Đặc điểm đột biến gen f9 trên người bệnh hemophilia b và tình trạng mang gen của các thành viên trong gia đình người bệnh tại viện huyết học – truyền máu trung ương giai đoạn 2020 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO – BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CƠNG CỘNG VŨ THỊ BÍCH HƯỜNG H P ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN F9 TRÊN NGƯỜI BỆNH HEMOPHILIA B VÀ TÌNH TRẠNG MANG GEN CỦA CÁC THÀNH VIÊN TRONG GIA ĐÌNH NGƯỜI BỆNH TẠI VIỆN HUYẾT HỌC – TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG GIAI ĐOẠN 2020 - 2021 U H LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 8720601 Hà Nội, 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO – BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG VŨ THỊ BÍCH HƯỜNG H P ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN F9 TRÊN NGƯỜI BỆNH HEMOPHILIA B VÀ TÌNH TRẠNG MANG GEN CỦA CÁC THÀNH VIÊN TRONG GIA ĐÌNH NGƯỜI BỆNH TẠI VIỆN HUYẾT HỌC – TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG GIAI ĐOẠN 2020 - 2021 U LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 8720601 H NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS DƯƠNG QUỐC CHÍNH Hà Nội, 2022 i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh hemophilia B H P 1.1.1 Khái quát bệnh 1.1.2 Đặc điểm di truyền bệnh .5 1.1.3 Phương pháp chẩn đoán bệnh hemophilia B 1.1.3.1 Chẩn đoán xác định bệnh 1.1.3.2 Chẩn đoán mức độ bệnh U 1.1.3.3 Chẩn đoán người mang gen bệnh 1.2 Cấu trúc gen F9 đặc điểm đột biến gen 1.2.1 Cấu trúc gen F9 H 1.2.2 Đặc điểm đột biến gen F9 10 1.2.2.1 Các đột biến đơn nucleotide 10 1.2.2.2 Đột biến dẫn đến kiểu hình bệnh hemophilia B Leyden 12 1.2.2.3 Các đột biên đoạn, chèn đoạn nhỏ 13 1.2.2.4 Các đột biến đoạn/chèn đoạn gen lớn 14 1.3 Phương pháp phân tích đột biến gây bệnh hemophilia B 14 1.3.1 Giải trình tự gen F9 kỹ thuật giải trình tự Sanger 15 1.3.2 Kỹ thuật MLPA phát đoạn/lặp đoạn gen F9 15 1.4 Một số nghiên cứu đột biến gen F9 người bệnh hemophilia B 17 1.4.1 Trên giới 17 1.4.2 Tại Việt Nam 18 1.5 Đặc điểm địa bàn nghiên cứu 20 ii Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.1.1 Hồ sơ bệnh án người bệnh hemophilia B 21 2.1.2 Hồ sơ xét nghiệm mẹ ruột, chị/em gái ruột người bệnh 21 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 22 2.3 Thiết kế nghiên cứu 22 2.4 Cỡ mẫu 22 2.5 Trình bày phương pháp chọn mẫu 23 2.6 Trình bày phương pháp thu thập số liệu 23 2.7 Các biến số nghiên cứu 23 H P 2.8 Các khái niệm, quy trình kỹ thuật, kiểm sốt chất lượng, 23 2.8.1 Bệnh phẩm 23 2.8.2 Hóa chất thực nghiên cứu 24 Bảng 2.1: Trình tự mồi khuếch đại gen F9 theo phương pháp Vidal 24 2.8.3 Vật tư – Trang thiết bị .25 U 2.8.4 Quy trình kỹ thuật sử dụng nghiên cứu .25 2.8.5 Kiểm soát chất lượng 30 2.8.6 Đánh giá kết xét nghiệm 30 H 2.9 Phương pháp phân tích liệu 31 2.9.1 Phân tích liệu giải trình tự gen Sanger .31 2.9.2 Phân tích kết MLPA 32 2.9.3 Xử lý, thống kê liệu 32 2.10 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 33 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34 3.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 34 3.2 Đặc điểm đột biến gen F9 người bệnh hemophilia B 34 3.2.1 Tỷ lệ phân tích đột biến thành cơng theo kỹ thuật sử dụng 34 3.2.2 Kết phân tích đột biến 36 3.2.3 Kết phân tích đột biến gen người bệnh hemophilia B 40 3.2.4 Đặc điểm đột biến gen gặp người bệnh nghiên cứu 43 iii 3.3 Kết xác định tình trạng mang gen bệnh thành viên gia đình 45 3.3.1 Một số đặc điểm thành viên gia đình người bệnh 45 3.3.2 Đặc điểm đột biến gen người bệnh 28 gia đình 46 3.3.3 Kết xác định tình trạng mang gen bệnh thành viên gia đình 47 3.3.4 Đặc điểm nhóm mang gen bệnh không mang gen bệnh 49 3.3.5 Đặc điểm đột biến người mang gen bệnh 50 Chương 4: BÀN LUẬN 51 4.1 Đặc điểm người bệnh nghiên cứu 51 4.2 Đặc điểm đột biến gen F9 người bệnh hemophilia B 52 4.2.1 Tỷ lệ phân tích thành cơng đột biến gen theo kỹ thuật 52 H P 4.2.2 Kết phân tích đột biến 54 4.2.3 Kết phân tích đột biến gen người bệnh hemophilia B 55 4.2.4 Đặc điểm đột biến gen gặp người bệnh nghiên cứu 56 4.3 Kết xác định tình trạng mang gen bệnh thành viên gia đình 59 4.3.1 Đặc điểm người bệnh thành viên gia đình 59 U 3.3.2 Đặc điểm đột biến gen người bệnh nghiên cứu 59 3.3.3 Kết xác định trình trạng mang gen thành viên gia đình 60 3.3.4 Đặc điểm nhóm mang gen bệnh không mang gen bệnh 61 H 3.3.5 Đặc điểm đột biến gen người mang gen bệnh 62 KẾT LUẬN 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT FIX Yếu tố IX Hemophilia B Bệnh lý rối loạn đông máu thiếu hụt yếu tố IX F9 Gen mã hóa yếu tố IX (gen F9) ADN Axit Deoxyribonucleic PCR Phản ứng tổng hợp chuỗi MLPA Phương pháp phân tích đột biến đoạn/lặp đoạn lớn dựa phát số lượng bất thường Kb Đơn vị đo chiều dài ADN 5’UTR Vùng khơng mã hóa đầu 5’ 3’UTR Vùng khơng mã hóa đầu 3’ WHO Tổ chức Y tế giới EAHDA Hiệp hội bệnh hemophilia rối loạn đông máu Châu Âu UKHCDO H P Tổ chức bác sỹ thuộc Trung tâm hemophilia Vương quốc U Anh CDC Trung tâm kiểm sốt phịng chống bệnh dịch Mỹ HGVS Hiệp hội biến đổi gen người PolyPhen-2 Phần mềm dự đoán tác động biến đổi axit amin đến cấu SIFT trúc chức phân tử protein H v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Kích thước exon intron gen F9 người Bảng 2.1: Trình tự mồi khuếch đại gen F9 theo phương pháp Vidal 24 Bảng 3.2: Kết phát đột biến theo kỹ thuật sử dụngError! Bookmark not defined Bảng 3.3: Đặc điểm bất thường di truyền 112 người bệnh 36 Bảng 3.4: Đặc điểm bất thường di truyền phát nghiên cứu 40 Bảng 3.5: Danh sách 66 đột biến gen khác phát nghiên cứu 41 Bảng 3.6: Kiểu đột biến gen gặp nghiên cứu 44 Bảng 3.7 Tương quan kiểu đột biến gen mức độ bệnh 45 H P Bảng 3.8: Đặc điểm thành viên gia đình người bệnh 45 Bảng 3.9 Kết phân tích đột biến gen thành viên gia đình người bệnh 48 Bảng 3.10: Kết phân tích tình trạng mang gen bệnh 49 Bảng 3.11 Đặc điểm nhóm mang gen bệnh khơng mang gen bệnh 49 Bảng 3.12 Nguồn gốc đột biến người bệnh gia đình 49 U Bảng 3.13: Đặc điểm đột biến người mang gen bệnh 50 Bảng 4.1 Tỷ lệ đột biến số nghiên cứu giới 56 H vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ di truyền bẩm sinh bệnh hemophilia B Hình 1.2: Cấu trúc gen F9 người 10 Hình 1.3: Kiểu đột biến tỷ lệ đột biến bệnh hemophilia B 12 Hình 1.4: Vị trí đột biến liên dẫn đến kiểu hình hemophilia Leyden mã 13 Hình 1.5: Kết phân tích đoạn gen kỹ thuật MLPA 16 Hình 3.1 Kết PCR gen F9 người bệnh nghi ngờ có đoạn gen 35 Hình 3.2 Kết phân tích kỹ thuật MLPA mẫu H14, H94, H97 35 Hình 3.3 Phân bố đột biến gen F9 44 H P H U vii TÓM TẮT NGHIÊN CỨU Hemophilia B bệnh lý rối loạn chảy máu di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể X thiếu hụt yếu tố IX Xác định đột biến gây bệnh có vai trị quan trọng chẩn đốn người mang gen, chẩn đoán trước sinh dự đoán nguy tạo chất ức chế Mục tiêu nghiên cứu: 1) Mô tả đặc điểm đột biến gen F9 người bệnh hemophilia B kỹ thuật giải trình tự gen Sanger MLPA Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương giai đoạn 2020 – 2021; 2) Bước đầu phân tích tình trạng mang gen bệnh cho số thành viên gia đình dựa đặc điểm đột biến gen H P thu người bệnh Đối tượng nghiên cứu: 112 hồ sơ bệnh án người bệnh hemophilia B điều trị Trung tâm hemophilia, Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương 33 hồ sơ xét nghiệm đột biến gen F9 thành viên gia đình người bệnh (bao gồm mẹ ruột, chị, em gái người bệnh) Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thiết kế theo phương pháp hồi cứu, thu thập số liệu từ hồ sơ bệnh án Số U liệu phân tích phần mềm Excel 365 Các biến số định lượng trình bày theo giá trị trung bình độ lệch chuẩn X ± SD Các biến số rời rạc mô tả theo bảng phân phối tần số tỷ lệ phần trăm Kết nghiên cứu: Nghiên cứu H mô tả thành công đặc điểm đột biến gen F9 112 người bệnh hemophilia B thông qua liệu phân tích đột biến gen kỹ thuật giải trình tự Sanger MLPA Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương giai đoạn 2020 – 2021 Có 66 đột biến gen khác phát 112 người bệnh hemophilia B nghiên cứu, có 17 đột biến Kiểu đột biến gen đa dạng với loại tổn thương di truyền gen F9 bao gồm đột biến điểm, đột biến chèn đoạn, đột biến đoạn lớn, đột biến đoạn nhỏ Trong đó, đột biến điểm chiếm tỷ lệ cao nhất, 87.88% Phân bố đột biến chủ yếu tập trung exon (89,39%), đột biến intron chiếm 10,61% Trong số exon gen F9, exon vùng gen xảy đột biến nhiều với 29/66 đột biến, chiếm 43,94% Về tương quan kiểu đột biến gen mức độ bệnh người bệnh nghiên cứu, nhận thấy dạng đột biến tác động lớn đến cấu trúc chức gen đột biến dịch khung đọc, đột biến vô nghĩa, đột biến viii đoạn gặp người bệnh mức độ nặng, khơng có người bệnh mức độ nhẹ hay trung bình nghiên cứu mang dạng đột biến Nhìn chung, đặc điểm đột biến gen F9 người bệnh nghiên cứu tương đồng với nghiên cứu giới Nghiên cứu bước đầu phân tích thành cơng tình trạng mang gen bệnh cho 33 thành viên đến từ 28 gia đình người bệnh hemophilia B Kết phân tích phát 21/33 thành viên mang gen bệnh, 12/33 thành viên không mang gen bệnh Đáng lứu ý 21 người mang gen bệnh có 13 người mang đột biến gen liên quan đến bệnh mức độ nặng người mang đột biến liên quan đến bệnh mức độ trung bình Tỷ lệ hemophillia B đơn phát gia đình nghiên cứu 28,57% H P Khuyến nghị: Nên phân tích tình trạng mang gen bệnh cho tất thành viên nữ gia đình người bệnh nghiên cứu Tư vấn, chẩn đoán trước sinh cho người xác định mang gen bệnh hemophilia B để giúp họ có hội sinh khỏe mạnh U H 74 PHỤ LỤC 02 ĐỊNH NGHĨA BIẾN SỐ NGHIÊN CỨU TT Tên biến Định nghĩa biến Tuổi Phân loại Phương pháp Lấy năm trừ năm biến thu thập Rời rạc Hồi cứu số liệu từ hồ sơ bệnh sinh án, hồ sơ xét nghiệm Giới tính Giới tính thật Định danh Hồi cứu số liệu cước công dân Mức độ bệnh từ hồ sơ bệnh H P án, hồ sơ xét nghiệm Người bệnh mức độ nặng Định danh Hồi cứu số liệu với nồng độ yếu tố IX