sinh hoc phan tu

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ CỦA acid nucleic Các phương pháp phân tích acid nucleic đề cập chương vừa qua cung cấp nhiều thông tin acid nucleic nghiên cứu chưa cho phép kết luận chất nó, cụ thể acid nucleic tương ứng với gen gì, có chức điều hịa hay mã hóa cho protein Thơng tin rút từ việc xác định trình tự nucleotide acid nucleic Hai phương pháp xác định trình tự phương pháp hóa học Macxam Gilbert (1977) phương pháp enzyme học Sanger cộng (1977) Dù khác nhâu nguyên tắc hai phương pháp có số điểm chung : hình thành tập hợp nhiều oligonucleotide có chiều dài khác nhau, olygonucleotide có sác xuất xuất phản ứng Các trình tự sau phân tách dựa vào kích thước phương pháp điện di gel polyacrylamide có khả phân tách hai trình tự cách nucleotide Kết đọc phóng xạ tự ghi nhờ máy dò tự động I-Nguyên tắc hóa học : Phương pháp Macxam Gilbert Phương pháp dựa vào thủy giải đặc trưng phân tử ADN cần xác định trình tự phương pháp hóa học Trước hết phân tử ADN đánh dấu 32P đầu Sau đó, chúng chia thành phân đoạn, phân đoạn chịu xử lý hóa học chuyên biệt có khả làm biến đổi đặc trưng loại nucleotide sau cắt phân tử AND nnucleotide Năm nhóm nucleotide bị tạc động : G, A, C , G + A , T + C Kết xử lý hóa học lả hình thành nên năm tập hợp olygonucleotide, olygonucleotide tập hợp có kích thước khác lại cung chấm dứt loại nucleotide Cuối năm phân đoạn đen phân tách gel polyacrylamide Vị trí oligonucleotide gel tương ứng với kích thước chúng phát nhờ đầu đánh phóng xạ Kết đọc bảng phóng xạ tự ghi II-Phương pháp enzyme học thông qua việc sử dụng dideoxynucleotide Sanger Phương pháp dựa vào tổng hợp nhờ enzyme ADNpolymerase mạch bổ xung cho trình tự ADN mạch đơn cần xác định Đặc trương phương pháp ngồi bốn loại nucleotide thơng thường cịn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide loại deoxynucleotide nhóm 3′OH thay H Điều khiến didoxynucleotide khơng cịn khả hình thành nối phosphatdiester làm ngừng q trình tổng hợp Trình tự ADN cần xác dịnh phải tạo dòng vecter mạch đơn (phage M 13) ADN polymerase sử dụng đoạn Klenow ADN polymerase I, Taq polymerase hay Sequanase Sự tổng hợp mạch mồi bắt cặp với trình tự chuyên biệt phage M 13, với diện bốn loại nucleotide loại đánh dấu đồng vị phóng xạ (35S) Phản ứng tổng hợp tiến hành bốn phân đoạn riêng Người ta cho vào phân doạn bốn loại dideoxynucleotide với hàn lượng nhỏ Do hàm lượng thấp nên có dideoxynucleotide sử dụng vào phản ứng tổng hợp oligonucleotide; tổng hợp oligonucleotide ngùng lại Tính xác suất phân đoạn có mặt tất cỡ oligonucleotide ứng với tất nucleotide loại diện ADN VD : triình tự DNA cần xác định AATCGATAGGCTTGCATG phân đoạn có mặt dideoxynucleotide ddC có tổng hợp oligonucleotide sau: AATC AATCGATGGC AATCGATGGCTTGC Sau đó, bốn phản ứng tổng hợp đem phân tách gel polyacrylmide kết dược đọc phóng xạ tự ghi III-Các phương pháp cải biên từ phương pháp Sanger Trong thực nghiệm, việc sử dụng phương pháp thống nêu địi hỏi thao tác phức tạo phải tạo dịng trở lại đoạn DNA cần xác định trình tự vào vecter mạch đơn (phage 13) Do đó, để đơn giản hóa, từ đầu người ta tạo dòng với vecter plasmid hệ thứ ba Ở hai bên đoạn DNA tạo dịng, plasmid có mang hai trình tự chuyên biệt, trình tự nằm mặt cần xác định trình tự mạch nào, trước hết người ta tách rời hai mạch (biến tính NaOH) sử dụng mồi bắt cặp với trình tự chun biệt nằm mạch Phản ứng tổng hợp xảy thoe nguyên tắc nêu phần 1-Xác định trình tự máy tự động Trong kỹ thuật này, người ta không đánh dấu đồng vị phóng xạ mà hóa chất –các fluochrome Mỗi loại dideoxynucleotide đánh dấu fluochrome có màu khác Như vậy, tất oligonucleotide chấm dứt loại dideoxynucleotide có màu Sau điện di gel polyacryl amide, kết đọc qua hệ thống vi tính Tất phương pháp vừa kể dùng để xác định trình tự DNA tạo dòng Sự đời phương pháp PCR cho phép xác định trực tiếp trình tự DNA khuyếch đại PCR khơng qua tạo dịng 2-Phương pháp PCR dùng xác định trình tự nucleic acid Nguyên tắc phương pháp dựa phối hợp phương pháp PCR phương pháp sử dụng dideoxynucleotide.Phương pháp sử dụng vùng cần xác định trình tư biết trước ; ứng dụng chủ yếu dùng phát nhah đột biến điểm Trước hết đoạn DNA cần xác định trình tự khuyếch đại phương pháp PCR Sau đó, hai mạch phân tử DNA tách rời Mỗi mạch bắt cặp với mồi (có thể mồi dùng cho phản ứng PCR hay mồi nằm bên đoạn DNA) Phản ứng tổng hợp xảy tượng tự phương pháp enzyme học sử dụng dideoxynucleotide *************************************** Tóm tắt Các phương pháp xác định trình tự nucleic acid dựa vào hai nguyên tắc : -Nguyên tắc hóa học (phương pháp Macxam-Gilbert): dựa vào phản ứng hóa học thủy giải đặ c hiệu DNA, tạo thành tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác -Nguyên tắc enzyme học (phương pháp Sanger phương pháp cải biên) : dựa vào tổng hợp mạch bổ xung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase Với việc sử dụng thêm dideoxynucleotide với deoxynucleotide thông thường, kết tổng hợp hình thành tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác Ở hai trường hợp, phân đoạn DNA phân tách qua điện di gel polyacrylmide có khả phân tách hai trình tự DNA nucleotide Với việc sử dụng loại nucleotide có đánh dấu đồng vị phóng xạ, kết trình tự cần xác định đọc phóng xạ tự ghi từ điện di ********************************************* Vào thập kỷ 70, có hai quy trình giải trình tự sau đưa gần lúc: - Phương pháp Maxam Gilbert (1977) cắt đứt sợi đôi DNA vị trí đặc biệt phản ứng hố học - Phương pháp Sanger (1977) dung enzyme xúc tác sợi bổ sung tương ứng chuỗi DNA cần xác định trình tự, nhứng sản phẩm tổng hợp bị chấm dứt điểm đặc biệt Hiện người ta không sử dụng rộng rãi phương pháp hố học độc tính hố chất Do đó, phương pháp Sanger sử dụng phổ biến VN lẫn giới Phương pháp Sanger sử dụng ddNTP (dideoxyribonucleoside triphosphate) tức dNTP mà phân tử thiếu nhóm 3’-OH Điều dẫn đến sử dụng ddNTP phản ứng tổng hợp PCR, phân tử gắn vào gốc dNTP trước lien kết phosphodiester khơng có gốc 3’-OH nen khơng thể tạo lien kết với phân tử dNTP khác đó, phản ứng tổng hợp DNA chấm dứt trình tổng hợp dừng lại ddATP gắn vào sợi DNA kéo dài Như hỗn hợp phản ứng sau thu nhiều phân tử DNA có độ dài khác biệt tất cúng chấm dứt vị trí A (do việc gắn ddATP thay dATP ngẫu nhiên) Các sản phầm có độ dài khác phân biệt quan sát gel polyacrylamide biến tính Kết trường điện di vạch có chiều dài khác có vị trí tận T sợi khn.◊Sanger áp dụng đặc tính cách phản ứng tổng hợp DNA, ngồi dNTPs, ơng cho thêm vào hỗn hợp dẫn xuất ddNTP, ví dụ thay dATP ddATP Phản ứng sau tiến hành lại thêm ddGTP; tiếp diễn với ddTTP ddCTP Chúng ta thu trường điện di suy trình tự sợi khuôn DNA Trong thực tế, ddNTP thường gắn với thuốc nhuộm phát huỳnh quang với màu khác cho loại ddNTP Tiên hành phản ứng tổng hợp với dNTPs ddNTPs, sản phẩm phản ứng đưa lên máy đọc Máy đọc sử dụng tia laser để xác định chất phát huỳnh quang phát từ thuốc nhuộm gắn lên sản phẩm kết chuyển vào máy tính để xử lý cho trình tự cần xác định Hiện VN sử dụng phương pháp đọc trình tự Sanger với máy đọc tự động nhập nước ngồi Theo tơi biết viện CNSH có sử dụng liên tục, trường ĐHBK, ĐHKHTN, ĐHSP, viện di truyền nông nghiệp… có chả sử dụng Cái máy mua hay trợ theo dự án đẹp thơi, tiền hố chất cho phản ứng đọc trình tự to nên chả dại dung nhiều, nhỡ khơng hỏng máy toi Giải trình tự gì? Thơng tin di truyền thể sinh vật chứa đựng phân tử có tên ADN (acid deoxynucleic), chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn tạo thành từ bốn loại nucleotide gồm A (adenine), C (cytosine), G (guanine) T (thymine) Các nucleotide nối trình tự xác định, khác lồi, chí thể Giải trình tự ADN kỹ thuật giúp xác định xếp bốn loại nucleotide A, T, C, G phân tử ADN, nhờ nghiên cứu đặc điểm di truyền mức độ sinh học phân tử Các phương pháp giải trình tự ADN Phương pháp Maxam Gilber Vào năm 1977, hai nhà khoa học người Mỹ Allan Maxam Walter Gilbert phát minh phương pháp hóa học xác định trình tự nucleotide chuỗi ADN Theo phương pháp để giải trình tự ADN trước hết phân tử ADN đánh dấu đồng vị phóng xạ 32P đầu 5’ Sau chúng chia thành nhóm, nhóm xử lý hóa chất khác nhằm làm biến đổi đặc trưng loại nucleotide cắt phân tử ADN nucleotide Bốn nhóm bị tác động bao gồm: G, A+G, T+C, C Kết tạo thành đoạn oligonucleotide có chiều dài khác Các đoạn phân tách gel polyacrylamide hiển thị kỹ thuật phóng xạ tự ghi Từ kết phóng xạ tự ghi bốn nhóm xác định vị trí bốn loại nucleotide chuỗi ADN Bảng đọc kết trình tự theo phương pháp Maxam Gilber Phương pháp hóa học xác định trình tự ADN Maxam Gilbert thực tế dễ thực cần phải xác định nhiều thơng số tối ưu cho thí nghiệm, khó phải xác định nồng độ giới hạn chất hóa học cho xử lý mẫu ADN đoạn ADN có base bị biến đổi Chính phức tạp này, phương pháp Maxam-Gilber sử dụng, mà thay vào nhà khoa học dùng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội Phương pháp Sanger Phương pháp Enzyme Sanger cộng phát minh vào năm 1977, ngày hôm phương pháp ngày hoàn thiện thực dễ dàng phịng thí nghiệm Để thực phương pháp này, trước hết, đoạn ADN cần xác định trình tự phải tạo dịng vào vector để nhân thành nhiều tế bào vi khuẩn, sau tách chiết tinh khiết vector từ vi khuẩn để thành vector tự Lượng ADN sau tách chiết phân vào bốn ống nghiệm khác để thực phản ứng giải trình tự Mỗi phản ứng bao gồm: vector có gắn chèn đoạn ADN cần xác định trình tự, đoạn mồi bổ sung cách đặc hiệu với trình tự vector vị trí đoạn chèn ADN, enzyme ADN polymerase, bốn loại dNTP 1% loại ddNTP ddNTP dideoxynucleotide triphosphate có cấu trúc hóa học gốc OH vị trí carbon thứ đường deoxyribose làm cho dNTP gắn vào Do kết thúc phản ứng kéo dài chuỗi Kết tạo mạch ADN có chiều dài khác tương ứng với vị trí trình tự nucleotide đoạn ADN gốc Các ddNTP đánh dấu đồng vị phóng xạ 32P hay 35S Sau điện di gel polyacrylamide giống phương pháp Maxam-Gilbert, vạch điện di hiển thị kỹ thuật phóng xạ tự ghi Từ vạch xác định trình tự ADN Bảng đọc kết trình tự theo phương pháp Sanger Giải trình tự máy giải tự động Ngày nay, việc giải trình tự thực dễ dàng nhờ có hỗ trợ máy giải trình tự tự động Máy giải trình tự hoạt động dựa theo nguyên lý phương pháp Sanger có cải biến Trong ddNTP khơng đánh dấu phóng xạ mà đánh dấu chất huỳnh quang khác cho loại ddNTP Máy giải trình tự tự động bao gồm thành phần như: hệ mao quản, hệ chiếu sáng laser, hệ nhận xử lý tín hiệu Các vạch điện di mao quản phát sáng qua chùm tia sáng laser Hệ thống nhận diện tín hiệu màu ghi lại mã hóa thành nucleotide A, T, C, G Sơ đồ hệ thống máy giải trình tự tự động Ứng dụng nghiên cứu sinh học phân tử virus Virus nhóm vi sinh vật nhỏ chưa có cấu tạo tế bào Vật liệu di truyền virus đa dạng bao gồm ADN sợi đôi, ADN sợi đơn, ARN sợi đơn, ARN sợi đơi, v.v Trong virus có vật liệu di truyền ARN chiếm đa số Và dù ADN hay ARN, tất thông tin di truyền đọc dạng A, T, G, C theo trình tự ADN Do giải trình tự ADN áp dụng nhóm virus ARN Theo đó, để gải trình tự ARN virus ARN virus tách chiết từ mẫu bệnh phẩm, sau chuyển đổi ngược thành cDNA, nhân lên kỹ thuật PCR Thông tin di truyền giải mã máy giảitự động Các bước giải trình tự gen virus: - Tách chiết vật liệu di truyền ADN hay ARN virus từ mẫu, - Thực phản ứng PCR hay RT-PCR để tăng lượng giới hạn vùng gen cần giải virus với mồi chuyên biệt, - Tinh sản phẩm PCR, - Thực phản ứng PCR giải trình tự với mồi chất ddNTP để tạo đoạn ADN có kích thước khác với đầu tận ddNTP có đánh dấu chất phát huỳnh quang, - Tinh sản phẩm PCR giải tình tự để loại ddNTP thừa mồi dư, - Thực giải trình tự máy giải tự động Những ứng dụng nghiên cứu: - Định danh virus: Trong trường hợp xét nghiệm virus kỹ thuật PCR cho kết vạch không đặc hiệu khó xác định hay cịn nghi ngờ kỹ thuật giải trình tự giúp định danh xác loại virus có trình tự riêng biệt, khơng trùng lẫn với lồi khác - Xác định kiểu gen: Kiểu gen (genotype) kiểu gen khác loài virus Việc phân biệt kiểu gen khác dựa khác số nucleotide gen Xác định kiểu gen giúp nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus gây bệnh truyền nhiễm Chẳng hạn virus sởi có 23 kiểu gen khác ký hiệu theo chữ chữ số ví dụ kiểu A, B1, B2, B3, C1, C2, C3, D1, D3, D4, D5, H1, H2, Ở Việt Nam, kiểu gen sởi lưu hành chủ yếu H1, H2, D5 - Nghiên cứu đột biến Giải trình tự gen virus cịn giúp nghiên cứu đột biến trình tự nucleotide mà khơng kỹ thuật xác định Ví dụ đột biến kháng thuốc virus cúm Đột biến xảy gen N virus cúm N gen mã hóa enzyme neuraminidase giúp virus hịa màng chui vào tế bào chủ Thuốc tamiflu (oseltamivir) chất giả dạng với cơchất neuraminidase, gắn vào neuraminidase làm virus xâm nhiễm vào tế bào chủ Đột biến gen N khiến tamiflu không gắn vào neuraminidase không ức chế hoạt động virus Đột biến kháng thuốc khác đột biến vùng DNA Polymerase virus viêm gan B Đột biến ngày quan tâm, đích tác động thuốc Lamivudine Đột biến kháng Lamivudine hay gọi tên YMDD Khi kết có đột biến bác sĩ biết bệnh nhân có kháng với thuốc cần phải thay đổi chế độ thuốc cho bệnh nhân để từ đạt kết điều trị tốt Tóm lại giải trình tự bước tiến kỹ thuật, công cụ hỗ trợ đắc lực cho xét nghiệm nghiên cứu sinh học phân tử virus, giúp người ngày hiểu rõ kiểm soát bùng phát virus gây bệnh ... nucleotide A, T, C, G Sơ đồ hệ thống máy giải trình tự tự động Ứng dụng nghiên cứu sinh học phân tử virus Virus nhóm vi sinh vật nhỏ chưa có cấu tạo tế bào Vật liệu di truyền virus đa dạng bao gồm... xác định xếp bốn loại nucleotide A, T, C, G phân tử ADN, nhờ nghiên cứu đặc điểm di truyền mức độ sinh học phân tử Các phương pháp giải trình tự ADN Phương pháp Maxam Gilber Vào năm 1977, hai nhà... tự to nên chả dại dung nhiều, nhỡ không hỏng máy toi Giải trình tự gì? Thơng tin di truyền thể sinh vật chứa đựng phân tử có tên ADN (acid deoxynucleic), chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn tạo thành