Tiểu luận Sinh học phân tử

Tiểu luận Sinh học phân tử

Trờng đại học quốc gia đại học khoa học tự nhiên khoa sinh học PCR (Polymerase chain reaction) (Tiểu luận Sinh học phân tử) Sinh viên: Nguyễn Đức Nhự Lớp K6-CNTNSH Giảng viên hớc dẫn: PGS.TS Đỗ Ngọc Liên 1 Hµ néi, N¨m 2004 2 PCR (Polymerase chain reaction) I. Những kiến thức cơ bản về PCR. PCR là từ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction trong tiếng Anh. Có nhiều cách dịch cho cụm từ này. Có sách dịch là phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ Polymerase, có tài liệu dịch là phản ứng chuỗi trùng hợp, hay đơn giản là kỹ thuật PCR. ở đây chúng ta sẽ dùng đơn giản là kỹ thuật PCR. Kỹ thuật này do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào giữa thập niên 80 của thế kỷ hai mơi đã đa lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Từ đó đến nay, nó đã đợc sử dụng rộng rãi và trở thành phần không thể thiếu trong các hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử. Kary Mullis nhận giải thởng Nobel năm 1993 về phát minh PCR Kary Mullis đã viết trong tạp chí khoa học Mỹ: Bắt đầu bằng một phân tử riêng lẻ có chứa chất liệu di truyền ADN, PCR có thể tạo ra 100 triệu phân tử t- ơng tự trong một buổi chiều. Phản ứng dễ dàng thực hiện. Nó đòi hỏi không nhiều hơn một ống nghiệm, một vài hoá chất đơn giản và một nguồn nhiệt. Mẫu ADN cần để nhân bản có thể tinh sạch, hoặc là một phần rất nhỏ trong một hỗn hợp chất sinh học cực kỳ phức tạp. ADN có thể từ mẫu bệnh phẩm của bệnh viện, một sợi tóc ngời, một giọt máu rơi ở hiện trờng phạm tội, hoặc từ mô não 3 xác ớp, hay từ một wooly không lồ 40.000 năm tuổi đóng băng ở sông băng (Kary Mullis website.htm). II. Mục đích và ý nghĩa: Đối tợng nghiên cứu của Sinh học phân tử thờng là những vật chất di truyền có hàm lợng tơng đối nhỏ trong mẫu, hoặc là những gen đơn lẻ, rất nhỏ trong một hệ gen phức tạp, khổng lồ ví dụ nh hệ gen của động vật bậc cao chứa tới 100.000 gen. Có nhiều kỹ thuật trong di truyền học phân tử đợc hoàn thiện để vợt qua khó khăn này, nhng chúng đòi hỏi nhiều thời gian, cồng kềnh và rất khó khăn trong việc tìm kiếm những đoạn and đặc hiệu. Kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại một lợng ADN trong mẫu một cách nhanh chóng và rẻ tiền. Còn đối với những gen đơn lẻ, việc tạo ra nhiều bản sao của đoạn ADN cần lựa chọn đợc thực hiện mà không cần tách và nhân dòng. ADN đợc khuếch đại có thể xuất phát từ các nguồn rất khác nhau, từ các tác nhân gây bệnh ở ngời (HIV hay là bệnh mụn giộp -herpes) đến tinh dịch trong một vụ án tội ác nào đó hay ADN của một chú mối sống từ 40 triệu năm trớc (Powledge 1998). Trình tự đích có thể rất nhỏ (nh đã nói ở trên) hay cũng có thể rất lớn (đến 10 4 cặp bazơ) (Stryer 1995). Yếu tố mấu chốt của ADN khiến PCR có thể đợc sử dụng trong mọi trờng hợp là vật liệu di truyền. Do những u điểm tuyệt đối trong nghiên cứu sinh học phân tử, kỹ thuật PCR đợc nhanh chóng áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học và cho kết quả chính xác. Mặt khác sự phân tích thành phần và trật tự nucleotide trên phân tử ADN trong hệ gen có giá trị rất lơn trong phân loại các loài sinh vật. Chính nhờ tính thực tiễn to lớn đó mà tác giả của PCR, Kary Mullis đã đợc tặng giải thởng Nobel năm 1993. III. Cơ sở khoa học (nguyên lý) của kỹ thuật PCR: PCR là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình sao chép AND với sự tham gia của một loại enzyme AND polymerase chịu nhiệt, có hai đoạn ngắn AND, một sợi làm mồi (primers) và dùng các đoạn AND mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với nó. Vì vậy khởi đầu quá trình tổng hợp AND cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotide (có độ dài từ 4 3-60 nucleotide). Đoạn này gắn kết với and khuôn tại điểm khởi đầu sao chép. Đó là đặc điểm quan trọng đầu tiên của PCR vì ADN polymerase đợc điều khiển để tổng hợp một đoạn ADN đặc thù. Quá trình này đợc enzyme adn polymerase điều khiển để tổng hợp nên một sợi ADNđặc thù. Các sợi ADN mạch đơn làm khuôn đợc tạo ra theo cách đơn giản là nâng nhiệt độ lên trên 90 độ C mà thờng là 94 độ C cho chuỗi xoắn kép ADN bung ra. Cả hai sợi ADN đều đợc dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các đoạn mồi (primer) đợc cung cấp để bám vào vị trí tơng ứng cho cả hai sợi. Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi đợc chọn nằm ở hai đầu đoạn ADN cần nhân lên sao cho các sợi ADN tổng hợp mới đợc bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài nằm giữa hai đoạn mồi này. Độ dài của sản phẩm PCR có thể từ vài trăm đến hàng ngàn, thậm chí hàng chục ngàn cặp nucleotide. Nh vậy, sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện cho mỗi ADN mới đợc tổng hợp . Hỗn hợp phản ứng lại đợc nâng nhiệt độ lên thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này sau đó đợc dùng làm khuôn cho chu kỳ tiếp theo, bao gồm các bớc: gắn mồi, tổng hợp ADN và tách rời các đoạn. Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ của phản ứng, tính theo lý thuyết ta sẽ có 2 n bản sao các phân tử ADN mạch kép nằm giữa hai đoạn mồi. Đó là đặc điểm quan trọng thứ hai của kỹ thuật PCR. Nh vậy kết quả là một đoạn ADN định trớc đợc nhân lên với một lợng rất lớn, ví dụ sau 32 chu kỳ số lợng bản sao ADN của PCR sẽ là 1.073.741.824. 5 IV. Cách tiến hành phản ứng PCR PCR là một kỹ thuật phòng thí nghiệm tơng đối dễ làm, mặc dù đó là một kỹ thuật rất đa năng và ứng dụng hết sức rộng rãi. Vật liệu khởi đầu cho PCR là ADN có chứa đoạn cần nhân lên, gọi là khuôn ADN. Không phải lúc nào cũng cần thiết tách chiết đoạn cần nhân lên vì việc đó đã đợc các đoạn mồi dùng trong phản ứng xác định. Tuy nhiên nếu ADN làm khuôn tinh khiết thì phản ứng PCR sẽ rất nhạy và đặc hiệu. Hàm lợng ADN khuôn cần cho phản ứng PCR rất nhỏ. Trong các thí nghiệm bình thờng ở phòng thí nghiệm chỉ cần 1-100 nanogam (ng) tổng số của hệ gen là đủ. Tuy nhiên ngày nay trong nhiều trờng hợp, phản ứng PCR có thể nhân các đoạn ADN chỉ từ một phân tử ADN riêng lẻ. Nguyên liệu cần thiết để tiến hành phản ứng invitro cũng giống nh nguyên liệu cần thiết để tổng hợp ADN trong tế bào. Có 4 thành phần cần thiết là: 1. ADN làm khuôn (mạch kép) cần khuếch đại 2. Hai đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN. 3. Enzyme chịu nhiệt ADN-polymerase (hiện nay đợc dùng phổ biến nhất là Tap, đợc chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus) 4. Tất cả 4 loại deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs): dATP, dTTP, dCTP, dDTP. Ngoài ra môi trờng đệm cung cấp ion Mg ++ và nớc tinh khiết rất cần thiết để tiến hành kỹ thuật PCR. Dung tích cho một phản ứng PCR thông thờng là 50 à hoặc 20 à . Chu trình thực hiện Để thực hiện phản ứng, chúng ta không chỉ đơn giản là cho tất cả nguyên liệu vào ống nghiệm rồi đun nóng. Đây là một chu trình khép kín, gồm ba bớc cơ bản: (3 bớc điều chỉnh nhiệt độ ) cho một chu kỳ: 1. Bung liên kết của ADN (denuteration): Mục đích của việc này là làm biến tính ADN, khiến hai sợi ADN tách nhau ra. Do đó, các đoạn mồi có thể gắn vào phần bổ sung trên ADN ở bớc sau. Cũng trong bớc này, các phản ứng enzym đều ngừng lại (ví dụ nh sự mở rộng của chu trình tr- ớc). 6 Đợc thực hiện ở nhiệt độ khoảng 94 0 trong vài giây đến vài phút. Tại nhiệt độ này, các phân tử ADN mạch kép sẽ bị tách ra hoàn toàn tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzyme polymerase xúc tác tổng hợp. 2. Mồi bám ( hay còn gọi là ủ với mồi) (annealing): Ngay lập tức nhiệt độ đợc hạ xuống 54 0 C để các đoạn mồi gắn với các trình tự bổ xung tơng ứng trên các phân tử ADN làm khuôn. Các đoạn mồi dịch chuyển lộn xộn dới chuyển động Brao (Brown). Liên kết ion giữa các đoạn mồi đơn và các sợi khuôn đơn liên tục đợc tạo ra rồi lại đứt gãy. Các liên kết bền vững hơn (do những mồi gắn đúng vào vị trí) kéo dài lâu hơn. Trên những đoạn ngắn ADN mạch kép bao gồm khuôn và mồi này, ADN polymerase có thể gắn vào và bắt đầu kéo dài chuỗi. Sau khi đã có một vài bazơ đ- ợc gắn vào, liên kết hyđro giữa mạch khuôn và mồi trở nên đủ mạnh để nó không bị đứt vỡ nữa. Nhiệt độ gắn kết này góp phần quyết định tính đặc hiệu của phản ứng PCR. Nhiệt độ và khoảng thời gian dùng ở đay thay đổi tuỳ thuộc vào chiều dài của ADN cần nhân lên. 3. Tổng hợp (hay còn gọi là kéo dài)(extension): Các đoạn mồi nào đã đợc kéo dài một vài bazơ thì có lực liên kết với khuôn mạnh hơn lực phá vỡ chúng. Còn các mồi gắn không chính xác trở nên lỏng lẻo (do nhiệt độ đã cao hơn) và không có sự kéo dài mạch xảy ra. Nhiệt độ ngay lập tức đợc nâng lên 72 0 C, sự tổng hợp ADN diễn ra tối u dới nhiệt độ này. Nhiệt độ 72 0 C đợc duy trì trong 5 phút để các sợi ADN vừa đợc tổng hợp xoắn vào nhau tạo nên ADN sợi kép. Vào cuối giai đoạn này, nhiệt độ một lần nữa đợc nâng lên 94 0 C , nhng lần này chỉ trong vòng 20 giây để cho các mẫu ngắn của ADN mạch kép (cả sợi ban đầu và sợi mới đợc tổng hợp) tách nhau ra. Nh vậy một chu kỳ gồm: đun nóng để tách các sợi ADN kép thành sợi đơn để làm khuôn, gắn kết các đoạn mồi vào sợi khuôn và tổng hợp ADN bằng ADN polymerase, đợc lặp đi lặp lại khoảng từ 30 đến 60 lần. 7 Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ đợc duy trì ở 72 0 C trong 5-10 phút cho tất cả các sợi đơn ADN có trong phản ứng xoắn lại tạo nên sản phẩm PCR. Cuối cùng nhiệt độ đợc hạ xuống 4 0 C để bảo quản sản phẩm. Hình ảnh minh hoạ các bớc của phản ứng PCR nh sau: Sản phẩm của phản ứng PCR là đoạn ADN mà ta cần nhân lên. Sản phẩm đợc kiểm tra bằng cách chạy điện di trên thạch Agarose nồng độ 0,8%-2%, và ADN 8 của PCR sẽ đợc nhìn thấy rõ hơn dới tác dụng của tia cực tím (ultra-violet) sau khi đực nhuộm bằng Ethidium Bromide, một loại hoá chất có khả năng bám và làm hiển thị ADN. Độ dài của ADN sản phẩm đợc tính bằng cách so sánh với chỉ thị ADN (ADN marker), sử dụng thông dụng nhất là ADN của thực khuẩn thể Lamda cắt bằng enzyme giới hạn Hindlll. V- Phản ứng RT-PCR (PCR ngợc) * Nguyên lý: Phản ứng RT-PCR thực chất là phản ứng nhân một đoạn giới hạn của khuôn ARN theo nguyên lý của phản ứng PCR, bao gồm hai giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất là chuyển đổi một sợi ARN làm khuôn thành ADN hai sợi, sau đó qua giai đoạn thứ hai, dùng ADN hai sợi này tiếp tục làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR nh đã giới thiệu. ARN là một sợi bao gồm 4 nucleotide liên kết vơi nhau, trong đó có Adenin, Guanin, Cystosin và Uracin. Chuỗi nucleotide này phải đợc chuyển đổi thành AND 2 sợi mà thành phần Uracin đợc thay thế bằng Thymin. Phản ứng làm biến đổi ARN hệ gen thành AND phải nhờ đến vai trò của một loại enzyme gọi là enzyme sao chép ngợc (Reverse Transcriptase), do vậy giai đoạn này đợc gọi là chuyển ng- ợc (RT), đợc thực hiện ở nhiệt độ 50-55 độ C trong 30 phút. Khi đã có ADN 2 sợi làm khuôn chuyển đổi từ ARN ban đầu, phản ứng tiếp theo là PCR nh đã giới thiệu và đợc thực hiện theo 3 bớc thay đổi nhiệt độ cho phù hợp ở mỗi chu kỳ. Toàn bộ phản ứng nhân một đoạn ADN từ khuôn ARN qua hai giai đoạn nói trên đợc gọi là phản ứng RT-PCR hay phản ứng PCR ngợc. Do một số virus có hệ gen là ARN cho nên muốn nhân một đoạn gen của nó thì ngời ta phải dùng phản ứng RT-PVR. Một số nghiên cứu về ARN thông tin cũng cần đến phản ứng RT-PCR để chuyển đổi sợi ARN thành ADN cho quá trình đồng hoá để giải trình tự hoặc tái tổ hợp trong nghiên cứu biểu thị protein. Trớc khi tiến hành phản ứng PCR phải thực hiện giai đoạn chuyển ngợc RT, sau đó thành phần ADN đợc chuyển đổi này làm khuôn tiếp tục mới đợc nhân lên bằng phản ứng PCR. Quá trình này gồm hai giai đoạn: - Phản ứng RT: Đó là giai đoạn chuyển ARN hệ gen thành ADN nhờ enzyme sao chép ngợc biến ARN ở dạng sợi đơn sang dạng sợi kép ADN bằng cách thực hiện phản ứng ở nhiệt độ 55 độ C trong vòng 30 phút. 9 - Phản ứng PCR: là giai đoạn gồm 3 bớc nh đã nới ở trên. * Cách tiến hành: - Giai đoạn 1 (RT): 1 chu kỳ. Thực hiện sao chép ngợc từ ARN sợi đơn sang AND sợi kép ở nhiệt độ 55 độ C trong vòng 30 phút. - Giai đoạn 2 (PCR): + Bớc khởi đầu: 1 chu kỳ. Bung liên kết: Bung chuỗi xoắn kép ADN 2 sợi thành khuôn 1 sợi làm khuôn và cho primer bám vào: 94-95 độ C/ 1 phút. + Bớc 1: Bung liên kết: Bung chuỗi xoắn kép ADN 2 sợi thành khuôn 1 sợi làm khuôn và cho primer bám vào: 94-95 độ C/ 1 phút + Bớc 2: Bám mồi + Bớc 3: Tổng hợp ADN kéo dài (Các bớc 1,2,3 đợc thực hiện lặp đi lặp lại trong 35-40 chu kỳ). + Bớc kết thúc: (1 chu kỳ), hoàn chỉnh gen ADN cho sản phẩm; 72 độ trong 1 phút. Cuối cùng nhiệt độ đợc hạ xuống 4 0 C để bảo quản sản phẩm. VI- Kiểm tra kết quả PCR: Trớc khi sản phẩm PCR đợc đem sử dụng, ngời ta cần phải kiểm tra: 1. Sản phẩm có đợc hình thành hay không: Cho dù hoá sinh có là ngành khoa học chính xác đến đâu đi nữa, ngời ta cũng không thể chắc chắn rằng mọi phản ứng PCR đều thành công. Chất lợng của ADN có thể quá tồi, do đó một trong các đoạn mồi có thể không phù hợp, hoặc cũng có thể có quá nhiều điểm bắt đầu. 2. Kích thớc của sản phẩm có đúng không: Có khả năng sản phẩm chỉ dài 500 bazơ, mà trên thực tế gen cần khuếch đại lại dài 1800 bazơ. Khi đó, một trong hai mồi có thể đã gắn (phù hợp) với phần nào đó trên gen mà gần với mồi còn lại hơn. Cũng có thể cả hai mồi đã gắn vào một gen hoàn toàn khác. Kết quả của PCR đợc kiểm tra thông qua băng điện di. Ngời ta thờng sử dụng phơng pháp điện di trên gel agarose. Nếu không có sản phẩm nào đợc tạo ra, trên băng điện di sẽ không có vạch nào. Nếu có các sản phẩm khuếch đại không mong muốn, chúng ta sẽ thu đợc băng điện di có nhiều vạch. 10 [...]... của PCR nhân bản từ một lợng nhỏ ADN trong mẫu nớc tiểu cảu một ngời 27 tuổi, họ phát hiện ra rằng có sự đột biến giống nhau ở gen p53 trong cả hai mẫu Các nhà nghiên cứu đã nói bệnh của Humphrey có thể phát hiện đợc ung th nếu các kỹ thuật của sinh học phân tử phát triển đợc nh hiện nay Lịch sử di truyền quay trở lại nhờ PCR Sau bệnh mù màu, nhà hoá học ngời Anh, John Dalton chết năm 1884, một số mô... định mức độ ô nhiễm sinh học có thể thực hiện rất hiệu quả nhanh chóng bằng kỹ thuật PCR 7 PCR với hệ thống hiện đại, nghiên cứu sinh thái học Với PCR các nhà hệ thống có thể trực tiếp đo đợc sự khác nhau của chuỗi ADN giữa các loài và lựa chọn những chuỗi có ít thay đổi trong quá trình tiến hoá, giữa những nhánh sinh vật chính Tốc độ và sự tự động hoá của các phơng tiện, các nhà khoa học có thể dễ dàng... giờ 3 Trong Y học PCR có thể giúp chẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn, các bệnh do virus, do nấm, kể cả HIV-AIDS, chẩn đoán sớm và theo dõi điều trị ung th Trong t vấn di truyền Y học, PCR cho phép chẩn đoán nhanh, chính xác các bệnh di truyền kể cả chẩn đoán trớc sinh giới tính và các dị tật bẩm sinh có thể từ khi thai mới đợc 8 tuần tuổi và điều quan trọng là không cần chọc ối, chỉ... (1990) đề xuất khuếch đại 40 - 45 chu trình đối với 50 phân tử đích, và 25-30 chu trình cho 3x105 phân tử cùng nồng độ Sự không tơng xứng này do cái gọi là hiệu ứng bằng (plateau effect) gây nên Đây là sự giảm tốc độ tăng của sự tích luỹ sản phẩm theo cấp số mũ ở những giai đoạn cuối của PCR, khi mà nồng độ sản phẩm đạt đến 0,3 1,0 nM Có thể sự phân rã của các chất phản ứng (dNTPs, enzyme), sự depletion... Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng không sử dụng vào các thao tác khác đầu tip sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm đầu micropipette bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phản ứng - Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trớc - Tất cả mọi thành phần phản ứng đều đợc chia thành những lợng nhỏ, tính toán sao cho đủ với 1 , 2 lần thao tác - Ngoài... PCR, các nhà khoa học thể hiện lại những thông tin di truyền từ những dấu vết mờ nhạt nhất, nớc tiểu, phân động vật, tóc hoặc da ngời dính trên cây Thêm những thông tin để giúp phân loại những cá thể có thể đợc xác định để ớc tính lợng dân số trong vùng hay để xác định vùng địa lý của động vật đơn lẻ hay từng nhóm Kỹ thuật này có thể đợc chấp nhận để nghiên cứu tỷ lệ đối với thực vật, phân tích sự gieo... di truyền của một loài sinh vật cần thiết với số lợng không hạn chế, vì vậy nó có thể dùng để phân tích những tế bào nào chứa vật chất đó Chúng có thể là tế bào mầm, hoặc thực vật hiếm có trong y học, hoặc con ngời, thực tế chúng ta có thể biết đợc những gì đợc ghi lại trên ADN của chúng Với những sinh vật đơn giản, biết ADN của chúng là sẽ biết đợc hầu hết về chúng, với những sinh vật phức tạp nh con... tinh dịch, vết máu đã lâu năm, PCR có thể không hạn chế nhân bản một lợng ADN rất nhỏ còn lại trong dấu vết sinh học nh đã tiến hành trong trờng hợp của Maryland * ADN cổ đại và mối quan hệ tiến hoá 29 Các nhà khoả cổ học đã dựa vào PCR và ứng dụng nó theo nhiều cách kác hau rất hữu ích, PCR giúp phân loại mối quan hệ giữa những nhóm ngời đã bị tuyệt chủng và những vết tích của những ngời di c Nghiên... sống xã hội 1 Trong nghiên cứu khoa học: Kỹ thuật PCR giúp ích hữu hiệu cho việc xác định trình tự nucleotide của các đoạn ADN đợc nhân; có thể sử dụng PCR để tác dòng những đoạn ADN đặc hiệu, mặc dù trong nhiều trờng hợp không cần đến PCR; nó giúp phát hiện đột biến, cho phép phân tích liên kết gen từ những tế bào riêng lẻ; giúp nghiên cứu quá trình tiến hoá ở mức phân tử Thậm chí giúp phục hồi những... khoảng không gian kín nh phòng thí nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã đợc khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí và bám vào tờng, cửa, thiết bị dụng cụ rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó Có thể khấc phục các vấn đề này bằng một số biện pháp sau; - Các công đoạn thao tác khác nhau nh thiết lập phản ứng PCR và phân tích các sản phẩm khuếch đại phải đợc tiến hành ở những . Trờng đại học quốc gia đại học khoa học tự nhiên khoa sinh học PCR (Polymerase chain reaction) (Tiểu luận Sinh học phân tử) Sinh viên: Nguyễn Đức. truyền học phân tử. Từ đó đến nay, nó đã đợc sử dụng rộng rãi và trở thành phần không thể thiếu trong các hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử.