Tiểu luận sinh học phân tử

Tiểu luận sinh học phân tử

Trờng đại học quốc gia

đại học khoa học tự nhiên

khoa sinh học

PCR

(Polymerase chain reaction)

(Tiểu luận Sinh học phân tử)

Sinh viên: Nguyễn Đức Nhự Lớp K6-CNTNSH

Giảng viên hớc dẫn:

PGS.TS Đỗ Ngọc Liên

Hà nội, Năm 2004

(Polymerase chain reaction)

I Những kiến thức cơ bản về PCR.

PCR là từ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction trong tiếng Anh

Có nhiều cách dịch cho cụm từ này Có sách dịch là phản ứng tổng hợp dâychuyền nhờ Polymerase, có tài liệu dịch là phản ứng chuỗi trùng hợp, hay đơngiản là kỹ thuật PCR ở đây chúng ta sẽ dùng đơn giản là kỹ thuật PCR

Kỹ thuật này do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào giữa thập niên 80của thế kỷ hai mơi đã đa lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử Từ

đó đến nay, nó đã đợc sử dụng rộng rãi và trở thành phần không thể thiếu trongcác hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử

Kary Mullis nhận giải thởng Nobel năm 1993 về phát minh PCR

Kary Mullis đã viết trong tạp chí khoa học Mỹ: “ Bắt đầu bằng một phân tử

riêng lẻ có chứa chất liệu di truyền ADN, PCR có thể tạo ra 100 triệu phân tử

t-ơng tự trong một buổi chiều Phản ứng dễ dàng thực hiện Nó đòi hỏi không nhiều hơn một ống nghiệm, một vài hoá chất đơn giản và một nguồn nhiệt Mẫu ADN cần để nhân bản có thể tinh sạch, hoặc là một phần rất nhỏ trong một hỗn hợp chất sinh học cực kỳ phức tạp ADN có thể từ mẫu bệnh phẩm của bệnh viện, một sợi tóc ngời, một giọt máu rơi ở hiện trờng phạm tội, hoặc từ mô não xác ớp, hay từ một wooly không lồ 40.000 năm tuổi đóng băng ở sông băng ”

(Kary Mullis website.htm).

II Mục đích và ý nghĩa:

Đối tợng nghiên cứu của Sinh học phân tử thờng là những vật chất ditruyền có hàm lợng tơng đối nhỏ trong mẫu, hoặc là những gen đơn lẻ, rất nhỏtrong một hệ gen phức tạp, khổng lồ ví dụ nh hệ gen của động vật bậc cao chứatới 100.000 gen Có nhiều kỹ thuật trong di truyền học phân tử đợc hoàn thiện để

vợt qua khó khăn này, nhng chúng đòi hỏi nhiều thời gian, cồng kềnh và rất khókhăn trong việc tìm kiếm những đoạn and đặc hiệu Kỹ thuật PCR cho phépkhuếch đại một lợng ADN trong mẫu một cách nhanh chóng và rẻ tiền Còn đốivới những gen đơn lẻ, việc tạo ra nhiều bản sao của đoạn ADN cần lựa chọn đ ợcthực hiện mà không cần tách và nhân dòng

ADN đợc khuếch đại có thể xuất phát từ các nguồn rất khác nhau, từ cáctác nhân gây bệnh ở ngời (HIV hay là bệnh mụn giộp -herpes) đến tinh dịchtrong một vụ án tội ác nào đó hay ADN của một chú mối sống từ 40 triệu năm tr-

ớc (Powledge 1998) Trình tự đích có thể rất nhỏ (nh đã nói ở trên) hay cũng cóthể rất lớn (đến 104 cặp bazơ) (Stryer 1995) Yếu tố mấu chốt của ADN khiếnPCR có thể đợc sử dụng trong mọi trờng hợp là vật liệu di truyền

Do những u điểm tuyệt đối trong nghiên cứu sinh học phân tử, kỹ thuậtPCR đợc nhanh chóng áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học và cho kếtquả chính xác Mặt khác sự phân tích thành phần và trật tự nucleotide trên phân

tử ADN trong hệ gen có giá trị rất lơn trong phân loại các loài sinh vật Chínhnhờ tính thực tiễn to lớn đó mà tác giả của PCR, Kary Mullis đã đợc tặng giải th-ởng Nobel năm 1993

III Cơ sở khoa học (nguyên lý) của kỹ thuật PCR:

PCR là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm củaquá trình sao chép AND với sự tham gia của một loại enzyme AND polymerasechịu nhiệt, có hai đoạn ngắn AND, một sợi làm mồi (primers) và dùng các đoạnAND mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với nó Vì vậy khởi

đầu quá trình tổng hợp AND cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotide (có độ dài

từ 3-60 nucleotide) Đoạn này gắn kết với and khuôn tại điểm khởi đầu saochép Đó là đặc điểm quan trọng đầu tiên của PCR vì ADN polymerase đợc điềukhiển để tổng hợp một đoạn ADN đặc thù Quá trình này đợc enzyme adnpolymerase điều khiển để tổng hợp nên một sợi ADNđặc thù Các sợi ADN mạch

đơn làm khuôn đợc tạo ra theo cách đơn giản là nâng nhiệt độ lên trên 90 độ C

mà thờng là 94 độ C cho chuỗi xoắn kép ADN bung ra

Cả hai sợi ADN đều đợc dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các

đoạn mồi (primer) đợc cung cấp để bám vào vị trí tơng ứng cho cả hai sợi Trong

kỹ thuật PCR, các đoạn mồi đợc chọn nằm ở hai đầu đoạn ADN cần nhân lên saocho các sợi ADN tổng hợp mới đợc bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía

đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài nằm giữa hai đoạn mồi này

Độ dài của sản phẩm PCR có thể từ vài trăm đến hàng ngàn, thậm chí hàng chụcngàn cặp nucleotide Nh vậy, sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lạixuất hiện cho mỗi ADN mới đợc tổng hợp Hỗn hợp phản ứng lại đợc nâng nhiệt

độ lên thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi nàysau đó đợc dùng làm khuôn cho chu kỳ tiếp theo, bao gồm các bớc: gắn mồi,tổng hợp ADN và tách rời các đoạn.

Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ của phản ứng, tínhtheo lý thuyết ta sẽ có 2n bản sao các phân tử ADN mạch kép nằm giữa hai đoạnmồi Đó là đặc điểm quan trọng thứ hai của kỹ thuật PCR Nh vậy kết quả là một

đoạn ADN định trớc đợc nhân lên với một lợng rất lớn, ví dụ sau 32 chu kỳ số ợng bản sao ADN của PCR sẽ là 1.073.741.824

l-IV Cách tiến hành phản ứng PCR

PCR là một kỹ thuật phòng thí nghiệm tơng đối dễ làm, mặc dù đó là một

kỹ thuật rất đa năng và ứng dụng hết sức rộng rãi Vật liệu khởi đầu cho PCR làADN có chứa đoạn cần nhân lên, gọi là khuôn ADN Không phải lúc nào cũngcần thiết tách chiết đoạn cần nhân lên vì việc đó đã đợc các đoạn mồi dùng trongphản ứng xác định Tuy nhiên nếu ADN làm khuôn tinh khiết thì phản ứng PCR

sẽ rất nhạy và đặc hiệu Hàm lợng ADN khuôn cần cho phản ứng PCR rất nhỏ.Trong các thí nghiệm bình thờng ở phòng thí nghiệm chỉ cần 1-100 nanogam(ng) tổng số của hệ gen là đủ Tuy nhiên ngày nay trong nhiều trờng hợp, phảnứng PCR có thể nhân các đoạn ADN chỉ từ một phân tử ADN riêng lẻ

Nguyên liệu cần thiết để tiến hành phản ứng invitro cũng giống nh nguyênliệu cần thiết để tổng hợp ADN trong tế bào Có 4 thành phần cần thiết là:

1 ADN làm khuôn (mạch kép) cần khuếch đại

2 Hai đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN

3 Enzyme chịu nhiệt ADN-polymerase (hiện nay đợc dùng phổ biếnnhất là Tap, đợc chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermusaquaticus)

4 Tất cả 4 loại deoxyribonucleoside triphosphates (dNTP’s): dATP,dTTP, dCTP, dDTP

Ngoài ra môi trờng đệm cung cấp ion Mg++ và nớc tinh khiết rất cần thiết

(3 bớc điều chỉnh nhiệt độ ) cho một chu kỳ:

1 Bung liên kết của ADN (denuteration):

Mục đích của việc này là làm biến tính ADN, khiến hai sợi ADN tách nhau

ra Do đó, các đoạn mồi có thể gắn vào phần bổ sung trên ADN ở bớc sau Cũngtrong bớc này, các phản ứng enzym đều ngừng lại (ví dụ nh sự mở rộng của chutrình trớc)

Đợc thực hiện ở nhiệt độ khoảng 940 trong vài giây đến vài phút Tại nhiệt độnày, các phân tử ADN mạch kép sẽ bị tách ra hoàn toàn tạo nên các sợi đơn dùng

để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzyme polymerase xúc tác tổnghợp

2 Mồi bám ( hay còn gọi là ủ với mồi) (annealing):

Ngay lập tức nhiệt độ đợc hạ xuống 540C để các đoạn mồi gắn với các trình

tự bổ xung tơng ứng trên các phân tử ADN làm khuôn

Các đoạn mồi dịch chuyển lộn xộn dới chuyển động Brao (Brown) Liên kếtion giữa các đoạn mồi đơn và các sợi khuôn đơn liên tục đợc tạo ra rồi lại đứtgãy Các liên kết bền vững hơn (do những mồi gắn đúng vào vị trí) kéo dài lâuhơn Trên những đoạn ngắn ADN mạch kép bao gồm khuôn và mồi này, ADNpolymerase có thể gắn vào và bắt đầu kéo dài chuỗi Sau khi đã có một vài bazơ

đợc gắn vào, liên kết hyđro giữa mạch khuôn và mồi trở nên đủ mạnh để nókhông bị đứt vỡ nữa

Nhiệt độ gắn kết này góp phần quyết định tính đặc hiệu của phản ứng PCR.Nhiệt độ và khoảng thời gian dùng ở đay thay đổi tuỳ thuộc vào chiều dài củaADN cần nhân lên

3 Tổng hợp (hay còn gọi là kéo dài)(extension):

Các đoạn mồi nào đã đợc kéo dài một vài bazơ thì có lực liên kết vớikhuôn mạnh hơn lực phá vỡ chúng Còn các mồi gắn không chính xác trở nênlỏng lẻo (do nhiệt độ đã cao hơn) và không có sự kéo dài mạch xảy ra

Nhiệt độ ngay lập tức đợc nâng lên 720 C, sự tổng hợp ADN diễn ra tối udới nhiệt độ này

Nhiệt độ 720 C đợc duy trì trong 5 phút để các sợi ADN vừa đợc tổng hợpxoắn vào nhau tạo nên ADN sợi kép

Vào cuối giai đoạn này, nhiệt độ một lần nữa đợc nâng lên 940C , nhng lầnnày chỉ trong vòng 20 giây để cho các mẫu ngắn của ADN mạch kép (cả sợi ban

đầu và sợi mới đợc tổng hợp) tách nhau ra Nh vậy một chu kỳ gồm: đun nóng đểtách các sợi ADN kép thành sợi đơn để làm khuôn, gắn kết các đoạn mồi vào sợikhuôn và tổng hợp ADN bằng ADN polymerase, đợc lặp đi lặp lại khoảng từ 30

đến 60 lần

Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ đợc duy trì ở 720C trong 5-10 phút cho tất cảcác sợi đơn ADN có trong phản ứng xoắn lại tạo nên sản phẩm PCR Cuối cùngnhiệt độ đợc hạ xuống 40 C để bảo quản sản phẩm

Hình ảnh minh hoạ các bớc của phản ứng PCR nh sau:

Sản phẩm của phản ứng PCR là đoạn ADN mà ta cần nhân lên Sản phẩm

đ-ợc kiểm tra bằng cách chạy điện di trên thạch Agarose nồng độ 0,8%-2%, vàADN của PCR sẽ đợc nhìn thấy rõ hơn dới tác dụng của tia cực tím (ultra-violet)sau khi đực nhuộm bằng Ethidium Bromide, một loại hoá chất có khả năng bám

và làm hiển thị ADN Độ dài của ADN sản phẩm đợc tính bằng cách so sánh vớichỉ thị ADN (ADN marker), sử dụng thông dụng nhất là ADN của thực khuẩnthể Lamda cắt bằng enzyme giới hạn Hindlll

V- Phản ứng RT-PCR (PCR ngợc)

* Nguyên lý:

Phản ứng RT-PCR thực chất là phản ứng nhân một đoạn giới hạn củakhuôn ARN theo nguyên lý của phản ứng PCR, bao gồm hai giai đoạn: Giai đoạnthứ nhất là chuyển đổi một sợi ARN làm khuôn thành ADN hai sợi, sau đó quagiai đoạn thứ hai, dùng ADN hai sợi này tiếp tục làm khuôn để thực hiện phảnứng PCR nh đã giới thiệu

ARN là một sợi bao gồm 4 nucleotide liên kết vơi nhau, trong đó cóAdenin, Guanin, Cystosin và Uracin Chuỗi nucleotide này phải đợc chuyển đổithành AND 2 sợi mà thành phần Uracin đợc thay thế bằng Thymin Phản ứng làmbiến đổi ARN hệ gen thành AND phải nhờ đến vai trò của một loại enzyme gọi

là enzyme sao chép ngợc (Reverse Transcriptase), do vậy giai đoạn này đợc gọi

là chuyển ngợc (RT), đợc thực hiện ở nhiệt độ 50-55 độ C trong 30 phút Khi đã

có ADN 2 sợi làm khuôn chuyển đổi từ ARN ban đầu, phản ứng tiếp theo là PCR

nh đã giới thiệu và đợc thực hiện theo 3 bớc thay đổi nhiệt độ cho phù hợp ở mỗichu kỳ Toàn bộ phản ứng nhân một đoạn ADN từ khuôn ARN qua hai giai đoạnnói trên đợc gọi là phản ứng RT-PCR hay phản ứng PCR ngợc

Do một số virus có hệ gen là ARN cho nên muốn nhân một đoạn gen của

nó thì ngời ta phải dùng phản ứng RT-PVR Một số nghiên cứu về ARN thôngtin cũng cần đến phản ứng RT-PCR để chuyển đổi sợi ARN thành ADN cho quátrình đồng hoá để giải trình tự hoặc tái tổ hợp trong nghiên cứu biểu thị protein

Trớc khi tiến hành phản ứng PCR phải thực hiện giai đoạn chuyển ngợc

RT, sau đó thành phần ADN đợc chuyển đổi này làm khuôn tiếp tục mới đợcnhân lên bằng phản ứng PCR Quá trình này gồm hai giai đoạn:

- Phản ứng RT: Đó là giai đoạn chuyển ARN hệ gen thành ADN nhờenzyme sao chép ngợc biến ARN ở dạng sợi đơn sang dạng sợi kép ADN bằngcách thực hiện phản ứng ở nhiệt độ 55 độ C trong vòng 30 phút

- Phản ứng PCR: là giai đoạn gồm 3 bớc nh đã nới ở trên

(Các bớc 1,2,3 đợc thực hiện lặp đi lặp lại trong 35-40 chu kỳ).

+ Bớc kết thúc: (1 chu kỳ), hoàn chỉnh gen ADN cho sản phẩm; 72 độ trong 1 phút

Cuối cùng nhiệt độ đợc hạ xuống 40 C để bảo quản sản phẩm

VI- Kiểm tra kết quả PCR:

Trớc khi sản phẩm PCR đợc đem sử dụng, ngời ta cần phải kiểm tra:

1 Sản phẩm có đợc hình thành hay không:

Cho dù hoá sinh có là ngành khoa học chính xác đến đâu đi nữa, ngời tacũng không thể chắc chắn rằng mọi phản ứng PCR đều thành công Chất lợngcủa ADN có thể quá tồi, do đó một trong các đoạn mồi có thể không phù hợp,hoặc cũng có thể có quá nhiều điểm bắt đầu

2 Kích thớc của sản phẩm có đúng không:

Có khả năng sản phẩm chỉ dài 500 bazơ, mà trên thực tế gen cần khuếch đạilại dài 1800 bazơ Khi đó, một trong hai mồi có thể đã gắn (phù hợp) với phầnnào đó trên gen mà gần với mồi còn lại hơn Cũng có thể cả hai mồi đã gắn vàomột gen hoàn toàn khác

Kết quả của PCR đợc kiểm tra thông qua băng điện di Ngời ta thờng sửdụng phơng pháp điện di trên gel agarose Nếu không có sản phẩm nào đợc tạo

ra, trên băng điện di sẽ không có vạch nào Nếu có các sản phẩm khuếch đạikhông mong muốn, chúng ta sẽ thu đợc băng điện di có nhiều vạch

Xem trên băng điện di:

Cột ở bên trái là hỗn hợp các đoạn đã biết kích thớc để so sánh Chú ý rằngkhoảng cách giữa các đoạn trên cột là cấp số mũ

Cột 1: đoạn PCR dài khoảng 1850 bazơ

Cột 2 và 4: các đoạn dài khoảng 800 bazơ

Cột 3: không có sản phẩm nào đợc tạo thành, cho thấy PCR đã thất bại Cột 5: nhiều vạch đợc tạo ra do một trong những đoạn mồi đã gắn sai chỗ

Kết quả cuối cùng có thể đợc kiểm tra bằng điện di trên gelpolyacrolamide, các đoạn gen có độ dài khác nhau hiện rõ có thể đọc đợcbằng mắt thờng nhờ so sánh với thang chuẩn

VII Các chỉ tiêu ảnh hởng đến phản ứng PCR

Một phản ứng PCR đòi hỏi nhiều thành phần tham gia: 1 AND mẫu làmkhuôn; 2 Enzyme ADN polymerase; 3 Mồi và nhiệt độ lai; 4 Dung dịch đệm(Nồng độ ion Magiê); 5 Thành phần dNDP’s; 6 Thời gian, số lợng chu kỳ phảnứng; 7 Yếu tố chu trình nhiệt; 8 Nớc; 9 Thiết bị và dụng cụ nhiệt

1 AND mẫu làm khuôn:

Phản ứng PCR tối u xảy ra trên ADN thật tinh sạch, nhng nhiều kỹ thuậtchẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tối u với ADN thu nhận trực tiếp từ dịchchiết tế bào Lợng ADN mẫu sử dụng cũng có có khuynh hớng giảm (1microgam xuống còn 100 nanogam) với việc sử dụng các polymerase cho hiệuquả cao Hơn nữa việc giảm lợng mẫu ban đầu còn có hạn chế đợc các khuếch

đại ký sinh (các nhân bản giả) tạo nên các sản phẩm phụ không mong muốn Một

u điểm khác của phản ứng PCR là cho phép khuếch đại cả những mẫu ADNkhông đợc bảo quản tốt, đã bị phân huỷ từng phần nh trong các vết máu để lâungày, tinh dịch đã khô, hoá thạch tóc, móng tay của ngời đã chết, da, niêm mạcmiệng …

2 Enzyme

Enzyme đợc sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của ADN polymerase I Vì

đây là enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp (phảithêm enzyme mới vào mỗi phản ứng sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bịnhiệt phân huỷ, nhiệt độ lai thấp khiến sự nhân bản giả tăng cao) Phơng phápADN chuyển sang một bớc ngoặt mới cùng với sự phát hiện một loại ADNpolymerase chịu nhiệt đợc tách chiết từ một vi khuẩn sống trong suói nớc nóng

có tên gọi là Thermus aquaticus Enzyme này có tên gọi là Taq polymerasekhông bị phá huỷ ở nhiệt độ biến tính và xúc tác từ đầu đến cuối quá trình phảnứng

Điều này cho phép có thể tự động hoá tất cả các bớc của chu trình nhânADN nhờ tạo ra một bộ máy tự động có khả năng điều khiển đợc các công đoạncả về nhiệt độ và thời gian Từ đó máy chu trình nhiệt PCR (Thermal Cycler) ra

đời và hiện nay có hàng chục loại do rất nhiều hãng khác nhau trên thế giới sảnxuất nh hãng Perkin Elmer, Eppendorf vv…

Taq ADN polymerase không đặc hiệu cho bất kỳ một loại phân tử ADNriêng biệt nào, chính vì vậy tất cả các phản ứng PCR sử dụng mồi và khuôn khácnhau đều sử dụng Taq ADN polymerase Mặt khác một số điểm quan trọng củaTaq- ADN polymerase là có khả năng gắn thêm vào đầu 3’ một base là Adenine(A) Đây là một điểm quan trọng để trong quá trình đồng hóa ngời ta lợi dụng

đặc tính này để gắn sản phẩm của PCR vào plasmide trong quá trình đồng hoá

Một nhợc điểm của Taq- ADN polymerase là: loại enzyme này chỉ có khảnăng tổng hợp các loại ADN có độ dài dới 3kb (dới 3000 nucleotide), do vậymuốn nhân bản ADN có độ dài hơn 3-20 kb phải cần những đoạn enzyme khác

Một nhợc điểm khác của Taq- ADN polymerase là không có khả năng sửachữa những sai sót xảy ra trong quá trình sao chép ( trong quá trình sao chép cácbase nitơ ở trên mạch đơn đợc tổng hợp, có thể xảy ra sự thay đổi một vài basenitơ, Taq- ADN polymerase không có khả năng sửa chữa sự nhầm lẫn trong trờnghợp này)

Ngày nay nhiều polymerase chịu nhiệt khác đã đực đa ra thị trờng vớinhiều chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn Tth polymerase, một enzymetách chiết từ vi khuẩn Thermus thermophilus có khả năng hoạt động nh một

enzyme phiên mã ngợc khi có mặt ARN khuôn và ion Mg++ ; nhng với sự hiệndiện của ADN khuôn và ion Mg++ , Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đạiADN Enyme này cho phép khuếch đại bản mẫu là ARN thông qua sự hình thànhcADN.

3 Mồi và nhiệt độ lai

3.1 Chiều dài mồi

Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt đợc một sự nhân bản đặc trng và hiệuquả cao nhằm thu nhận sản phẩm PCR chất lợng cao trên khuôn ADN biết trớc.Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phơng pháp PCR và tuân thủ một

số nguyên tắc sau:

- Trình tự của mồi đợc chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ xung giữa mồixuôi và mồi ngợc, và cũng không có cấu trúc kẹp tóc (hair loop forming) do sựbắt cặp bổ xung giữa các phần khác nhau trong chuỗi nucleotide của một mồi

- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi xuôi và mồi ngợc không cách biệt quá xa(thông thờng trong khoảng 4-5 độ C) Thành phần nucleotide của các mồi cânbằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần

- Các mồi phải chọn đặc trng cho trình tự ADN cần nhân bản, không trùng vớicác trình tự lặp lại trên gen

- Độ dài cần chọn cho một mồi đặc hiệu thông thờng là 18-30 nucleotide.Nếu quá ngắn (dới 10 nucleotide), mồi sẽ bám không đặc hiệu; nếu quá dài (trên

30 nucleotide), chu kỳ nhiệt ở giai đoạn thứ 3 (giai đoạn tỏng hợp hay kéo dài) sẽ

ảnh hởng đến cơ chế bám của mồi Nhiệt độ nóng chảy của mồi không đợc vợtquá chu kỳ nhiệt ở giai đoạn thứ 3

Chiều dài tối u của một đoạn mồi phụ thuộc vào lợng (A+T) của nó Một

điều cần lu ý về mồi là các đoạn mồi phải đủ phức tạp để khả năng xảy ra việcgắn mồi vào các trình tự khác mà không phải là trình tự đích đợc chọn trớc rấtthấp

Ví dụ, khả năng bắt gặp A, G, C hay T trong một trình tự ADN cho trớcbất kỳ là 1/4; khả năng bắt gặp một trình tự dinucleotide bất kỳ (ví dụ AG) là1/16; còn khả năng bắt gặp một trình tự 4 bazơ cho trớc là 1/256 Do đó, mộttrình tự 16 bazơ xét về mặt thống kê sẽ có xác suất có mặt là 1 trên 416 (= 4 294

967 296, hay là khoảng hơn 4 tỉ) 416 bazơ tơng đơng với kích thớc hệ gen ngời

hay ngô, và lớn gấp 1000 lần so với kích thớc hệ gen của E.coli Do đó việc kết

hợp một oligonucleotide dài hơn 17 bazơ với trình tự đích của nó là một quá trìnhthực sự đặc hiệu, đặc hiệu hơn cả sự đặc hiệu của kháng thể với kháng nguyên.Vì vậy một đoạn mồi dài 17 bazơ hay hơn thờng đợc dùng để khuếch đại từ ADNthuộc hệ gen của thực vật và động vật Mồi quá dài có thể đồng nghĩa với việc

ngay cả nhiệt độ gắn mồi cao cũng không ngăn ngừa đợc sự bắt cặp sai và gắnmồi không đặc hiệu.

3.2 Một số nguyên tắc thiết kế trình tự mồi (theo Innis và GelfDNA, 1991).

i Mồi nên dài 17 - 28 bazơ

ii Thành phần của các bazơ nên có 50 - 60% (G+C)

iii Mồi nên có đầu 3’ ở G hay C hay CG hay GC; điều này ngăn ngừa việc

“thở” (breathing) của các đầu và tăng hiệu suất gắn mồi

iv Nhiệt độ Tm tốt nhất là nằm trong khoảng 55 - 80oC

v Việc sử dụng mồi có nhiều hơn 3 G hay C ở đầu 3’ có thể làm tăng khả năngbắt cặp sai ở những trình tự giàu G hay C (do sự ổn định của việc gắn mồi), nêntránh điều này

vi Các đầu 3’ của các mồi không nên bổ sung cho nhau (cụ thể hơn là khôngnên bắt cặp bazơ với nhau), nếu không thì các dimer mồi sẽ đợc tổng hợp nhiềuhơn là các sản phẩm khác

vii Nên tránh dùng các mồi có thể tự bổ sung cho nhau (nghĩa là khả năng hìnhthành cấu trúc 2o nh cái thòng lọng)

6.5 Dung dịch đệm cho phản ứng.

Dung dịch đệm thờng chứa:

+ Tris-HCl pH 8,3 10-50mM

+ KCl không quá 50 mM; MgCl2 1,5 mM hay cao hơn

+ Mồi 0.2 - 1mM đối với mỗi mồi

+ 50 - 200m đối với mỗi dNTP

+ Gelatin hay BSA đến 100mg/ml

+ Và/hoặc thuốc tẩy không mang tính ion ví dụ Tween-20 hay NonidetP40 hay Triton x-100 (0,05 - 0.1% nếu dùng một loại nào đó) (Innis vàGelfan, 1990)

Các công thức hiện đại có thể khác một cách đáng kể, nhng chúng thờng có

có nồng độ cao nhất, do đó, nồng độ Mg2+ nên cao hơn nồng độ dNTP 0,5 2,5mM Đối với mỗi tổ hợp khuôn-mồi mới, nồng độ Mg2+ thay đổi nên cần phải

-định lợng lại, vì nhu cầu của chúng sẽ khác nhau đáng kể thậm chí dới cùng điềukiện nồng độ và thời gian hay nhiệt độ của chu trình

Nồng độ ion Mg++ là thành phần không thể thiếu đợc của phản ứng PCR.Tuy nhiên không có một qui luật chung cho vấn đề này Nồng độ tối u phải đợcxác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm

Một số enzyme không cần protein bổ sung, trong khi số khác lại phụ thuộcvào chúng Một vài enzyme hoạt động tốt hơn rõ rệt khi có mặt chất tẩy(detergent), có thể bởi vì chất tẩy ngăn cản xu hớng tự nhiên là co cụm lại củaenzyme

Nồng độ mồi không nên vợt quá 1mM trừ phi mức độ thoái hoá cao; 0,2mM

là đủ đối với các mồi tơng đồng

Nồng độ nucleotide không cần nhiều hơn 50mM đối với mỗi loại; tuy nhiêncác sản phẩm dài có thể cần nồng độ cao hơn

5 Thành phần dNDP

Bốn loại nucleotide trong phản ứng PCR thờng đợc sử dụng ở dạngdeoxynucleotide (dNTP’s bao gồm dATP; dGTP; dCTP và dTTP) Thờng đợc sửdụng ở nồng độ 20-200 mM / mỗi loại nucleotide Nồng độ cao hơn hay thấp hơn

dễ dẫn đến sự tạo nên sản phẩm PCR giả Sự mất cân bằng trong thành phần cácnucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của enzyme ADN polymerase

6 Thời gian

6.1 Thời gian và nhiệt độ biến tính:

Hai trình tự bổ sung liên kết với nhau bởi liên kết hydro giữa các bazơ bổsung của chúng (G với C và A với T hay U), hình thành phân tử mạch kép ổn

định Phản ứng PCR cần các sợi ADN mạch đơn làm khuôn, do đó nếu ADNkhuôn ban đầu không phải là dạng sợi đơn, nh hầu hết các virus ARN, thì cầnphải làm nóng nó đến trên “nhiệt độ nóng chảy” (melting temperature) của dạngsợi kép hoặc “nhiệt độ nóng chảy” của một phần dạng sợi kép Rồi sau đó làm

lạnh nhanh nó Việc làm lạnh nhanh là để chắc chắn các sợi đã đợc làm biến tính,tức là các sợi đã tách nhau ra, không còn liên kết lại với nhau nữa Ngoài ra, nếuacide nucleic đợc đun nóng trong dung dịch đệm chứa các ion có nồng độ thấphơn 150mM NaCl thì nhiệt độ nóng chảy thông thờng sẽ thấp hơn 100oC Đâychính là khoảng nhiệt độ làm việc của PCR, nhiệt độ biến tính nằm trong khoảng

từ 91oC đến 97oC

Taq polymerase có thời gian bán huỷ ở 95oC là 30 phút Đây chính là lý dotại sao không nên thực hiện quá 30 chu trình khuếch đại Tuy nhiên cũng có thểgiảm nhiệt độ biến tính xuống sau khoảng 10 chu trình, khi mà chiều dài trungbình của ADN đích đã giảm xuống Ví dụ, đối với khuôn dài khoảng 300 cặpbazơ hay ngắn hơn, nhiệt độ biến tính có thể đợc giảm xuống đến 88oC chokhuôn chứa 50% (G+C) (Yap và McGee, 1991) Điều này đồng nghĩa với việc cóthể tiến hành đến 40 chu trình mà không sợ làm giảm hiệu suất của enzyme

“Thời gian tại nhiệt độ” là nguyên nhân chính cho sự biến tính hay là bấthoạt của Taq Do đó, nếu ta có thể giảm điều này, ta sẽ có thể tăng số chu trìnhphản ứng mà bất kể là nhiệt độ có giảm hay không Thông thờng, thời gian biếntính là 1 phút ở 94oC: đối với những trình tự khuôn ngắn thời gian này có thể đợcgiảm xuống đến 30 giây hay thấp hơn nữa Ngời ta cũng có thể vừa tăng nhiệt độbiến tính, vừa giảm thời gian biến tính: Innis và GelfDNA (1990) đã đề xuất thờigian là 15 giây khi nhiệt độ là 96oC

6.2 Thời gian gắn mồi và việc thiết kế mồi.

Chiều dài và trình tự mồi là một tham số có ý nghĩa vô cùng quan trọng đảmbảo sự thành công của quá trình khuếch đại Nhiệt độ nóng chảy của một acidenucleic mạch kép tăng lên theo chiều dài của nó cũng nh là số lợng (G+C) Côngthức đơn giản để tính nhiệt độ nóng chảy (temperature melting-Tm) của một

đoạn DNA kép là:

Tm ( o C) = 4(G + C) + 2(A + T)

Do đó, nhiệt độ gắn mồi (annealing temperature-Ta) cho một phản ứng PCRnhất định phụ thuộc trực tiếp vào thành phần và chiều dài mồi Nhiệt độ Ta nênchọn thấp hơn khoảng 5oC so với nhiệt độ Tm thấp nhất của cặp mồi đợc sử dụng(Innis và GelfDNA, 1990) Rychlik và nhiều ngời khác (1990) đã chỉ ra cách xử

sự của Ta Họ cho rằng nếu tăng nhiệt độ Ta lên 1oC sau mỗi chu trình thì tính

đặc hiệu của quá trình khuếch đại và số lợng sản phẩm (1kb chiều dài) đều tănglên Một hệ quả của việc sử dụng nhiệt độ Ta quá thấp là một hay cả hai đoạnmồi lại gắn vào các trình tự khác chứ không phải trình tự đích, do các bắt cặp saimột bazơ hay sự gắn mồi một phần Điều này không gây ảnh hởng gì nếu ta chỉ

khuếch đại các trình tự đích thân thuộc hoặc tơng tự nhau Tuy nhiên, điều này

có thể dẫn đến việc khuếch đại “không đặc hiệu” và hậu quả là số lợng các sảnphẩm mong muốn bị giảm xuống

Một hậu quả của việc sử dụng nhiệt độ Ta quá cao là rất ít sản phẩm đợc tạo

ra do khả năng gắn mồi bị giảm xuống Một điều quan trọng khác cần cân nhắc

là một cặp mồi với nhiệt độ Ta không thích hợp sẽ không bao giờ cho sản phẩmduy nhất với số lợng đáng kể, và còn có thể dẫn đến sự khuếch đại không đốixứng có nghĩa là sự khuếch đại sợi đợc gắn mồi hiệu quả hơn

Sự gắn mồi không thể diễn ra trong thời gian dài: hầu hết các mồi chỉ gắnhiệu quả đợc trong 30 giây hay ít hơn, trừ trờng hợp nhiệt độ Ta rất gần nhiệt độ

Tm hoặc các mồi dài bất thờng

Hình trên minh hoạ ảnh hởng của nhiệt độ gắn mồi dến tính đặc hiệu và hiệusuất khuếch đại của papillomavirus ngời type 16 (Human papillomavirus type

16, HPV-16) (Williamson và Rybicki, 1991: J Med Virol 33: 165-171)

Plasmide và khuôn DNA mẫu đợc khuếch đại ở các nhiệt độ gắn mồi khácnhau nh đã chỉ ra ở trên Chú ý rằng trong khi plasmide đợc khuếch đại trongkhoảng từ 37oC đến 55o C thì HPA, ADN chỉ đợc khuếch đại đặc hiệu ở 50oC

6.4 Thời gian và nhiệt độ kéo dài mạch:

Thông thờng ngời ta tiến hành ở 70oC - 72oC trong 0,5 đến 3 phút Trong khi

đó, Taq hoạt động thực sự đặc hiệu ở 37oC, nhiệt độ rất gần với nhiệt độ hoạt

động của đoạn Klenow của E.coli DNA polymerase I Đây quả là một nghịch lý,

làm thế nào mà các đoạn mồi chỉ gắn vào mạch khuôn ở nhiệt độ tối u của nó lại

có thể đợc kéo dài ở nhiệt độ cao một cách đáng kể nh vậy Câu trả lời là sự kéodài mạch xảy ra ngay từ khi bắt đầu có sự gắn mồi, thậm chí nếu điều này chỉxảy ra trong thời gian rất ngắn ngủi, thì nó cũng dẫn đến sự ổn định đáng kể.Hoạt động này xảy ra tối u ở khoảng 70oC và sự mở rộng mồi diễn ra với tốc độtối đa là 100 bazơ/giây Thời gian khoảng một phút là đủ để sự khuếch đại trình

tự 2kb là đáng tin cậy (Innis và GelfDNA, 1990) Các sản phẩm dài hơn thì cần

thời gian lâu hơn: 3 phút cho sản phẩm 3kb hay dài hơn Việc kéo dài thời gian làcần thiết trong những chu trình cuối khi mà nồng độ sản phẩm vợt quá nồng độenzyme (>1nM), và khi dNTP và/hoặc sự suy giảm số lợng mồi có thể trở nênhạn chế.

6.6 Số chu trình.

Số lợng chu trình cần thiết để tạo ra băng nhìn thấy đợc trên gel phụ thuộcphần lớn vào nồng độ ADN đích ban đầu: Innis và GelfDNA (1990) đề xuấtkhuếch đại 40 - 45 chu trình đối với 50 phân tử đích, và 25-30 chu trình cho3x105 phân tử cùng nồng độ Sự không tơng xứng này do cái gọi là hiệu ứngbằng (plateau effect) gây nên Đây là sự giảm tốc độ tăng của sự tích luỹ sảnphẩm theo cấp số mũ ở những giai đoạn cuối của PCR, khi mà nồng độ sản phẩm

đạt đến 0,3 - 1,0 nM Có thể sự phân rã của các chất phản ứng (dNTPs, enzyme),

sự depletion của chất phản ứng (mồi, dNTPs - cái đầu là trục trặc đối với các sản

phẩm ngắn, cái sau là trục trặc đối với các sản phẩm dài), sự ức chế đầu sảnphẩm (end-product) (sự hình thành Pyrophosphate), sự cạnh tranh của các sảnphẩm không đặc hiệu với chất tham gia phản ứng, sự cạnh tranh của việc tái gắnmồi của các sản phẩm nồng độ cao (10nM) với việc gắn mồi (Innis và GelfDNA,1990)

Nếu sản phẩm mong muốn không đợc tạo ra sau 30 chu trình, tốt hơn là lấymột mẫu nhỏ (1ml) của hỗn hợp đã khuếch đại làm hỗn hợp phản ứng mới, đemkhuếch đại 20-30 lần chứ không nên tiếp tục chạy thêm nhiều chu trình Trongmột số trờng hợp khi mà nồng độ khuôn hạn chế, điều này có thể tạo ra sản phẩmtốt trong khi việc tiếp tục chu trình đến 40 lần hay hơn không làm đợc

Một biến số quyết định số lợng chu trình là PCR mồi làm tổ Sự khuếch đạiPCR đợc thực hiện với một tập hợp các mồi, sau đó sản phẩm nào đó đợc lấy ra -

có hay không có sự bỏ thuốc thử- để khuếch đại lại, vói tập hợp các mồi nằm bêntrong, hay còn gọi là mồi làm tổ Quá trình này làm tăng mức độ của tính đặchiệu, có nghĩa là tất cả các sản phẩm không đặc hiệu đợc khuếch đại trong lầnchạy đầu tiên sẽ không đợc khuếch đại trong lần chạy thứ hai Điều này đợc minhhoạ nh sau:

Thời gian cho một chu kỳ khởi đầu mục đích bung liên kết của chuỗi xoắnkép ADN là không vợt quá 5 phút Đối với 25-40 chu kỳ tiếp theo, thời gian chogiai đoạn 1 (bung liên kết ) là 10 giây – 2 phút; thời gian cho giai đoạn 2 (mồibám) không quá nhanh hoặc quá lâu, thông thờng dới 1 phút; thời gian cho giai

đoạn 3 (tổng hợp) tuỳ thuộc vào độ dài vùng ADN cần nhân lên, nhng nói chungtheo qui luật, 1 phút cho 1 kb (1000 nucleotide) Ví dụ cần có sản phẩm là 3 kb,thời gian thích hợp là 3 phút Thời gian dài hơn không ảnh hởng lớn đến ADN có

độ dài ngắn hơn

Trong thực tế, phản ứng đợc thực hiện trong 25-40 chu kỳ, và không vợtquá 40 chu kỳ cho một phản ứng PCR Sở dĩ nh vậy là vì phản ứng PCR diến tiếnqua hai giai đoạn: trong giai đoạn đầu số lợng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệvới lợng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyênnhân sau:

- Sự phân huỷ xảy ra và cạn kiệt các thành phần của phản ứng

- Có sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng

- Các bản sao vừa đợc tổng hợp không kết hợp với các cặp mồi mà bắt cặpvới nhau

Phản ứng PCR ít khi đợc thực hiện dới 25 chu kỳ, vì nh thế số lợng nhânbản sẽ ít và lợng ADN thu đợc trong sản phẩm PCR thấp

Số chu kỳ cho một phản ứng phụ thuộc vào số lợng bản mẫu ban đầu Ví

dụ, nếu số lợng bản mẫu là 105 thì cần 25-30 chu kỳ, nếu số lợng bản mẫu là 102

-103 thì số chu kỳ phải là 35-40

7 Yếu tố chu trình nhiệt

Một yếu tố quan trọng đảm bảo sự thành công của phản ứng PCR là nhiệt

độ của chu trình nhiệt ở giai đoạn thứ 2 khi mồi bám vào khuôn (giai đoạn mồibám) Một kinh nghiệm có tính qui luật là nhiệt độ cho mồi bám phải thấp hơnnhiệt độ nóng chảy của cặp mồi là ít nhất 4o C

8 Nớc

Nớc sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa bất kỳ ionnào, không chứa enzyme phân huỷ ADN (ADNaza), phân huỷ ARN (ARnaza),enzyme giới hạn cắt Adn (endonucleaza) và bất kỳ các thành phần nào khác Ionkhác lạ sẽ ảnh hởng nồng độ dung dịch đệm trong phản ứng, các loại enzyme sẽpha huỷ hay cắt bỏ ADN làm khuôn hoặc sản phẩm PCR

9 Thiết bị và dụng cụ

Thực chất một thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng

đ-ợc yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác các thiết bị hiện nay đã đđ-ợccải tiến để tránh tối đa sự bốc hơi nớc trong quá trình phản ứng, hay cho phéptiến hành phản ứng PCR ngay ở trên mô tế bào,… Tuy nhiên mỗi kiểu thiết bị có

đặc điểm khuếch đại riêng nên mọi thí nghiệm của một nghiên cứu cần đợc tiếnhành trên cùng một loại thiết bị

Hơn nữa ống nghiệm dùng cho các phan ứng của cùng một nghiên cứuphải thuộc cùng một kiểu vì đặc tính truyền nhiệt của các ống này cúng nh độ

tiếp xúc giữa ống và bộ phận tạo nhiệt của thiết bị có ảnh hởng lớn đến quá trìnhkhuếch đại.

1 Trong thực nghiệm, kích thớc của trình tự cần khuếch đại là giới hạn

đầu tiên

Trừ vài trờng hợp rất cá biệt, phơng pháp PCR không hoạt động đợc vớinhững đoạn ADN lớn hơn 3 kb Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dới 1,5 kbcho kết quả tốt Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối u cho phản ứng phải đợcxác định qua thực nghiệm

2 Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khảnăng khuếch đại bản sao của phơng pháp này

Vấn đề đặc biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đoán, dự phòng vìhậu quả có thể rất nghiệm trọng Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thờng là các sảnphẩm khuếch đại của những lần thao tác trớc Ngời ta chứng minh đợc rằng việc

mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng không giankín nh phòng thí nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã đợc khuếch đại thoát rakhỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí và bám vào tờng, cửa, thiết bị dụng

cụ… rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó Có thể khấc phục các vấn đềnày bằng một số biện pháp sau;

- Các công đoạn thao tác khác nhau nh thiết lập phản ứng PCR và phântích các sản phẩm khuếch đại phải đợc tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau

- Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng không sử dụng vào các thao táckhác đầu tip sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm đầumicropipette bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phản ứng

- Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại ớc

tr Tất cả mọi thành phần phản ứng đều đợc chia thành những lợng nhỏ, tínhtoán sao cho đủ với 1 , 2 lần thao tác

- Ngoài ra các hãng sản xuất còn tung ra thị trờng những hệ thống chophép loại bỏ hoàn toàn sự ngoại nhiễm, ví dụ hãng Perkin - Elmer- Cetus đề xuấtviệc sử dụng dUTP thay vì dTTP; việc thay thế này không ảnh hởng đến phảnứng Trớc mỗi lần phản ứng kế tiếp, ngời ta cho thêm vào dung dịch phản ứnguracylglycolase; enzyme này sẽ phân huỷ tất cả các ADN có mang dUTP nhiễm