Khảo sát tác dụng ức chế enzyme a amylase và a glucosidase của các hợp chất có tong cây sài đất wedelia chinensis

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYME α-AMYLASE α-GLUCOSIDASE CỦA CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG CÂY SÀI ĐẤT WEDELIA CHINENSIS Hà Nội - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYME α-AMYLASE α-GLUCOSIDASE CỦA CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG CÂY SÀI ĐẤT WEDELIA CHINENSIS Sinh viên thực : TRỊNH NGỌC ANH Khoa : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MSV : 637002 Lớp : K63CNSHA Giáo viên hướng dẫn : TS NGUYỄN THANH HẢO : PGS.TS NGUYỄN TIẾN ÐẠT Hà Nội - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu hướng dẫn TS Nguyễn Thanh Hảo PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt Số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa sử dụng công bố Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận cảm ơn tồn trích dẫn khóa luận có trích dẫn rõ ràng Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Trịnh Ngọc Anh i LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình thực tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp, tơi nhận giúp đỡ nhiệt tình nhiều tập thể cá nhân Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thanh Hảo, môn Sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt, Trung Tâm Nghiên Cứu Và Chuyển Giao Công Nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam tận tâm hướng dẫn, khuyến khích, giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Trong thời gian thực tập vừa qua nhận giúp đỡ hướng dẫn tận tình anh chị cán trung tâm Tôi xin chân thành cảm ơn trợ giúp q báu Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm khoa quý thầy, cô khoa Công nghệ sinh học trực tiếp giảng dạy, trang bị kiến thức bổ ích suốt thời gian em học tập trường Qua đây, tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc, chân thành tới gia đình, bạn bè động viên giúp đỡ suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Mặc dù có nhiều cố gắng nỗ lực thân Tuy nhiên, thiếu sót, hạn chế báo cáo tránh khỏi Tôi mong nhận ý kiến đóng góp q thầy, giáo để khóa luận hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Sinh viên ii năm 2022 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Sài đất Wedelia chinensis 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.2 Tổng quan thành phần hóa học Sài đất 1.1.3 Tác dụng dược lý Sài đất 1.2 Tổng quan bệnh tiểu đường 1.2.1 Giới thiệu bệnh tiểu đường 1.2.2 Điều trị bệnh tiểu đường 1.3 Tổng quan enzyme α-amylase α-glucosidase 11 1.3.1 Khái niệm enzyme 11 1.3.2 Enzyme α-amylase 12 1.3.3 Enzyme α-glucosidase 12 1.3.4 Lý cần phải ức chế hai enzyme α-amylase α-glucosidase điều trị bệnh tiểu đường 13 1.4 Một số nghiên cứu hoạt tính ức chế hai enzyme α-amylase αglucosidase từ loại dược liệu khác 13 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.2 Phạm vi nghiên cứu 17 iii 2.3 Nguyên liệu, vật liệu thiết bị 17 2.3.1 Thiết bị, dụng cụ để thu thập xử lý mẫu 17 2.3.2 Thiết bị dụng cụ để thử hoạt tính sinh học 18 2.3.3 Mẫu đối chứng 18 2.4 Phương pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Phương pháp thu xử lý mẫu 19 2.4.2 Phương pháp phân lập xác định thành phần hóa học Sài đất 20 2.4.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế ức chế enzyme α-amylase 21 2.4.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế ức chế enzyme α-glucosidase 24 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết phân lập xác định thành phần hóa học Sài đất 27 3.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ cao chiết Sài đất đến khả ức chế enzyme α-amylase 28 3.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ cao chiết Sài đất đến khả ức chế enzyme α-glucosidase 31 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 4.1 Kết luận 36 4.2 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số nghiên cứu ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase Việt Nam 15 Bảng 2.1 Tỉ lệ phối trộn mẫu cao chiết với MeOH nồng độ 22 Bảng 2.2 Tỉ lệ trộn mẫu cao chiết với enzyme α-amylase nồng độ so sánh với ống đối chứng 23 Bảng 2.3 Tỉ lệ phối trộn mẫu cao chiết với MeOH nồng độ 25 Bảng 2.4 Tỉ lệ trộn mẫu cao chiết với enzyme α-glucosidase nồng độ so sánh với ống đối chứng 26 Bảng 3.1 Bảng tổng hợp số liệu kết phần trăm ức chế Acarbose ức chế enzyme α-amylase 28 Bảng 3.2 Kết khảo sát khả ức chế enzyme α-amylase hợp chất cao chiết sài đất 29 Bảng 3.3 Bảng tổng hợp số liệu kết phần trăm ức chế Acarbose ức chế enzyme α-glucosidase 32 Bảng 3.4 Kết khảo sát khả ức chế enzyme α-glucosidase hợp chất cao chiết sài đất 33 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây Sài đất Hình 1.2 Cấu trúc hóa học Dimethylwedelolaton, Wedelolacton, Luteolin Apigenin Hình 1.3 Cấu trúc hóa học Acid vanillic Acid gallic Hình 1.4 Cấu trúc hợp chất phân lập từ Wedelia chinensis Hình 1.5 Cơ chế ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase 13 Hình 2.1 Mẫu tiêu sài đất Hà Nội 17 Hình 2.2 Thiết bị quay cao chiết 19 Hình 2.3 Mẫu Acarbose làm đối chứng 20 Hình 3.1 Hợp chất hóa học có cao chiết Sài đất 27 Hình 3.2 Đồ thị so sánh biểu diễn hoạt tính ức chế enzyme α - amylase hợp chất Jaceosidin so với mẫu đối chứng Acarbose 30 Hình 3.3 Đồ thị so sánh biểu diễn hoạt tính ức chế enzyme α - glucosidase hợp chất Jaceosidin so với mẫu đối chứng Acarbose 34 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu UPLC Tiếng Anh Diễn giải Ultra Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu Chromatography cao MS Mass Spectrometry GBM Glioblastoma Multiforme IDF Internationnal Diabetes Federation PNP p - Nitrophenol pNPG p-Nitrophenyl-α-D- glucopyranoside DMSO Dimethyl sulfoxide DNSA 3,5-Dinitrosalicylic acid IC50 Nồng độ ức chế tối đa nửa vii Phương pháp khối phổ U nguyên bào thần kinh đệm đa dạng Liên đoàn tiểu đường Quốc tế MỞ ĐẦU Bệnh đái tháo đường hay gọi tiểu đường ngày phổ biến có gia tăng tỉ lệ mức độ ảnh hưởng đến sức khỏe Nguyên nhân rối loạn chuyển hóa carbohydrate hormone insulin tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động thể Insulin loại hormone từ tế bào tuyến tụy tiết ra, chúng có tác dụng chuyển hóa carbonhydrate thể chuyển hóa mơ mỡ gan thành loại lượng ATP cung cấp cho hoạt động thể Insulin giúp kiểm soát lượng đường máu insulin bị thiếu hụt glycogen khơng ngừng chuyển hóa đưa lượng thừa thãi glucose vào máu gây bệnh tiểu đường Biểu bệnh tiểu đường lượng glucose máu cao bình thường, việc làm giảm lượng glucose mức cao máu bệnh nhân tiểu đường mục tiêu quan trọng để làm giảm nguy biến chứng sức khỏe lâu dài bệnh tiểu đường Carbohydrate nguồn cung cấp lượng lớn glucose cho thể, phân tử carbohydrate bị thủy phân thành oligosaccharide tác dụng enzyme α-amylase (tụy tạng tiết ra), màng ruột non, enzyme α-glucosidase thủy phân oligosaccharide thành glucose sau thẩm thấu vào máu Do đó, ức chế enzyme lượng glucose máu giảm việc điều trị bệnh dễ dàng Tiểu đường trực tiếp hay gián tiếp gây nên rối loạn tăng đường huyết, bệnh võng mạc, suy thận, bệnh thiếu máu tim, bệnh thần kinh, xơ vữa động mạch Các thuốc điều trị bệnh tiểu đường sử dụng Metformin, Glimepiride, Glyburide,…Tuy nhiên việc sử dụng loại thuốc tây có ưu điểu lớn hạ đường huyết nhanh lại dễ gây tụt đường huyết khơng trì ổn định đường huyết, gây dị ứng mẩn đỏ, mề đay, đau bụng tiêu chảy,…Vì việc nghiên cứu phát triển thuốc hạ đường huyết có nguồn gốc thực vật, đặc biệt thuốc sử dụng phổ biến dân gian nhằm tìm thuốc hiệu không gây tác dụng phụ so với thuốc hóa dược cần thiết Qua tìm hiểu đồ thị biểu diễn phụ thuộc giá trị phần trăm ức chế theo nồng độ với phần mềm Excel ta phương trình Logarit có dạng y = aln(x) + b, với y = 50 Từ ta suy x giá trị IC50 - Số liệu tập hợp xử lý excel - % Ức chế = [1- (Acao chiết / Ađối chứng)] ×100 Acao chiết : Giá trị mật độ quang dung dịch cao chiết Ađối chứng : Giá trị mật độ quang dung dịch đối chứng 2.4.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế ức chế enzyme α-glucosidase Nguyên tắc: Enzym α-glucosidase xúc tác cho trình thủy phân p-nitrophenyl-αglucopyranosid (p-NPG), tạo thành p-nitrophenol có màu vàng nhạt, hấp thu cực đại 405nm Khả ức chế mẫu thử xác định thông qua giá trị độ hấp thụ p-nitrophenol tạo thành sau phản ứng (Kazeem, MI., et al., 2013) p-Nitrophenyl-α-Glucopyranoside + α - Glucosidase => D–Glucose (C6 H12O6) + p-Nitrophenol (C6H5NO3) (Hấp thụ màu bước sóng 405nm) Thí nghiệm khảo sát khả ức chế enzyme α-glucosidase sài đất tiến hành theo phương pháp Kalita cộng năm 2018 với chút sửa đổi Mục đích: - Khảo sát giá trị IC50 đối chiếu với mẫu đối chứng - So sánh hoạt tính ức chế tiềm hợp chất Các bước tiến hành: - Pha dung dịch đệm K2HPO4/KH2PO4 (0,02 M; 0,006 M) PH 6,9: Pha lít đệm cần 2,28g K2HPO4.3H2O 1.37g KH2PO4 sau thêm 0.447g KCl sau định mức lên 1L H2O Sau pha giữ 4°C - Enzyme α-glucosidase 2U/ml: Cân 5mg bột α-amylase 4U/mg + 10ml đệm K2HPO4 / KH2PO4 (0,02 M), KCl (0,006 M) pH 6,9) Sau pha giữ 4°C - Chuẩn bị Acarbose 24 - Pha dung dịch pNPG 4mM Cân 4,3mg pNPG pha 5ml nước cất - Chuẩn bị mẫu thí nghiệm nồng độ (50-100-200-500-700µg/ml): Cân 10mg mẫu pha 1ml DMSO 10% hòa tan thêm dung dịch đệm (K2HPO4 / KH2PO4 (0,02 M), KCl (0,006 M) pH 6,9) thu dung dịch cao chiết 10mg/1ml Lấy 100µl mẫu 10mg/ml cho vào 900µl DMSO 10% hòa tan thêm dung dịch đệm (K2HPO4 / KH2PO4 (0,02 M), KCl (0,006 M) pH 6,9) thu dung dịch thí nghiệm 1mg/1ml Bảng 2.3 Tỉ lệ phối trộn mẫu cao chiết với MeOH nồng độ Nồng độ nghiệm µg/ml thí Thể tích mẫu Thể tích MeOH Tổng cao chiết 1mg/ml (µl) thể tích trộn (µl) (µl) 50 50 950 1000 100 100 900 1000 200 200 800 1000 500 500 500 1000 700 700 300 1000 Các bước tiến hành Bước 1: 150 µl cao chiết dải nồng độ khác + 150 µl enzyme α-glucosidase 2U/ml vào ống ủ 33°C phút Bước 2: Thêm 150 µl dung dịch p-NPG lắc Bước 3: Ủ 37°C 30 phút Bước 4: Thêm Na2CO3 để dừng phản ứng Hút vào đĩa 96 giếng 200µl dung dịch gốc Lượng dung dịch lại ống effendoft pha loãng lần với nước Bước 5: Đem đo OD bước sóng λ = 405 nm 25 Bước 6: Phần trăm enzyme α-amylase bị ức chế (%) tính cơng thức: % I = [1-(Acao chiết/Ađối chứng)] ×100 Bảng 2.4 Tỉ lệ trộn mẫu cao chiết với enzyme α-glucosidase nồng độ so sánh với ống đối chứng Ống mẫu thí Ống Trắng nghiệm (µl) (µl) Ống đối chứng (µl) Mẫu thí nghiệm 150 150 (DMSO 10%) 150 ( Acarbose) α-glucosidase 150 150 150 p-NPG 150 150 150 Tổng V 450 450 450 V pha lỗng với 500 500 500 H2 O Xử lí số liệu - Số liệu tập hợp xử lý excel - % Ức chế = [1-(Acao chiết/Ađối chứng)] ×100 Acao chiết : Giá trị mật độ quang dung dịch cao chiết Ađối chứng : Giá trị mật độ quang dung dịch đối chứng 26 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập xác định thành phần hóa học Sài đất Sài đất sau chiết lần dung môi methanol, tiến hành phân lập chất phương pháp sắc kí mỏng sắc ký cột thu số hợp chất Kết định tính sơ thành phần hóa học có cao chiết Sài đất trình bày (hình 3.1): (1) Jaceosidin (2) 19-hydroxy-3-oxo-12-ursen-28-oic acid (pomonic acid) (3) ilexgenin B (Pubescenolic acid) Hình 3.1 Hợp chất hóa học có cao chiết Sài đất 27 Kết phân lập cho thấy có mặt nhóm hợp chất Jaceosidin, 19-hydroxy-3-oxo-12-ursen-28-oic acid (pomonic acid) ilexgenin B (Pubescenolic acid) 3.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ cao chiết Sài đất đến khả ức chế enzyme α-amylase Trong thể, enzyme α-amylase có vai trị thủy phân liên kết α-1,4glucoside tinh bột, glycogen polysaccharide khác tạo thành glucose maltose Enzyme α-amylase xúc tác thủy phân tinh bột tạo nhiều glucose, làm tăng lượng glucose máu dẫn đến nguy dễ mắc bệnh tiểu đường Do đó, ức chế α-amylase xem chế để làm giảm glucose máu hạn chế nguy mắc bệnh tiểu đường Acarbose biết đến thuốc thương mại, sử dụng phổ biến điều trị bệnh tiểu đường loại Để đánh giá tác dụng ức chế enzyme, nhà nghiên cứu thường so sánh tác dụng ức chế mẫu đối tượng cần nghiên cứu với đối chứng có hoạt tính ức chế enzyme Vì vậy, thí nghiệm Acarbose sử dụng mẫu đối chứng nghiên cứu ức chế enzyme α-amylase Dưới bảng kết thử hoạt tính ức chế Acarbose ức chế enzyme α-amylase (Bảng 3.1) Bảng 3.1 Bảng tổng hợp số liệu kết phần trăm ức chế Acarbose ức chế enzyme α-amylase Acarbose Nồng độ (µg/ml) %Ức chế Sai số 75 25,84 0,24 125 39,35 0,36 250 45,65 0,41 500 52,36 0,29 1000 71,12 0,32 Khi tăng nồng độ Acarbose từ 75-1000 µg/ml, phần trăm α-amylase bị ức chế tăng tuyến tính với nồng độ Acarbose khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê mức 5% Cụ thể, nồng độ Acarbose 1000 µg/mL, khả ức chế α28 amylase đạt 71,12%; 52,36% nồng độ Acarbose 500 µg/ mL thấp 25,84% nồng độ Acarbose 75 µg/mL (Bảng 3.1) Kết hoạt tính enzyme cịn thể thông qua giá trị IC50, giá trị mà ức chế tối thiểu 50% hoạt động enzyme Giá trị IC50 thấp cho thấy hoạt tính ức chế enzyme mạnh, cụ thể giá trị IC50 Acarbose 78,80 ± 0,45 µg/ml Bảng 3.2 Kết khảo sát khả ức chế enzyme α-amylase hợp chất cao chiết sài đất % Ức chế enzyme α-amylase (%) Nồng độ cao chiết sài đất Jaceosidin Pomonic acid Ilexgenin B 75 26,36 ± 0,32 2,36 ± 0,39 1,50 ± 0,35 125 38,78 ± 0,37 10,53 ± 0,37 4,36 ± 0,37 250 47,52 ± 0,42 15,42 ± 0,42 10,25 ± 0,42 500 54,35 ± 0,45 25,36 ± 0,45 16,72 ± 0,45 1000 73,85 ± 0,41 26,41 ± 0,41 17,35 ± 0,41 (µg/ml) Khả ức chế α-amylase hợp chất sài đất tính dựa vào chênh lệch lượng tinh bột ban đầu lượng tinh bột lại sau phản ứng thủy phân để đánh giá mức độ thủy phân α-amylase Lượng tinh bột lại sau phản ứng nhiều, lượng đường (màu nhạt dần) khả ức chế α-amylase mạnh Kết quả, hiệu ức chế α-amylase tăng lên tăng nồng độ cao chiết có khác biệt hợp chất có sài đất Cao chiết methanol sài đất cho hiệu ức chế enzyme α-amylase thể qua bảng 3.2 Ở hợp chất Jaceosidin, tăng nồng độ cao chiết sài đất từ 75-1000 (µg/ml) phần trăm enzyme α-amylase bị ức chế tăng với nồng độ khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê nồng độ Cụ thể, nồng độ cao chiết 29 1000 µg/ml khả ức chế Jaceosidin đạt 73,85% Các nồng độ 75, 125, 250, 500, 1000 tương ứng với khả ức chế 26,36%; 38,78%; 47,52%; 54,35%; 73,85% Khi so sánh kết ức chế với mẫu đối chứng Acarbose, cho thấy nồng độ 250µg/ml, Acarbose ức chế 45,65% hoạt động enzyme α-amylase hợp chất Jaceosidin có cao chiết sài đất ức chế đến 47,52% hoạt động enzyme α-amylase Tương tự nồng độ Acarbose cao 1000µg/ml chất đối chứng ức chế 71,12% hoạt động enzyme hợp chất Jaceosidin ức chế đến 73,85% hoạt động enzyme α-amylase Kết IC50 hợp chất Jaceosidin 67,08 ± 0,46 µg/ml cao hẳn so với chất đối chứng Acarbose 78,80 ± 0,45 µg/ml (thể đồ thị hình 3.2) 90 78.8 80 67.08 70 IC50 µg/ml 60 50 40 30 20 10 Acarbose Jaceosidin Mẫu cao chiết Hình 3.2 Đồ thị so sánh biểu diễn hoạt tính ức chế enzyme α - amylase hợp chất Jaceosidin so với mẫu đối chứng Acarbose Kết khảo sát khả ức chế enzyme α - amylase sài đất cho thấy có chất Jaceosidin thể hoạt tính ức chế mạnh so với loại chất lại (Pomonic Acid Ilexgenin B) giá trị IC50 Jaceosidin có khả ức chế enzyme vượt trội so với mẫu đối chứng Acarbose (Giá trị IC50 cao hiệu ức chế thấp ngược lại) Còn Pomonic Acid nồng độ 75µg/ml phần trăm ức chế đạt 2,36% tiếp tục tăng dần nồng độ lên 30 đến 1000µg/ml giá trị phần trăm ức chế đạt 26,41% Các kết cho thấy phần trăm ức chế enzyme α – amylase hợp chất Pomonic Acid nồng độ thử 50%, nên coi hợp chất Pomonic Acid có hoạt tính Tương tự vậy, hợp chất Ilexgenin B nồng độ 75µg/ml phần trăm ức chế đạt 1,5%, tiếp tục tăng nồng độ lên đến 1000µg/ml giá trị phần trăm ức chế đạt 17,35% Như phần trăm ức nồng độ thử 50% nên Ilexgenin B có hoạt tính Cả hai hợp chất cho thấy hiệu ức chế đối chứng Acarbose Hiệu ức chế cao chiết Sài đất tương tự kết Lê Quốc Duy cộng khảo sát năm 2016, cụ thể họ khảo sát khả ức chế enzyme amylase cao ethanol từ mẫu có Xồi IC50 đạt 66,17µg/ml (Lê Quốc Duy, 2016) Từ kết cho thấy tiềm thảo dược điều trị bệnh tiểu đường thông qua ức chế enzyme α-amylase Enzyme α-amylase enzyme thực bước trình thủy phân tinh bột, việc ức chế enzyme dẫn tới hạn chế tạo thành glucose sau bữa ăn, giúp người bệnh ổn định đường huyết Mặc dù cao chiết lẫn tạp chất, chưa tinh hiệu ức chế cao Acarbose - loại thuốc thương mại tinh coi sài đất loại thảo dược giúp hỗ trợ cải thiện bệnh tiểu đường 3.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ cao chiết Sài đất đến khả ức chế enzyme α-glucosidase Enzyme α-glucosidase ruột non người có vai trị thủy phân liên kết α-1,4 oligosaccharide thành glucose sau hấp thu qua niêm mạc ruột non thẩm thấu vào máu Bên cạnh đó, nồng độ glucose máu cao biểu bệnh tiểu đường cần ức chế α-glucosidase điều khiển lượng đường huyết máu góp phần điều trị bệnh tiểu đường Acarbose biết đến chất ức chế glucosidase sử dụng phổ biến cho bệnh nhân đái tháo đường type Trong thí nghiệm nhóm nghiên cứu chúng tơi sử dụng Acarbose đối chứng dương Dưới 31 bảng kết thử hoạt tính ức chế Acarbose ức chế enzyme αglucosidase (Bảng 3.3) Bảng 3.3 Bảng tổng hợp số liệu kết phần trăm ức chế Acarbose ức chế enzyme α-glucosidase Acarbose Nồng độ (µg/ml) %Ức chế Sai số 50 10,06 0,43 100 21,25 0,41 200 33,36 0,36 500 55,94 0,41 700 57,42 0,37 Trong điều kiện thí nghiệm nhiệt độ 33⁰C, nồng độ enzyme 2U/ml chất pNPG mM, khả ức chế hoạt tính enzyme tăng dần tăng nồng độ Acarbose từ 50 - 700 µg/ml, phần trăm α-glucosidase bị ức chế tăng với nồng độ Acarbose Cụ thể, nồng độ Acarbose 700 µg/mL, khả ức chế αamylase đạt 57,42%; 55,94% nồng độ Acarbose 500 µg/ mL; 33,36% nồng độ 200 µg/ mL; 21,25% nồng độ 100µg/ mL thấp 10,06% nồng độ Acarbose 50 µg/mL Có thể cho thấy chất đối chứng Acarbose có hoạt tính (Bảng 3.3) Kết hoạt tính enzyme cịn thể thông qua giá trị IC50, giá trị mà ức chế tối thiểu 50% hoạt động enzyme Giá trị IC50 thấp cho thấy hoạt tính ức chế enzyme mạnh, cụ thể giá trị IC50 Acarbose ức chế enzyme α-glucosidase 444,87 µg/ml 32 Bảng 3.4 Kết khảo sát khả ức chế enzyme α-glucosidase hợp chất cao chiết sài đất % Ức chế enzyme α-glucosidase (%) Nồng độ cao chiết sài đất Jaceosidin Pomonic acid Ilexgenin B 50 8,54 ± 0,57 2,43 ± 0,35 2,43 ± 0,89 100 21,78 ± 0,55 8,25 ± 0,42 8,25 ± 0,76 200 38,25 ± 0,61 15,09 ± 0,40 18,45 ± 0,65 500 57,85 ± 0,60 16,65 ± 0,37 35,28 ± 0,67 700 61,04 ± 0,53 20,36 ± 0,39 36,42 ± 0,70 (µg/ml) Khả ức chế α-glucosidase hợp chất sài đất tính dựa vào chênh lệch lượng p-nitrophenyl α-glucosidase ban đầu lượng pnitrophenol sau phản ứng thủy phân để đánh giá mức độ thủy phân αglucosidase Lượng p-nitrophenol lại sau phản ứng nhiều (màu đậm dần) khả ức chế α-glucosidase mạnh Kết quả, hiệu ức chế αglucosidase tăng lên tăng nồng độ cao chiết có khác biệt hợp chất có sài đất Các hợp chất có cao chiết methanol sài đất cho hiệu ức chế enzyme α-glucosidase thể qua bảng 3.4 Ở hợp chất Jaceosidin, tăng nồng độ cao chiết sài đất từ 50 – 700 (µg/ml) phần trăm enzyme α-glucosidase bị ức chế tăng Ở nồng độ cao chiết 700 µg/ml khả ức chế Jaceosidin đạt 61,04% Các nồng độ 50, 100, 200, 500 tương ứng với khả ức chế 8,54%; 21,78%; 38,25%; 57,85% Khi so sánh kết ức chế với mẫu đối chứng Acarbose, cho thấy nồng độ 500µg/ml, Acarbose ức chế 55,94% hoạt động enzyme α-glucosidase hợp chất Jaceosidin có cao chiết sài đất ức chế đến 57,85% hoạt động enzyme α-glucosidase Tương tự nồng độ 33 Acarbose cao 700µg/ml chất đối chứng ức chế 57,42% hoạt động enzyme hợp chất Jaceosidin ức chế đến 61,04% hoạt động enzyme α-glucosidase Kết IC50 ức chế enzyme αglucosidase hợp chất Jaceosidin 336,246 ± 0,75µg/ml cao hẳn so với chất đối chứng Acarbose 444,87 ± 0,32µg/ml (thể đồ thị hình 3.3) 600 500 444.87 IC50 µg/ml 400 336.246 300 200 100 Acarbose Jaceosidin Mẫu cao chiết Hình 3.3 Đồ thị so sánh biểu diễn hoạt tính ức chế enzyme α - glucosidase hợp chất Jaceosidin so với mẫu đối chứng Acarbose Kết khảo sát khả ức chế enzyme α -glucosidase sài đất cho thấy có chất Jaceosidin thể hoạt tính ức chế mạnh so với loại chất lại (Pomonic Acid Ilexgenin B) giá trị IC50 Jaceosidin có khả ức chế enzyme vượt trội so với mẫu đối chứng Cịn Pomonic Acid nồng độ 50µg/ml phần trăm ức chế đạt 2,43% tiếp tục tăng dần nồng độ lên đến 700µg/ml giá trị phần trăm ức chế đạt lớn 20,36% Các kết cho thấy phần trăm ức chế enzyme α –glucosidase hợp chất Pomonic Acid nồng độ thử 50%, nên coi hợp chất Pomonic Acid có hoạt tính Tương tự vậy, hợp chất Ilexgenin B nồng độ 50µg/ml phần trăm ức chế đạt 2,43%, tiếp tục tăng nồng độ lên đến 700µg/ml giá trị phần trăm ức chế đạt 36,42% Có thể thấy phần trăm ức nồng độ thử 50% nên Ilexgenin B có hoạt tính Cả 34 hai hợp chất cho thấy hiệu ức chế so với đối chứng Acarbose Hiệu ức chế enzyme α -glucosidase cao chiết Sài đất tương tự kết Berna Elya cộng khảo sát năm 2012, cụ thể họ khảo sát khả ức chế enzyme α-glucosidase từ số thuộc họ Apocynaceae, Clusiaceae, Euphorbiaceae, and Rubiaceae có chiết xuất thơ họ Euphorbiaceae Croton argyratus Blume Folium với giá trị IC50 đạt 366,07µg/ml (Elya, B., et al., 2012) Từ kết cho thấy sài đất xem sản phẩm hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường thơng qua ức chế enzyme α-glucosidase có tác dụng hiệu ức chế cao Acarbose loại thuốc thương mại tinh Người bệnh có thêm lựa chọn với sản phẩm từ thiên nhiên mà lại gây tác dung phụ điều trị bệnh tiểu đường 35 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Về thành phần hóa học Cao chiết Sài đất, tìm hợp chất có hoạt tính sinh học - Các kết thí nghiệm thử hoạt tính ức chế enzyme α-amylase αglucosidase hợp chất Sài đất cho thấy hoạt tính ức chế có hợp chất Jaceosidin hoạt tính ức chế thể tốt so với hai hợp chất lại Pomonic acid Ilexgenin B - Hiệu ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase hợp chất Jaceocidin Sài đất tốt so với cao chiết từ chế phẩm Acarbose công nhận lưu hành rộng rãi ngooài thị trường hiệu điều trị bệnh tiểu đường 4.2 Kiến nghị - Cần tiến hành thực nghiên cứu ba hợp chất phương pháp invivo lâm sàng, sản xuất đưa thị trường thực phẩm chức thuốc hỗ trợ điều trị điều bệnh tiểu đường - Tiếp tục phân lập thêm hợp chất khác có cao chiết sài đất thực tiếp thí nghiệm để ức chế enzyme α-amylase α-glucosidase hợp chất 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ y tế, Hướng dẫn chẩn đoán điều trị đái tháo đường típ 2017 Đái Thị Xuân Trang cộng sự, 2012 Khảo sát khả điều trị bệnh tiểu đường cao chiết ổi (Psidium Guajava L.) Tạp chí khoa học trường đại học Cần Thơ số 22b: tr163-171 Đái Thị Xuân Trang cộng sự, 2019 Đánh giá khả kháng oxy hóa, ức chế enzyme αamylase α-glucosidase cao chiết từ núc nác (Oroxylum indicum L.) Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ 55(6A): tr.29-36 Đỗ Nguyễn Anh Thư, Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme thủy phân tinh bột kháng oxy hóa cao chiết rau cua (peperomia pellucida) Luận văn thạc sĩ, Viện Hàn lâm Khoa học Công Nghệ Việt Nam, 2021 Đỗ Q Hai, 2008 Giáo trình cơng nghệ sinh học enzyme Nxb Đại học Huế Đỗ Tất Lợi, 2006 Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nxb Y học tr.102 Lê Chuyển, Nguyễn Thành Tín Cập nhật thuốc điều trị đái tháo đường: Dưới góc nhìn dược lý lâm sàng Tạp chí nội tiết đái tháo đường, 2021(46): tr.52-67 Lê Quốc Duy, Khảo sát khả ức chế enzyme α- amylase α-glucosidase số thuốc dân gian điều trị bệnh đái tháo đường Tạp chí Nơng nghiệp - Thủy sản, 2016 22: tr.139-147 Nguyễn Minh Chơn, Dương Duy Dương Ảnh hưởng ức chế dịch chiết lồng đèn (Physalis angulate L.) lên hoạt tính α- amylase α-glucosidase Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 2019 55(2): tr.126-132 Nguyễn Phương Thảo cộng sự, 2018 α-Amylase and α-Glucosidase Inhibitory Activities of Chemical Constituents from Wedelia chinensis (Osbeck.) Merr Leaves Journal of Analytical Methods in Chemistry, 2018: tr.1-8 Nguyễn Quốc Vinh, Hoàng Thị Ngọc Nhơn, 2021 Xác định khả ức chế enzyme αamylase α-glucosidase dịch saponin tinh từ đảng sâm Tạp chí cơng thương, 2021 4: tr.320-326 Nguyễn Thị Ái Lan, Trần Chí Linh, Điều tra sơ hoạt tính chống oxy hóa, chống đái tháo đường chống viêm invitro cao chiết từ thân củ nghệ đen (curcuma zedoaria) Tạp chí khoa học công nghệ - Đại học Đà Nẵng, 2022 20(7): tr.81-86 Phạm Hoàng Hộ, 2003 Cây cỏ Việt Nam Tập Nxb Trẻ tr.273 TÀI LIỆU THAM KHẢO NƯỚC NGOÀI Chen, L.-J., et al., Differential Effects of Wedelia chinensis on Human Glioblastoma Multiforme Cells Integartive Cancer Therapies, 2021 20: p.1-13 Dalsgaard, N.B., et al., The role of GLP-1 in the postprandial effects of acarbose in type diabetes Eur J Endocrinol, 2021 184(3): p.383-394 Elya, B., et al., Screening of α-Glucosidase Inhibitory Activity from Some Plants of Apocynaceae, Clusiaceae, Euphorbiaceae, and Rubiaceae Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2012 Figueiredo-González, M., et al., The involvement of phenolic-rich extracts from Galician autochthonous extra-virgin olive oils against the α-glucosidase and α-amylase inhibition Food Research International, 2018 116: p 447-454 37 10 11 12 13 14 Hogan, S.P., Grape extracts for type diabetes treatment through specific inhibition of α-glucosidase and antioxidant protection Doctor of Philosophy in Food Science and Technology, 2009 p.22 Hossen, K., et al., Allelopathic Potential and Active Substances from Wedelia Chinensis (Osbeck) Foods, 2020 9(11): p.1591 Hua, F., et al., Inhibition of flavonoid glycosides from Lu'an GuaPian tea on αglucosidase and α-amylase: molecular docking and interaction mechanism Food & Function, 2018 9(8): p 4173-4183 Islam, M., et al., Evaluation of cholinesterase inhibitory and antioxidant activity of Wedelia chinensis and isolation of apigenin as an active compound BMC Complementary Medicine and Therapies, 2021 21(1): p.204 Kalita, D., et al., Inhibition of α-glucosidase, α-amylase, and aldose reductase by potato polyphenolic compounds Plos one, 2018 13(1) Kazeem, MI., et al., Modes of inhibition of α-amylase and α-glucosidase by aqueous extract of Morinda lucida Benth Leaf Biomed Res Int, 2013 Kumar, R.M., et al., Pharmacognostical studies of the plant Wedelia Chinensis (Osbeck) Merr International Journal of Pharma Resesch & Development, 2011 2: p 53-57 Sharma, A.K., et al., Hepatoprotective Effect of Wedelia Calendulacea Journal of Ethnopharmacology, 1989 25: p 93-102 Tsai, Y.-T., et al., Introduction of Polyploidy and Metabolic Profiling in the Medicinal Herb Wedelia chinensis Plants, 2021 10(6): p.1232 Verma, N., et al., Wound healing activity of wedelia chinensis leaves Pharmacologyonline, 2008 2: p.139-145 38