Động học dập tắt huỳnh quang của a glucosidase bằng genistein

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP NGÀNH CƠNG NGHỆ KỸ THUẬT HĨA HỌC ĐỘNG HỌC DẬP TẮT HUỲNH QUANG CỦA α-GLUCOSIDASE BẰNG GENISTEIN GVHD: TS HỒ PHƯƠNG SVTH : NGUYỄN THỊ MỸ DUYÊN NGUYỄN THÀNH DUY SKL 08854 Tp Hồ Chí Minh, tháng 08/2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC VÀ THỰC PHẨM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ HÓA HỌC −−−−−−−−−− LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐỘNG HỌC DẬP TẮT HUỲNH QUANG CỦA α-GLUCOSIDASE BẰNG GENISTEIN SVTH: MSSV: Nguyễn Thị Mỹ Duyên 18128012 Nguyễn Thành Duy 18128009 GVHD: TS Hồ Phương Tp Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 08 năm 2022 Bảng 7: Pha mẫu thử từ mẫu Genistein 10 µM 100 µM Nồng độ (µM) 1,0 2,0 5,0 Nồng độ (µM) 10 20 35 Ký hiệu a b c Ký hiệu d e f α – glucosidase 10 10 10 α – glucosidase 10 10 10 20 40 70 140 120 90 9,7 U/mL 9,7 U/mL (µL) (µL) Genistein 10 µM 20 40 100 Genistein 100 µM (µL) Đệm phosphate (µL) 140 120 Đệm phosphate 60 (µL) (µL) Tiến hành ủ tủ sấy 37 oC 90 phút Sau thêm 30 µL PNPG (5 mM) tiếp tục ủ 30 phút để lượng PNPG tác dụng với lượng lại enzyme tiến hành đo độ hấp thu quang máy Elisa bước sóng 405 nm Thành phần phản ứng mẫu thử gồm: Đệm phosphate 50 mM, pH = 6,9; α-glucosidase 0,25 U/mL, mẫu thử p-nitrophenyl -D-glucopyranoside (PNPG) 0,75 mM Phép thử gồm thành phần mẫu: Độ hấp thu mẫu trắng (Amẫu trắng ) = Đệm + PNPG Độ hấp thu mẫu chứng trắng (Amẫu chứng) = Mẫu thử + PNPG + Đệm Độ hấp thu mẫu chứng (Amẫu chứng trắng) = Đệm + PNPG + Enzym Độ hấp thu mẫu thử (Amẫu thử) = Mẫu thử + PNPG + Enzym + Đệm Đánh giá khả ức chế α-glucosidase genistein theo phương trình (15): % ức chế α-glucosidase = 𝟏 − ( 𝑨𝐦ẫ𝒖 𝒕𝒉ử − 𝑨𝐦ẫ𝐮 𝐜𝐡ứ𝐧𝐠 𝐭𝐫ắ𝐧𝐠 ) (𝑨𝐦ẫ𝐮 𝐜𝐡ứ𝐧𝐠 − 𝑨𝐦ẫ𝐮 𝐭𝐫ắ𝐧𝐠 ) 21 × 𝟏𝟎𝟎 (15) 2.2.5 Xác định chế phản ứng α-glucosidase genistein: Tiến hành thử nghiệm để tìm chế phản ứng α-glucosidase genistein cách cố định nồng độ α-glucosidase, nồng độ genistein thử μM; 20 μM; 50 μM Tương ứng với nồng độ genistein nồng độ PNPG thay đổi từ (0 – 0,75 mM) Mẫu thử chuẩn bị dĩa 96 giếng, ứng với nồng độ genistein μM; 20 μM; 50 μM chuẩn bị theo [Bảng 2.8; 2.9; 2.10] Dung dịch α-glucosidase, genistein đệm thêm vào giếng tiến hành ủ 37 oC 90 phút Sau cho PNPG vào theo thứ tự nồng độ ủ tiếp 30 phút Tiến hành đo độ hấp thu quang mẫu 405 nm Sau thêm thành phần nồng độ cuối 200 μL thể tích mẫu đo gồm: α-glucosidase 0,25 U/mL;nồng độ PNPG giếng 0,15 mM; 0,25 mM; 0,5 mM; 0,75 mM Nồng độ genistein μM; 20 μM; 50 μM Bảng 8: Chuẩn bị mẫu đo cho nồng độ genistein μM Nồng độ PNPG giếng (mM) Enzyme U/mL (µL) Genistein 0,25 mM (µL) PNPG 1,67 mM (µL) Đệm phosphate (µL) 0.15 0.25 10 10 Nồng độ PNPG giếng (mM) Enzyme U/mL 0.5 0.75 10 10 0 20 30 170 160 (µL) Genistein 0,25 mM 18 30 172 160 (µL) PNPG mM (µL) Đệm phosphate (µL) 22 Bảng 9: Chuẩn bị mẫu đo cho nồng độ genistein 20 μM Nồng độ PNPG giếng (mM) Enzyme U/mL (µL) 0.15 0.25 10 10 Nồng độ PNPG giếng (mM) Enzyme U/mL 0.5 0.75 10 10 16 16 20 30 154 144 (µL) Genistein 0,25 mM (µL) 16 Genistein 0,25 mM 16 (µL) PNPG 1,67 mM (µL) 18 PNPG mM 30 (µL) Đệm phosphate (µL) 156 144 Đệm phosphate (µL) Bảng 10: Chuẩn bị mẫu đo cho nồng độ genistein 50 μM Nồng độ PNPG giếng (mM) Enzyme U/mL (µL) Genistein 0,25 mM (µL) PNPG 1,67 mM (µL) Đệm phosphate (µL) 0.15 0.25 10 10 Nồng độ PNPG giếng (mM) Enzyme U/mL 0.5 0.75 10 10 40 40 20 30 130 120 (µL) 40 Genistein 0,25 mM 40 (µL) 18 PNPG mM 30 (µL) 132 120 Đệm phosphate (µL) Đồ thị Linerweaver – Burk, theo phương trình (14): 𝟏 𝑲𝒎 𝟏 𝟏 = + 𝒗 𝒗𝒎𝒂𝒙 [𝑺] 𝒗𝒎𝒂𝒙 Trong đó: [S] nồng độ PNPG, v vận tốc phản ứng enzyme PNPG, vmax vận tốc cực đại phản ứng, Km số Michaelis Xây dựng đồ thị ghép (3 nồng độ genistein) biểu thị phụ thuộc 1/v theo 1/[S] để xác định chế ức chế 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Quá trình dập tắt huỳnh quang tryptophan genistein Genistein sử dụng để khảo sát tương tác genistein tryptophan thông qua phổ phát huỳnh quang tryptophan Theo kết [Hình 3.1] kích thích bước sóng 295 nm, cường độ phát xạ tryptophan khơng có mặt genistein đạt cực đại khoảng 353 nm, kết phù hợp với kết công bố [5] Khi có mặt genistein cường độ phát xạ tryptophan giảm xuống, nồng độ genistein tăng cường độ phát quang giảm Điều cho thấy genistein tương tác với tryptophan Dựa vào kết này, tương tác genistein tryptophan có mặt α-glucosidase khảo sát cho thí nghiệm Hình 1: Cường độ phát xạ tryptophan có mặt genistein nồng độ khác 3.2 Hoạt tính genistein -glucosidase Để thử nghiệm khả ức chế in vitro genistein -glucosidase, nồng độ enzyme giếng 0,25 U/mL nồng độ genistein thay đổi khoảng 24 35 µM Khả ức chế enzyme genistein biểu diễn qua phần trăm ức chế (%) [Hình 3.2], phần trăm enzyme bị ức chế tăng nồng độ genistein tăng Giá trị IC50 = 7,79 µM xác định dựa phương trình mơ Hình 3.2 Trong điều kiện nghiên cứu này, kết thử nghiệm tương tự số kết nghiên cứu trước công bố [2], [3], [13] Kết cho thấy genistein chất ức chế tiềm -glucosidase Hình 2: Phần trăm ức chế enzyme nồng độ khác enzyme 3.3 Quá trình dập tắt huỳnh quang -glucosidase genistein Thử nghiệm in vitro -glucosidase cho thấy genistein có khả tương tác với enzyme Để chứng thực điều này, phổ phát huỳnh quang -glucosidase khảo sát có khơng có genistein Theo kết [Hình 3.3], kích thích bước sóng 295 nm (bước sóng kích thích tryptophan enzyme), genistein khơng có khả phát huỳnh quang Vì vậy, cường độ phát huỳnh quang đến từ -glucosidase Phổ phát huỳnh quang ezyme có đỉnh cực đại khoảng 343 nm, phù hợp với phổ phất huỳnh quang tryptophan [5] Khi nồng độ genistein tăng cường độ phát huỳnh quang enzyme giảm, hay nói cách khác phát huỳnh quang enzyme bị dập 25 tắt Kết cho thấy rằng, genistein tương tác dập tắt huỳnh quang enzyme Hình 3: Cường độ phát huỳnh quang -glucosidase có khơng có genistein Dựa vào trình dập tắt huỳnh quang -glucosidase genistein, đồ thị SternVolmer xây dựng [Hình 3.4 (a)] Hằng số Stern-Volmer, Ksv [Bảng 3.1] độ dốc (slope) phương trình Stern-Volmer Từ giá trị KSV = kq0, số trình dập tắt lưỡng phân tử kq tính tốn (phương trình (8) chương 1) Giá trị kq cho biết chế dập tắt huỳnh quang Quá trình dập tắt huỳnh quang xảy theo chế dập tắt tĩnh (static quenching) dập tắt động (dynamic quenching) hai Nếu giá trị kq 1010 M-1s-1 [5] q trình dập tắt huỳnh quang xảy theo chế dập tắt động Nếu kq lớn nhiều 1010 M-1s-1 trình dập tắt xảy theo hai chế, chế tĩnh chiếm ưu thế, nghĩa tạo phức chất trạng thái [FQ] (phương trình (11) chương 1) Ở đây, giá trị giá trị kq 4,04 × 1013 [Bảng 3.1] lớn nhiều so với 1010 M-1s-1 nên đề xuất chế dập tắt huỳnh quang - 26 glucosidase genistein xảy theo hai chế, trong chế tĩnh chiếm ưu Vì có q trình dập tắt tĩnh nên phương trình Stern-Volmer biểu diễn dạng phương trình (12): (a) (b) Hình 4: Đồ thị phương trình Stern – Volmer (a) Đồ thị phương trình (12) (b) Như vậy, cách xây dựng đồ thị log(F0/F - 1) với log[genistein] [Hình 3.4 (a)] xác định giá trị như: Hằng số kết hợp (association constant) Ka, M-1 tỷ lệ phản ứng enzyme genistein (stoichiometry, n) Giá trị Ka lớn, nghĩa enzyme genistein liên kết mạnh hay nói cách khác ức genistein ức chế tốt [14] [15] Hằng số Ka có giá trị 3,38×105 M-1 cho thấy genistein có lực lớn với glucosidase Điều phù hợp với giá trị IC50 7,79 µM Giá trị n = 1,06 cho thấy tỉ lệ liên kết enzyme genistein 1:1 3.4 Tương tác liên kết kỵ nước -glucosidase genistein 3.4.1 Phổ phát xạ phức chất enzyme – ANS Chất ANS đóng vai trị đầu dị huỳnh quang kết hợp với bề mặt enzyme thông qua tương tác kỵ nước Khi có mặt chất ANS, enzyme tạo phức với ANS phức chất có khả phát huỳnh quang bước sóng kích thích phù hợp Để xác định bước sóng kích thích, phức chất enzyme – ANS khảo sát cách đo phổ phát xạ bước sóng Ex = 300-600 nm, Em = 500 nm Như [Hình 3.5] cường độ 27 phát xạ phức chất cho đỉnh phát xạ cực đại bước sóng ≈ 375 nm, kết phù hợp với công bố [9] [14] Dựa vào kết này, nhóm nghiên cứu chọn bước sóng 375 nm làm bước sóng kích thích đo phổ phát huỳnh quang phức enzyme – ANS mặt có mặt genistein để xác định chất tương tác -glucosidase genistein Hình 5: Phổ phát xạ phức chất enzyme – ANS 3.4.2 Tương tác liên kết kỵ nước -glucosidase genistein Để xác định chất tương tác -glucosidase genistein, 8-anilino-1naphthalenesulfonic acid (ANS) cho vào dung dịch enzyme Tương tác enzyme ANS tương tác kỵ nước Như [Hình 3.5], kích thích bước sóng 375 nm phức chất enzyme – ANS cho đỉnh phát xạ cực đại khoảng 475 nm Trong ANS cho đỉnh phát xạ cực đại khoảng 510 nm enzym glucosidase gần không phát xạ khoảng bước sóng khảo sát từ 400 đến 600 nm Điều cho thấy phổ phát huỳnh quang ANS -glucosidase không ảnh hưởng đến phổ phát huỳnh quang phức chất enzyme – ANS Kết [Hình 3.5] cho thấy, cường độ phát huỳnh quang phức chất enzyme – ANS giảm có mặt genistein Khi nồng độ genistein tăng lên từ µM đến 25 µM cường độ phát huỳnh quang phức enzyme – ANS giảm có xu hướng bị dập tắt 28 hoàn toàn tiếp tục tăng nồng độ genistein Điều genistein tương tác kỵ nước với enzyme Hình 6: Quang phổ huỳnh quang phức -glucosidase – ANS trường hợp có mặt genistein 3.5 Phân loại ức chế genistein -glucosidase Xây dựng đồ thị Lineweaver – Burk thể phụ thuộc 1/v theo 1/[S] để xác định loại ức chế (Inhibition mode) Từ kết [Hình 3.6] giá trị 1/v tăng lên nồng độ genistein tăng đường giao điểm trục hoành đồ thị, điều cho thấy genistein chất ức chế không cạnh tranh (non – competitive) glucosidase Kết phù hợp với nghiên cứu trước [2] [9] Ngồi ra, từ đồ thị Lineweaver – Burk xác định số Michaelis Km 2,45×10-3 M 29 Hình 7: Đồ thị Lineweaver – Burk Vận tốc phản ứng (v) Bảng 1: Giá trị IC50, thông số động học ức chế chế ức chế -glucosidase genistein Đại lượng động học Giá trị Đại lượng động học Giá trị IC50 (M) 7,79 kq (M-1s-1) 4,041013 KSV (M-1) 4,04105 Km (M) 2,4510-3 o (s) 10-8 Ki (M) 25,610-6 n 1,06 Ka(M-1) 3,38105 Cơ chế ức chế Không cạnh tranh Loại tương tác Kỵ nước 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Trong nghiên cứu này, genistein dập tắt huỳnh quang -glucosidase thông qua hai chế: Dập tắt động dập tắt tĩnh, dập tắt tĩnh chiếm ưu Genistein tương tác với -glucosidase thông qua tương tác kỵ nước với tỉ lệ 1:1 Nghiên cứu động học enzyme cho thấy genistein ức chế -glucosidase thông qua chế ức chế không cạnh tranh với giá trị IC50 7,79 µM Kiến nghị Mặc dù nghiên cứu trước genistein ức chế -glucosidase theo chế thuận nghịch (reversible), nhiên thực nghiệm chưa thực nghiên cứu Do nhóm kiến nghị hoàn thành thực nghiệm thời gian tới Kết nghiên cứu động học genistein khố luận sử dụng để làm chất so sánh nhằm nghiên cứu hoạt tính ức chế động học hợp chất flavonoid chalconoid tổng hợp cơng trình nghiên cứu liên quan 31 DANH MỤC CÁC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] S M Boué et al., "Glyceollins, soy isoflavone phytoalexins, improve oral glucose disposal by stimulating glucose uptake," (in eng), J Agric Food Chem, vol 60, no 25, pp 6376-82, Jun 27 2012 [2] D.-S Lee and S.-H J F l Lee, "Genistein, a soy isoflavone, is a potent α‐ glucosidase inhibitor", FEBS Lett, vol 501, no 1, pp 84-6, Jul 13 2001 [3] D Şöhretoğlu and S J P R Sari, "Flavonoids as alpha-glucosidase inhibitors: Mechanistic approaches merged with enzyme kinetics and molecular modelling," Phytochemistry Reviews, vol 19, no 5, pp 1081-1092, 2020 [4] H U Son et al., "Effects of Synergistic Inhibition on α-glucosidase by Phytoalexins in Soybeans," (in eng), Biomolecules, vol 9, no 12, Dec 2019 [5] T Rollins, Essentials of Molecular Photochemistry NY Research Press, 2015 [6] J L Liu et al., "Spectroscopy and molecular docking analysis reveal structural specificity of flavonoids in the inhibition of α-glucosidase activity," (in eng), Int J Biol Macromol, Food Chemistry, vol 152, pp 981-989, Jun 2020 [7] N Cardullo et al., "C-glucosidic ellagitannins and galloylated glucoses as potential functional food ingredients with anti-diabetic properties: A study of αglucosidase and α-amylase inhibition", vol 313, p 126099, 2020 [8] M Deshpande and S K Sathe, "Interactions with 8-Anilinonaphthalene-1sulfonic Acid (ANS) and Surface Hydrophobicity of Black Gram (Vigna mungo) Phaseolin," (in eng), J Food Sci, vol 83, no 7, pp 1847-1855, Jul 2018 [9] O K Gasymov and B J Glasgow, "ANS fluorescence: potential to augment the identification of the external binding sites of proteins," (in eng), Biochim Biophys Acta, vol 1774, no 3, pp 403-11, Mar 2007 32 [10] J.-H Kim et al., "Neuroprotective effects of ginsenoside Rg3 against homocysteine-induced excitotoxicity in rat hippocampus," Brain Research, 1136(1), 190-199, vol 1136, pp 190-199, 2007 [11] B J T F j Srinivasan, "A guide to the Michaelis–Menten equation: steady state and beyond," FEBS Lett 2021 [12] B J C Srinivasan, "Explicit treatment of non‐Michaelis‐Menten and atypical kinetics in early drug discovery," ChemMedChem vol 16, no 6, pp 899-918, 2021 [13] T Kenjiro, M Yuji, T Kouta, and M J J N S V Tomoko, "Inhibition of αGlucosidase and α-Amylase by Flavonoids," Journal of Nutritional Science and Vitaminology vol 52, pp 149-53, 2006 [14] M Deshpande and S K J J o f s Sathe, "Interactions with 8‐ Anilinonaphthalene‐1‐sulfonic Acid (ANS) and Surface Hydrophobicity of Black Gram (Vigna mungo) Phaseolin," Journal of Food Scrence, vol 83, no 7, pp 1847-1855, 2018 [15] H.-U Son et al., "Effects of Synergistic Inhibition on α-glucosidase by Phytoalexins in Soybeans", Biomolecules, vol 9, no 12, p 828, 2019 33 PHỤ LỤC Đồ thị phương trình Stern – Volmer (a) Đồ thị phương trình (12) (b) G 25 I0/I 1,67006 3,04719 11,11204 Đồ thị Lineweaver – Burk Vận tốc hấp thụ (v) 1/[PNPG] G0 G20 G50 6,67 1,08 1,69 3,1 4,00 0,68 1,07 1,91 2,00 0,39 0,53 0,97 1,33 0,29 0,45 0,86 Đồ thị biểu diễn hình ảnh phổ hấp thu UV – Vis tryptophan, genisten ANS 34