TIỂU LUẬN SINH học PHÂN tử

lý do chọn đề tài Sự phát triển của công nghệ sinh học, trên nền tảng của sinh học phân tử, cung cấp nhiều phương pháp phân tử có ý nghĩa ứng dụng lớn trong y học phòng ngừa, chẩn đoán v

A.Phần mở đầu

1 lý do chọn đề tài

Sự phát triển của công nghệ sinh học, trên nền tảng của sinh học phân tử, cung cấp nhiều phương pháp phân tử có ý nghĩa ứng dụng lớn trong y học phòng ngừa, chẩn đoán và điều trị Trong lĩnh vực chẩn đoán, việc tích lũy ngày càng nhiều và nhanh thông tin về bộ gene người và các tác nhân gây bệnh, kể từ khi Chương trình Bộ Gene Người (Human Genome Project) cơ bản hoàn tất, là đóng góp thiết yếu thứ hai dẫn đến sự hình thành chẩn đoán phân tử Bên cạnh đó, mối liên kết ngày càng chặt chẽ giữa các trường đại học, viện nghiên cứu với các bệnh viện và cơ sở y tế đã tạo thuận lợi cho việc triển khai các chẩn đoán phân

tử vào thực tiễn Một yếu tố đặc biệt quan trọng cho sự “phổ thông hóa” chẩn đoán phân tử là đóng góp của các công ty công nghệ sinh học vào việc chế tạo

và thương mại hóa nhiều trang thiết bị y tế hiện đại cùng với các “kit” (tạm dịch

là “bộ thuốc thử”) dùng trong chẩn đoán

Các phương pháp sinh học phân tử được ứng dụng vào việc xây dựng chẩn đoán phân tử thuộc hai nhóm, nhóm nhân bản DNA, RNA Chẩn đoán phân tử trong lĩnh vực bệnh nhiễm thường được sử dụng để sàng lọc nhanh, phát hiện, định type, định lượng, xác định tính kháng thuốc của các tác nhân bệnh, chủ yếu

là virus và vi khuẩn Bên cạnh ưu điểm về độ nhạy, độ đặc hiệu, phát hiệm sớm, thời gian xét nghiệm nhanh, chẩn đoán phân tử vẫn có một số nhược điểm như khả năng cho kết quả dương tính và âm tính giả, ý nghĩa lâm sàng của kết quả chẩn đoán trong một số trường hợp không rõ ràng, thiếu tính thống nhất trong kết quả thu được từ các kit khác nhau, cần thiết bị đắt tiền và kỹ thuật viên lành nghề Trong tương lai, một số khái niệm như : phát hiện các yếu tố di truyền ở người bệnh, “xét nghiệm tại chỗ” (Point-of-Care Testing), các công cụ chẩn đoán mạnh, rẻ tiền sẽ được phát triển để biến chẩn đoán phân tử thành một bộ phận thiết yếu trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng Chẩn đoán phân tử cần được xác nhận tính hiệu quả (validation) một cách nghiêm ngặt để có thể áp dụng rộng rãi

Các phương pháp lai phân tử được ứng dụng rất nhiều trong cuộc sống của chúng ta và để hiểu rõ dươc các phương pháp lai phân tử nên em đã chọn đề tài này

2 Mục đích nghiên cứu

Thông qua đề tài tìm hiểu rõ hơn về các phương pháp lai phân tử và ứng dụng của các phương pháp trong đời sống

3 Đối tượng nghiên cứu

Phương pháp lai phân tử

4 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu tài liệu

5 lịch sử nghiên cứu

1960 Julius Marmur và những đồng nghiệp của ông quản lý, ngành học tại

đại học Harvard đã khám phá ra quá trình ủ lại (reannealing).

B Nội dung

I Cơ sở lý thuyết của lai phân tử.

1. Khái niệm về lai phân tử

1.1. Khái niệm về “nhiệt độ nóng chảy “của DNA

Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá

“nhiệt độ nóng chảy” (Tm) thì hai mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết hydro nối liền hai mạch

Đường cong Tm

1.2. Các nhân tố ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA

1.2.1.Ảnh hưởng của thành phần các base trong phân tử DNA

Trong phân tử DNA, khi tăng nhiệt độ các mối liên kết A-T dễ bị đứt trước, khi nhiệt độ >900C các liên kết G-C bị đứt Do đó thành phần các base cấu tạo một DNA mạch đôi có ảnh hưởng rất quan trọng cho sự bền vững của phân tử này, đặc biệt các base G, C trong điều kiện chuẩn DNA có tỉ lệ G-C cao sẽ có điểm nóng chảy cao, DNA có 60% G-X thì điểm nóng chảy là 950C Biểu thức thể hiện sự phụ thuộc của Tm vào thành phần các base:

Tm=69,3+0,41 (%G+C)

1.2.2.Ảnh hưởng của độ dài DNA

Đoạn DNA càng dài bao nhiêu thì số lượng liên kết hydro nối hai mạch càng lớn bấy nhiêu và do đó “nhiệt độ nóng chảy” cũng càng cao Sự thay đổi

Tm theo chiều dài phân tử DNA được tính theo công thức sau:

Tm=-500/số lượng cặp baseρ

Công thức trên cho thấy ảnh hưởng của độ dài chỉ quan trọng đối với nhũng đoạn DNA ngắn điều này chính là kết quả của tính “hợp tác” đã đề cập ở phần trên

1.2.3.Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch).

Những điểm bắt cặp sai lệch (A bắt cặp với C, G bắt cặp với T,…) sẽ làm giảm tính ổn định của một phân tử lai Thông thường người ta ước lượng Tm giảm 10C cho mỗi 1% phần trăm bắt cặp sai lệch Nhưng cũng như các thành phần các base, các mismatch chỉ có ý nghĩa thực tiễn đối với các đoạn DNA ngắn

1.2.4.Ảnh hưởng của môi trường phản ứng

a.Ảnh hưởng của nồng độ muối

Sự giảm lực ion (nồng độ muối) của môi trường sẽ làm giảm rất mạnh nhiệt độ nóng chảy Tm sẽ làm giảm khoảng 150C cho mỗi logarithm nộng độ đối với các ion hóa trị I các cation hóa trị II cón có tác động mạnh hơn Như vậy, một dung dịch càng loãng thì càng làm mất ổn định chuỗi xoắn kép của DNA

b.Ảnh hưởng của formamide

Hóa chất này có khả năng hạ thấp Tm rất nhiều, đối với những đoạn dài hơn 100 cặp nucleotide, sự giảm Tm có thể được ước lượng theo công thức sau: Tm= -0.6x(%formamide)ρ

Formamide được sử dụng trong các phương pháp li phân tử nhằm làm giảm nhiệt độ lai Nồng độ thông dụng là 50% tương ứng với việc hạ nhiệt độ tương ứng tới 300C

Trong thực tế cần lưu tâm đến tất cả các chỉ tiêu nêu trên khi tính toán

Tm Công thức thực nghiệm sau đây cho phép tập hợp mọi yếu tố để ước lượng Tm:

Tm=16,6 log [m]+0.41(%GC)+81,5-%mismatch-675/chiều dài (cặp base)-0,65 (%formamide)

Công thức này dùng cho những đoạn DNA ngắn hơn 100 cặp nucleotide; trong đó [M] biểu thị nồng độ ion Na+

1.3 Khái niệm về lai phân tử

Sau khi hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau dưới tác động của Tm, sự bắt cặp sẽ không xảy ra nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột

Lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn dưới một cấu hình không gian vô trật tự Ngược lại, nếu sau khi hai mạch tách rời, nhiệt

độ được gíảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch sẽ bắt cặp trở lại

Hiện tượng này được gọi là sự lai phân tử (molecular hybridization)

2. Đặc điểm của lai phân tử.

Đặc hiệu tuyệt đối : sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung

Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA, dẫn đến sự hình thành các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay các phân tử lai DNA-RNA

3. Các yếu tố ảnh hưởng đến lai phân tử

3.1. Nồng độ DNA và thời gian phản ứng

Nồng độ DNA, nghĩa là số lượng các trình tự bổ sung, càng cao thì xác suất tiếp xúc với nhau càng tăng, tốc độ phản ứng lai phân tử tăng lên

Thời gian phản ứng càng dài thì xác suất tiếp xúc càng lớn hơn và số lượng phân tử lai tăng dần cho đến khi toàn bộ các trình tự bổ sung đều tái bắt cặp

3.2. Nhiệt độ

Thông thường tốc độ phản ứng lai cực đại ở nhiệt độ thấp hơn Tm của chính nucleic acid đó độ 25%

3.3. Độ dài của các trình tự

Tốc độ lai tăng tỉ lệ thuận với căn bậc hai của độ dài các trình tự bổ sung

3.4. Lực ion

Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng lên từ 5 -10 lần Nồng độ NaCl < 1,2M lại hoàn toàn không còn tác dụng

II Các phương pháp lai phân tử

1.1. Lai trong pha lỏng

1.1.1. Nguyên tắc :

- Các mạch đơn nằm trong môi trường lỏng là một dung dịch đệm

- Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ

Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm trong môi trường lỏng là một dung dịch đệm Sự lai phân tử này chỉ xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ Trong thực tế, nhiệt độ lai được chọn thấp hơn Tm khoảng 15˚C , hơn nữa người ta còn thêm formamide để giảm nhiệt độ lai Đối với những trình tự ngắn nhiệt độ lai được tính theo như công thức ở phân trên, đối với trình tự dài, nhiệt độ lai thông dụng là 42˚C

1.1.2 Phân tích định lượng các phân tử lai

3 phương pháp thường được sử dụng:

- Phương pháp dùng quang phổ kế

- Phương pháp sử dụng nuclease S1

- Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite

a.Phương pháp dùng quang phổ kế.

DNA mạch đôi hấp thu ánh sáng yếu hơn DNA mạch đơn Sự chuyển từ DNA mạch đôi sang dạng mạch đơn được xác định thông qua giá trị của mật độ quang (OD) ở bước sóng 260nm Do đó, trong phản ứng lai, sự tăng OD 260nm tương ứng với sự tăng số lượng các phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn, hiện tượng này gọi là hiệu ứng siêu sắc (hyperchromic effect)

Các giá trị OD được đo với một quang phổ kế trong đó cuvet đựng mẫu đo có

bộ phận điều chỉnh nhiệt độ.Hiệu ứng siêu sắc:

Nhuộm tím phân tử DNA, nếu đem chúng đun lên và làm lạnh từ từ thì kết quả

là các phân tử DNA sẽ trở nên tím đậm hơn lúc đầu một chút Nếu hạ nhiệt độ

một cách đột ngột thì chúng sẽ trở nên rất đậm Đó là do hiện tượng các mạch đơn DNA hấp thu tia UV mạnh hơn DNA mạch đôi

b.Phương pháp dùng Nuclease S1.

Nuclease S1 là một enzyme có khả năng thuỷ giải các nucleic acid mạch đơn bất kể DNA hay RNA, trong một số điều kiện thực nghiệm nhất định Dung dịch phản ứng lai được trích ra một phần, đem xử lý với Nuclease S1 Các mạch đơn đều sẽ bị thuỷ giải, sản phẩm của phản ứng là oligonucleotides hoặc nhóm nucleotide 5' phosphoryl Các nucleic còn lại tương ứng với các phân tử lai, chúng được thu nhận qua phương pháp tủa rồi đem định lượng

c.Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite.

Hydroxylapatite là những tinh thể phosphat calci Kĩ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu (đoạn nucleotide hoặc kháng thể) để lai với DNA, RNA hoặc với các protein ở trong các tế bào mà không cần tách chiết

Ở nồng độ muối cao, chỉ những nucleic mạch đôi mới gắn vào giá thể này, phần nucleic không gắn vào giá thể sẽ được thu nhận Sau đó, nếu tăng nồng độ phosphate lên, các nucleic acid đã gắn sẽ tách rời giá thể và được thu nhận riêng Số lượng DNA gắn (mạch đôi) và không gắn vào giá thể (mạch đơn) được xác định bằng quang phổ kế, từ đó tính được % tỉ lệ phân tử lai

1.1.3.Các ứng dụng của phương pháp lai trong pha lỏng

a.Tính tỉ lệ % các trình tự giống nhau ở hai loài gần nhau

Nếu không hiện diện với số lượng quá lớn, các mismatch (bắt cặp sai lệch) không ngăn cản hoàn toàn quá trình lai giữa những DNA lớn Chúng chỉ giảm Tm (nghĩa là giảm độ bền vững) của các phân tử lai Như vậy DNA có nguồn gốc từ hai loài gần nhau, dù không tuyệt đối giống nhau vần có thể lai được với nhau Để tránh sự tái bắt cặp giữa 2 mạch của cùng một phân tử ban đầu, DNA của 2 loài phải có nồng độ rất khác nhau Nếu phản ứng xảy ra hoàn toàn, tỷ lệ % các phân tử lai có thể được xem như tương ứng với tỷ lệ % các trình tự giống nhau giữa 2 loài

đó Tỷ lệ càng cao thì 2 loài càng gần nhau trong cây tiến hoá

Ở prokaryote, động học của sự tái bắt cặp biểu thị dưới dạng một đường cong đơn giản, điều này cho thấy vận tốc tái bắt cặp của tất cả các trình tự trên bộ gen là như nhau nghĩa là không có trình tự nào được lặp lại

Ở Eukaryote, đó là một đường cong phức tạp bao gồm nhiều đường cong đơn giản, điều này cho thấy có 3 loại trình tự DNA:

DNA có khả năng bắt cặp tức thời, tương ứng với các trình tự lặp lại rất nhiều lần.+

DNA tái bắt cặp chậm hơn, tương ứng với các trình tự lặp lại vừa vừa.+

DNA tái bắt cặp rất chậm tương ứng với các trình tự duy nhất.+

b.Phân tích các trình tự lặp lại

Trong 1 dung dịch DNA, một trình tự lặp lại nhiều lần sẽ có nhiều cơ may gặp mạch bổ sung hơn so với một trình tự duy nhất Động học tái bắt gặp của nó sẽ nhanh hơn so với trình tự duy nhất, động học này càng lớn khi số lượng bản sao

của trình tự lặp lại càng cao, như bộ gen của động vật có vú.

c.So sánh kích thước các bộ gen không chứa trình tự lặp lại

Ở prokaryote, bộ gen không chứa các trình tự lặp lại nên động học lai của tất cả các trình tự là như nhau Do đó giá trị Cot1/2 chỉ phụ thuộc kích thước của bộ gen Tính chất này được sử dụng để so sánh kích thước bộ gen ở các loài sinh vật

prokaryote

2.2 Lai trên pha rắn

2.1.1.Nguyên tắc

Lai trên pha rắn có cùng nguyên tắc với lai trên pha lỏng Điểm khác biệt ở đây

là một trong hai trình tự bổ sung (thường là trình tự đích, trình tự cần tìm) được cố định trên một giá thể rắn

Thuận lợi của việc sử dụng giá thể rắn là dễ dàng trong thao tác và trong việc tách các trình tự không lai ra khỏi các phân tử lai, mặt khác còn ngăn sự tái bắt cặp giữa hai mạch của cùng một phân tử

Hạn chế là, việc phân tích và định lượng các phân tử lai sau đó kém chính xác

và hiệu quả lai thấp Mặt khác, vận tốc lai trên pha rắn kém gấp 10 lần vận tốc lai trên pha lỏng do một phần các nucleic trên giá thể bị che khuất, không tiếp xúc được với các trình tự bổ sung

2.2.2.Các yếu tố kỹ thuật

Giá thể rắn dùng để cố định nucleic acid là các màng lai

Có 2 loại màng lai:

a.Màng lai bằng nitrocellulose

Là loại giá thể được sử dụng đầu tiên, hiện nay không còn thông dụng do 2 nhược điểm :

+ Độ bền cơ học kém nên khó thao tác

+ Không thể tách rời các phân tử lai trên màng để lai trở lại với một mẫu dò khác b.Màng lai bằng nylon

Có độ bền cơ học cao và cho phép lai nhiều lần với nhiều mẫu dò khác nhau, tuy nhiên cần phải loại bỏ mẫu dò cũ trước khi lai với mẫu dò mới

Các bước lai trên pha rắn 2.2.3.Ứng dụng của các phương pháp lai trên pha rắn

Có rất nhiều ứng dụng của phương pháp lai trên pha rắn, hiện nay có 4 phương

pháp cơ bản sau:

+ Southern blot

+ Northern blot

+ Western blot

+ Dot (SLot) blot

Trong đó có 3 phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất là: Southern, Northern và Dot blot

2.2.3.1.Phương pháp Southern blot

Mục đích : Phương pháp này dùng để định vị những trình tự đặc biệt trên DNA

bộ gen, hay những DNA kích thước nhỏ như DNA plasmid, phage…

Cơ sở của phương pháp là kỹ thuật chuyển (transfer) DNA tử gel lên màng lai do Southern mô tả năm 1975

Các bước tiến hành:

1 Đoạn DNA phân tích, được cắt thành những đoạn có kích thước khác nhau bằng enzyme cắt giới hạn Đối với sinh vật có hệ gen phức tạp, quá trình cắt có thể tạo ra hàng triệu mảnh vỡ

2 Hỗn hợp phức tạp các mảnh vỡ được đem điện di trên gel agarose, để tách các mảnh theo kích thước Nếu có một số các mảnh vỡ DNA lớn hơn 15 kb (1kb =

1000 cặp base của DNA hoặc RNA), trước khi thực hiện quá trình thấm, gel có thể được xử lý bằng một acid, ví dụ như acid HCL loãng, các mảnh DNA bị phá vỡ thành các phần nhỏ hơn, do đó cho phép chuyển giao hiệu quả hơn

3 Những đoạn DNA ngắn trong gel bị biến tính bằng chất kiềm, trong dung dịch kiềm DNA sợi kép bị tách thành các DNA sợi đơn Sau đó, chúng được

chuyển vào lên màng nitrocellulose hoặc nylon bằng cách thấm Thủ tục này duy trì sự phân bố của các mảnh vỡ trong gel, tạo ra một bản sao của gel trên bộ lọc Màng tế bào sau đó được nướng trong lò chân không hoặc đun nóng ở 80°C trong

2 giờ (ở điều kiện tiêu chuẩn; sử dụng màng nitrocellulose hoặc nylon) hoặc tiếp xúc với tia cực tím (sử dụng màng nylon) để vĩnh viễn gắn DNA được chuyển trên màng tế bào

4 Đem lai các DNA được cố định trên màng này với các mẫu dò có đánh dấu phóng xạ Sau quá trình lai, người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp chuyên biệt với DNA cố định trên màng

5 Cuối cùng, người ta dùng kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) để định vị các phân tử lai Người ta sẽ đặt một phim nhạy cảm với tia xạ áp sát vào màng lai, các mẫu dò được đánh dấu phóng xạ sẽ tác động lên phim và kết quả được thể hiện qua các chấm đen trên phim

Ứng dụng của phương pháp lai Southern blot

+ Lập bản đồ giới hạn của một gen

+ Phát hiện các đa dạng trình tự (fragment polymorphism) của cùng một gen

ở các chủng hay các cá thể khác nhau qua sự so sánh bản đồ giới hạn của chúng + Phát hiện các đột biến mất đoạn, đột biến điểm hay tái tổ hợp trên một gen vì

chúng làm thay đổi bản đồ giới hạn.

2.2.3.2.Phương pháp Nortnern blot

a.Mục đích:

Nhằm xác định kích thước và hàm lượng của một RNA thông tin cụ thể

(mRNA)

b.Các bước thực hiện:

1 Để chiết xuất RNA từ mô, sử dùng các tác nhân chaotropic, chẳng hạn như guanidinium isothiocyanate Các đại lý như vậy phá vỡ các tế bào và làm biến tính protein cũng như hoà tan các RNA mRNA chiếm 2-5% tổng số RNA, và để chiết xuất nó đòi hỏi một bước chọn lọc, sử dụng mRNA có đuôi poly(A)

2 Các RNA được điện di trên gel agarose để phân tách theo kích thước

3 Chuyển RNA lên màng lai nylon hoặc bộ lọc nitrocellulose thông qua một

hệ thống thấm bằng mao mạch hoặc chân không Theo phương pháp truyền thống,

sử dụng thấm mao mạch vì nó không cần đến các thiết bị đặc biệt Tuy nhiên, ngày nay xu hướng sử dụng thấm chân không ngày càng nhiều vì nó đem đến lợi thế về tốc độ và khả năng tái tạo

Các bộ đệm chuyển giao được sử dụng trong hệ thống thấm thường chứa

formamide, vì nó làm giảm nhiệt độ ủ của sự tương tác thăm dò-RNA, do đó ngăn ngừa suy thoái RNA bởi nhiệt độ cao

4 Sau khi RNA đã được chuyển giao, nó là di động thông qua mối liên kết cộng hóa trị màng bằng ánh sáng tia cực tím hoặc nhiệt Việc hình thành các mối liên kết cộng hóa trị của RNA trên màng tế bào, giúp ngăn cản axit nucleic không

bị rửa trôi trong bước xử lý tiếp theo

Đem lai RNA trên màng với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ Điều kiện thí nghiệm

có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và độ đặc hiệu của lai bao gồm: lực ion, độ nhớt, các cặp cơ sở không phù hợp và các thành phần cơ bản

5 Màng được rửa sạch để loại bỏ các đầu dò không bị ràng buộc

6 Các phân tử lai được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi

c.Ứng dụng

Phương pháp Northem blot cho phép quan sát mô hình biểu hiện gen của các

mô, cơ quan, giai đoạn phát triển, nhiễm mầm bệnh… Kĩ thuật này dùng để hiển thị sự xuất hiện quá mức các gen gây ung thư và giảm các gen ức chế quá trình ung thư khi so sánh với mô bình thường, cũng như biểu hiện sự từ chối các cơ quan khi cấy ghép Kết quả thu được khi quan sát mô hình biểu hiện gen sẽ cung cấp một cái nhìn sâu sắc vào chức năng của gen đó

Phương pháp này cũng cung cấp một cái nhìn sâu sắc vào kích thước của sản

phẩm, có thể thấy các mối nối thay thế sản phẩm trên cùng một gen hoặc các mẫu

có trình tự lặp đi lặp lại Một sản phẩm gen không đúng kích thước có thể do xóa

bỏ hoặc sai sót trong xử lý bản sao, bằng cách thay đổi mục tiêu thăm dò được sử dụng theo trình tự được biết đến, nó có thể xác định khu vực của RNA mất tích 2.2.3.3.Phương pháp Western blot