Đánh giá khả năng thủy ngân cơ chất của xylanase d tái tổ hợp từ chủng pichia pastoris gs115

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CƠ CHẤT CỦA XYLANASE D TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG PICHIA PASTORIS GS115 Hà Nội - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN CƠ CHẤT CỦA XYLANASE D TÁI TỔ HỢP TỪ CHỦNG PICHIA PASTORIS GS115 Người thực : TRẦN THỊ HỒNG NHUNG Mã sinh viên : 637255 Lớp : K63CNSHC Khoa : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn : TS ĐỖ THỊ TUYÊN PGS.TS NGUYỄN THANH HẢI Hà Nội - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thực cá nhân, thực dựa sở nghiên cứu lý thuyết, kiến thức chuyên ngành nghiên cứu, khảo sát tình hình thực tiễn hướng dẫn khoa học TS Đỗ Thị Tuyên PGS.TS Nguyễn Thanh Hải Các số liệu, bảng biểu kết khóa luận trung thực Các nhận xét phương hướng đưa xuất phát từ thực tiễn kinh nghiệm có Một lần nữa, tơi xin khẳng định trung thực lời cam đoan Người thực Trần Thị Hồng Nhung i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn tới tồn thể thầy giáo Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, người dạy dỗ cho em kiến thức quý báu suốt thời gian năm học tập trường Em xin chân thành cảm ơn thầy cô anh chị phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme tạo điều kiện thuận lợi tận tình hướng dẫn em trình thực tập, nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Đỗ Thị Tuyên, người tận tình bảo em kiến thức chun mơn, giúp em hình thành ý tưởng nghiên cứu thực nghiệm tạo điều kiện tốt giúp em học tập, rèn luyện thực khóa luận suốt q trình thực tập phịng Cơng nghệ sinh học enzyme - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Sự khích lệ suốt q trình nghiên cứu phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme tiếp thêm động lực cho em, giúp em tự tin bước tiếp đường nghiên cứu khoa học Em xin chân thành cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Thanh Hải người vừa người thầy tâm huyết, vừa người truyền cảm hứng sống làm việc cho em nhiều hệ sinh viên Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Em cảm ơn thầy suốt thời gian qua ln động viên, khích lệ em Những lời khun học thầy kim nam giúp em định hướng thân đường tương lai Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè bên cạnh thời điểm khó khăn nhất, động viên tiếp thêm niềm tin, động lực cho em đường học tập rèn luyện thân Báo cáo không tránh khỏi thiếu sót mong nhận ý kiến đóng góp q báu Q Thầy Cơ để báo cáo hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2022 Sinh Viên Trần Thị Hồng Nhung ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii TÓM TẮT MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Enzyme xylanase 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Cấu trúc 1.1.4 Cơ chế xúc tác 1.1.5 Ứng dụng 1.2 Xylanase tự nhiên xylanase tái tổ hợp 1.2.1 Xylanse tự nhiên 1.2.2 Xylanase tái tổ hợp 11 1.3 Xylanase từ Aspergillus 13 1.4 Chủng biểu Pichia Pastoris 15 1.5 Tình hình nghiên cứu nước 16 1.5.1 Một số nghiên cứu giới 16 1.5.2 Một số nghiên cứu Việt Nam 17 PHẦN ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 20 2.1.1 Chủng giống 20 2.1.2 Hóa chất 20 iii 2.1.3 Các dung dịch đệm 20 2.1.4 Môi trường 22 2.1.5 Máy móc thiết bị thí nghiệm 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy 23 2.2.2 Xác định hoạt tính xylanase 23 2.2.2.1 Định tính xylanase 23 2.2.2.2 Định lượng xylanase 24 2.2.3 Xác định hàm lượng protein 25 2.2.4 Phương pháp xác định thủy phân chất 26 2.2.5 Điện di protein gel polyacrylamid (SDS-PAGE) 27 2.2.6 Xử lý số liệu 28 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Nuôi cấy chủng, xác định hoạt độ xylanase 29 3.2 Xác định xylanase D điện di SDS-PAGE 30 3.3 Xác định khả thủy phân chất xylanase D 31 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ 31 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian 33 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất 35 3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC 44 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt AOX1 Alcohol oxidase AOX2 Alcohol oxidase APS Ammonium persulfate CAGR Compounded Annual Growth rate Tốc độ tăng trưởng hàng năm kép CAZy Carbohydrate-Active enzymes Ammonium persulfat Cơ sở liệu enzym carbohydrat Database DNS Dinitro salysilic acid Acid dinitro salysilic EDTA Ethylen diamin tetra acetic acid Acid ethylen diamin tetraacetic GH Glycosid hydrolase kb Kilo base kDa Kilo Dalton OD Optical density Mật độ quang PAGE Polyacrylamide gel Điện di gel polyacrylamid electrophoresis SDS Sodium dodecyl sulfate Natri dodecyl sulfat TEMED N,N,N’,N’Tetramethylethylenediamin Tris Tris-(hydroxymethyl) aminomethan v/v Volume/volume w/v Weight/volume XOS Xylo-oligosaccharide v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm số họ GH chứa enzyme có hoạt tính xylan Bảng 1.2 Vi khuẩn sản xuất xylanase Bảng 1.3 Một số nấm sản xuất xylanase 10 Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 20 Bảng 2.2 Thành phần loại đệm dung dịch 21 Bảng 2.3 Môi trường sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 2.4 Các máy móc thiết bị sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 2.5 Thành phần gel polyacrylamid 12,5% 27 Bảng 3.1 Xác định lượng đường khử hàm lượng protein dịch nuôi cấy từ chủng P pastoris GS115/pPXlnD 30 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc chủng P pastoris GS115/pPXlnD 29 Hình 3.2 Kết xác định hoạt tính xylanase dịch nuôi cấy từ chủng P pastoris GS115/pPXlnD 30 Hình 3.3 Điện di đồ SDS-PAGE kiểm tra hệ thống biểu rXlnD P pastoris GS115 31 Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả thủy phân chất 32 Hình 3.5 Ảnh hưởng thời gian đến khả thủy phân chất 33 Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ chất đến hoạt tính enzyme 35 Hình 3.7 Ảnh hưởng nồng độ enzyme 36 vii TÓM TẮT Xylanase enzyme ưa chuộng thị trường khả ứng dụng cao ngành cơng nghiệp Nên việc nghiên cứu điều kiện tối ưu cho hoạt động enzyme đạt hàm lượng đường khử cao góp phần bổ sung vào việc ứng dụng sản xuất enzyme xylanase cần thiết Sau khảo sát điều kiện ảnh hưởng nhiệt độ ủ, thời gian ủ, nồng độ chất nồng độ enzyme để đánh giá khả thủy phân chất xylanase D tái tổ hợp cho thấy: Ở nhiệt độ ủ 40℃ tối thích cho hoạt động cùa enzyme xylanase, thời gian ủ thích hợp với nồng độ chất (lõi ngô, cám gạo, bột đậu tương) 40 mg nồng độ enzyme xylanase U/ml cho lượng đường khử tạo enzyme đạt cao nhiệt độ cao thời gian dài enzyme hoạt tính Kết trình bày hình 3.7 Hình 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả thủy phân chất Kết hình 3.7 cho thấy, ủ nhiệt độ 40 hàm lượng đường khử cao đạt 0,544 ± 0,002 µmol/ml với lõi ngơ, 0,607 ± 0,003 µmol/ml với cám gạo 0,735 ± 0,004 µmol/ml với bột đậu tương Như vậy, nhiệt độ tối thích cho enzyme xylanase xúc tác Khi vượt ngưỡng 40 lượng đường khử có tăng giảm không đồng Về kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ, năm 2018 (Li et al , 2018) tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ xylanase tái tổ hợp từ Lentinula edodes (rLeXyn11A) biểu Pichia pastoris dải nhiệt độ khác (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 90 ) để tìm nhiệt độ thích hợp cho hoạt động enzyme kết cho thấy 40 tối ưu cho xylanase tái tổ hợp Ở nghiên cứu khác (Liu et al., 2017) thực khảo sát xylanase tái tổ hợp từ Bacillus amyloliquefaciens biểu Pichia pastoris 32 tạo xylooligosaccharides từ xylanase thủy phân cám lúa mì, kết cho thấy nhiệt độ mà xylanase hoạt động tốt 50 theo nhóm tác giả kết luận Dựa sở nghiên cứu khảo sát nhiệt độ trước đó, tơi tiến hành khảo sát lại ảnh hưởng nhiệt độ đến khả thủy phân chất xylanase tái tổ hợp đem đo hoạt tính Kết thu hoạt tính cao 40 , chúng tỏ nhiệt độ tối thích cho enzyme xylanase xúc tác, hồn tồn phù hợp với cơng bố (Li et al , 2018) có khác biệt so với công bố (Liu et al , 2017) Điều hiểu chủng khác có đặc điểm khác enzyme hoạt động nhiệt độ khác Từ đó, tơi đưa dự đốn ban đầu hoạt động tối ưu enzyme khảo sát khoảng nhiệt độ để làm tiền đề cho khảo sát 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian Sau xác định nhiệt độ có hàm lượng đường khử cao 40 , để nghiên cứu ảnh hưởng thời gian tiến hành ủ enzyme chất với khoảng thời gian 2, 4, với nồng độ chất 20mg nhiệt độ ủ 40 Kết trình bày hình 3.8 Hình 3.8 Ảnh hưởng thời gian đến khả thủy phân chất 33 Kết hình 3.8 cho thấy, khả thủy phân chất enzyme khác theo thời gian ủ Khi ủ giờ, hàm lượng đường đạt cao với lõi ngô, cám gạo, bột đậu tương 0,688 ± 0,003 µmol/ml, 0,640 ± 0,003 µmol/ml 0,695 ± 0,001µmol/ml Hàm lượng đường khử tạo bắt đầu giảm sau Thời gian yếu tố quan trọng trình xúc tác enzyme Mỗi phản ứng từ bắt đầu kết thúc cần khoảng thời gian định Thời gian phản ứng không đủ làm giảm hiệu thuỷ phân phản ứng q thời gian cần thiết hiệu khơng tăng mà cịn gây lãng phí thời gian ảnh hưởng đến hiệu enzyme Việc chọn thời gian phản ứng phù hợp cho phản ứng điều cần thiết Trong nghiên cứu (Lý et al , 2013) kết ảnh hưởng thời gian phản ứng đến hiệu thủy phân dịch xylan 10 giờ, hàm lượng đường khử lên đến 72,2 mg/l Khi nhóm tác giả tăng thời gian từ đến 10 lượng đường tạo tăng dần Sau tiếp tục kéo dài thời gian phản ứng lên 12, 14, 16, 18, 20 lượng đường sản phẩm tạo gần khơng thay đổi Vì vậy, xét hiệu kinh tế lựa chọn thời gian phản ứng thích hợp sử dụng lõi ngô chất Năm 2011, Ghaffar et al tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến hoạt tính enzyme sử dụng chất bột cám gạo, nghiên cứu enzyme hoạt động tốt (Ghaffar et al., 2011) Để góp phần vào nghiên cứu trước đó, tơi lựa chọn khoảng thời gian phản ứng thu hoạt tính enzyme cao Kết giống với nghiên cứu trước (Romo-Sánchez et al., 2014) , khác với nghiên cứu (Lý et al , 2013) (Ghaffar et al , 2011) Điều hiểu chất khác cần thời gian cho trình thủy phân enzyme khác Chính thế, nồng độ chất chọn để tiến hành khảo sát lên trình thủy phân enzyme 34 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất Để lựa chọn nồng độ thích hợp cho khả thủy phân chất dịch ni xylanase tái tổ hợp, thí nghiệm tiến hành nồng độ chất 10, 20, 30, 40 50 mg chất (lõi ngô, cám gạo, bột đậu tương) với nhiệt độ 40 sau xác định hàm lượng đường khử tạo theo đường chuẩn Kết trình bày hình 3.9 Hình 3.9 Ảnh hưởng nồng độ chất Kết khảo sát nồng độ chất cho thấy, với nồng độ chất 40mg đủ để hàm lượng đường tạo đạt giá trị cực đại 0,974 ± 0,003 µmol/ml với lõi ngơ, 0,750 ± 0,004 µmol/ml với cám gạo 0,888 ± 0,002 µmol/ml với bột đậu tương Vì nồng độ chất 40 mg chọn với thời gian 40 để tiến hành khảo sát điều kiện cuối đến hàm lượng đường tạo enzyme xylanase D tái tổ hợp Đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng xylan từ phụ phẩm nông nghiệp sản xuất enzyme xylanase (Song et al., 2016) nghiên cứu “Tác dụng đồng thời cellulase xylanase trình thủy phân chất lignocellulosic tự nhiên”, nhóm tác giả sử dụng lõi ngô, râu ngô rơm rạ làm 35 chất nồng độ 40 mg lượng xylose giải phóng đạt 19,53; 15,56 17,35 mg/ml chất Năm 2013, Alencar công thực khảo sát ảnh hưởng chất cám gạo, rơm rạ, bã mía thơ, bã mía mịn, lõi ngơ cám lúa mì nồng độ 0,5% 1% Kết cho thấy 1% tốt cho nguồn carbon để sản xuất xylanase A niger (8,42 U/ml), bã mía mịn 0,5% (5,32 U/ml ) lõi ngơ 1% (8 U/ml) (Alencar Guimaraes De et al., 2013) Trong nghiên cứu này, nồng độ chất ( lõi ngô, cám gạo, bột đậu tương) enzyme thủy phân cho hoạt tính cao 40 mg hồn tồn phù hợp với nghiên cứu trước (Song et al., 2016) 3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme Để xác định xác hơn, khác biệt khả thủy phân xylanase nồng độ enzyme khác nhau, tiến hành đo hàm lượng đường khử nồng độ enzyme khác (3, 4, 10 U/ml) pha loãng xác định theo đường chuẩn xylose, kết trình bày hình 3.10 Hình 3.10 Ảnh hưởng nồng độ enzyme 36 Kết hình 3.10 cho thấy, nồng độ enzyme U/ml hàm lượng đường khử tạo cao với lõi ngô, cám gạo, bột đậu tương 0,731 ± 0,002 µmol/ml, 0,687 ± 0,002 µmol/ml 0,763 ± 0,003 µmol/ml Cuối cùng, sau tối ưu nồng độ chất, tiến hành khảo sát nồng độ enzyme, cho thấy nồng độ U/ml enzyme cho hàm lượng đường khử cao (0,763 ± 0,003 µmol/ml với bột đậu tương) Do thời gian nghiên cứu có hạn, tơi khảo sát điều kiện nên kết thu hàm lượng đường khử enzyme xylanase khiêm tốn Để sinh tổng hợp sản lượng enzyme lớn phục vụ cho nghiên cứu, ứng dụng quy mô công nghiệp sau cần có nghiên cứu môi trường dinh dưỡng điều kiện khác để tối ưu điều kiện sinh tổng hợp xylanase 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết thí nghiệm số liệu thu được, tơi đưa kết luận sau: Chủng P pastoris GS115/pPXlnD có khả sinh tổng hợp xylanase D tái tổ hợp môi trường YP, cảm ứng 1% methanol Xylanase tái tổ hợp thể điện di SDS-PAGE với trọng lượng phân tử khoảng 35 kDa, hoạt tính xylanase D đạt 15,94 IU/mg protein Sau khảo sát điều kiện nhiệt độ ủ, thời gian ủ, nồng độ chất nồng độ enzyme để đánh giá khả thủy phân chất xylanase D tái tổ hợp cho kết nhiệt độ ủ 40℃ thời gian ủ với nồng độ chất 40 mg nồng độ enzyme U/ml cho lượng đường khử tạo enzyme đạt cao (0,73 ± 0,002 μmol/ml lõi ngô, 0,687 ± 0,002 μmol/ml cám gạo 0,763 ± 0,003 μmol/ml bột đậu tương) KIẾN NGHỊ Do thời gian thực đề tài có hạn, luận văn nhận thấy kết bước đầu sơ khai cơng trình nghiên cứu, tơi xin đưa kiến nghị: - Khảo sát chất khác để đưa tranh tổng thể khả thủy phân phụ phẩm nông nghiệp enzyme xylanase tái tổ hợp - Khảo sát thêm tính bền nhiệt xylanase khoảng nhiệt độ khác nhằm ứng dụng enzyme ngành cơng nghiệp địi hỏi xylanase hoạt động môi trường nhiệt độ cao 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Alencar Guimaraes de , Cavalieri N., Sorgatto M., Peixoto-Nogueira S d C., Betini J H A., Zanoelo F F., Marques M R., de Moraes Polizeli M d L T & Giannesi G C (2013) Bioprocess and biotechnology: effect of xylanase from Aspergillus niger and Aspergillus flavus on pulp biobleaching and enzyme production using agroindustrial residues as substract SpringerPlus 2(1): 380 Alzari P M., ne Souchon H & Dominguez R J S (1996) The crystal structure of endoglucanase CelA, a family glycosyl hydrolase from Clostridium thermocellum 4(3): 265-275 Amaike S & Keller N P (2011) Aspergillus flavus 49(1): 107-133 Bae H.-J., Kim H J & Kim Y S (2008) Production of a recombinant xylanase in plants and its potential for pulp biobleaching applications Bioresource Technology 99(9): 3513-3519 Bassam B J., Caetano-Anollés G & Gresshoff P M J A b (1991) Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels 196(1): 80-83 Beg Q., Kapoor M., Mahajan L., Hoondal G J A m & biotechnology (2001) Microbial xylanases and their industrial applications: a review 56(3): 326-338 Bennett J (2010) An overview of the genus Aspergillus Molecular biology genomics 1-17 Bradford M M (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Analytical biochemistry 72: 248-254 Byrne B J C o i s b (2015) Pichia pastoris as an expression host for membrane protein structural biology 32: 9-17 Collins T., Gerday C & Feller G (2005) Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases FEMS Microbiology Reviews 29(1): 3-23 Cregg J., Tschopp J., Stillman C., Siegel R., Akong M., Craig W., Buckholz R & Madden K J B T (1987) kellaris PA, Davis GR, Smiley BL, Cruze J., Torregrossa R., Velicelebi G., abd Thill GP high level expression nad efficient assembly of hepatitis B surface antigen in Pichia pastoris 5: 470-485 Cunha d Q B., Gama C C., Cintra A R., Bataus L C., Ulhoa L A M & José C (2018) Improvement of bread making quality by supplementation with a recombinant xylanase produced by Pichia pastoris PLoS One 13(2): e0192996 Dalby P A (2007) Engineering enzymes for biocatalysis Recent Pat Biotechnol 1: 1-9 39 Dobrev G T., Pishtiyski I G., Stanchev V S & Mircheva R (2007) Optimization of nutrient medium containing agricultural wastes for xylanase production by Aspergillus niger B03 using optimal composite experimental design Bioresource Technology 98(14): 2671-2678 DODD D & CANN I K O (2009) Enzymatic deconstruction of xylan for biofuel production 1(1): 2-17 Driss D., F B., R G & S.E C (2012) Cloning and constitutive expression of His-tagged xylanase GH 11 from Penicillium occitanis Pol6 in Pichia pastoris X33: purification and characterization Protein Expr Purif 83: 814 Ellis S B., Brust P F., Koutz P J., Waters A., Harpold M M., Gingeras T R J M & biology c (1985) Isolation of alcohol oxidase and two other methanol regulatable genes from the yeast Pichia pastoris 5(5): 11111121 Ghaffar A., Khan S A., Mukhtar Z., Rajoka M I & Latif F (2011) Heterologous expression of a gene for thermostable xylanase from Chaetomium thermophilum in Pichia pastoris GS115 Molecular Biology Reports 38(5): 3227-3233 Gu S., Liu C., Zhang W., Qu M., Li Y., Zang Y., Xiong X., Pan K & Zhao X (2021) Characteristics of a recombinant Fusarium verticillioides cutinase and its effects on enzymatic hydrolysis of rice straw International Journal of Biological Macromolecules 171: 382-388 Guérin D M., Lascombe M.-B., Costabel M., Souchon H., Lamzin V., Béguin P & Alzari P M J J o m b (2002) Atomic (0.94 Å) resolution structure of an inverting glycosidase in complex with substrate 316(5): 1061-1069 Hedayati M T., Pasqualotto A C., Warn P A., Bowyer P & Denning D W (2007) Aspergillus flavus: human pathogen, allergen and mycotoxin producer 153(6): 1677-1692 Higgins D R J C p i p s (1995) Overview of protein expression in Pichia pastoris 2(1): 5.7 1-5.7 18 Hồng Quốc Khánh, Ngơ Đức Duy, Đào Thị Thu Hiền & Mai Kim Rí (2012) Thu nhận enzyme cellulase xylanase từ giá thể trồng nấm sau thu hoạch thử nghiệm xử lý rơm rạ Tạp chí Sinh học 34(3): 84-90 Ichishima E (2016) Development of enzyme technology for Aspergillus oryzae, A sojae, and A luchuensis, the national microorganisms of Japan Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 80(9): 1681-1692 Jeffries T W (1996) Biochemistry and genetics of microbial xylanases Current Opinion in Biotechnology 7(3): 337-342 Juturu V & Wu J C (2012) Microbial xylanases: Engineering, production and industrial applications Biotechnology Advances 30(6): 1219-1227 40 Karbalaei M., Rezaee S A & Farsiani H (2020) Pichia pastoris: A highly successful expression system for optimal synthesis of heterologous proteins 235(9): 5867-5881 Khandeparker R., Parab P., Amberkar U J F t & biotechnology (2017) Recombinant xylanase from Bacillus tequilensis BT21: biochemical characterisation and its application in the production of xylobiose from agricultural residues 55(2): 164-172 Koutz P., Davis G R., Stillman C., Barringer K., Cregg J & Thill G J Y (1989) Structural comparison of the Pichia pastoris alcohol oxidase genes 5(3): 167-177 Kumar V & Shukla P (2016) Functional Aspects of Xylanases Toward Industrial Applications In: Frontier Discoveries and Innovations in Interdisciplinary Microbiology Shukla, P (ed.) Springer India New Delhi: 157-165 pages Laemmli U K (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 227(5259): 680-5 Li L., Qu M., Liu C., Xu L., Pan K., Song X., OuYang K., Li Y & Zhao X (2018) Expression of a Recombinant Lentinula edodes Xylanase by Pichia pastoris and Its Effects on Ruminal Fermentation and Microbial Community in in vitro Incubation of Agricultural Straws Liu M.-q., Huo W.-k., Xu X & Weng X.-y (2017) Recombinant Bacillus amyloliquefaciens xylanase A expressed in Pichia pastoris and generation of xylooligosaccharides from xylans and wheat bran International Journal of Biological Macromolecules 105: 656-663 Lombard V., Golaconda Ramulu H., Drula E., Coutinho P M & Henrissat B (2013) The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013 Nucleic Acids Research 42(D1): D490-D495 Lý T T., Xuân T T., Chí T V & Vinh P T (2013).Ảnh hưởng enzyme xylanase đến q trình thủy phân dịch xylan lõi ngơ Retrieved from on 08/06/2022 Mandal A (2015) Review on microbial xylanases and their applications International Journal of Life Sciences 4(3): 178-187 Mao L., Meng P., Zhou C., Ma L., Zhang G & Ma Y (2012) Molecular cloning and heterologous expression of an acid stable xylanase gene from Alternaria sp HB186 World J Microbiol Biotechnol 28: 777-784 Markets R a (2021).Global Markets for Enzymes in Industrial Applications 2021-2026 167.Retrieved from on 20/02/2022 Mendis M & Simsek S (2014) Arabinoxylans and human health Food Hydrocolloids 42: 239-243 Miller G L (1959) Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar Analytical Chemistry 31(3): 426-428 41 Motta A., Santana (2013) A review of xylanase production by the fermentation of xylan: classification, characterization and applications 1: 251-276 Nguyễn Thị Quỳnh Mai, Nguyễn Hồng Đào, Võ Thị Kim Viên, Lê Thị Khánh Hồng, Huỳnh Thị Quế Anh & Đào Thị Mỹ Linh (2019) Nghiên cứu q trình thu nhận đánh giá hoạt tính sinh học xylooligosaccharide (XOS) từ bã mía Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 55(CĐ Công nghệ Sinh học): 250-257 Nhung T T., Phương P T T., Hường N T & Phương N T M J T c S h (2013) Nghiên cứu thu nhận xylooligosaccharide (XOS) từ cám gạo công nghệ enzyme 35(1): 67-73 Nurizzo D., Turkenburg J P., Charnock S J., Roberts S M., Dodson E J., McKie V A., Taylor E J., Gilbert H J & Davies G J J N s b (2002) Cellvibrio japonicus α-L-arabinanase 43A has a novel five-blade βpropeller fold 9(9): 665-668 Okafor U A., Okochi V I., Onyegeme-okerenta B M & Nwodo-Chinedu S (2007) Xylanase production by Aspergillus niger ANL 301 using agro wastes African Journal of Biotechnology 6(14): 1710-1714 Polizeli M d L., Rizzatti A C S., Monti R., Terenzi H F., Jorge J A., Amorim D S J A M & Biotechnology (2005) Xylanases from fungi: properties and industrial applications 67: 577-591 Romo-Sánchez S., Camacho C., Ramirez H L & Arévalo-Villena M (2014) Immobilization of Commercial Cellulase and Xylanase by Different Methods Using Two Polymeric Supports Advances in Bioscience and Biotechnology Vol.05No.06: 10 Rye C S & Withers S G (2000) Glycosidase mechanisms Current Opinion in Chemical Biology 4(5): 573-580 Safder I., Khan S., Islam I.-u., Ali M., Bibi Z & Waqas M J B L (2018) Pichia pastoris expression system: a potential candidate to express protein in industrial and biopharmaceutical domains 4(1): 1-14 Samanta A., Kolte A P., Senani S., Sridhar M & Jayapal N J B J o M (2011) A simple and efficient diffusion technique for assay of endo β-1, 4-xylanase activity 42: 1349-1353 Sen S., Dasu V V & Mandal B (2007) Developments in directed evolution for improving enzyme functions Appl Biochem Biotechnol 143: 212-223 Song H.-T., Gao Y., Yang Y.-M., Xiao W.-J., Liu S.-H., Xia W.-C., Liu Z.-L., Yi L & Jiang Z.-B (2016) Synergistic effect of cellulase and xylanase during hydrolysis of natural lignocellulosic substrates Bioresource Technology 219: 710-715 Song L., Tsang A & Sylvestre M (2015) Engineering a thermostable fungal GH10 xylanase, importance of N-terminal amino acids Biotechnol Bioeng 42 Sun T., Yan P., Zhan N., Zhang L., Chen Z., Zhang A & Shan A (2020) The optimization of fermentation conditions for Pichia pastoris GS115 producing recombinant xylanase 20(5-6): 216-228 Till M., Goldstone D., Card G., Attwood G T., Moon C D & Arcus V L (2014) Structural analysis of the GH43 enzyme Xsa43E from Butyrivibrio proteoclasticus Acta Crystallographica Section F 70(9): 1193-1198 Uday U S P., Choudhury P., Bandyopadhyay T K & Bhunia B (2016) Classification, mode of action and production strategy of xylanase and its application for biofuel production from water hyacinth International Journal of Biological Macromolecules 82: 1041-1054 Wong K., Tan L & Saddler J N J M r (1988) Multiplicity of beta-1, 4xylanase in microorganisms: functions and applications 52(3): 305-317 Wu S & Letchworth G J J B (2004) High efficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreated with lithium acetate and dithiothreitol 36(1): 152-154 Zahrl R J., Peña D A., Mattanovich D & Gasser B J F y r (2017) Systems biotechnology for protein production in Pichia pastoris 17(7) Zhang W., Pan K., Liu C., Qu M., OuYang K., Song X & Zhao X (2020) Recombinant Lentinula edodes xylanase improved the hydrolysis and in vitro ruminal fermentation of soybean straw by changing its fiber structure International Journal of Biological Macromolecules 151: 286292 43 PHỤ LỤC Bảng 4.1 Đường khử đo theo nhiệt độ Nhiệt Thời độ gian 30℃ 24h 35℃ 24h 40℃ 24h 45℃ 24h Cơ chất OD1 OD2 OD3 Lõi ngô Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô 0,032 0,105 0,157 0,041 0,097 0,153 0,075 0,122 0,219 0,027 0,031 0,033 0,027 0,035 0,098 0,149 0,042 0,101 0,157 0,074 0,123 0,222 0,018 0,024 0,028 0,02 0,030 0,106 0,152 0,037 0,099 0,155 0,077 0,126 0,225 0,015 0,028 0,022 0,025 OD Hàm đường khử TB tạo 0,487 ± 0,003 0,032 0,580 ± 0,006 0,103 0,576 ± 0,114 0,153 0,481 ± 0,031 0,040 0,575 ± 0,003 0,099 0,155 0,648 ± 0,003 0,075 0,544 ± 0,002 0,124 0,607 ± 0,003 0,222 0,735 ± 0,004 0,020 0,460 ± 0,013 0,028 0,481 ± 0,005 0,028 0,467 ± 0,019 0,024 0,468 ± 0,02 0,037 0,128 0,029 0,029 0,120 0,022 0,038 0,116 0,022 0,025 0,117 0,028 0,036 0,129 0,033 0,022 0,126 0,032 0,037 0,124 0,028 0,025 0,121 0,027 0,494 ± 0,001 0,557 ± 0,097 0,472 ± 0,024 0,466 ± 0,018 0,548 ± 0,089 0,469 ± 0,021 0,067 0,071 0,068 0,069 0,13 0,134 0,136 0,133 0,018 0,02 0,015 0,018 0,504 ± 0,051 0,563 ± 0,102 0,462 ± 0,014 0,123 0,177 0,126 0,167 0,121 0,078 0,553 ± 0,093 0,597 ± 0,131 0,555 ± 0,095 0,590 ± 0,125 0,554 ± 0,094 0,514 ± 0,059 30 phút Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô 50℃ 1h Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô 1h30 phút Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô 30 phút Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô 55℃ 1h Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô 0,124 0,171 0,125 0,162 0,124 0,072 0,120 0,198 0,130 0,165 0,125 0,079 0,122 0,182 0,127 0,165 0,123 0,076 44 Nhiệt Thời Cơ chất độ gian 1h30 phút Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô 30 phút Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô 65℃ 1h Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô 1h30 phút Cám gạo Bột đậu tương OD1 OD2 OD3 OD TB Hàm đường khử tạo 0,116 0,11 0,118 0,115 0,1 0,095 0,097 0,097 0,028 0,023 0,025 0,025 0,547 ± 0,088 0,529 ± 0,072 0,466 ± 0,018 0,114 0,089 0,047 0,072 0,086 0,22 0,115 0,088 0,041 0,073 0,088 0,093 0,596 ± 0,002 0,524 ± 0,068 0,483 ± 0,033 9,597 ± 0,054 0,560 ± 0,003 0,471 ± 0,022 0,02 0,03 0,034 0,028 0,055 0,053 0,048 0,052 0,473 ± 0,024 0,492 ± 0,041 0,117 0,091 0,035 0,071 0,09 0,031 0,115 0,084 0,040 0,077 0,088 0,028 Bảng 4.2 Đường khử đo theo thời gian Nhiệt Thời độ gian 2h 4h 40℃ 6h 8h Cơ chất OD1 OD2 OD3 Lõi ngô Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô Cám gạo Bột đậu tương 0,184 0,147 0,191 0,13 0,13 0,168 0,087 0,067 0,094 0,015 0,014 0,024 0,188 0,151 0,192 0,098 0,13 0,166 0,085 0,065 0,093 0,019 0,016 0,025 0,186 0,149 0,190 0,097 0,128 0,169 0,089 0,068 0,091 0,014 0,010 0,027 OD TB 0,186 0,149 0,191 0,108 0,129 0,168 0,087 0,067 0,093 0,016 0,013 0,025 Hàm đường khử tạo 0,688 ± 0,003 0,640 ± 0,003 0,695 ± 0,001 0,530 ± 0,074 0,614 ± 0,002 0,664 ± 0,002 0,559 ± 0,003 0,532 ± 0,002 0,527 ± 0,071 0,458 ± 0,011 0,458 ± 0,011 0,478 ± 0,002 45 Bảng 4.3 Đường khử đo theo nồng độ chất Nồng độ chất (mg) 10 20 30 40 50 Cơ chất OD1 OD2 OD3 Lõi ngô Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô Cám gạo Bột đậu tương 0,051 0,09 0,007 0,184 0,147 0,191 0,117 0,064 0,186 0,405 0,236 0,338 0,195 0,192 0,226 0,053 0,11 0,007 0,188 0,151 0,192 0,115 0,064 0,188 0,407 0,23 0,341 0,223 0,193 0,223 0,054 0,1 0,008 0,186 0,149 0,190 0,114 0,063 0,194 0,397 0,234 0,339 0,221 0,195 0,227 OD TB 0,053 0,100 0,007 0,186 0,149 0,191 0,115 0,064 0,189 0,403 0,233 0,339 0,213 0,193 0,225 Hàm đường khử tạo 0,524 ± 0,002 0,576 ± 0,013 0,455 ± 0,001 0,688 ± 0,003 0,640 ± 0,003 0,695 ± 0,001 0,596 ± 0,002 0,528 ± 0,001 0,608 ± 0,141 0,974 ± 0,003 0,750 ± 0,004 0,888 ± 0,002 0,639 ± 0,167 0,698 ± 0,002 0,740 ± 0,003 Bảng 4.4 Đường khử đo theo nồng độ enzyme Nồng độ enzyme (U/ml) 10 Cơ chất OD1 OD2 OD3 Lõi ngô Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô Cám gạo Bột đậu tương Lõi ngô Cám gạo Bột đậu tương 0,018 0,011 0,026 0,184 0,147 0,191 0,201 0,158 0,190 0,217 0,174 0,241 0,015 0,009 0,027 0,188 0,151 0,192 0,203 0,160 0,184 0,219 0,175 0,243 0,011 0,020 0,028 0,186 0,149 0,190 0,205 0,165 0,188 0,220 0,177 0,245 OD TB 0,015 0,013 0,027 0,186 0,149 0,191 0,203 0,161 0,187 0,219 0,175 0,243 Hàm đường khử tạo 0,460 ± 0,013 0,454 ± 0,008 0,480 ± 0,001 0,688 ± 0,003 0,640 ± 0,003 0,695 ± 0,001 0,710 ± 0,003 0,584 ± 0,120 0,607 ± 0,140 0,731 ± 0,002 0,687 ± 0,002 0,763 ± 0,003 46