Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả phản ứng khuếch đại PCR

Các chỉ tiêu ảnh hởng đến phản ứng PCR

Thời gian và nhiệt độ biến tính

Một điều quan trọng khác cần cân nhắc là một cặp mồi với nhiệt độ Ta không thích hợp sẽ không bao giờ cho sản phẩm duy nhất với số lợng đáng kể, và còn có thể dẫn đến sự khuếch đại không đối xứng có nghĩa là sự khuếch đại sợi đợc gắn mồi hiệu quả hơn. Có thể sự phân rã của các chất phản ứng (dNTPs, enzyme), sự depletion của chất phản ứng (mồi, dNTPs - cái đầu là trục trặc đối với các sản phẩm ngắn, cái sau là trục trặc đối với các sản phẩm dài), sự ức chế đầu sản phẩm (end- product) (sự hình thành Pyrophosphate), sự cạnh tranh của các sản phẩm không. Nếu sản phẩm mong muốn không đợc tạo ra sau 30 chu trình, tốt hơn là lấy một mẫu nhỏ (1àl) của hỗn hợp đã khuếch đại làm hỗn hợp phản ứng mới, đem khuếch đại 20-30 lần chứ không nên tiếp tục chạy thêm nhiều chu trình.

Nớc sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa bất kỳ ion nào, không chứa enzyme phân huỷ ADN (ADNaza), phân huỷ ARN (ARnaza), enzyme giới hạn cắt Adn (endonucleaza) và bất kỳ các thành phần nào khác. Hơn nữa ống nghiệm dùng cho các phan ứng của cùng một nghiên cứu phải thuộc cùng một kiểu vì đặc tính truyền nhiệt của các ống này cúng nh độ tiếp xúc giữa ống và bộ phận tạo nhiệt của thiết bị có ảnh hởng lớn đến quá trình khuếch. Ngời ta chứng minh đợc rằng việc mở nắp các ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín nh phòng thí nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã đợc khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí và bám vào tờng, cửa, thiết bị dụng cụ rồi… nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó.

Ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có thể giảm bớt, ví dụ nh đảm bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng xác định trình tự của nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trớc khi đi đến trình tự chính thức. Tuy nhiên sai sót này không trầm trọng lắm vì trong ống nghiệm cùng một lúc có tập hợp nhiều phản ứng, cùng nhân một đoạn ADN giống nhau nên số ADN có một nucleotide sai sót là không lớn, và sẽ đợc điều chỉnh chính xác sau khi so sánh các chuỗi khác nhau của cùng. Để khắc phục cần một lợng lớn ADN nguyên bản và giảm số chu kỳ nhân xuống để chỉ thu đợc ít số phân tử cần nhân lên, và dĩ nhiên sau khi có chuỗi qua giải trình tự, nhất thiết cần so sánh kiểm tra bằng nhiều phơng pháp khác nhau.

Các lĩnh vực ứng dụng của phản ứng PCR

Cũng nh tất cả các quá trình sinh học khác, tái bản ADN là một quá trình không hoàn hảo, đôi khi enzyme ADN polymerase cũng nhân nhầm một nucleotide không bổ sung vào chuỗi đang kéo dài của mình, tỷ lệ này trong tự nhiên là 1/106. Phản ứng chuỗi trùng hợp từ khi đợc Kary Mullis đề xuất và hoàn thiện, đã có những ứng dụng hết sức rộng rãi bao trùm nhiều lĩnh vực quan trọng trong nghiên cứu và trong khoa học công nghệ và trong đời sống xã hội. Trong chọn giống vật nuôi và cây trồng đặc biệt đối với động vật và thực vật bậc cao, vốn trớc đây việc lựa chọn cặp cha mẹ làm giống là rất khó khăn, cần nhiều năm nay kỹ thuật PCR cho phép thực hiện chỉ trong vài ngày, thậm chí vài giê.

Trong t vấn di truyền Y học, PCR cho phép chẩn đoán nhanh, chính xác các bệnh di truyền kể cả chẩn đoán trớc sinh giới tính và các dị tật bẩm sinh có thể từ khi thai mới đợc 8 tuần tuổi và điều quan trọng là không cần chọc ối, chỉ cần lấy một giọt máu ngoại vi của ngời mẹ để làm mẫu thí nghiệm. Phơng pháp này có lợi trong việc tìm kiếm các cơ quan bệnh mà rất khó trong việc nuôi cấy nh một số loài vi khuẩn, nấm, vivrus, vì nó tạo ra một khối lợng chất liệu di truyền của sinh vật đó có thể phân tích đợc để xác định. PCR tìm kiếm trực tiếp ADN duy nhất từ virus, thay vì phơng pháp xét nghiệm tiêu chuẩn phải tìm gián tiếp bằng chứng xuất hiện của virus từ việc tìm kiếm những kháng thể của cơ thể sinh ra để chống lại sự nhiễm bệnh của virus.

Không giống nh những xét nghiệm trớc đây, PCR có thể phát hiện đợc 3 bệnh truyền nhiễm qua đ- ờng tình dục trên cùng một mẫu bệnh phẩm (Herpes, papillomavius, Chlamydia) và thậm chí có thể phân biệt chủng đặc biệt của papillomavius có thể gây ra ung th mà các xét nghiệm khác không thể làm đợc. Những xét nghiệm này không chỉ để giúp chẩn đoán với những ngời có rối loạn di truyền mà cả với những ngời mang những biến đổi có hại nh đột biến mà có thể truyền cho con cái của họ (những ngời mang gen này thờng bản thân họ không bị ảnh hởng bởi đột biến gen mà họ có thể truyền bệnh cho thế hệ sau). Khả năng vô song của kỹ thuật này đối với xác định và nhân bản một lợng rất nhỏ, thậm chí từ những ADN đã lâu hoặc bị phân huỷ đã đợc chứng minh là có giá trị đối với pháp luật đặc biệt trong lĩnh vực tội phạm, PCR là một phần không thể thiếu đợc với giám định pháp y, thờng gọi là ADN fingerpriting (in dấu ADN).

Tơng lai của PCR

Với PCR các nhà hệ thống có thể trực tiếp đo đợc sự khác nhau của chuỗi ADN giữa các loài và lựa chọn những chuỗi có ít thay đổi trong quá trình tiến hoá, giữa những nhánh sinh vật chính. Trong khi những thiết bị chip-base vẫn cha đợc chuẩn bị cho thí nghiệm, các nhà khoa học có thể mang chúng ra ngoài đờng và bệnh nhân sẽ có thể đợc đọc ADN của họ tại ngay hiện trờng. PCR giúp các nghiên cứu viên trong các lĩnh vực từ sức khoẻ con người (đặc biệt là về vấn đề phát hiện HIV) đến các nghiên cứu pháp lý, hay mối quan hệ tiến hoá, hay nghiên cứu sinh thái và tập tính động vật (Powledge 1998).

Điều này có nghĩa là mặc dù không cần biết trình tự đặc hiệu của ADN đích, nhưng trình tự của các nucleotide ở đầu 3’ của trình tự ADN đích lại cần phải được biết chính xác thì PCR mới thực hiện được. Sự đặc hiệu sẽ đợc cải thiện hơn trong phơng pháp “hot-start”, nơi mà tất cả các chất thử phản ứng đợc lu ở một nơi có nhiệt độ 72 độ C trớc khi thêm thành phần cuói cùng, ví dụ Taq polymerase. Người ta mới phát hiện ra rằng những DNA polymerase từ các sinh vật này thậm chí còn chịu nhiệt hơn cả DNA polymerase từ Thermus aquaticus và thậm chí có thể thay thế cho Taq DNA polymerase trong phản ứng PCR.

Cuối cùng, ADN polymerase chịu nhiệt (giống như Taq ADN polymerase) lại phụ thuộc vào ion Mg2+. Do đó, cần xác định chính xác nồng độ ion Mg2+ để làm cho hiệu suất của polymerase và tính đặc hiệu của phản ứng đạt cực đại. Trong những ngày đầu của PCR, người ta sử dụng ba bồn nước ở các nhiệt độ khỏc nhau để thay đổi nhiệt độ của hỗn hợp PCR trong suốt chu trình PCR. Việc duy trì ba bồn nước riêng rẽ này rất không thuận tiện vì hai lý do. Thứ nhất, kỹ thuật viên phải điều khiển nhiệt độ của nước trong mỗi bồn. Thêm vào đó, kỹ thuật viên cũng phải di chuyển hỗn hợp PCR giữa các bồn nước trong suốt chu trình PCR. Sự phát triển của kỹ thuật gần đây đã loại bỏ việc phải thường xuyên theo dừi trong suốt chu trỡnh PCR. Cycle”) là mỏy PCR tự động đầu tiên. Được sử dụng như vật đánh dấu báo trước (prognostic marker) cho những neonate được sinh từ các bà mẹ sero dương (seropositive) với khả năng phát hiện 50% số người bị nhiễm neonate sớm ngay sau khi sinh. Nếu trình tự cuối N khoảng 20-30 acid amin, thông thường người ta có thể tạo ra hai mồi thoái hoá, và có thể tiến hành PCR đến mảnh cADN 50-90bp, mà sau đó có thể được sử dụng như mẫu dò để tạo ra thư việ cDNA.

Các hệ gen này cung cấp những thông tin phong phú về sự tiến hoá của rất nhiều họ gen khác nhau và có thể sử dụng làm điểm bắt đầu để tìm các gen thậm chí ở những sinh vật còn chưa được biết đến. Nếu protein không được bảo tồn tốt, thử tìm các vùng có acid amin được bảo tồn, và nếu ta biết trình tự từ một sinh vật khá thân thuộc, sử dụng nó như một “trình tự dẫn” (guide sequence). Đôi khi việc chọn trình tự cũng như việc đặt cược trong một ván bài vậy, cần rất nhiều may mắn).