệm chống tăng sinh tế bào ung thư ruột kết người (SW480) Ở nồng độ 300 1M, G-Rb1 G-Rg1 ức chế tăng sinh < 5% G-Rg3 có khả ức chế lên đến 99% Do đó, so với G-Rg1 G-Rb1, có G-Rg3 có tác dụng chống tăng sinh đáng kể 53 Ngoài ra, việc nghiên cứu nhiệt độ thời gian hấp Tam thất ứng dụng nghiên cứu tác dụng dược lý Tam thất chế liên quan đến bệnh lý Alzheimer Kết cho thấy số mẫu Tam thất hấp (110 oC 6/8/10 120 oC 14 4/6 giờ) cho thấy gia tăng đáng kể khả bảo vệ tế bào thần kinh chống gốc oxi hóa 65 1.5 Độc tính Tam thất Có nghiên cứu báo cáo độc tính Tam thất, vài tác dụng phụ Tam thất ghi nhận sử dụng lâm sàng việc sử dụng Tam thất phổ biến Yin cộng (2014) báo cáo bệnh nhân lớn tuổi (1 nam nữ) bị phát ban sử dụng cao chiết saponin Tam thất dạng tiêm, bệnh nhân có triệu chứng mụn mủ, sốt tăng bạch cầu trung tính 66 Dạng chưa chế biến Tam thất biết đến với tác dụng cầm máu tác dụng tim mạch, dùng để trị xuất huyết nội ngoại, loại bỏ máu ứ, cải thiện tuần hoàn máu, tiêu vết bầm giảm xưng đau Tuy nhiên, dạng chế biến cách hấp cho dược liệu có tác dụng bổ dưỡng, sử dụng bổ máu, tăng sản xuất tế bào máu điều trị thiếu máu Do dạng chưa chế biến dạng chế biến cách hấp thể hoạt tính dược lý khác nhau, cần sử dụng cho loại để tránh tác dụng phụ khơng đáng có Sử dụng q liều Tam thất dẫn đến số tác dụng phụ buồn nơn, nơn mửa chảy máu mũi Thêm vào đó, giá trị cao nên Tam thất thường bị giả mạo Một điều đáng lưu ý chống định cho phụ nữ mang thai 1.6 Các chế phẩm từ Tam thất Hiện nay, hầu hết chế phẩm thị trường Việt Nam bào chế từ nguyên liệu Tam thất chưa qua chế biến dạng kết hợp với dược liệu khác dạng bột, viên nén, viên bao đường, viên nang với nhiều công dụng như: bổ máu, cầm máu, giảm đau, kháng viêm, tăng sức đề kháng nhiều tác dụng khác (Hình 1.4) Bên cạnh đó, thị trường Trung Quốc có chế phẩm bào chế từ dược liệu Tam thất qua chế biến Tuy nhiên, Việt Nam, chưa ghi nhận chế phẩm bào chế từ dạng (Hình 1.5) Do đó, việc nghiên cứu bào chế sản phẩm từ Tam thất chế hỗ trợ điều trị ung thư tạo giá trị kinh tế lớn cho nhà 15 sản xuất nước mang đến sản phẩm có hàm lượng khoa học chất lượng cao đến cho người dân Hình 1.4 Các chế phẩm bào chế từ Tam thất thị trường Việt Nam Hình 1.5 Các chế phẩm bào chế từ Tam thất chế 16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu 2.1.1 Nguyên liệu Tổng 31 mẫu dược liệu Tam thất thu mua từ nguồn khác nhau: Tam thất có nguồn gốc từ Trung Quốc cung cấp Viện Shandong Analysis and Test Center Tam thất có nguồn gốc từ Việt Nam thu mua từ Hà Giang Lai Châu Trong đó, có 29 mẫu rễ củ khơ mẫu tươi (được trình bày Bảng 2.1) Các mẫu tươi sấy nguyên củ tách riêng phận dùng thân rễ, rễ củ, sấy 60 oC khô Tất mẫu khơ sau đươc xay thành bột mịn qua rây số 355 Bảng 2.1 Các mẫu Tam thất nguyên liệu STT Lô #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 10 #10 11 #11 12 #12 Xuất xứ Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Mã số lơ Đặc điểm mẫu Khối lượng trung bình/ củ (g) 01-TQ khô 7,47 97,06 02-TQ khô 12,58 100,67 03-TQ khô 7,89 98,30 04-TQ khô 11,03 99,29 05-TQ khô 14,04 98,30 06-TQ khô 15,12 151,15 01-HG_N khô 32,83 492,51 02-HG_N khô 24,73 494,58 khô 37,12 222,73 khô 7,89 98,3 05-HG-M3 khô 20,13 201,29 06HG_M4 khô 11,46 183,42 03HG_M1 04HG_M2 Khối lượng tổng (g) 17 STT Lô 13 #13 14 #14 15 #15 16 #16 17 #17 18 #18 19 #19 20 #20 21 #21 22 #22 23 #23 24 #24 25 #25 26 #26 27 #27 28 #28 29 #29 30 #30 31 #31 Xuất xứ Mã số lô Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam Hà Giang, Việt Nam 07HG_M5 08-HGN50 09-HGN60 10-HGN70 11-HGN80 12-HGN90 13-HGN100 14-HG-9 15-HG-10 16-HG-80 17-HG-32 18-HG-70 19-HG-60a 20-HG-60 21-HG-40 22-HG-X 23-HG-27 Đặc điểm mẫu Khối lượng trung bình/ củ (g) Khối lượng tổng (g) khơ 16,52 198,29 19,86 39,72 17,48 34,96 15,35 30,7 15,76 31,51 11,71 23,41 10,00 20,00 10,91 21,81 8,71 17,42 11,31 22,62 32,93 65,86 15,12 15,12 19,96 19,96 18,65 37,21 23,82 23,82 24 250 18,51 500 Khơ, trung bình 50 củ/kg Khơ, trung bình 60 củ/kg khơ, trung bình 70 củ/kg Khơ, trung bình 80 củ/kg khơ, trung bình 90 củ/kg khơ, trung bình 100 củ/kg Khơ, trung bình 90 củ/kg Khơ, trung bình 100 củ/kg Khơ, trung bình 80 củ/kg Khơ, trung bình 30 củ/kg Khơ, trung bình 60 củ/kg Khơ, trung bình 100 củ/kg Khơ, trung bình 50 củ/kg Khơ, trung bình 40 củ/kg Khơ, trung bình 40 củ/kg Khơ, trung bình 50 củ/kg 24-LC-H Tươi # 25-HG-DN Tươi # 70 (Thân rễ) 150 (Rễ củ) 275(Thân rễ) 275 (Rễ củ) 2.1.2 Chất chuẩn – dược liệu chuẩn Các chất chuẩn nhóm nghiên cứu từ đề tài “Thiết lập tiêu chuẩn sở cho dược liệu Tam thất (Panax notoginseng (Burk) F.H Chen)” 67 cung cấp với độ tinh khiết (tính chế phẩm nguyên trạng) trình bày cụ thể Bảng 2.2 18 Bảng 2.2 Các chất chuẩn sử dụng đề tài STT Tên chất chuẩn Hàm lượng (%) Ginsenoisd-Rg1 Ginsenosid-Re Ginsenosid-Rb1 20R-Ginsenosid-Rh1 Ginsenosid-Rd 20S-Ginsenosid-Rg3 Notoginsenosid-R1 99,41 97,77 99,30 95,90 99,02 90,90 99,00% Khối lượng có (mg) 50 50 50 50 50 50 50 Dược liệu Tam thất chuẩn (Nguồn gốc: Trung Quốc, SKS: 120941-201810) 2.2 Hóa chất, thuốc thử Bảng 2.3 Hóa chất dung mơi dùng cho chiết xuất định tính, định lượng Hóa chất, dung mơi Dung mơi phân tích Độ tinh khiết Xuất xứ Acetonitril TKPT Scharlau (Tây Ban Nha) Chloroform TKPT Scharlau (Tây Ban Nha) Ethyl acetat TKPT Scharlau (Tây Ban Nha) Methanol TKPT Scharlau (Tây Ban Nha) TKPT Scharlau (Tây Ban Nha) TK cho HPLC Scharlau (Tây Ban Nha) TK cho HPLC Scharlau (Tây Ban Nha) n-Butanol Dung môi HPLC Acetonitril Methanol Khác Bản mỏng sắc ký silica gel 60 F254 Merck (Đức) Đầu lọc PTFE 0.22 μm, đường kính 13mm Membrane solution (Mỹ) Bảng 2.4 Hóa chất, thuốc thử dùng cho thử nghiệm sinh học Hãng cung cấp Xuất xứ Môi trường DMEM Gibco Mỹ Huyết bào thai bê (FCS) Gibco Mỹ L-glutamin Gibco Mỹ Hóa chất 19 Penicilin-Streptomycin Gibco Mỹ Trypsin-EDTA Gibco Mỹ Phosphate buffered salin (PBS) Gibco Mỹ Mỹ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromid) (MTT) SigmaAldrich SigmaAldrich Isopropanol Merck Đức Acid hydroclorid (HCl) Merck Đức Trypan blue Mỹ 2.3 Thiết bị, dụng cụ Bảng 2.5 Trang thiết bị phân tích Xuất xứ Trang thiết bị, dụng cụ Đức Bể siêu âm Sonorex RK-1028H Bandelin Đức Bếp cách thủy Memmert WB-14 Cân phân tích CP-2250 Sartorius độ nhạy 0,1 mg Đức Cân phân tích CP-2250 Sartorius độ nhạy 0,01 mg Đức Cột sắc ký HPLC Phenomenex C18 (4,6 x 150 mm; 3µm) Mỹ Cột sắc ký UPLC Acquity C18 (2,1 x 50 mm, 1,7µm) Mỹ Kính hiển vi quang học ACCU-SCOPE Mỹ Đức Lò nung Carbolite AAF 11/7 Máy sắc ký lỏng siêu hiệu UPLC/PDA Waters (Mỹ) Nồi hấp tiệt trùng Hirayama 110 lít Nhật Bản Tủ hốt CLEARAIR CHC-101BN Hàn Quốc Đức Tủ sấy Memmert UN750 Các dụng cụ thơng thường khác phịng thí nghiệm Bảng 2.6 Thiết bị, dụng cụ thử nghiệm sinh học Hãng cung cấp Xuất xứ Tủ an toàn sinh học AC2-4E1 ESCO Singapore Tủ ấm nuôi cấy tế bào Sanyo Nhật Thiết bị 20 Nikon Nhật Nồi hấp tiệt trùng Hirayama Nhật Máy đọc ELISA BioTek Mỹ Máy vortex Labnet Mỹ Tủ lạnh °C Sanyo Việt Nam Tủ đông -20 °C Toshiba Nhật Cân phân tích Sartorius Đức Kính hiển vi soi ngược Nơi thực hiện: - Khoa Dược - Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh - Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh - Trung tâm Dịch vụ phân tích thí nghiệm TP Hồ Chí Minh 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Khảo sát nguyên liệu đầu vào Dựa vào số tiêu chuyên luận Tam thất (rễ củ) - DĐVN V quy trình định lượng từ đề tài “Thiết lập tiêu chuẩn sở cho dược liệu Tam thất” (Panax notoginseng (Burk) F H Chen) tiến hành kiểm nghiệm mẫu nguyên liệu Tam thất Cảm quan Kiểm tra hình thái, màu sắc mùi vị dược liệu cảm quan, kiểm tra kích thước cách đo trực tiếp Độ ẩm Không 14% (theo DĐVN V, phụ lục 9.6, 1g, 105 oC, giờ) Tro tồn phần Khơng 6%(theo DĐVN V, phụ lục 9.8) Định tính Phương pháp sắc ký lớp mỏng Bản mỏng: Silica gel F254 Hệ dung môi khai triển: Hỗn hợp cloroform – methanol – nước (65:35:10) 21 Dung dịch thử: Lấy khoảng 0,2 g bột dược liệu, thêm ml methanol, siêu âm 20 phút, lọc lấy dịch chiết Dung dịch chất đối chiếu: Hòa tan chất chuẩn ginsenosid-Rg1, ginsenosidRb1, ginsenosid-Rd notoginsenosid-R1 methanol để dung dịch hỗn hợp chuẩn có nồng độ chuẩn khoảng 0,5 mg/ml Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl (bằng mao quản có khắc vạch) cho dung dịch Triển khai sắc ký đến dung môi khoảng cm, lấy mỏng ra, để khơ nhiệt độ phịng, phun dung dịch H2SO4 %/ cồn 96% Sấy mỏng 105 °C xuất rõ vết Quan sát mỏng ánh sáng thường ánh sáng tử ngoại bước sóng 365 nm Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết có màu sắc giá trị Rf với vết ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rd notoginsenosid-R1 sắc ký đồ dung dịch chất đối chiếu phải có vết có màu sắc giá trị Rf với vết sắc ký đồ dung dịch dược liệu đối chiếu Định lượng: Phương pháp sắc ký lỏng Pha động A: Acetonitril Pha động B: Nước Dung dịch thử: Cân xác khoảng 0,1 g bột dược liệu (rây qua số 355) vào ống nghiệm có nắp, thêm xác 10 ml methanol 80 %, vặn chặt nắp, cân, sau siêu âm 60 phút 45 °C, để nguội, cân lại bổ sung methanol 80% để khối lượng ban đầu Trộn lọc qua màng lọc 0,22 µm Dung dịch chuẩn: Hịa tan chất chuẩn notoginsenosid-NR1, ginsenosidRg1, ginsenosid-Re, ginsenosid-Rb1 ginsenosid-Rd methanol để dung dịch chuẩn có nồng độ chuẩn xác khoảng 0,5 mg/ml Điều kiện sắc ký: - Hệ thống sắc ký: UPLC (Waters, Mỹ) đầu dò PDA - Cột HPLC C18 Phenomenex (150 mm × 4,6 mm; µm) - Đầu dị PDA bước sóng 203 nm 22 - Thể tích tiêm: 10 l - Tốc độ dòng: ml/phút - Nhiệt độ cột: 30 °C Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương trình rửa giải Bảng 2.7 Bảng 2.7 Chương trình pha động định lượng saponin Tam thất Thời gian (phút) Pha động A (% tt/tt) Pha động B (% tt/tt) 11 25 35 40 41 50 52 55 21 21 32 40 60 95 95 21 21 79 79 68 60 40 5 79 79 Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, dung dịch thử Căn vào diện tích pic thu từ dung dịch thử, dung dịch chuẩn hàm lượng chất chuẩn, tính hàm lượng ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rd, ginsenosid-Re notoginsenosid-R1 dược liệu theo công thức sau: 𝑋= 𝑉 𝑆𝑡 × 𝐶𝑐 × × 𝑝 × 100 𝑆𝑐 𝑚 (1 − ℎ ) Trong đó: X: Hàm lượng chất định lượng có mẫu thử (%) Sc: Diện tích đỉnh thu chất chuẩn (µV x s) St: Diện tích đỉnh thu mẫu thử (µV x s) Cc: Nồng độ chất chuẩn (mg/ml) V: thể tích dung mơi chiết xuất mẫu (ml) m: khối lượng mẫu thử (mg) h: độ ẩm mẫu thử (%) p: độ tinh khiết chất chuẩn chất đối chiếu (%) 23 2.4.2 Xây dựng quy trình bào chế Tam thất chế 2.4.2.1 Xây dựng quy trình đánh giá hàm lượng saponin Tam thất điều kiện chế biến khác phương pháp UPLC/PDA Chuẩn bị mẫu: Dược liệu khô xay qua rây cỡ rây 355 Cân xác khoảng 250 mg bột dược liệu, cho vào ống thép không rỉ, thêm tiếp ml nước cất, đậy kín hấp điều kiện 100 °C 2, 4, 6, 8, 10 (n=3) 120 °C 2, 4, 6, 8, 10 (n=3) Dược liệu sau hấp chuyển vào bình định mức 25 ml, bổ sung vừa đủ thể tích MeOH 80% (250 mg dược liệu tương ứng 25 ml MeOH 80%), chiết siêu âm 40 °C Dịch chiết sử dụng để phân tích hàm lượng saponin đánh giá hoạt tính sinh học Dung dịch chuẩn: Chuẩn bị dung dịch chuẩn ginsenosid chính: GRb1, G- Rd, G-Rg1, 20S-G-Rg3, N-R1 20R-G-Rh1 pha nethanol có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml Điều kiện sắc ký: - Hệ thống sắc ký: UPLC (Waters, Mỹ) với đầu dò PDA bước sóng 203 nm - Cột UPLC C18 Acquity Waters (2,1 × 50 mm; 1,7 µm) - Tốc độ dịng: 0,3 ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: l - Nhiệt độ cột: 40 °C Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương trình rửa giải acetonitril (A) nước (B) Bảng 2.8 Bảng 2.8 Chương trình pha động xác định hàm lượng saponin Tam thất điều kiện chế biến khác phương pháp UPLC/PDA Thời gian (phút) Pha động A (% tt/tt) Pha động B (% tt/tt) 5,5 10 19 19 31 34,5 81 81 69 65,5 24 11 13 14 15 18 19 22 50 56 70 95 95 19 19 50 44 30 5 81 81 2.4.2.2 Đánh giá hoạt tính độc tế bào Tam thất điều kiện chế biến khác a) Dòng tế bào Dòng tế bào ung thư vú người MDA-MB-231 đạt tiêu chuẩn ATCC (American type culture collection, Hoa Kỳ), hoạt hóa, ni cấy lưu Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh b) Mẫu thử Cao chiết theo quy trình chuẩn bị mẫu Mục 2.4.2.1 Mỗi điều kiện chế biến thực lặp lại mẫu dược liệu để thu mẫu cao chiết khác Chất đối chứng dương: Doxorubicin “Ebewe”® (Doxorubicin 10 mg/ ml (số lô JZ5440, ngày sản xuất: 13/6/2019, hạn dùng: 13/6/2021) c) Vô trùng môi trường, dụng cụ hóa chất Tủ an tồn sinh học chiếu UV 30 phút, chờ quạt thổi phút trước tiến hành thao tác Các dụng cụ hấp tiệt trùng nhiệt độ 121 °C 30 phút, xịt cồn trước đưa vào sử dụng Các hóa chất, mẫu thử sau chuẩn bị lọc vơ trùng qua màng lọc 0,22 µm chiếu UV 60 phút d) Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị dung dịch mẹ mẫu thử: - Mẫu thử từ Tam thất: bột dược liệu Tam thất chế từ lô chiết với MeOH 80% thu cao chiết toàn phần Cao chiết pha thành mẫu thử dung dịch DMSO 0,2% môi trường ni cấy để tạo thành dung dịch mẹ có nồng độ khoảng 15 mg/ml 25 - Doxorubicin: dung dịch mẹ mg/ml Các dung dịch mẹ bảo quản -20 °C, pha lỗng mơi trường nuôi cấy để đạt nồng độ khảo sát, lọc vơ trùng qua màng lọc 0,22 µm trước sử dụng e) Nuôi cấy xử lý tế bào Tế bào ung thư vú MDA-MB-231 và/hoặc tế bào ung thư phổi A549 nuôi cấy môi trường DMEM, bổ sung 10% FCS, mM L-glutamin, 100 IU/ml penicilin, 100 µM streptomycin.Tế bào ni bình ni cấy 75 cm2, ủ 37 °C, 5% CO2 đạt độ phủ 70-80% Thu đếm tế bào sống với trypan blue, chia vào đĩa nuôi cấy 96 giếng với mật độ 1.104 tế bào/giếng Ủ tế bào 18 – 24 37 °C, 5% CO2 để tế bào phát triển ổn định bám lên bề mặt đĩa nuôi cấy Xử lý tế bào với mẫu thử từ Tam thất pha môi trường nuôi cấy nồng độ khác từ 50 – 500 µg/ml Mẫu đối chứng dương Doxorubicin pha loãng xử lý với tế bào nồng độ: 0,1 – µM Mẫu đối chứng âm (xử lý với môi trường nuôi cấy chứa 0,2% DMSO) tiến hành đồng thời Sau xử lý với mẫu thử mẫu đối chứng, tế bào ủ 37 °C, 5% CO2 72 đánh giá tỉ lệ tế bào sống thử nghiệm MTT f) Đánh giá tỉ lệ tế bào sống phương pháp MTT Nguyên tắc: Tỷ lệ sống tế bào đánh giá dựa hoạt tính enzym succinat dehydrogenase (SDH) Enzym SDH có ty thể tế bào sống, chuyển MTT [3- (4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid)] có màu vàng thành tinh thể formazan có màu tím Tinh thể formazan hịa tan dung mơi hữu isopropanol tạo thành dung dịch màu tím đo mật độ quang bước sóng 570 nm Tỷ lệ tế bào sống tính dựa độ hấp thu mẫu Thực hiện: Tế bào sau xử lý với mẫu thử mẫu đối chứng 72 giờ, loại bỏ môi trường nuôi cấy Rửa tế bào dung dịch PBS, bổ sung dung dịch MTT 0,5 mg/ml pha môi trường nuôi cấy không chứa huyết thanh, ủ 37 °C, 5% CO2 Loại bỏ mơi trường chứa MTT, hịa tan tinh thể formazan tạo 26 thành dung dịch isopropanol acid hóa Đo độ hấp thu bước sóng 570 nm máy đọc microplate Tính kết quả: % ức chế so với mẫu chứng = 100% – (OD mẫu thử/OD mẫu chứng) x 100% *Dựa vào kết đánh giá hàm lượng saponin đánh giá hoạt tính độc tế bào mẫu Tam thất chế, lựa chọn điều kiện chế biến thích hợp 2.4.2.3 Bào chế Tam thất chế Mục đích: xây dựng quy trình bào chế Tam thất chế, đồng thời đánh giá tính ổn định lặp lại quy trình chế biến nâng cấp lên quy mô sản xuất lớn Cách tiến hành: Quy trình chế biến thể ở: - Chế biến quy mơ phịng thí nghiệm: Tiến hành chế biến dược liệu Tam thất nhiệt độ thời gian lựa chọn Thực lô, lô tối thiểu 500 g Tam thất - Chế biến quy mô 3-5 kg Tam thất: Tiến hành khảo sát điều chỉnh thơng số quy trình điều kiện chế biến quy mô tối thiểu 3-5 kg Tam thất, thực lô Dược liệu sau hấp sấy khô 60 oC (để đạt hàm ẩm 12%) bảo quản điều kiện tránh ẩm tránh sáng Hình 2.1 Sơ đồ quy trình bào chế Tam thất chế 27 2.4.3 Xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu Tam thất chế 2.4.3.1 Xây dựng quy trình định lượng saponin Tam thất chế phương pháp HPLC/PDA a) Khảo sát điều kiện sắc ký Chuẩn bị mẫu: Dung dịch chuẩn: cân xác khoảng 1,00 mg chuẩn G-Rg1, G-Rb1, 20R-G-Rh1, G-Rd 20S-G-Rg3 cho vào bình định mức ml Hịa tan bổ sung thể tích vừa đủ MeOH 80% để thu hỗn hợp chuẩn có nồng độ 0,5 mg/ml Dung dịch thử: Cân xác khoảng 100 mg bột dược liệu (rây qua số 355) vào ống nghiệm có nắp, thêm xác 10 ml methanol 80 %, vặn chặt nắp, cân, siêu âm 45 °C 60 phút Để nguội, cân lại bổ sung MeOH 80% để khối lượng ban đầu, lọc qua màng lọc 0,22 µm Khảo sát bước sóng phát hiện: Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn với dải bước sóng phát từ 190 nm-400 nm Dựa vào phổ UV chất đối chiếu, chọn bước sóng có cực đại hấp thu làm bước sóng phát Khảo sát chương triển khai sắc ký : Tiến hành phân tích đồng thời dung dịch thử dung dịch đối chiếu với hệ dung môi sử dụng acetonitril nước, chế độ rửa giải gradient với tăng dần nồng độ acetonitril Điều chỉnh thành phần rửa giải tốc độ dịng nhiệt độ cột thích hợp cho pic cần định lượng mẫu thử đạt tiêu chí: - Pic đạt độ tinh khiết - Pic tách tốt (Rs ≥ 1,5) - Pic cân đối hạn chế bị kéo đuôi (0,8 ≤ As ≤ 1,5) - Hệ số dung lượng k’≥ 1,0 - Độ lặp lại tốt b) Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu Quy trình chuẩn bị mẫu phải đảm bảo mục tiêu: - Chiết kiệt chất cần định lượng 28 - Quy trình đơn giản, hiệu cho kết lặp lại i Khảo sát dung mơi chiết xuất: Cân xác khoảng 100 mg bột dược liệu Tam thất chế cho vào ống ly tâm 12 ml, thêm xác 10 ml dung môi cần khảo sát (MeOH 100%, MeOH 80%, MeOH 50% nước); đậy chặt nắp, vortex siêu âm 45 oC vòng 60 phút Lọc dịch chiết qua màng lọc PTFE 0,22 µm, khai triển hệ thống HPLC theo điều kiện sắc ký khảo sát Dựa vào diện tích đỉnh saponin cần định lượng, lựa chọn dung môi chiết tối ưu ii Khảo sát nhiệt độ chiết xuất: Cân xác khoảng 100 mg bột dược liệu Tam thất chế cho vào ly tâm 12 ml, thêm xác 10 ml dung môi chiết khảo sát; đậy chặt nắp, vortex, siêu âm 45, 60 oC đun hồi lưu 85 oC vòng 60 phút (phương pháp chiết thay đổi để phù hợp với nhiệt độ chiết: siêu âm nhiệt độ chiết không 60 oC đun hồi lưu nhiệt độ chiết cao hơn) Lọc dịch chiết qua màng lọc PTFE 0,22 µm, khai triển hệ thống HPLC theo điều kiện sắc ký khảo sát Dựa vào diện tích đỉnh saponin cần định lượng, lựa chọn nhiệt độ chiết tối ưu iii Khảo sát thời gian chiết xuất: Cân xác khoảng 100 mg bột dược liệu Tam thất chế cho vào ly tâm 12 ml, thêm xác 10 ml dung môi chiết khảo sát; đậy chặt nắp, vortex siêu âm nhiệt độ khảo sát khoảng thời gian 30, 45, 60, 75 90 phút Lọc dịch chiết qua màng lọc PTFE 0,22 µm, khai triển hệ thống HPLC theo điều kiện sắc ký khảo sát Dựa vào diện tích đỉnh saponin cần định lượng, lựa chọn thời gian chiết tối ưu iv Khảo sát tỉ lệ dược liệu - dung môi số lần chiết Lần lượt cân xác khoảng 100, 150, 200 mg bột dược liệu Tam thất chế cho vào ống ly tâm 12 ml Tiến hành chiết với dung môi, nhiệt độ thời gian chiết khảo sát Gạn lấy dịch chiết lần 1, rửa bã dược liệu dung môi chiết 29 tiến hành chiết với điều kiện tương tự lần Lọc dịch chiết lần lần qua màng lọc PTFE 0,22 µm, khai triển hệ thống HPLC theo điều kiện sắc ký khảo sát Dựa vào diện tích đỉnh saponin cần định lượng, tính tốn hàm lượng saponin chiết tỉ lệ, chọn tỉ lệ dược liệu: dung môi chiết tối ưu 2.4.3.2 Đánh giá quy trình định lượng saponin có Tam thất chế phương pháp HPLC/PDA Quy trình định lượng tiến hành xây dựng phương pháp thẩm định theo ICH bao gồm: Tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại độ đúng, giới hạn định lượng (LOQ) giới hạn phát (LOD) a) Tính tương thích hệ thống Chuẩn bị mẫu: chuẩn bị mẫu thử theo quy trình khảo sát mục 2.4.2.1 Cách tiến hành: Triển khai sắc ký với lần tiêm mẫu thử Ghi nhận thông số sắc ký: thời gian lưu (tR), diện tích pic (S), số đĩa lý thuyết (N), hệ số dung lượng (k’), hệ số kéo đuôi (As), độ phân giải (Rs) Yêu cầu: Hệ thống đạt tính tương thích thỏa mãn yêu cầu Bảng 2.9 Bảng 2.9 Yêu cầu thông số sắc ký kiểm tra tính tương thích hệ thống Thơng số sắc ký ts S k’ As Rs Yêu cầu RSD% ≤ RSD% ≤ k’ ≥ 1,0 0,8 ≤ As ≤ 1,5 Rs >1,5 b) Tính đặc hiệu Chuẩn bị mẫu: - Mẫu trắng: Dung môi chiết xuất khảo sát - Mẫu chuẩn: Hỗn hợp chuẩn đối chiếu gồm G-Rg1, G-Rb1, 20R-G-Rh1, GRd, 20S-G-Rg3 với nồng độ 0,1 mg/ml chuẩn bị theo quy trình chuẩn bị mẫu chuẩn Mục 2.4.2.1 30 - Mẫu thử: Pha loãng (2 lần) dung dịch thử chuẩn bị theo quy trình chuẩn bị mẫu định lượng khảo sát - Mẫu thử thêm chuẩn: Thêm xác ml hỗn hợp chuẩn vào ml dung dịch thử Cách tiến hành: Triển khai sắc ký mẫu chuẩn bị So sánh thời gian lưu, phổ UV pic chất cần định lượng mẫu Yêu cầu: - Sắc ký đồ mẫu trắng không xuất pic khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn - Sắc ký đồ mẫu thử cho pic có thời gian lưu tương tự với pic chất chuẩn sắc ký đồ mẫu chuẩn Trên sắc ký đồ mẫu thử xuất thêm pic khác, pic chất cần phân tích, pic chất cần phân tích phải tách hồn tồn khỏi pic tạp - Diện tích đỉnh chất cần định lượng mẫu thử thêm chuẩn phải tăng lên so với mẫu thử - Phổ UV chất mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thử thêm chuẩn phải tương đương c) Tính tuyến tính Chuẩn bị mẫu: cân xác khoảng 2,5 mg chuẩn đối chiếu G-Rg1, GRb1, 20R-G-Rh1, G-Rd 20S-G-Rg3 cho vào bình định mức ml Hòa tan bổ sung thể tích vừa đủ MeOH 80% để thu dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 0,5 mg/ml Từ dung dịch chuẩn gốc, pha loãng thành giai mẫu với mức nồng độ 0,50 – 0,25 – 0,125 – 0,1 – 0,05 – 0,01 mg/ml Cách tiến hành: - Tiến hành phân tích mẫu Ghi nhận lại sắc ký đồ xác định đáp ứng pic mẫu - Xây dựng phương trình hồi quy có dạng y = B0x + B - Sử dụng trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa hệ số phương trình hồi quy 31 Giả thuyết: Ho: Bj = “hệ số Bj khơng có ý nghĩa thống kê” HA: Bj ≠ “hệ số Bj khơng có ý nghĩa thống kê” Giá trị thống kê: 𝑡= |𝐵𝑖−𝛽𝑖| √𝑆𝑏2 = 𝐵 √𝑆𝑏2 𝑆𝑏2 = ∑(𝑋 𝑆2 𝑖 −𝑋𝑡𝑏 ) Biện luận: Nếu t0 < t0,05 (N-2) => Chấp nhận giả thuyết H0 Nếu t0 > t0,05 (N-2) => Chấp nhận giả thuyết HA Sử dụng trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp phương trình hồi quy Giả thuyết: H0: “Phương trình hồi quy khơng tương thích” HA: “Phương trình hồi quy tương thích” Giá trị thống kê: 𝐹= 𝑆𝑓2 𝑆𝑟2 Trong đó: 𝑆𝑓2 : Phương sai yếu tố khảo sát 𝑆𝑟2 : Phương sai yếu tố ngẫu nhiên Biện luận: Nếu F < F0,05 => chấp nhận giả thiết H0 Nếu F > F0,05 => chấp nhận giả thiết HA d) Giới hạn định lượng (LOQ) giới hạn phát (LOD) Tiến hành đo tín hiệu thu từ mẫu chuẩn có nồng độ xác định Giả sử tín hiệu tạp nhiễu đường thu từ mẫu trắng N, tín hiệu pic mẫu chuẩn S Thiết lập tỉ lệ S/N dựa vào chiều cao pic với LOD có S/N =2/1 hay 3/1 LOQ có S/N = 9/1 hay 10/1 Từ tín hiệu S, tính nồng độ đem đo suy LOD LOQ kiểm tra thực nghiệm 32 e) Độ xác a Độ lặp lại Chuẩn bị mẫu: Chuẩn bị 06 mẫu thử theo quy trình chuẩn bị mẫu định lượng khảo sát Cách tiến hành: Thực quy trình định lượng 06 mẫu thử, người ngày, thiết bị phịng thí nghiệm Độ lặp lại phương pháp xác định giá trị %RSD kết xác định hàm lượng saponin có mẫu dược liệu (%) 𝑋= 𝑉 𝑆𝑡 × 𝐶𝑐 × × 𝑝 × 100 𝑚(1 − ℎ) 𝑆𝑐 Trong đó: X: Hàm lượng chất định lượng có mẫu thử (%) Sc: Diện tích đỉnh thu chất chuẩn (µV x s) St: Diện tích đỉnh thu mẫu thử (µV x s) V: thể tích dung mơi chiết xuất mẫu (ml) m: lượng cân bột dược liệu (mg) h: độ ẩm bột dược liệu (mg) p: độ tinh khiết chất đối chiếu (%) b Độ xác trung gian Tiến hành tương tự độ lặp lại, lặp lại thử nghiệm ngày khác, người, thiết bị phịng thí nghiệm Xác định mức độ sai khác kết định lượng mẫu ngày phân tích ngày phân tích khác f) Độ Chuẩn bị mẫu: xác định hàm lượng câc chất chuẩn cần định lương mẫu thử Thêm xác lượng thể tích chất chuẩn cần phân tích vào mẫu thử Tiến hành chiết theo quy trình chuẩn bị mẫu thử khảo sát Lượng chất chuẩn thêm vào tương ứng với mức nồng độ 80, 100 120% so với hàm lượng chất cần 33 định lượng mẫu thử nằm khoảng tuyến tính phương pháp Tại mức nồng độ, thực 03 mẫu độc lập Cách tiến hành: Phân tích mẫu theo quy trình khảo sát Xác định độ phương pháp theo công thức: 𝑇ỉ 𝑙ệ 𝑡ℎ𝑢 ℎồ𝑖 (%) = 𝐿ượ𝑛𝑔 𝑐ℎấ𝑡 𝑡ì𝑚 𝑡ℎấ𝑦 × 100% 𝐿ượ𝑛𝑔 𝑐ℎấ𝑡 𝑐ℎ𝑢ẩ𝑛 𝑡ℎê𝑚 𝑣à𝑜 2.4.3.3 Xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu Tam thất chế Dựa theo DĐVN V - chuyên luận Tam thất (rễ củ) quy trình định lượng xây dựng Mục 2.4.3.1 tiến hành kiểm nghiệm lô dược liệu Tam thất chế biến quy mô tối thiểu 500 g (theo mục 2.4.2.3) với tiêu: mô tả, soi bột, độ ẩm, tro toàn phần, chất chiết dược liệu, định tính định lượng Mơ tả Kiểm tra hình thái, màu sắc mùi vị dược liệu cảm quan, kiểm tra kích thước cách đo trực tiếp Soi bột Dược liệu xay nhỏ rây qua rây 0,5 mm để thu bột có độ mịn đồng Nhận xét cảm quan bột dược liệu mắt thường, soi bột kính hiển vi Độ ẩm Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.6, 1g, 105 oC Tro toàn phần Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.8 Chất chiết dược liệu Tiến hành theo phương pháp chiết nóng (DĐVN V, phụ lục 12.10), dùng methanol làm dung mơi Định tính Phương pháp sắc ký lớp mỏng Bản mỏng: Silica gel F254 34 Dung môi khai triển: Hỗn hợp cloroform – ethyl acetat – methanol – nước (15:40:22:10) Dung dịch thử: Lấy khoảng 0,2 g bột dược liệu, thêm ml methanol, siêu âm 20 phút, lọc lấy dịch chiết Dung dịch chất đối chiếu: Hòa tan chất chuẩn ginsenosid-Rg1, ginsenosidRb1, ginsenosid-Rd, ginsenosid-Rh1, ginsenosid-Rg3 notoginsenosid-R1 methanol 100 % để dung dịch hỗn hợp chuẩn có nồng độ chuẩn khoảng 0,5 mg/ml Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl ((bằng mao quản có khắc vạch) cho dung dịch Triển khai sắc ký đến dung môi khoảng cm, lấy mỏng ra, để khô nhiệt độ phòng, phun dung dịch H2SO4 %/ cồn 96% Sấy mỏng 105 °C xuất rõ vết Quan sát mỏng ánh sáng thường ánh sáng tử ngoại bước sóng 365 nm Định lượng Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, dung dịch thử theo quy trinh định lượng Mục 2.4.3.1 Căn vào diện tích pic thu từ dung dịch thử, dung dịch chuẩn hàm lượng chất chuẩn ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rd, 20Rginsenosid-Rh1 20S-ginsenosid-Rg3, tính hàm lượng dược liệu theo cơng thức sau: 𝑋= 𝑆𝑡 𝑉 × 𝐶𝑐 × × 𝑝 × 100 𝑆𝑐 𝑚(1 − ℎ) Trong đó: X: Hàm lượng chất định lượng có mẫu thử (%) Sc: Diện tích đỉnh thu chất chuẩn (µV x s) St: Diện tích đỉnh thu mẫu thử (µV x s) V: thể tích dung mơi chiết xuất mẫu (ml) m: lượng cân bột dược liệu (mg) h: độ ẩm bột dược liệu (mg) p: độ tinh khiết chất đối chiếu (%) 35 Giới hạn kim loại nặng: Mẫu nguyên liệu Tam thất chế gửi đến Trung tâm Dịch vụ phân tích thí nghiệm TP Hồ Chí Minh để kiểm tra tiêu giới hạn kim loại nặng với nội dung thể Bảng 2.11 Bảng 2.10 Các tiêu kiểm tra giới hạn kim loại nặng bột Tam thất chế Chỉ tiêu kiểm nghiệm As Cd Hg Pb Phương pháp thử AOAC 986.15 AOAC 999.11 AOAC 971.21 AOAC 999.11 * Từ kết kiểm nghiệm mẫu Tam thất chế lơ chế biến quy mơ phịng thí nghiệm, đề xuất tiêu chuẩn cho dược liệu Tam thất chế 2.4.3.4 Kiểm nghiệm lô chế biến quy mô 3-5 kg Kiểm nghiệm lô chế biến quy mô 3-5 kg theo tiêu chuẩn xây dựng Mục 2.4.3.3 36 CHƯƠNG KẾT QUẢ 3.1 Khảo sát nguyên liệu đầu vào 3.1.1 Cảm quan Rễ củ có hình dạng thay đổi, hình trụ hay hình chùy, dài 1,5 cm đến 5,0 cm, đường kính 1,2 cm đến 2,0 cm Mặt ngồi màu vàng xám nhạt, có đánh bóng, mặt có vết nhăn dọc nhỏ Trên đầu có bướu nhỏ vết tích rễ con, phần có phân nhánh Trên đỉnh cịn vết tích thân Chất cứng rắn, khó bẻ, khó cắt Khi đập vỡ, phần gỗ phần vỏ dễ tách rời Mặt cắt ngang có lớp vỏ màu xám nhạt, có chấm nhỏ màu nâu (ống tiết), phần gồ màu xám nhạt, mạch gỗ xếp hình tia tỏa trịn Mùi thơm nhẹ đặc biệt, vị đắng Hình ảnh đại diện lơ Tam thất nguyên liệu trình bày Phụ lục 3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết mẫu Tất mẫu Tam thất có độ ẩm khơng 11% (DĐVN V quy định giờ) khó khả thi Do vậy, đề tài chọn điều kiện hấp 120 oC để chể biến Tam thất 3.2.2 Đánh giá hoạt tính độc tế bào Tam thất chế Các mẫu Tam thất chế gửi đến Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh để khảo sát hoạt tính ức chế tế bào ung thư vú MDA-MB-231 Kết trình bày Phụ lục Có thể đưa số kết luận sau: - Đối với mẫu Tam thất chưa chế biến, khả ức chế tế bào ung thư vú MDA-MB-231 thấp Cụ thể, nồng độ cao thử nghiệm 750 µg/mL Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 45 (tương đương g bột dược liệu), tỷ lệ ức chế tế bào đạt khoảng 48% so với mẫu chứng âm (DMSO 0,2%) - Sau hấp 100 oC giờ, khả ức chế tế bào ung thư vú MDA-MB-231 cao chiết từ Tam thất thay đổi không đáng kể so với mẫu chưa chế biến, tỉ lệ ức chế tế bào nồng độ thử nghiệm thấp 50%, chưa xác định IC50 mẫu hấp 100 oC Khi tăng thời gian chế biến, khả ức chế tế bào ung thư vú mẫu thử từ Tam thất tăng rõ rệt theo thời gian Cụ thể IC50 mẫu thử chế biến 6, 10 690 ± 0,11 µg/ml, 380 ± 0,07 µg/ml 28,5 ± 0,19 μg/ml - Khi chế biến Tam thất nhiệt độ 120 oC làm tăng đáng kể khả ức chế tế bào ung thư MDA-MB-231 Hoạt tính mẫu thử tăng dần tăng thời gian chế biến từ giờ, giờ, thể qua IC50 giảm dần: 397,5 ± 0,08 μg/ml, 267,5 ± 0,06 μg/ml 192,5 ± 0,03 μg/ml Khi tăng thời gian chế biến Tam thất 120 oC lên 10 giờ, khả ức chế tế bào ung thư thay đổi không đáng kể so với mẫu chế biến Như vậy, trình chế biến Tam thất cách hấp điều kiên nhiệt độ thời gian khác làm tăng hoạt tính ức chế tế bào ung thư vú MDA-MB-231 Tam thất so với mẫu chưa chế biến Nhìn chung, tăng thời gian chế biến làm tăng hoạt tính kháng ung thư mẫu thử Giữa điều kiện nhiệt độ, trình chế biến Tam thất 120 oC cho hiệu tốt 100 oC 800 750.0 750.0 690.0 Nồng độ IC50 700 600 500 397.5 380.0 400 282.5 267.5 300 192.5 200 197.5 202.5 100 0 giờ Thô giờ 10 Thời gian hấp 100 oC 120 oC Hình 3.4 IC50 cao chiết Tam thất điều kiện chế biến khác Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 46 Kết luận chung: Tam thất sau hấp 120 oC vòng giữ đầy đủ thành phần saponin thể hoạt tính ức chế tế bào ung thư vú MDA-MB-231 hiệu quả, đồng thời điều kiện chế biến thích hợp quy mơ sản xuất Do đó, điều kiện chế biến lựa chọn để thực nghiên cứu 3.2.3 Bào chế Tam thất chế Ở quy mơ phịng thí nghiệm, mẫu dược liệu Tam thất (thực với lô thử nghiệm, lô kg Tam thất nguyên củ) khảo sát Mục 3.1 hấp 120 oC vịng giờ, sau sấy khơ 60 oC (để đạt hàm ẩm 12%) Dược liệu Tam thất chế sau xay nhỏ, qua rây 355 bảo quản điều kiện thích hợp dùng để xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu Tam thất chế Nâng cấp cỡ lô, tiến hành hấp lô dược liệu (mỗi lô kg Tam thất nguyên củ) điều kiện tương tự, sau sấy khơ, thu lô Tam thất chế 3.3 Xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu Tam thất chế 3.3.1 Xây dựng quy trình định lượng saponin Tam thất chế phương pháp HPLC/PDA 3.3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký Khảo sát bước sóng phát hiện: Tiến hành theo Mục 2.4.3.1, dựa vào phổ UV chất chuẩn (Hình 3.5), tham khảo từ Chuyên luận Tam thất (Rễ củ) (DĐVN V) số tài liệu tham khảo định lượng saponin Tam thất (Bảng 1.3) Lựa chọn bước sóng 203 nm làm bước sóng phát định lượng Hình 3.5 Kết khảo sát bước sóng phát Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 47 Khảo sát chương trình triển khai sắc ký: Tiến hành theo mục 2.4.3.1, chương trình pha động khảo sát thể qua sắc ký đồ phân tích mẫu thử trình bày Hình 3.6 Điều kiện sắc ký lựa chọn (Bảng 3.4) để định lượng đồng thời saponin Tam thất chế cho thấy pic cần định lượng tách hoàn toàn với pic kế cận pic đạt độ tinh khiết pic (Phụ lục 3) Hình 3.6 Sắc ký đồ khảo sát chương trình rửa giải phân tích dịch chiết MeOH Tam thất chế Kết luận: Điều kiện sắc ký cho quy trình định lượng số saponin Tam thất chế đề nghị sau: - Cột HPLC C18 Phenomenex (150 mm ì 4,6 mm; àm) - Detector PDA bước sóng 203 nm - Thể tích tiêm: 10 l - Tốc độ dòng: ml/phút - Nhiệt độ cột: 30 °C Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương trình dung mơi sau: Bảng 3.4 Chương trình rửa giải phân tích dịch chiết MeOH Tam thất chế Thời gian (phút) – 11 11 25 27 Acetonitril (% tt/tt) 21 21 30 35 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Nước (%tt/tt) 79 79 70 65 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 48 Thời gian (phút) 37 50 51 60 61 65 Acetonitril (% tt/tt) 39 53 95 95 21 21 Nước (%tt/tt) 61 47 5 79 79 3.3.1.2 Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu thử a) Khảo sát dung môi chiết xuất: Tiến hành theo mục 2.4.3.1, kết trình bày Bảng 3.5 Bảng 3.5 Kết khảo sát dung môi chiết xuất Thời gian chiết MeOH 100% MeOH 80% MeOH 50% H2 O G-Rg1 320091 323623 305334 322367 G-Rb1 355902 364958 360362 351078 Diện tích đỉnh 20R-G-Rh1 170808 163705 166725 176931 G-Rd 146577 155045 145174 140474 20S-G-Rg3 228244 234211 233233 228689 Nhận xét: Hàm lượng saponin thu chiết MeOH 80% cao so với dung môi chiết khác Do đó, chọn MeOH 80% làm dung mơi chiết xuất quy trình chuẩn bị mẫu định lượng b) Khảo sát nhiệt độ chiết xuất: Tiến hành theo mục 2.4.3.1, kết trình bày Bảng 3.6 Bảng 3.6 Kết khảo sát nhiệt độ chiết xuất Nhiệt độ chiết 45 oC 60 oC 85 oC Diện tích đỉnh G-Rg1 G-Rb1 20R-G-Rh1 G-Rd 20S-G-Rg3 276939 337027 329288 295203 356161 362104 146923 356161 362104 127591 143996 149431 201464 227961 230739 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 49 Nhận xét: Bột dược liệu chiết siêu âm 60 oC thu saponin có hàm lượng cao Do đó, chọn chiết siêu âm 60 oC làm điều kiện chiết xuất quy trình chuẩn bị mẫu định lượng c) Khảo sát thời gian chiết xuất: Tiến hành theo mục 2.4.3.1, kết trình bày Bảng 3.7 Bảng 3.7 Kết khảo sát thời gian chiết xuất Thời gian chiết 30 phút 45 phút 60 phút 75 phút G-Rg1 320091 323623 330534 322367 G-Rb1 355902 364958 360362 351078 Diện tích đỉnh 20R-G-Rh1 170808 163705 166725 176931 G-Rd 146577 155045 145174 140474 20S-G-Rg3 228244 234211 233233 228689 Nhận xét: nhìn chung, khơng có khác biệt đáng kể chiết dược liệu thời gian chiết tăng dần Tuy nhiên, từ phút 45 trở đi, có giảm nhẹ hàm lượng saponin chiết G-Rb1, Rd 20S-G- Rg3 Do đó, chọn 45 phút thời gian chiết xuất quy trình chuẩn bị mẫu định lượng d) Khảo sát tỉ lệ dược liệu - dung môi số lần chiết xuất Tiến hành theo mục 2.4.3.1, kết khảo sát chiết lần trình bày Bảng 3.8 Dịch chiết lần khơng cịn saponin cần định lượng tỉ lệ chiết khảo sát Bảng 3.8 Kết khảo sát tỉ lệ dược liệu - dung môi chiết lần MeOH 80% Diện tích đỉnh Lượng cân (mg) G-Rg1 G-Rb1 20R-G-Rh1 G-Rd 20S-G-Rg3 100 150 200 329765 487465 645653 355747 524789 692262 166389 229257 297482 146615 214161 281725 232316 124257 172214 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 50 Nhận xét: Tính tốn hàm lượng saponin chiết tỉ lệ (Bảng 3.9) So sánh hàm lượng saponin chiết tỉ lệ dược liệu - dung môi, lựa chọn chiết 100 mg bột dược liệu 10 ml dung môi điều kiện chuẩn bị mẫu định lượng Bảng 3.9 Hàm lượng saponin chiết tỉ lệ dược liệu - dung môi khác Hàm lượng (mg/100mg) Lượng cân (mg) G-Rg1 G-Rb1 20R-G-Rh1 G-Rd 20S-G-Rg3 100 150 200 0,949 0,935 0,929 1,445 1,421 1,400 0,326 0,312 0,306 0,552 0,538 0,536 0,870 0,852 0,851 e) Kết luận việc khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu Như vậy, để chuẩn bị mẫu cho quy trình định lượng, tiến hành cân xác khoảng 100 mg bột dược liệu Tam thất chế (rây qua số 355) vào ống nghiệm có nắp, thêm xác 10 ml methanol 80 %, vặn chặt nắp, cân, siêu âm 60 °C 45 phút Để nguội, cân lại bổ sung MeOH 80% để khối lượng ban đầu, lọc qua màng lọc 0,22 µm 3.3.2 Đánh giá quy trình định lượng 3.3.2.1 Tính tương thích hệ thống Tiến hành theo mục 2.4.3.2, kết trình bày Bảng 3.10 Hình 3.7 Bảng 3.10 Các thơng số sắc ký chất cần định lượng mẫu thử Hợp chất G-Rg1 G-Rb1 20R-G-Rh1 G-Rd TB %RSD TB %RSD TB %RSD TB %RSD tR S 16,959 0,3 30,171 0,1 31,750 0,1 34,617 0,2 325833 1,0 361127 0,3 163722 1,0 146067 0,9 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn k’ As Rs 16,01 0,91 - 29,22 0,93 4,11 30.82 1,13 4,13 33,76 0,87 15,24 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 51 20S-G-Rg3 TB %RSD 47,198 0,1 222444 0,9 46,30 0,96 10,96 Hình 3.7 Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống Nhận xét: Giá trị RSD thời gian lưu diện tích pic ≤ 2,0% Đồng thời, thông số khác pic đáp ứng yêu cầu quy định Bảng 2.9 Kết luận: Quy trình đạt tính tương thích hệ thống 3.3.2.2 Tính đặc hiệu Tiến hành theo mục 2.4.3.2, kết trình bày Bảng 3.11 Hình 3.8 Bảng 3.11 Kết khảo sát độ đặc hiệu Mẫu Trắng Chuẩn Thử Chuẩn + Thử G-Rg1 187357 189493 368986 G-Rb1 130163 192685 310079 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Diện tích đỉnh 20R-G-Rh1 259610 88869 357148 G-Rd 145238 78336 226999 20S-G-Rg3 76306 119027 202654 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 52 Hình 3.8 Kết khảo sát độ đặc hiệu Nhận xét: - Sắc ký đồ mẫu trắng không xuất pic khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn - Sắc ký đồ mẫu thử cho pic có thời gian lưu tương tự với pic chất chuẩn sắc ký đồ mẫu chuẩn, pic chất cần phân tích tách hồn tồn khỏi pic tạp - Diện tích đỉnh chất cần định lượng mẫu thử thêm chuẩn tăng lên so với mẫu thử - Phổ UV chất mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thử thêm chuẩn tương đương (xem Phụ lục 10) 3.3.2.3 Tính tuyến tính Tiến hành theo mục 2.2.3, kết trình bày Bảng 3.12 Hình 3.9 Bảng 3.12 Tương quan nồng độ diện tích đỉnh chất phân tích Nồng độ (mg/ml) 0,010 0,050 0,100 0,125 0,250 0,500 G-Rg1 33841 166662 360343 448690 888604 1803309 G-Rb1 23949 122068 254388 320401 633687 1276761 Diện tích pic (µV*s) 500000 0 20S-G-Rg3 24414 136208 256718 314200 622058 1276316 2000000 y = 2557.2x - 2571.3 R² = 1000000 G-Rd 25286 125288 270127 339331 680634 1369406 G-Rg1 G-Rb1 1500000 Diện tích pic (µV*S) Diện tích đỉnh 20R-G-Rh1 48663 239186 513628 640378 1272190 2556982 200 400 Nồng độ (ppm ) 600 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn y = 3613.7x - 6455.8 R² = 0.9999 1500000 1000000 500000 0 200 400 Nồng độ (ppm) 600 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 53 G-Rd 20R-G-Rh1 1500000 Diện tích pic (µL*S) Diện tích đỉnh (µL*S) 3000000 y = 5124.6x - 5495.2 R² = 0.9999 2500000 2000000 y = 2750.3x - 6087.9 R² = 1000000 1500000 1000000 500000 500000 0 200 400 Nồng độ (ppm) 600 200 400 Nồng độ (ppm) 600 20S-G-Rg3 Diện tích pic (µV*S) 1500000 y = 2540.4x + 107.92 R² = 0.9997 1000000 500000 0 100 200 300 400 Nồng độ (ppm ) 500 600 Hình 3.9 Đường tuyến tính chuẩn đối chiếu Từ phương trình hồi quy (có dạng y = B0x+ B) xây dựng, xử lý kết xác định tính tương thích phương trình (Bảng 3.13) Bảng 3.13 Xử lý kết xác định tính tương thích phương trình hồi quy chất phân tích Các giá trị G-Rg1 G-Rb1 20R-G-Rh1 G-Rd 20S-G-Rg3 Hệ số B0 Hệ số B R2 F0,05 F t0,05 tB tB0 Phương trình hồi quy (*) Khoảng tuyến tính (mg/ml) 3613,7 6455,8 0,9999 2557,2 2571,3 1,0000 2750,3 6087,9 1,0000 2540,4 107,92 0,9997 42603,671 126131,720 85222,036 13451,816 -1,565 208,813 1,499 355,150 5124,6 5495,2 0,9999 7,709 75323,485 2,132 -1,235 274,451 -2,712 291,928 0,021 115,982 y = 3613,7x y = 2557,2x y = 5124,6x y = 2750,3x y = 2540,4x 0,01 – 0,5 0,01 – 0,5 0,01 – 0,5 0,01 – 0,5 0,01 – 0,5 (*) Phương trình hồi quy tương thích (F > F0,05), hệ số B khơng có ý nghĩa thống kê (tB < t0,05) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 54 3.3.2.4 Giới hạn định lượng (LOQ) giới hạn phát (LOD) Tiến hành theo mục 2.4.2.2, kết trình bày Bảng 3.14 Hình 3.10 Bảng 3.14 Giá trị LOD LOQ chất phân tích LOQ (mg/ml) 0,006 0,0075 0,006 0,0075 0,0075 G-Rg1 G-Rb1 20R-G-Rh1 G-Rd 20S-G-Rg3 LOD (mg/ml) 0,002 0,0025 0,002 0,0025 0,0025 0.003 0.004 30.678 0.002 30.381 30.073 AU AU 0.001 16.443 15.987 0.002 0.000 0.000 -0.001 29.40 29.60 29.80 30.00 30.20 30.40 30.60 30.80 31.00 31.20 Minutes 15.50 15.60 15.70 15.80 15.90 16.00 16.10 16.20 16.30 16.40 16.50 16.60 16.70 16.80 16.90 17.00 17.10 17.20 17.30 Minutes 0.004 31.417 0.002 31.107 AU 0.003 0.001 0.000 30.20 30.40 30.60 30.80 31.00 31.20 31.40 Minutes 31.60 31.80 32.00 32.20 32.40 32.60 0.0410 0.0030 34.239 0.0400 0.0010 0.0390 46.615 34.563 0.0015 47.171 0.0395 AU 0.0020 AU 46.869 0.0405 0.0025 0.0385 0.0380 0.0005 0.0375 0.0000 0.0370 33.80 33.90 34.00 34.10 34.20 34.30 34.40 34.50 34.60 34.70 34.80 Minutes 34.90 46.30 46.40 46.50 46.60 46.70 46.80 Minutes 46.90 47.00 47.10 47.20 47.30 Hình 3.10 Giới hạn phát (LOD) chất đối chiếu 3.3.2.5 Độ xác Tiến hành theo mục 2.4.3.2, kết trình bày Hình 3.11 Bảng 3.15, 3.16 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 55 Hình 3.11 Sắc ký đồ khảo sát độ xác Bảng 3.15 Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại (ngày 1) Lượng cân G-Rg1 G-Rb1 20R-G-Rh1 G-Rd 20S-G-Rg3 143604 140320 144874 143519 143598 146600 217093 217167 215262 217167 214984 218580 0,541 0,528 0,546 0,540 0,541 0,522 0,541 0,008 1,43 0,813 0,813 0,806 0,813 0,805 0,818 0,811 0,005 0,617 Diên tích pic (µV*S) 100,1 99,9 100,0 100,1 100,1 100,2 100,1 99,9 100,0 100,1 100,1 100,2 TB SD %RSD 322408 311857 325382 311664 324073 322798 0,928 0,897 0,936 0,897 0,933 0,929 0,920 0,018 1,95 347575 160787 343614 166329 348378 160615 346319 161827 348773 164469 346774 159521 Hàm lượng (mg/100mg) 1,412 0,315 1,396 0,326 1,415 0,314 1,408 0,317 1,417 0,322 1,409 0,312 1,409 0,318 0,008 0,005 0,54 1,61 Bảng 3.16 Kết khảo sát độ lặp lại (ngày 2) Lượng cân G-Rg1 G-Rb1 20R-G-Rh1 G-Rd 20S-G-Rg3 145386 144976 149839 144691 218795 215906 209218 221717 Diên tích pic (µV*S) 100,1 100,0 100,1 99,9 310117 313397 310864 308410 351920 347944 350254 353545 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 155776 155763 158066 159788 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 56 100,0 100,2 100,1 99,9 100,0 100,1 100,1 100,2 TB SD %RSD 314658 316339 0,892 0,902 0,895 0,887 0,905 0,910 0,899 0,009 0,96 350932 159413 350137 161827 Hàm lượng (mg/100mg) 1,429 0,305 1,413 0,305 1,423 0,309 1,436 0,313 1,425 0,312 1,422 0,317 1,425 0,310 0,008 0,003 0,54 0,82 144408 144425 219022 223395 0,548 0,546 0,564 0,545 0,544 0,544 0,544 0,001 0,11 0,819 0,808 0,783 0,830 0,820 0,836 0,816 0,019 2,30 Nhận xét: Quy trình có độ lặp lại tương đối cao, giá trị RSD dao động khoảng 0,54 – 2,30 % Độ sai khác kết trung bình ngày phân tích khơng đáng kể, với RSD khơng q 2% Hàm lượng trung bình saponin cần định lượng mẫu Tam thất chế xác định trình bày Bảng 3.17 Bảng 3.17 Kết khảo sát độ xác trung gian Hàm lượng (mg/100 mg) G-Rg1 G-Rb1 20R-G-Rh1 G-Rd 20S-G-Rg3 TB 0,910 1,417 0,314 0,545 0,82 %RSD 1,63 0,80 1,80 0,91 0,87 3.3.2.6 Độ Tiến hành theo mục 2.4.3.2, kết trình bày Bảng 3.18 Bảng 3.18 Kết khảo sát độ Mức nồng độ (%) G-Rg1 80 100 Lượng cân (mg) Lượng sẵn có (mg) 100,1 100,1 100,1 100,0 100,1 100,0 0,910 0,910 0,910 0,910 0,910 0,910 Lượng thêm vào (mg) 0,715 0,715 0,715 0,893 0,893 0,893 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Diện tích pic (µV*S) 560230 566319 559782 620022 623167 624481 Lượng tìm (mg) 1,612 1,630 1,611 1,784 1,793 1,797 Tỉ lệ phục hồi (%) 98,2 100,6 98,0 96,1 97,1 97,5 Kết TB: 98,9 SD: 0,015 %RSD: 0,65 TB: 96,8 SD: 0,007 %RSD: 0,75 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 57 Mức nồng độ (%) 120 G-Rb1 80 100 120 20R-G-Rh1 80 100 120 G-Rd 80 100 120 20S-G-Rg3 80 100 120 Lượng cân (mg) Lượng sẵn có (mg) 100,0 100,1 99,9 100,1 100,1 100,1 100,0 100,1 100,0 100,0 100,1 99,9 100,1 100,1 100,1 100,0 100,1 100,0 100,0 100,1 99,9 100,1 100,1 100,1 100,0 100,1 100,0 100,0 100,1 99,9 100,1 100,1 100,1 100,0 100,1 100,0 100,0 100,1 99,9 0,910 0,910 0,910 1,417 1,417 1,417 1,417 1,417 1,417 1,417 1,417 1,417 0,314 0,314 0,314 0,314 0,314 0,314 0,314 0,314 0,314 0,545 0,545 0,545 0,545 0,545 0,545 0,545 0,545 0,545 0,811 0,811 0,811 0,811 0,811 0,811 0,811 0,811 0,811 Lượng thêm vào (mg) 1,071 1,071 1,071 1,111 1,111 1,111 1,389 1,389 1,386 1,666 1,666 1,666 0,251 0,251 0,251 0,314 0,314 0,314 0,377 0,377 0,377 0,472 0,472 0,472 0,590 0,590 0,590 0,708 0,708 0,708 0,634 0,634 0,634 0,792 0,792 0,792 0,950 0,950 0,950 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Diện tích pic (µV*S) 685660 685389 686329 628632 630326 629118 696695 697178 698288 763611 770264 764869 281791 282501 282842 308085 311112 311183 343541 343402 344028 282232 279382 278507 307025 309365 310853 340351 345241 341315 372263 370848 370798 411171 408250 408448 449573 450443 448190 Lượng tìm (mg) 1,973 1,972 1,975 2,55 2,56 2,56 2,83 2,83 2,84 3,102 3,129 3,107 0,552 0,553 0,554 0,623 0,609 0,609 0,672 0,672 0,673 1,063 1,052 1,049 1,156 1,165 1,171 1,282 1,300 1,285 1,393 1,425 1,388 1,539 1,528 1,529 1,683 1,686 1,678 Tỉ lệ phục hồi (%) 97,5 97,5 97,7 102,4 103,0 102,6 101,6 101,8 102,1 100,9 102,5 101,2 94,7 95,2 95,5 92,1 93,9 94,0 95,1 95,0 95,3 109,7 107,4 106,8 103,6 105,1 100,6 104,1 106,7 104,6 94,8 94,0 94,0 94,3 92,9 93,0 93,8 94,1 93,2 Kết TB: 97,6 SD: 0,001 %RSD: 0,13 TB: 101,8 SD: 0,003 %RSD: 0,12 TB: 102,6 SD: 0,003 %RSD: 0,31 TB: 101,5 SD: 0,009 %RSD: 0,85 TB: 95,1 SD: 0,004 %RSD: 0,44 TB: 93,3 SD: 0,011 %RSD: 1,18 TB: 95,1 SD: 0,002 %RSD: 0,18 TB:108,0 SD: 0,016 %RSD: 1,44 TB: 104,9 SD: 0,012 %RSD: 1,17 TB: 105,1 SD: 0,014 %RSD: 1,31 TB: 94,3 SD: 0,005 %RSD: 0,52 TB: 93,4 SD: 0,008 %RSD: 1,3 TB: 93,7 SD: 0,004 %RSD: 0,48 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 58 Độ phương pháp có tỉ lệ hồi phục ginsenosid từ 93,80 – 106,00 % (RSD = 0,46 – 1,73%) 3.3.3 Xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu Tam thất chế 3.3.3.1 Mơ tả Rễ củ có hình dạng thay đổi, hình trụ hay hình chùy, dài 1,5 - 4,0 cm, đường kính 1,2 - 2,0 cm Mặt ngồi màu nâu đỏ, có vết xém đen, mặt có vết nhăn dọc nhỏ Trên đầu có bướu nhỏ vết tích rễ con, phần có phân nhánh Trên đỉnh cịn vết tích thân Thể chất mềm dẻo, dễ cắt Mặt cắt ngang có lớp vỏ màu nâu, có chấm nhỏ màu nâu (ống tiết), phần gỗ màu đỏ nâu, mạch gỗ xếp hình tia tỏa trịn Mùi thơm nhẹ đặc biệt, vị đắng Hình dạng rễ củ Tam thất thể Hình 3.12 Hình 3.12 Mơ tả hình dạng bên ngồi mặt cắt ngang rễ củ Tam thất chế 3.3.3.2 Soi bột Tiến hành theo mục 2.4.3.3, mô tả cảm quan bột dược liệu cấu tử có bột dược liệu Tam thất chế Bột dược liệu Tam thất chế có màu vàng nâu, mùi thơm, vị đắng Quan sát kính hiển vi thấy: Mảnh mạch vạch, mạch mạng Tinh thể canxi oxalat khối nhựa màu có màu nâu đỏ Những hạt tinh bột hình chng, hình trịn hay hình khối, đường kính 3-13 μm, thường tụ thành đám, có đứng riêng rẽ Bột dược liệu cấu tử quan sát kính hiển vi thể Hình 3.13 Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 59 Hình 3.13 Bột dược liệu cấu tử quan sát kính hiển vi Ghi chú: A: bột dược liệu; B: mảnh mạch vạch; C: hạt tinh bột; D: mảnh mạch mạng; E: khối nhựa màu; F: tinh thể canxi oxalat; 3.3.3.3 Định tính sắc ký lớp mỏng Kiểm tra sắc ký lớp mỏng bột dược liệu Tam thất chế lô với hỗn hợp chuẩn G-Rg1, G-Rb1, G-Rd, G-Rh1, G-Rg3 N-R1 Tiến hành theo mục 2.4.3.3, ghi nhận hình ảnh kết sắc ký lớp mỏng quan sát ánh sáng thường UV 365 nm (Hình 3.14) Hình 3.14 Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng Tam thất chế (lô đại diện) so sánh với chất chuẩn Ghi chú: Hệ dung môi khai triển CHCl3-EA-MeOH-H2O (15:40:22:10) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 60 Nhận xét: Trên sắc ký đồ dung dịch thử có vết có màu sắc giá trị Rf với vết G-Rg1, G-Rb1, G-Rd, G-Rh1, G-Rg3 N-R1 sắc ký đồ dung dịch chất đối chiếu 3.3.3.4 Kiểm tinh khiết Tiến hành thử nghiệm xác định độ ẩm, độ tro hàm lượng chất chiết theo Mục 2.4.3, kết trình bày Bảng 3.19 Bảng 3.19 Kết thử tinh khiết bột dược liệu lô Tam thất chế Mẫu Độ ẩm Tro toàn phần Hàm lượng chất chiết Mẫu Mẫu Trung bình ± SD 8,46 4,30 8,00 4,33 8,27 4,33 8,24 ± 0,23 4,31 ± 0,03 23,0 24,1 23,2 23,40 ± 0,43 3.3.3.5 Định lượng Tiến hành xác định hàm lượng saponin Tam thất chế theo quy trình định lượng xây dựng Kết định lượng trình bày Bảng 3.20 Bảng 3.20 Hàm lượng saponin Tam thất chế Lượng cân (mg) G-Rg1 100,1 99,9 100,0 100,1 100,1 100,2 TB ± SD 0,892 0,902 0,895 0,887 0,905 0,910 0,899 ± 0,009 Hàm lượng (mg/100mg) 20R-GG-Rb1 G-Rd Rh1 1,429 0,305 0,548 1,413 0,305 0,546 1,423 0,309 0,564 1,436 0,313 0,545 1,425 0,312 0,544 1,422 0,317 0,544 1,425 0,310 0,544 ± 0,008 ± 0,003 ± 0,001 20S-GRg3 0,819 0,808 0,783 0,830 0,820 0,836 0,816 ± 0,019 3.3.3.6 Giới hạn loại nặng Kết kiểm nghiệm trình bày Phụ lục 13 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Hàm lượng tổng (mg/100 mg) 3,708 ± 0,435 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 61 3.3.4 Đề xuất tiêu chuẩn dược liệu Tam thất chế Định nghĩa Tam thất chế (Processed radix Panacis notoginseng), rễ củ Tam thất [Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen], họ Nhân sâm (Araliaceae) hấp nước nhiệt độ cao, sau sấy khơ Cơng thức bào chế Tam thất nguyên củ rửa sau hấp nhiệt độ 120 oC vịng Dược liệu sau hấp sấy nhiệt độ 60 oC khô Mô tả Rễ củ có hình dạng thay đổi, hình trụ hay hình chùy, dài 1,5 - 4,0 cm, đường kính 1,2 - 2,0 cm Mặt ngồi màu nâu đỏ, có vết xém đen, mặt có vết nhăn dọc nhỏ Trên đầu có bướu nhỏ vết tích rễ con, phần có phân nhánh Trên đỉnh cịn vết tích cùa thân Thể chất mềm dẻo, dễ cắt Mặt cắt ngang có lớp vỏ màu nâu, có chấm nhỏ màu nâu (ống tiết), phần gỗ màu đỏ nâu, mạch gỗ xếp hình tia tỏa tròn Mùi thơm nhẹ đặc biệt, vị đắng Soi bột Mảnh mạch vạch, mạch mạng Tinh thể canxi oxalat màu nâu đỏ Những hạt tinh bột hình chng, hình trịn hay hình khối, đường kính 3-13 μm, thường tụ thành đám, có đứng riêng rẽ Độ ẩm Không 10 % ( theo DĐVN V, phụ lục 9.6, 1g, 105 oC) Tro tồn phần Khơng % (theo DĐVN V, phụ lục 9.8) Chất chiết dược liệu Không 16% (phương pháp chiết nóng, dùng methanol làm dung mơi theo DĐVN V, phụ lục 12.10) Định tính: Phương pháp sắc ký lớp mỏng Bản mỏng: Silica gel F254 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 62 Dung mơi khai triển: Hỗn hợp cloroform – ethyl acetat – methanol – nước (15:40:22:10) Dung dịch thử: Lấy khoảng 0,2 g bột dược liệu, thêm ml methanol, siêu âm 20 phút, lọc lấy dịch chiết Dung dịch đối chiếu: Hòa tan chất chuẩn ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rd, ginsenosid-Rh1, ginsenosid-Rg3 notoginsenosid-R1 methanol 100 % để dung dịch hỗn hợp chuẩn có nồng độ chuẩn khoảng 0,5 mg/ml Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl (bằng mao quản có khắc vạch) cho dung dịch Triển khai sắc ký đến dung môi khoảng cm, lấy mỏng ra, để khô nhiệt độ phòng, phun dung dịch H2SO4 %/ cồn 96% Sấy mỏng 105 °C xuất rõ vết Quan sát mỏng ánh sáng thường ánh sáng tử ngoại bước sóng 365 nm Trên sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết có màu sắc Rf với ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rd, ginsenosid-Rh1, ginsenosid-Rg3 notoginsenosid-R1 sắc ký đồ dung dịch chất đối chiếu Định lượng: Phương pháp HPLC Pha động A: Acetonitril Pha động B: Nước Dung dịch thử: Cân xác khoảng 100 mg bột dược liệu (rây qua số 355) vào ống nghiệm có nắp, thêm xác 10 ml methanol 80 % vặn chặt nắp, cân, sau siêu âm 60 phút 45 °C, để nguội, cân lại bổ sung methanol 80% để khối lượng ban đầu Trộn lọc qua màng lọc 0,22 µm Dung dịch chuẩn: Hòa tan chất chuẩn ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rd, 20R-ginsenosid-Rh1 20S-ginsenosid-Rg3 methanol để dung dịch chuẩn có nồng độ chuẩn xác khoảng 0,1 mg/ml Điều kiện sắc ký: - Cột HPLC C18 Phenomenex (150 mm ì 4,6 mm; àm) - Detector PDA bước sóng 203 nm Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 63 - Thể tích tiêm: 10 l - Tốc độ dòng: ml/phút - Nhiệt độ cột: 30 °C Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương trình dung mơi Bảng 3.21 Bảng 3.21 Chương trình pha động xác định hàm lượng saponin Tam thất chế Thời gian (phút) 11 25 27 37 50 51 60 61 65 Pha động A (% tt/tt) 21 21 30 35 39 53 95 95 21 21 Pha động B (% tt/tt) 79 79 70 65 61 47 5 79 79 Thứ tự rửa giải: ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rd, 20Rginsenosid-Rh1 20S-ginsenosid-Rg3 Kiểm tra tính phù hợp hệ thống: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn Độ lệch chuẩn tương đối diện tích pic ginsnenosid Rb1 lần tiêm lặp lại không lớn 2,0% Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, dung dịch thử Căn vào diện tích pic thu từ dung dịch thử, dung dịch chuẩn hàm lượng chất chuẩn ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rd, 20R-ginsenosid-Rh1 20Sginsenosid-Rg3 Dược liệu phải khơng chứa 3,0% ((mg/100 mg) tổng hàm lượng ginsenosid-Rg1, ginsenosid-Rb1, 20R-ginsenosid-Rh1, ginsenosid-Rd 20Sginsenosid-Rg3, tính theo dược liệu khơ kiệt Giới hạn kim loại nặng Bảng 3.22 Các tiêu kiểm tra giới hạn kim loại nặng bột Tam thất chế Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 64 Chỉ tiêu As Cd Hg Pb Phương pháp thử AOAC 986.15 AOAC 999.11 AOAC 971.21 AOAC 999.11 Tiêu chuẩn Không mg/kg Không mg/kg Không mg/kg Không 0,2 mg/kg Bảo quản Để nơi khô thống mát, tránh mốc mọt Kiêng kỵ Phụ nữ có thai 3.3.5 Kiểm nghiệm lô chế biến khác lô Tam thất chế biến quy mô 3-5 kg theo Mục 3.2.3 kiểm nghiệm theo tiêu xây dựng Mục 3.3.4 Kết kiểm nghiệm tóm tắt Bảng 3.23 Bảng 3.23 Kết kiểm nghiệm lô Tam thất chế STT Chỉ tiêu Lô Kết (n=3) Lô Mô tả Đúng Soi bột Đúng Độ ẩm (%) Tro toàn phần (%) 5 Chất chiết dược liệu (%) Định tính sắc ký lớp mỏng Định lượng HPLC Đạt (8,28 ± 0,03) Đạt (4,29 ± 0,04) Đạt (22,7 ± 0,33) Đạt (7,35 ± 0,09) Đạt (4,26 ± 0,04) Đạt (23,2 ± 0,52) Lô Đạt (7,84 ± 0,08) Đạt (4,35 ± 0,06) Đạt (23,5 ± 0,36) Đạt Đạt (3,995 ± 0,031) Đạt (4,058 ± 0,028) Đạt (4,519 ± 0,050) Kết luận: lô chế biến (quy mô 3-5 kg) đạt yêu cầu tiêu chuẩn xây dựng cho dược liệu Tam thất chế So sánh kết kiểm nghiệm lơ chế biến lơ thử nghiệm (quy mơ phịng thí nghiệm), kết luận quy trình chế biến đạt tính ổn định phù hợp để nâng cấp cỡ lơ Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 65 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Khảo sát nguyên liệu đầu vào Khi xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu, cần khảo sát nguồn nguyên liệu đầu vào để chọn mẫu nguyên liệu thích hợp dựa vào để xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng dược liệu Nguồn nguyên liệu đề tài nghiên cứu đảm bảo tính đại diện, cụ thể thu mua từ nguồn khác (Việt Nam Trung Quốc), sau phân loại dựa vào khối lượng (số củ/kg, ví dụ: 32 củ/kg, 50 củ/kg, 100 củ/ kg…) phận dùng (thân rễ rễ củ) Dựa vào số tiêu DĐVN V, bao gồm mô tả, soi bột, thử tinh khiết, định tính, kết luận mẫu nghiên cứu đạt yêu cầu theo quy định DĐVN V với độ ẩm không 11% (DĐVN V quy định 750 > 750 > 750 > 750 > 750 > 750 > 750 > 750 > 750 722,5 670,0 677,5 377,5 397,5 362,5 285 230 327,5 380 390 420 277,5 250 277,5 185 200 195 199 198 196 180 237,5 185 IC50 > 750 IC50> 750 IC50 > 750 690 ± 0,11 380 ± 0,07 282,5 ± 0,19 397,5 ± 0,08 267,5 ± 0,06 192,5 ± 0,03 197,5 ± 0,01 202,5 ± 0,13 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Độ tinh khiết chất chuẩn dùng nghiên cứu PL.9 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Kết khảo sát dung môi chiết PL.10 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Kết khảo sát nhiệt độ chiết xuất PL.11 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Kết khảo sát thời gian chiết xuất PL.12 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Kết khảo sát tỉ lệ dược liệu – dung mơi chiết xuất PL.13 Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.14 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Kết khảo sát tính tương thích hệ thống PL.15 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục Phổ UV chất phân tích mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu thử thêm chuẩn độ tinh khiết pic mẫu thử thêm chuẩn PL.17 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.17 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 10 Kết khảo sát độ xác PL.18 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 11 Kết khảo sát độ PL.19 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 12 Kết kiểm nghiệm giới hạn kim loại nặng bột Tam thất chế PL.20 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Phụ lục 13 Kết định lượng lô chế biến khác Lô Lô Lô PL.21 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn