Tiểu luận sinh học phân tử

Lãnh vực này khôngngừng được phát triển là nhờ kỹ thuật liên quan đến sự thao tác ADN,ARN và protein thay đổi mau lẹ và mạnh mẽ mà các kỹ thuật đó ngày nayđược gọi là công nghệ gen hay c

1/ Đặ t v ấ n đề :

Di truyền học phân phân tử nghiên cứu cấu trúc các gen và sự vậnhành các sản phẩm của chúng trong một tế bào Lãnh vực này khôngngừng được phát triển là nhờ kỹ thuật liên quan đến sự thao tác ADN,ARN và protein thay đổi mau lẹ và mạnh mẽ mà các kỹ thuật đó ngày nayđược gọi là công nghệ gen hay công nghệ tái tổ hợp ADN

Công nghệ tái tổ hợp ADN là những kỹ thuật tách và tái tổ hợp lạicác gen invitro ADN tái tổ hợp là phân tử ADN lai từ ADN của hai loàikhác nhau Ví dụ một gen cần nghiên cứu được gắn vào ADN của virustạo ADN tái tổ hợp Quá trình tách gen cần nghiên cứu, sử dụng rồi gắnvào ADN khác (như ADN virus, ADN plasmid…) tạo ra ADN tái tổ hợp rồichuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào cần thiết là các kỹ thuật cơ bản củcông nghệ tái tổ hợp ADN

Các enzym cắt hạn chế RE và các vector là các công cụ sử dụngtrong công nghệ tái tổ hợp ADN Đề tài: “ Vai trò của enzyme restriction và plasmid trong ứng dụng của sinh học phân tử”

giúp người viết hiểu hơn về vai trò của sinh học phân tử trong nhiều lĩnhvực khoa học

2/ Đối tượng và phạm vi nghiên cứu :

Đối tượng nghiên cứu: là vi khuẩn, nấm, thực vật, động vật và cácenzym

Phạm vi nghiên cứu: chỉ tập trung nghiên cứu vai trò của enzymerestriction và plasmid thông qua kỹ thuật tái tổ hợp ADN

3/ Phương pháp nghiên cứu:

Phương pháp nghiên cứu đề tài là phương pháp tổng hợp các tài liệuđược lấy từ các nguồn thông tin như thư viện, báo đài, internet Dựa vào sựphân tích, tổng hợp, so sánh, đối chiếu các tài liệu để thực hiện đề tài.Mặc dù đề tài được chuẩn bị khá công phu, nhưng chắc chắn vẫn còn

sơ suất, rất mong được sự góp ý của quí thầy hướng dẫn và các bạn đồngnghiệp Tác giả chân thành biết ơn

4/ Cấu trúc tiểu luận:

Phần 1: Kỹ thuật tái tổ hợp ADN

Phần 2: Một số ứng dụng của kỹ thuật di truyền

PHẦN MỞ ĐẦU

DUNG

MỤC LỤC

Trang

Phần mở đầu 1

Phần nội dung 3

Phần I- Kỹ thuật tái tổ hợp ADN I/ Các enzyme hạn chế 3

II/ Thu nhận gen 5

1/Tạo các đoạn ADN có chứa gen từ bộ gen 5

2/Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học 6

3/Sinh tổng hợp gen từ mARN của gen tương ứng 6

III/ Các vector chuyển gen 6

1/ Các vector chuyển gen plasmid 7

2/ Các vector chuyển gen là phage lamdaˆ 3/ Các vector chuyển gen dự trên cosmid 9

4/ Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men 10

IV/ Tạo ADN tái tổ hợp 11

V/ Tạo dòng phân tử 13

Phần II- Một số ứng dụng của kỹ thuật di truyền……….16

KẾT LUẬN 19

TÀI LIỆU THAM KHẢO 20

Phần 1: KỸ THUẬT TÁI TỔ HỢP ADN.

Kỹ thuật tái tổ hợp ADN được thực hiện qua nhiều giai đoạn nhờ cáccông cụ enzyme cắt, nối và sao chép nucleic acid

I.CÁC ENZYME HẠN CHẾ:

Kỹ thuật tái tổ hợp ADN sử dụng hàng loạt các công cụ phân tử, đó làcác enzym nuclease, ADN-polymerase, ligase, reverse transcriptase,terminal transferase, trong đó vai trò hàng đầu là các enzyme restriction.Vào năm 1962, V.Arber lần đầu tiên chứng minh rằng có nhữngenzyme đặc biệt hoạt động trong tế bào vi khuẩn, chúng có khả năng phânbiệt ADN của mình với ADN lạ của phage Các enzym này hạn chế khảnăng sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn bằng cách phân hủy chúng

một cách đặc hiệu do đó gọi theo tiếng Anh là Restriction enzyme Chữ

restriction có nghĩa là hạn chế có nguồn gốc lịch sử từ đó và được dùngđến nay

Các enzyme phân cắt ADN được gọi là nuclease gồm 2 loại làexonuclease và endonuclease Exonuclease cắt ADN từ 2 đầu mút, cònendonuclease cắt ADN ở giữa phân tử Các restriction enzyme cắt phân tửAND ở giữa một cách đặc hiệu nên được gọi là restriction endonuclease.Năm 1970, H.Smith và các cộng tác viên đã tách được restrictionendonuclease đầu tiên từ vi khuẩn Haemophilus influenzae Rd được gọi làHindII Các enzyme restriction endonuclease nằm trong hệ thống chuyênbiệt hạn chế- biến đổi ( restrictio-modification system) để bảo vệ tế bàokhỏi sự xâm nhập của ADN lạ

Các restriction enzyme nhận biết ADN mạch kép ở những trình tựnhất định thường được gọi là điểm nhận biết (recognition sites) và cắtADN ở ngay điểm này hay kế cận Các điểm nhận biết này thường cótrình tự 4-8 cặp nucleotide đối xứng đảo ngược nhau, được gọi là cácpalyndrom Sự cắt ADN như vậy có thể tạo đầu tù hay đầu bằng (HpaI)hoặc đầu dính (BamHI) phụ thuộc vào cơ chế cắt của enzyme Đầu dínhđặc biệt được sử dụng trong cấu trúc phân tử ADN lai hay khảm

Ngày nay hơn 500 loại restriction endonuclease đã được phát hiện,chúng có khả năng cắt ADN tổng cộng với hơn 120 trình tự nhận biết khácnhau Hàng trăm loại restriction endonuclease được bán ở thị trường Mỗirestriction endonuclease có trình tự nhận biết đặc trưng

PHẦN NỘI DUNG

Ví dụ:

*Restriction endonuclease EcoRI (từ E.coli) có trình tự

Eco RI cắt

-G-A-A-T-T-C - -G A-A-T-T-C -C-T-T-A-A-G - -G-T-T-A-A G -

*Enzyme Bam HI (từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens)

Bam HI

- G-C - -G C -

-C-C-T-A-G-G - -C-C-T-A-GG -

*Enzyme Hae III (từ vi khuẩn Haemophilus aegyptium)

Hae III

-G-G- -G-G -C-C-G-G - -C-C G-G -Các enzym Eco RI và Bam HI khi cắt ADN mạch kép tạo ra các đầulệch dính (cohesive ends) vì các base bổ sung dễ bắt cặp để gắn lại vớinhau như lúc chưa bị cắt rời Nếu có một đoạn ADN lạ khác cùng bị cắtbởi một loại enzym hạn chế, ví dụ Eco RI thì nhờ các đầu dính đoạn ADNlạ có thể xen vào giữa như sau :

Đoạn ADN1 Đoạn ADN lạ 2

-G-A-A-T-T-C - ~G-A-A-T-T-C~~~~~~G-G-A-T-C-C~ -C-T-T-A-A-G - ~C-T-T-A-A-G~~~~~~C-T-T-A-A-G~

Đoạn ADN lạ xen giữa

Tính chất quan trọng này được sử dụng để cắt và ghép các gen

Các enzyme endonucleaza hạn chế và những đoạn cắt của chúng Enzyme hạn chế Các đoạn cắt Có nguồn gốc từ vi khuẩn

Thermus aquaticus YTI

II.THU NHẬN GEN :

Có thể thu nhậân gen cho việc thực hiện kỹ thuật di truyền bằng baphương pháp : tách trực tiếp từ ADN bộ gen, tổng hợp hóa học và sinhtổng hợp gen từ mARN tương ứng

1.Tạo các đoạn ADN có chứa gen từ bộ gen :

Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong buổi đầu của sựphát triển kỹ thuật di truyền Toàn bộ ADN của một sinh vật được cắt

đoạn nhỏ khoảng 15-20.000 cặp base bằng lắc cơ học hay bởi cácrestriction endonuclease rồi gắn vào các vật mang gen tạo plasmid tái tổhợp Các plasmid tái tổ hợp được đưa vào tế bào để tạo dòng đoạn ADNhoặc theo dõi sự biểu hiện của gen.

Phương pháp này mang nhiều tính chất mò mẫm vì nguyên bộ gentức toàn bộ ADN của các sinh vật khác nhau chứa rất nhiều gen Phươngpháp này được gọi bằng tiếng Anh là Shotgun ( bắn đạn chài) Tuy nhiênhiện nay nó vẫn được sử dụng có hiệu quả trong việc lập ngân hàng genhay thư viện gen của các sinh vật, được gọi là ngân hàng gen nhiễm sắcthể (Bank of genomic ADN) hay thư viện gen (genomic ADN libraries)

2.Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học :

Lần đầu tiên vào năm 1977, KaItakura và Boyer đã thành côngtrong việc cho gen tổng hợp nhân tạo mã hóa hormone somatostatin củađộng vật có vú biểu hiện trong tế bào E.coli Gen somatostatin đã nhậnđược nhờ biết cấu trúc peptid của hormone chỉ gồm có 14 amino acid Sauđó, các nòi E.coli mang gen tổng hợp được tạo ra, chúng sản sinh hormonetăng trưởng ở người Somatotripin) và các hormone peptid khác Genhormone tăng trưởng ở người dài 584 cặp nucleotide là gen dài nhất đượctổng hợp nhân tạo vào cuối những năm 70

3.Sinh tổng hợp gen từ mARN của gen tương ứng :

Trong thực tiễn của kỹ thuật di truyền người ta sử dụng rộng rãiphương pháp thứ ba tạo gen từ các ARN thông tin của chúng Phương phápnày được vào quá trình phiên mã ngược nhờ sử dụng enzyme phiên mãngược reverse transcriptase Enzyme gọi đúng nghĩa là ADN-polymerasephụ thuuộc ARN (ARN- dependent ADN-polymerase) Enzym có khảnăng tổng hợp nên ADN một mạch là c-ADN (complementary ADN) từkhuôn mARN hoặc từ một đoạn polyribonucleotide tổng hợp hóa học Nhờenzyme này có thể tổng hợp hầu như bất cứ gen riêng biệt nào miễn cómặt mARN của gen đó

III.CÁC VECTOR CHUYỂN GEN:

Vật chuyển gen là phân tử ADN có khả năng tự tái sinh, tồn tại độclập trong tế bào và mang được đoạn gen cần thiết Các vật chuyển genphải thỏa mãn các yêu cấu tối thiểu :

*Có các trình tự xuất phát sao chép (ori) để có thể tồn tại độc lập

*Có các trình tự nhận biết (ricognition site) mà các restrictionendonuclease nhận biết để cắt

*Các trình tự điều hòa tạo thuận lợi cho sự phiên mã gen lạ.

*Đảm bảo sự di truyền bền vững của ADN tái tổ hợp ở dạng độc lậphay gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ

*Có các gen đánh dấu để dễ phát hiện vector hoặc các gen gắn vào

1.Các vector chuyển gen plasmid :

a.Vector pBR322.

Các vector thông dụng được sử dụng với E.coli trước tiên phải kểđến là pBR322 (chữ p là chữ viết tắt của cụm từ plasmid ; BR là tên viếttắt của hai nhà khoa học ở phòng thí nghiệm đầu tiên tìm ra vector này là :F.Bolivar và R.Rodrigues ; 322 là danh số của plasmid này để phân biệtvới các plasmid khác trong khi nghiên cứu cũng do phòng thí nghiệm nàytìm ra như pBR325, pBR327 )

Plasmid có kích thước nhỏ hơn 10kb nên dễ loại trừ vấn đề ADN bịgãy khi làm sạch : pBR322 có 4361 cặp base Kích thước đó nói lên rằng,không chỉ vector có thể làm sạch một cách dễ dàng mà còn có thể cả phântử ADN được cấu trúc với nó Thậm chí thêm vào 6 kb ADN, phân tửpBR322 tái tổ hợp vẫn còn là kích thước có thể điều khiển được

Plasmid này có hai bộ gen kháng kháng sinh là gen kháng ampicilinhoặc gen kháng tetracyclin được dùng làm marker chọn lựa đối với tế bàochứa plasmid này Mỗi gen marker gồm những vị trí cắt gen hạn chế duynhất, mà chúng được dùng trong các thí nghiệm chọn dòng

Việc gài ADN mới vào pBR322 đã được cắt với PstI, PvuI hoặcScaI sẽ làm ức chế gen ampR và khi dùng gài một trong 8 emzyme cắt hạnchế làm ức chế tetracyclin Sự thay các vị trí cắt hạn chế –mà chỗ đó cóthể dùng để ức chế gài- pBR322 có thể được dùng để chọn dòng các đoạnADN có đầu dính

Một sự tiến bộ thứ ba của pBR322 là cơ số bản sao cao Có khoảng

15 phân tử có mặt trong E.coli bị biến nạp nhưng số lượng này có thể tăngtừ 1.000 tới 3.000 phân tử bởi sự phóng đại plasmid với sự có mặt của chấtứu chế tổng hợp như chloramphenicol Do đó sự nuôi cấy E.coli đã cungcấp một sự sản sinh lớn phân tử pBR322 tái tổ hợp

b Vector pBR325 chứa ba marker chọn lựa.

pBR325 là plasmid pBR222 có thêm đoạn ADN Đoạn này manggen acetylcholintransferaza của chloramphenicol (CAT) một enzyme ứcchế hoạt động của chloramphenicol và như vậy kháng kháng sinh này.Gen CAT chỉ chứa vị trí enzyme cắt hạn chế E.coRI trên plasmid Như vậy

vị trí này có thể được dùng để chọn dòng những tái tổ hợp được phát hiệnbởi ức chế gài của kháng chloramphenicol, pBR325 có tiến bộ hơnpBR222 là thêm một vị trí chọn dòng và thêm một marker chọn lựa

c.Vector pATI 53-plasmid có số bản sao cao.

Vector pATI 53 là một dẫn suất khác của pBR322 nhưng trongtrường hợp này sự thay đổi không bao gồm sự cộng thêm marker chọndòng mới hay những vị trí chọn dòng bên ngoài Ngược lại, vector pATI 53đã được cấu trúc bởi sự tách ra một đoạn 700 đôi base của pBR322, trongđó có cả gen ampR và tetR nhưng làm thay đổi sự tái bản và tiếp tục tạo raplasmid pATI 53 khác với pBR322 ở hai phương diện:

- pARI 53 có số lượng bản sao cao hơn pBR322, thường có mặtkhoảng 30-45 phân tử trên một E.coli Với số lượng copy này thì dễ dàngđược phát hiện khi nghiên cứu hiệu quả của gen được chọn dòng trong tếbào chủ

- pARI 53 là một plasmid không liên tục, không trực tiếp vậnchuyển được tới tế bào E.coli khác do sự phát đi 700 đôi base đã làm pháhủy khả năng liên tục của pBR322 Điều này quan trọng đối với sự kiềmchế sinh học để tránh đi khả năng làm tẩu thoát phân tử pATK- 53 tái tổhợp từ trong các ống nghiệm

d.Vector pUC8-sự chọn dòng gen lacZ.

Vector pUC8 đã được dẫn ra từ pBR322, mặc dù trong trường hợpnày sự tái bản và gen ampR vẫn còn nguyên vẹn Một đoạn nucleotide củagen này đã bị thay đổi Tất cả những vị trí chọn dòng bây giờ đã được tụtập lại trong một đoạn ngắn của gen lacz1 Sự chọn dòng bằng gen lacz1

không thuận tiện hơn khi dùng marker kháng sinh song giá trị của nó ởchỗ là tập trung lại được các vị trí cắt hạn chế và cho phép một đoạn ADNcó hai đầu dính khác nhau được chọn dòng mà không còn chất gắn.

2.Các vector chuyển gen là phage lamda :

Phân tử ADN lamda chứa 52 kb có thể tăng lên khoàng 5% tức làkhoảng 3 kb ADN mới thêm vào nữa Nếu kích thước của phân tử lớn hơn

52 kb, thì nó không bao gói vào cấu trúc đầu lamda được và các tiểu phầnphage gây nhiễm không tiến hành được Điều đó làm hạn chế kích thướccủa đoạn ADN cài vào vector lamda

Bộ gen lamda thì quá lớn, điều đó phải có nhiều đoạn thứ tự nhậndiện đối với các enzym cắt hạn chế Song enzym cắt hạn chế không thểđược dùng để làm gãy phân tử lamda bình thường trong cái kiểu- mà kiểuđó sẽ cho phép gài ADN mới vào đó được Hình như phân tử này có thểđược cắt thành nhiều mẫu nhỏ mà những mẫu này có thể tạo thành bộ genlamda mới thay đổi do kết cấu nối trở lại

Do những khó khăn đó nên chúng ta ngạc nhiên rằng; có nhiều kiểuvector chọn dòng lamda được phát triển Việc sử dụng đầu tiên của chúnglà những mẫu ADN lớn từ 5kb đến 40kb, còn những mẫu quá lớn thì lạiđược dùng bởi plasmid hay vector M13

Dưới đây là những vector gài vào và thay thế dựa vào phage lamda

* Vector gài vào ít nhất phải có một vị trí cắt hạn chế

-Lamda (ƯEB’) : đoạn ADN mới có thể thay vào là 15kb

-Lamda EMBl4 : đoạn ADN mới có thể thay vào là 23 kb

3.Các vector chuyển gen dựa trên cosmid :

Cosmid là vector lai tạo giữa phân tử ADN phage và plasmid vikhuẩn

Cosmid về cơ bản là một plasmid mang vị trí cos Vị trí cos cần chochức phận bao gói của phage Cosmid thiếu các gen lamda nên không sảnxuất plaque

Thí nghiệm chọn dòng với cosmid thì được giản ra như sau : cosmidmở ra một vị trí cắt hạn chế và những đoạn ADN mới được gài vào.Những đoạn này thì được sản xuất bằng enzyme cắt hạn chế và được dẫnvào cosmid Sự kết nối được giản ra Sau đó ADN cosmid tái tổ hợp đượcbao gói và làm nhiễm E.coli mặc dù vòng plaque không được hình thành.

Cosmid được dùng để thuần hóa những đoạn ADN lớn có khi tới40kb Khả năng này đã làm dấy lênvấn đề thư viện genom hay còn gọi làthư viện bộ gen Thư viện bộ gen là một bộ của dòng tái tổ hợp-mà dòngđó chứa tất cả các ADN có mặt trong một cơ thể riêng lẻ, chẳng hạn thưviện bộ gen E.coli chứa tất cả những gen E.coli Các cơ thể có thư viện bộgen được giới thiệu ở bảng sau :

Số lượng các dòng gen có mặt trong thư viện bộ gen của các cá thể Các cá thể khác nhau Kích thước bộ

gen (đôi base)

Số đoạn dài 17 kb (1)

Số đoạn dài 35 kb (2)

(1) đoạn 17 kb có thể dùng vector lamda EMB L4 nhân dòng

(1) đoạn 35 kb có thể dùng vector cosmid nhân dòng

Những thư viện này có thể giữ lại nhiều năm, có thể gửi cho nhau từnhóm nghiên cứu này tới nhóm nghiên cứu khác Điều đó giupù cho sự pháttriển nghiên cứu nhanh chóng trong lĩnh vực sinh học phân tử

4.Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men :

Nấm men S.cerevisiae là một trong những cơ thể quan trọng nhấttrong kỹ thuật di truyền Vector có cấu trúc vòng 2 micromet, kích thước6kb tồn tại trong tế bào nấâm men và có số luợng bản sao từ 70 đến 200.Dùng gen leu.2 như là marker chọn lọc Vector được dẫn ra từ vòng 2micromet gọi là plasmid episom nấm men Sự cải tiến plasmid này quanhiều bước dẫn đến tạo thành nhiễm sắc thể nhân tạo ở nấm men gọi tắtYAC (yeast artificial chromosome)