TIỂU LUẬN SINH học PHÂN tử

A.Phần mở đầu lý chọn đề tài Sự phát triển công nghệ sinh học, tảng sinh học phân tử, cung cấp nhiều phương pháp phân tử có ý nghĩa ứng dụng lớn y học phòng ngừa, chẩn đoán điều trị Trong lĩnh vực chẩn đoán, việc tích lũy ngày nhiều nhanh thông tin gene người tác nhân gây bệnh, kể từ Chương trình Bộ Gene Người (Human Genome Project) hoàn tất, đóng góp thiết yếu thứ hai dẫn đến hình thành chẩn đoán phân tử Bên cạnh đó, mối liên kết ngày chặt chẽ trường đại học, viện nghiên cứu với bệnh viện sở y tế tạo thuận lợi cho việc triển khai chẩn đoán phân tử vào thực tiễn Một yếu tố đặc biệt quan trọng cho “phổ thông hóa” chẩn đoán phân tử đóng góp công ty công nghệ sinh học vào việc chế tạo thương mại hóa nhiều trang thiết bị y tế đại với “kit” (tạm dịch “bộ thuốc thử”) dùng chẩn đoán Các phương pháp sinh học phân tử ứng dụng vào việc xây dựng chẩn đoán phân tử thuộc hai nhóm, nhóm nhân DNA, RNA Chẩn đoán phân tử lĩnh vực bệnh nhiễm thường sử dụng để sàng lọc nhanh, phát hiện, định type, định lượng, xác định tính kháng thuốc tác nhân bệnh, chủ yếu virus vi khuẩn Bên cạnh ưu điểm độ nhạy, độ đặc hiệu, phát hiệm sớm, thời gian xét nghiệm nhanh, chẩn đoán phân tử có số nhược điểm khả cho kết dương tính âm tính giả, ý nghĩa lâm sàng kết chẩn đoán số trường hợp không rõ ràng, thiếu tính thống kết thu từ kit khác nhau, cần thiết bị đắt tiền kỹ thuật viên lành nghề Trong tương lai, số khái niệm : phát yếu tố di truyền người bệnh, “xét nghiệm chỗ” (Point-of-Care Testing), công cụ chẩn đoán mạnh, rẻ tiền phát triển để biến chẩn đoán phân tử thành phận thiết yếu chăm sóc sức khỏe cộng đồng Chẩn đoán phân tử cần xác nhận tính hiệu (validation) cách nghiêm ngặt để áp dụng rộng rãi Các phương pháp lai phân tử ứng dụng nhiều sống để hiểu rõ dươc phương pháp lai phân tử nên em chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Thông qua đề tài tìm hiểu rõ phương pháp lai phân tử ứng dụng phương pháp đời sống Đối tượng nghiên cứu Phương pháp lai phân tử Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu tài liệu lịch sử nghiên cứu 1960 Julius Marmur đồng nghiệp ông quản lý, ngành học đại học Harvard khám phá trình ủ lại (reannealing) B Nội dung I Cơ sở lý thuyết của lai phân tử Khái niệm lai phân tử 1.1 Khái niệm “nhiệt độ nóng chảy “của DNA Khi phân tử DNA mạch đôi đun lên nhiệt độ vượt “nhiệt độ nóng chảy” (Tm) hai mạch tách rời phá vỡ liên kết hydro nối liền hai mạch Đường cong Tm 1.2 Các nhân tố ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy DNA 1.2.1.Ảnh hưởng thành phần base phân tử DNA Trong phân tử DNA, tăng nhiệt độ mối liên kết A-T dễ bị đứt trước, nhiệt độ >900C liên kết G-C bị đứt Do thành phần base cấu tạo DNA mạch đôi có ảnh hưởng quan trọng cho bền vững phân tử này, đặc biệt base G, C điều kiện chuẩn DNA có tỉ lệ G-C cao có điểm nóng chảy cao, DNA có 60% G-X điểm nóng chảy 950C Biểu thức thể phụ thuộc Tm vào thành phần base: Tm=69,3+0,41 (%G+C) 1.2.2.Ảnh hưởng độ dài DNA Đoạn DNA dài số lượng liên kết hydro nối hai mạch lớn nhiêu “nhiệt độ nóng chảy” cao Sự thay đổi Tm theo chiều dài phân tử DNA tính theo công thức sau: Tm=-500/số lượng cặp baseρ Công thức cho thấy ảnh hưởng độ dài quan trọng nhũng đoạn DNA ngắn điều kết tính “hợp tác” đề cập phần 1.2.3.Ảnh hưởng điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch) Những điểm bắt cặp sai lệch (A bắt cặp với C, G bắt cặp với T,…) làm giảm tính ổn định phân tử lai Thông thường người ta ước lượng Tm giảm 10C cho 1% phần trăm bắt cặp sai lệch Nhưng thành phần base, mismatch có ý nghĩa thực tiễn đoạn DNA ngắn 1.2.4.Ảnh hưởng môi trường phản ứng a.Ảnh hưởng nồng độ muối Sự giảm lực ion (nồng độ muối) môi trường làm giảm mạnh nhiệt độ nóng chảy Tm làm giảm khoảng 150C cho logarithm nộng độ ion hóa trị I cation hóa trị II cón có tác động mạnh Như vậy, dung dịch loãng làm ổn định chuỗi xoắn kép DNA b.Ảnh hưởng formamide Hóa chất có khả hạ thấp Tm nhiều, đoạn dài 100 cặp nucleotide, giảm Tm ước lượng theo công thức sau: Tm= -0.6x(%formamide)ρ Formamide sử dụng phương pháp li phân tử nhằm làm giảm nhiệt độ lai Nồng độ thông dụng 50% tương ứng với việc hạ nhiệt độ tương ứng tới 300C Trong thực tế cần lưu tâm đến tất tiêu nêu tính toán Tm Công thức thực nghiệm sau cho phép tập hợp yếu tố để ước lượng Tm: Tm=16,6 log [m]+0.41(%GC)+81,5-%mismatch-675/chiều dài (cặp base)-0,65 (%formamide) Công thức dùng cho đoạn DNA ngắn 100 cặp nucleotide; [M] biểu thị nồng độ ion Na+ 1.3 Khái niệm lai phân tử Sau hai mạch phân tử DNA tách rời tác động Tm, bắt cặp không xảy nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột Lúc phân tử DNA tồn môi trường dạng mạch đơn cấu hình không gian vô trật tự Ngược lại, sau hai mạch tách rời, nhiệt độ gíảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch bắt cặp trở lại Hiện tượng gọi lai phân tử (molecular hybridization) Đặc điểm lai phân tử Đặc hiệu tuyệt đối : tái bắt cặp xảy hai trình tự hoàn toàn bổ sung Các trình tự bổ sung DNA hay RNA, dẫn đến hình thành phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay phân tử lai DNA-RNA Các yếu tố ảnh hưởng đến lai phân tử 3.1 Nồng độ DNA thời gian phản ứng Nồng độ DNA, nghĩa số lượng trình tự bổ sung, cao xác suất tiếp xúc với tăng, tốc độ phản ứng lai phân tử tăng lên Thời gian phản ứng dài xác suất tiếp xúc lớn số lượng phân tử lai tăng dần toàn trình tự bổ sung tái bắt cặp 3.2 Nhiệt độ Thông thường tốc độ phản ứng lai cực đại nhiệt độ thấp Tm nucleic acid độ 25% 3.3 Độ dài trình tự Tốc độ lai tăng tỉ lệ thuận với bậc hai độ dài trình tự bổ sung 3.4 Lực ion Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng lên từ -10 lần Nồng độ NaCl < 1,2M lại hoàn toàn không tác dụng II Các phương pháp lai phân tử 1.1 Lai pha lỏng 1.1.1 Nguyên tắc : - Các mạch đơn nằm môi trường lỏng dung dịch đệm - Sự lai phân tử xảy trình tự gặp chuyển động nhiệt nhiệt độ môi trường thấp Tm vài độ Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm môi trường lỏng dung dịch đệm Sự lai phân tử xảy trình tự gặp chuyển động nhiệt nhiệt độ môi trường thấp Tm vài độ Trong thực tế, nhiệt độ lai chọn thấp Tm khoảng 15˚C , người ta thêm formamide để giảm nhiệt độ lai Đối với trình tự ngắn nhiệt độ lai tính theo công thức phân trên, trình tự dài, nhiệt độ lai thông dụng 42˚C 1.1.2 Phân tích định lượng phân tử lai phương pháp thường sử dụng: - Phương pháp dùng quang phổ kế - Phương pháp sử dụng nuclease S1 - Phương pháp sắc kí hydroxylapatite a.Phương pháp dùng quang phổ kế DNA mạch đôi hấp thu ánh sáng yếu DNA mạch đơn Sự chuyển từ DNA mạch đôi sang dạng mạch đơn xác định thông qua giá trị mật độ quang (OD) bước sóng 260nm Do đó, phản ứng lai, tăng OD 260nm tương ứng với tăng số lượng phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn, tượng gọi hiệu ứng siêu sắc (hyperchromic effect) Các giá trị OD đo với quang phổ kế cuvet đựng mẫu đo có phận điều chỉnh nhiệt độ.Hiệu ứng siêu sắc: Nhuộm tím phân tử DNA, đem chúng đun lên làm lạnh từ từ kết phân tử DNA trở nên tím đậm lúc đầu chút Nếu hạ nhiệt độ cách đột ngột chúng trở nên đậm Đó tượng mạch đơn DNA hấp thu tia UV mạnh DNA mạch đôi b.Phương pháp dùng Nuclease S1 Nuclease S1 enzyme có khả thuỷ giải nucleic acid mạch đơn DNA hay RNA, số điều kiện thực nghiệm định Dung dịch phản ứng lai trích phần, đem xử lý với Nuclease S1 Các mạch đơn bị thuỷ giải, sản phẩm phản ứng oligonucleotides nhóm nucleotide 5' phosphoryl Các nucleic lại tương ứng với phân tử lai, chúng thu nhận qua phương pháp tủa đem định lượng c.Phương pháp sắc kí hydroxylapatite Hydroxylapatite tinh thể phosphat calci Kĩ thuật sử dụng mồi đánh dấu (đoạn nucleotide kháng thể) để lai với DNA, RNA với protein tế bào mà không cần tách chiết Ở nồng độ muối cao, nucleic mạch đôi gắn vào giá thể này, phần nucleic không gắn vào giá thể thu nhận Sau đó, tăng nồng độ phosphate lên, nucleic acid gắn tách rời giá thể thu nhận riêng Số lượng DNA gắn (mạch đôi) không gắn vào giá thể (mạch đơn) xác định quang phổ kế, từ tính % tỉ lệ phân tử lai 1.1.3.Các ứng dụng phương pháp lai pha lỏng a.Tính tỉ lệ % trình tự giống hai loài gần Nếu không diện với số lượng lớn, mismatch (bắt cặp sai lệch) không ngăn cản hoàn toàn trình lai DNA lớn Chúng giảm Tm (nghĩa giảm độ bền vững) phân tử lai Như DNA có nguồn gốc từ hai loài gần nhau, dù không tuyệt đối giống vần lai với Để tránh tái bắt cặp mạch phân tử ban đầu, DNA loài phải có nồng độ khác Nếu phản ứng xảy hoàn toàn, tỷ lệ % phân tử lai xem tương ứng với tỷ lệ % trình tự giống loài Tỷ lệ cao loài gần tiến hoá Ở prokaryote, động học tái bắt cặp biểu thị dạng đường cong đơn giản, điều cho thấy vận tốc tái bắt cặp tất trình tự gen nghĩa trình tự lặp lại Ở Eukaryote, đường cong phức tạp bao gồm nhiều đường cong đơn giản, điều cho thấy có loại trình tự DNA: DNA có khả bắt cặp tức thời, tương ứng với trình tự lặp lại nhiều lần.+ DNA tái bắt cặp chậm hơn, tương ứng với trình tự lặp lại vừa vừa.+ DNA tái bắt cặp chậm tương ứng với trình tự nhất.+ b.Phân tích trình tự lặp lại Trong dung dịch DNA, trình tự lặp lại nhiều lần có nhiều may gặp mạch bổ sung so với trình tự Động học tái bắt gặp nhanh so với trình tự nhất, động học lớn số lượng trình tự lặp lại cao, gen động vật có vú c.So sánh kích thước gen không chứa trình tự lặp lại Ở prokaryote, gen không chứa trình tự lặp lại nên động học lai tất trình tự Do giá trị Cot1/2 phụ thuộc kích thước gen Tính chất sử dụng để so sánh kích thước gen loài sinh vật prokaryote 2.2 Lai pha rắn 2.1.1.Nguyên tắc Lai pha rắn có nguyên tắc với lai pha lỏng Điểm khác biệt hai trình tự bổ sung (thường trình tự đích, trình tự cần tìm) cố định giá thể rắn Thuận lợi việc sử dụng giá thể rắn dễ dàng thao tác việc tách trình tự không lai khỏi phân tử lai, mặt khác ngăn tái bắt cặp hai mạch phân tử Hạn chế là, việc phân tích định lượng phân tử lai sau xác hiệu lai thấp Mặt khác, vận tốc lai pha rắn gấp 10 lần vận tốc lai pha lỏng phần nucleic giá thể bị che khuất, không tiếp xúc với trình tự bổ sung 2.2.2.Các yếu tố kỹ thuật Giá thể rắn dùng để cố định nucleic acid màng lai Có loại màng lai: a.Màng lai nitrocellulose Là loại giá thể sử dụng đầu tiên, không thông dụng nhược điểm : + Độ bền học nên khó thao tác + Không thể tách rời phân tử lai màng để lai trở lại với mẫu dò khác b.Màng lai nylon Có độ bền học cao cho phép lai nhiều lần với nhiều mẫu dò khác nhau, nhiên cần phải loại bỏ mẫu dò cũ trước lai với mẫu dò Các bước lai pha rắn 2.2.3.Ứng dụng phương pháp lai pha rắn Có nhiều ứng dụng phương pháp lai pha rắn, có phương pháp sau: + Southern blot + Northern blot + Western blot + Dot (SLot) blot Trong có phương pháp sử dụng rộng rãi là: Southern, Northern Dot blot 2.2.3.1.Phương pháp Southern blot Mục đích : Phương pháp dùng để định vị trình tự đặc biệt DNA gen, hay DNA kích thước nhỏ DNA plasmid, phage… Cơ sở phương pháp kỹ thuật chuyển (transfer) DNA tử gel lên màng lai Southern mô tả năm 1975 Các bước tiến hành: Đoạn DNA phân tích, cắt thành đoạn có kích thước khác enzyme cắt giới hạn Đối với sinh vật có hệ gen phức tạp, trình cắt tạo hàng triệu mảnh vỡ Hỗn hợp phức tạp mảnh vỡ đem điện di gel agarose, để tách mảnh theo kích thước Nếu có số mảnh vỡ DNA lớn 15 kb (1kb = 1000 cặp base DNA RNA), trước thực trình thấm, gel xử lý acid, ví dụ acid HCL loãng, mảnh DNA bị phá vỡ thành phần nhỏ hơn, cho phép chuyển giao hiệu Những đoạn DNA ngắn gel bị biến tính chất kiềm, dung dịch kiềm DNA sợi kép bị tách thành DNA sợi đơn Sau đó, chúng chuyển vào lên màng nitrocellulose nylon cách thấm Thủ tục trì phân bố mảnh vỡ gel, tạo gel lọc Màng tế bào sau nướng lò chân không đun nóng 80°C (ở điều kiện tiêu chuẩn; sử dụng màng nitrocellulose nylon) tiếp xúc với tia cực tím (sử dụng màng nylon) để vĩnh viễn gắn DNA chuyển màng tế bào Đem lai DNA cố định màng với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ Sau trình lai, người ta rửa màng lai để loại bỏ mẫu dò không bắt cặp chuyên biệt với DNA cố định màng Cuối cùng, người ta dùng kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) để định vị phân tử lai Người ta đặt phim nhạy cảm với tia xạ áp sát vào màng lai, mẫu dò đánh dấu phóng xạ tác động lên phim kết thể qua chấm đen phim Ứng dụng phương pháp lai Southern blot + Lập đồ giới hạn gen + Phát đa dạng trình tự (fragment polymorphism) gen chủng hay cá thể khác qua so sánh đồ giới hạn chúng + Phát đột biến đoạn, đột biến điểm hay tái tổ hợp gen chúng làm thay đổi đồ giới hạn 2.2.3.2.Phương pháp Nortnern blot a.Mục đích: Nhằm xác định kích thước hàm lượng RNA thông tin cụ thể (mRNA) b.Các bước thực hiện: Để chiết xuất RNA từ mô, sử dùng tác nhân chaotropic, chẳng hạn guanidinium isothiocyanate Các đại lý phá vỡ tế bào làm biến tính protein hoà tan RNA mRNA chiếm 2-5% tổng số RNA, để chiết xuất đòi hỏi bước chọn lọc, sử dụng mRNA có đuôi poly(A) Các RNA điện di gel agarose để phân tách theo kích thước Chuyển RNA lên màng lai nylon lọc nitrocellulose thông qua hệ thống thấm mao mạch chân không Theo phương pháp truyền thống, sử dụng thấm mao mạch không cần đến thiết bị đặc biệt Tuy nhiên, ngày xu hướng sử dụng thấm chân không ngày nhiều đem đến lợi tốc độ khả tái tạo Các đệm chuyển giao sử dụng hệ thống thấm thường chứa formamide, làm giảm nhiệt độ ủ tương tác thăm dò-RNA, ngăn ngừa suy thoái RNA nhiệt độ cao Sau RNA chuyển giao, di động thông qua mối liên kết cộng hóa trị màng ánh sáng tia cực tím nhiệt Việc hình thành mối liên kết cộng hóa trị RNA màng tế bào, giúp ngăn cản axit nucleic không bị rửa trôi bước xử lý Đem lai RNA màng với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ Điều kiện thí nghiệm ảnh hưởng đến hiệu độ đặc hiệu lai bao gồm: lực ion, độ nhớt, cặp sở không phù hợp thành phần Màng rửa để loại bỏ đầu dò không bị ràng buộc Các phân tử lai phát nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi c.Ứng dụng Phương pháp Northem blot cho phép quan sát mô hình biểu gen mô, quan, giai đoạn phát triển, nhiễm mầm bệnh… Kĩ thuật dùng để hiển thị xuất mức gen gây ung thư giảm gen ức chế trình ung thư so sánh với mô bình thường, biểu từ chối quan cấy ghép Kết thu quan sát mô hình biểu gen cung cấp nhìn sâu sắc vào chức gen Phương pháp cung cấp nhìn sâu sắc vào kích thước sản phẩm, thấy mối nối thay sản phẩm gen mẫu có trình tự lặp lặp lại Một sản phẩm gen không kích thước xóa bỏ sai sót xử lý sao, cách thay đổi mục tiêu thăm dò sử dụng theo trình tự biết đến, xác định khu vực RNA tích 2.2.3.3.Phương pháp Western blot 10 a.Mục đích Là phương pháp phổ biến, sử dụng rộng rãi để phát protein b.Các bước thực Chiết tách protein từ tế bào, sử dụng chất tẩy rửa, muối đệm để khuyến khích phân giải tế bào hòa tan protein Các chất ức chế protease phosphatase thường thêm vào để ngăn chặn tiêu hóa mẫu enzyme Chuẩn bị mô thường thực nhiệt độ lạnh để tránh làm biến tính suy thoái protein Protein sau chiết tách, đem điện di gen polyacrylamide Trong trình khả tách protein nhờ vào điểm đẳng điện (pI), trọng lượng phân tử, điện tích, kết hợp yếu tố Bản chất khác biệt phụ thuộc vào việc xử lý mẫu tính chất gel Đây cách hữu ích để xác định protein Gel chuyển lên màng nitrocellulose PVDF Protein cố định màng tạo vệt thăm dò nhờ sử dụng kháng thể đặc hiệu với protein mục tiêu Màng đem ủ với loại protein (ví dụ protein sữa BSA), protein liên kết với nơi trống nitrocellulose Điều giúp giảm thiểu tượng gắn không đặc hiệu kháng thể lên màng Sau loại kháng thể (primary antibody) có kháng nguyên protein xác định thêm vào kháng thể gắn lên vệt protein màng tạo lớp phân tử kháng (nhưng vị trí nhìn thấy vào thời điểm này) Một kháng thể khác (secondary antibody) có mang lọai enzyme bắt cặp với kháng thể ban đầu, enzyme phản ứng với chế đặc hiệu tạo sản phẩm kết tủa có màu vị trí phức hợp kháng nguyên-kháng thể Ứng dụng phương pháp + Các thử nghiệm khẳng định HIV sử dụng phương pháp Western blot để phát kháng thể chống HIV mẫu huyết người + Một Western blot sử dụng kiểm tra xác định cho bệnh não bò (BSE, thường gọi bệnh bò điên) +Western blot sử dụng thử nghiệm xác minh nhiễm viêm gan B +Trong y học thú y, blot phương Tây sử dụng để xác nhận FIV + tình trạng mèo 2.2.3.4.Phương pháp Dot (slot) blot a.Mục đích Một Dot blot (hoặc Slot blot) phương pháp sinh học phân tử sử dụng để phát phân tử sinh học Nó định lượng tương đối RNA đặc trưng hỗn hợp RNA mà không cần phải phân tách chúng b.Cách tiến hành 11 Trong phương pháp người ta không chuyển acid nulceic từ gel lên màng mà đặt trực tiếp lượng mẫu nhỏ lên màng lai ( thành điểm-Dot hay khe-Slot) Sau phân tử phát đầu dò nucleotide kháng thể Bản phóng xạ tự ghi sau đươc phân tích kỹ thuật mật độ kế cho phép ước lượng số lượng phân tử lai có mẫu Trong thực nghiệm, người ta sử dụng dụng cụ (tên manifold) cho phép đặt lúc nhiều mẫu DNA hay RNA lên màng lai c.Ưu nhược điểm Dot blot đơn giản phương pháp Southern blot, Northern blot, Western blot Phương pháp giúp tích kiệm thời gian, bỏ bớt bước điện di gen, không cần enzyme cắt giới hạn trình thấm Tuy nhiên phương pháp không cung cấp thông kích thước phân tử sinh học Hơn nữa, hai phân tử kích cỡ khác phát hiện, xuất dấu chấm Do phương pháp xác nhận diện hay vắng mặt phân tử sinh học phân tử sinh học, phát đầu dò kháng thể d.Ứng dụng Một ví dụ việc ứng dụng Dot blot sinh học phân tử Vào năm 1990, Tiến sĩ Siwo de Kloet, cựu giáo sư di truyền học Đại học bang Florida, dùng phương pháp Dot-blot để xác định giới tính loạt loài chim Phương pháp chứng minh đáng tin cậy, thu thập đầy đủ số lượng phân tử DNA di truyền 2.3 Phương pháp lai tai chỗ 2.3.1.Định nghĩa Lai chỗ kiểu lai phân tử trình tự nuclic acid cần tìm (trình tự đích) nằm tế bào hay mô 2.3.2.Nguyên tắc Nghiên cứu acid nucleic mà không cần qua giai đọan tách chiết chúng khỏi mô hay tế bào 2.3.3.Các phương pháp lai chỗ 2.3.3.1.Lai NST a.Mục đích Phương pháp cung cấp thông tin xác vị trí phân bố trình tự DNA cần tìm NST nhờ mẫu dò chuyên biệt b.Các bước thực Các NST giai đoạn trung kì (các NST thường có nguồn gốc từ bạch cầu) xử lí kỹ thuật tế bào học lame 12 NST cố định lame đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ Để phát phân tử lai, người ta phủ lên lame huyền dịch (emulsion) nhạy cảm với tia xạ Sau thời gian cho tia xạ tác động lên huyền dịch Lame quan sát kính hiển vi, kết thể thành hạt nằm lớp huyền dịch vị trí có phân tử lai c.Kĩ thuật FISH Một số kỹ thuật thường dùng phương pháp kỹ thuật lai chỗ nhiễm sắc thể gắn huỳnh quang (FISH), kỹ thuật thường áp dụng để phát yếu tố HER-2/NEU ung thư biểu mô Cũng phương pháp xét nghiệm dựa DNA khác, FISH có lợi điểm nuclieotid có khả biến tính tái tổ hợp lại Một đặc tính quan trọng dạng chuỗi đơn DNA, axít nucleic bắt cặp với acid nucleic khác theo nguyên tắc bổ sung để tái cấu trúc lại chuỗi xoắn kép DNA Trong kỹ thuật FISH thường quy định đoạn DNA đích cố định bề mặt tiêu lai với đoạn DNA đánh dấu huỳnh quang (đầu dò DNA), tạo thành chuỗi xoắn kép DNA lai FISH phương pháp xét nghiệm cho kết khách quan Nó coi xét nghiệm tiêu chuẩn với độ nhạy độ đặc hiệu cao để phát khuyếch đại gene HER-2/neu Tuy nhiên, nhược điểm phương pháp giá thành cao, nhiều thời gian hơn, phải quan sát kính hiển vi huỳnh quang, việc đọc kết khó khăn khó ghi nhận dấu hiệu hình thái học kèm theo, khó xác định vùng ung thư xâm lấn tiêu FISH, tiêu lưu giữ lâu để xem lại tín hiệu huỳnh quang bay màu dần theo thời gian… 2.3.3.2.Lai khuẩn lạc a.Mục đích Phương pháp sử dụng để phát dòng vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp cần tìm ngân hàng gen Ngân hàng gen tức tập hợp dòng vi khuẩn tái tổ hợp trải mặt thạch hộp petri Sau khuẩn lạc (colony) đạt kích thước định, người ta thu lấy dấu ấn chúng cách áp màng lai lên mặt thạch b.Quy trình thực chung 13 Mỗi khuẩn lạc để lại vài tế bào vi khuẩn màng lai Màng lai sau xử lí NaOH để làm vỡ tế bào vi khẩn làm biến tính DNA Việc cố định DNA màng thao tác lai diễn biến theo cá bước tương tự phương pháp lai pha rắn khác Kết phóng xạ tự ghi dấu ấn cho phép xác định dòng vi khuẩn cần tìn hộp petri ban đầu Dòng thu nhận phân tích c.Ứng dụng Phương pháp ứng dụng để sang lọc DNA, DNA tạo dòng vector có nguồn gốc plasmid vector nhiễm sắc thể nhân tạo (BAC, YAC) sản xuất khuẩn lạc (vi khuẩn nấm men) nuôi cấy biến nạp dàn mỏng đĩa agar chứa môi trường sinh trưởng nuôi điều kiện thích hợp ttrong đó, vector có nguồn gốc virus (bacteriophage) sinh tan tế bào bị chúng xâm nhiễm sản xuất plaque (vết tan ) có dạng hình tròn chu vi khoảng 2-3 mm có màu sáng thảm vi khuẩn (bacterial lawn) đĩa agar Các phage trộn với tế bào E.coli môi trương nuôi dàn mỏng 14 (plating) lên dĩa petri bottom agar (nuôi cấy top agar) Sau ủ qua đêm 370C, tế bào vi khuẩn mọc nên thảm vi khuẩn, vùng bị nhiễm phage hình thành vết trong, tượng sinh tan vi khuẩn phage, gọi vết tan Các vector, mô tả trên, thường chứa gen thị cho phép chọn lọc tế bào vật chủ mang vector (thể biến nạp) thông thường thị gen kháng sinh tế bào biến nạp sinh trưởng môi trường chứa kháng sinh tương ứng Ngoài ra, vector chứa gen bổ sung để phân biệt tế bào biến nạp chứa đoạn chèn DNA ngoại lai với tế bào chứa vector tự tái tạo lại vòng Một dòng chứa chuỗi DNA quan tâm đặc biệt xác định lai khuẩn lạc lương nhỏ khuẩn lạc biến nạp nhỏ hặcvết tan chuyển lên màng nitrocellulose nylon phủ lên đĩa agar trước DNA biến tính cố định màng cách đun nóng chiếu tia cực tím, sau lai đệm chứa mẫu dò đánh dấu đồng vị phóng xạ có trình tự bổ sung phần chuỗi xác định Gần đây, phương pháp sàng lọc khác thiết kế theo hướng khuẩn lạc vi khuẩn nấm men nhặt riêng rẽ chấm ngắn thành hang lên màng giếng đĩa microtiter Mỗi dòng xác định tọa độ đường kẻ riêng rẽ So với phương pháp truyền thống, phương pháp dễ dàng việc tự động hóa, xếp đối chiếu số liệu phòng thí nghiệm khác 2.3.3.3.Lai tế bào mô a.Mục đích Trong tế bào mô, RNA, đặc biệt mRNA có phân bố không gian xác định Sự phân bố không gian liên quan đến chức năng, điều hòa biểu tương tác mRNA với thành phần khác tế bào mô Nghiên cứu mRNA tách chiết tinh không cho phép thu nhận thông tin vừa kể Trong trường hợp đó, người ta thường sử dụng phương pháp lai tế bào mô Mô xử lí phương pháp mô học (cố định, khử nước ; tẩm parafin, cắt thành lát mỏng (7 đến 10 micromet trải lame) Kết đọc trực tiếp lame nhờ kính hiển vi b.Ứng dụng Đối tượng nghiên cứu có tổ chức phức tạp, bao gồm nhiều tập hợp tế bào khác não Ở người ta định xác vị trí phân bố mRNA nhóm tế bào chuyên biệt tổ chức Các thông tin góp phần vào việc xác định vai trò mRNA tổ chức Các phương pháp miễn dịch tế bào cho phép xác định protein chuyên biệt thông qua kháng thể đặc trưng Khi phối hợp phương pháp mhiễn dịch tế bào 15 lai chỗ, người ta phát đồng thời mRNA proteincủa ; từ đó, xác định mối tương quan hoạt động phiên mã dịch mã gen, Bằng cách lai nhiều lát cắt liên tục (có cấu trúc gần đồng nhất) với nhiều mẫu dò khác nhau, người ta xác định vị trí, phân bố tương tác mRNA tham gia vào trìng sống Hiện nay, kỹ thuật đánh dấu mẫu dò hóa chất có nhiều tiến lớn Điều tạo bước nhảy vọt lớn cho phương pháp lai chỗ, đặc biệt cho phép quan sát đồng thời nhiều tập hợp phân tử lai khác mẫu dò đánh dấu hóa chất cho nhiều màu khác III Ứng dụng phương pháp lai phân tử 3.1 Một thoi sinh học – tRNA Nghiên cứu RNA điều mẻ lĩnh vực sinh học phân tử, kể từ “kỷ nguyên RNA” thiết lập chừng mười năm trở lại đây, nhà sinh học chứng kiến nhiều khám phá ngọan mục liên quan đến RNA Các chứng trước cho thấy tRNA (transfer RNA–RNA vận chuyển) tạo nhân sau tống xuất khỏi nhân lần Nhưng trưởng thành trình chuyển vận từ nhân tế bào chất thật không đơn giản trước người ta nghĩ, thực tế phức tạp nhiều Trên tờ Science (Vol 309, Issue 5731, 140-142, July 2005), nhóm tác giả 16 Tohru Yoshihisa cho tho thấy tRNA trưởng thành tế bào chất chủ động quay trở lại nhân nơi mà chúng sinh Các tác giả sử dụng kỹ thuật lai chỗ có hỗ trợ chất phát hùynh quang (fluorescence in situ hybridization) để lần theo di chuyển chúng nấm men Hơn trình tái xâm nhập tRNA vào nhân trình phụ thuộc lượng 3.2 Trong y học Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử lĩnh vực y học có nhiều thuận lợi phương pháp cổ điển dùng Đối với tác nhân gây bệnh khó nuôi cấy hay nuôi cấy kỹ thuật sinh học phân tử giải pháp nhất, chẳng hạn Chlamydia, Brucella, viêm gan B Việc tạo dòng gen dùng làm đầu dò đơn giản việc sản xuất kháng thể đặc hiệu, với đầu dò người ta phát tất kiểu huyết Đặc biệt phương pháp lai chỗ cho phép xác định trực tiếp virus lát cắt sinh thiết Đối với tác nhân vi khuẩn, có nhiều kit chẩn đoán sinh học phân tử thương mại hóa cho loài: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Salmonella Đối với tác nhân ký sinh trùng, người ta thành công chẩn đoán Plasmodium, Schistosoma, Trypanosoma, Toxoplasma, Leishmania lai phân tử Trong lĩnh vực y học, dùng phương pháp với thú cần để thực thử nghiệm việc trị bệnh cho người Nếu loài thú tìm thấy có di truyền tương đồng với người qua việc lai DNA, có khả phương pháp chữa bệnh cho người khám phá việc thực phẫu thuật dựa kinh nghiệm loài thú 3.3 nông nghiệp Phương pháp chẩn đoán lai phân tử không giới hạn y học mà ứng dụng rộng rãi nông nghiệp Chẩn đoán virus gây bệnh thực vật có ý nghĩa quan trọng bảo vệ trồng Ví dụ: phát viroid thực vật, chúng vỏ protein nên phát kỹ thuật miễn nhiễm ELISA Chẩn đoán bệnh di truyền Cho đến nay, người ta biết 17 hàng trăm bệnh di truyền gen lặn Các bệnh chưa có cách chữa trị, hy vọng liệu pháp gen Chiến lược nhiều nước dự phòng Trong ngành thủy sản, dùng phương pháp lai chỗ (in situ hybridization) để chẩn đoán bệnh virus đốm trắng tôm 3.4 Trong thực phẩm Dùng phương pháp lai phân tử để kiểm tra thực phẩm biến đổi gen DNA chiết xuất từ mô, sau trình xử lý đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ Các tín hiệu thông tin kết lai DNA, phản ánh DNA microarry (một cảm biến sinh học) Từ kết thu DNA microarry cho phép xác định đột biến gen mẫu thực phẩm 18 C Kết luận Những phần trình bày kỹ thuật lai phân tử, nguyên tắc ứng dụng phương pháp vào thực tế Phương pháp lai phân tử có vai trò quan trọng sống chúng ta, phương pháp giúp tìm hiểu phát sớm vấn đề bất thiết sức khỏe hay đời sống ngày Vì lai phân tử có vai trò quan trọng thực tế phát triển nhân loại 19 [...]... cấp thông về kích thước phân tử sinh học Hơn nữa, nếu hai phân tử kích cỡ khác nhau được phát hiện, nó vẫn sẽ xuất hiện như là một dấu chấm duy nhất Do đó phương pháp này chỉ có thể xác nhận sự hiện diện hay vắng mặt của một phân tử sinh học hoặc phân tử sinh học, được phát hiện bởi các đầu dò hoặc kháng thể d.Ứng dụng Một ví dụ của việc ứng dụng Dot blot trong sinh học phân tử Vào năm 1990, Tiến sĩ... xác minh về nhiễm viêm gan B +Trong y học thú y, blot phương Tây đôi khi được sử dụng để xác nhận FIV + tình trạng ở mèo 2.2.3.4.Phương pháp Dot (slot) blot a.Mục đích Một Dot blot (hoặc Slot blot) là một phương pháp sinh học phân tử được sử dụng để phát hiện các phân tử sinh học Nó định lượng tương đối một RNA đặc trưng trong một hỗn hợp RNA mà không cần phải phân tách chúng ra b.Cách tiến hành 11... dò được đánh dấu bằng các hóa chất cho nhiều màu khác nhau III Ứng dụng của phương pháp lai phân tử 3.1 Một con thoi sinh học mới – tRNA Nghiên cứu RNA không phải là một điều mới mẻ trong lĩnh vực sinh học phân tử, nhưng chỉ kể từ khi “kỷ nguyên RNA” được thiết lập chừng mười năm trở lại đây, các nhà sinh học đã chứng kiến nhiều khám phá ngọan mục liên quan đến RNA Các bằng chứng trước đây cho thấy... đã có nhiều bộ kit chẩn đoán sinh học phân tử được thương mại hóa cho các loài: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Salmonella Đối với các tác nhân ký sinh trùng, người ta cũng đã thành công trong chẩn đoán Plasmodium, Schistosoma, Trypanosoma, Toxoplasma, Leishmania bằng lai phân tử Trong lĩnh vực y học, dùng phương pháp này với... quay trở lại nhân nơi mà chúng được sinh ra Các tác giả sử dụng kỹ thuật lai tại chỗ có sự hỗ trợ chất phát hùynh quang (fluorescence in situ hybridization) để lần theo sự di chuyển của chúng trong nấm men Hơn nữa quá trình tái xâm nhập của tRNA vào nhân này là một quá trình phụ thuộc năng lượng 3.2 Trong y học Ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong lĩnh vực y học có nhiều thuận lợi hơn các phương... 1990, Tiến sĩ Siwo de Kloet, một cựu giáo sư di truyền học tại Đại học bang Florida, đã dùng phương pháp Dot-blot để xác định giới tính của một loạt các loài chim Phương pháp này được chứng minh là cực kỳ đáng tin cậy, khi có thể thu thập đầy đủ số lượng phân tử DNA di truyền 2.3 Phương pháp lai tai chỗ 2.3.1.Định nghĩa Lai tại chỗ là một kiểu lai phân tử trong đó trình tự nuclic acid cần tìm (trình tự... lai phân tử để kiểm tra thực phẩm biến đổi gen DNA được chiết xuất từ mô, sau quá trình xử lý sẽ đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ Các tín hiệu thông tin về kết quả lai DNA, sẽ được phản ánh trong DNA microarry (một cảm biến sinh học) Từ kết quả thu được trên DNA microarry sẽ cho phép xác định sự đột biến gen trong các mẫu thực phẩm 18 C Kết luận Những phần trên đã trình bày về kỹ thuật lai phân. .. hay không thể nuôi cấy thì kỹ thuật sinh học phân tử là giải pháp duy nhất, chẳng hạn Chlamydia, Brucella, viêm gan B Việc tạo dòng một gen dùng làm đầu dò đơn giản hơn việc sản xuất kháng thể đặc hiệu, hơn nữa với một đầu dò người ta có thể phát hiện tất cả các kiểu huyết thanh Đặc biệt phương pháp lai tại chỗ còn cho phép xác định trực tiếp virus trên lát cắt sinh thiết Đối với các tác nhân vi khuẩn,... từ gel lên màng mà đặt trực tiếp một lượng mẫu nhỏ lên màng lai ( thành một điểm-Dot hay một khe-Slot) 2 Sau đó các phân tử được phát hiện bằng các đầu dò nucleotide hoặc kháng thể 3 Bản phóng xạ tự ghi sau đó đươc phân tích bằng kỹ thuật mật độ kế cho phép ước lượng số lượng các phân tử lai có trong mẫu Trong thực nghiệm, người ta sử dụng một dụng cụ (tên là manifold) cho phép đặt một lúc nhiều mẫu... thành các vết trong, do hiện tượng sinh tan vi khuẩn của phage, gọi là vết tan Các vector, như mô tả ở trên, thường chứa các gen chỉ thị cho phép chọn lọc những tế bào vật chủ mang vector (thể biến nạp) thông thường các chỉ thị này là gen kháng sinh và các tế bào biến nạp sinh trưởng trên môi trường chứa kháng sinh tương ứng Ngoài ra, các vector còn chứa các gen bổ sung để phân biệt các tế bào biến nạp