(LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố IX ở người bệnh hemophilia b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ VŨ THỊ BÍCH HƯỜN G NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN VÀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN TRÊN GEN MÃ HÓA YẾU TỐ IX Ở BỆNH NHÂN HEMOPHILIA B LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC H N ộ i , 2 an an tien si TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - VŨ TH Ị BÍ CH HƯỜNG NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN VÀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN TRÊN GEN MÃ HĨA YẾU TỐ IX Ở BỆNH NHÂN HEMOPHILIA B : Di truyền học Chuyên ngành Mã số:9420121 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS DƯ ƠN G QU ỐC CHÍ NH V H h T n T P G S T S Đ Ồ N G V Ă N Q U Y Ề N V C n s h H N , 2 an an tien si TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com ii LỜI CAM ĐOAN Tơi Vũ Thị Bích Hường, nghiên cứu sinh khóa II, năm 2016, chuyên ngành Di truyền học, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn hai thầy TS Dương Quốc Chính PGS.TS Đồng Văn Quyền Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Người viết cam đoan NCS Vũ Thị Bích Hường an an tien si TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com iii LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Đảng Ủy, Ban Lãnh đạo Viện Huyết học – Truyền máu TW cho phép dự tuyển, tham gia khóa đào tạo Tiến sĩ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc đến TS Dương Quốc Chính, Phó trưởng môn Huyết học – Truyền máu, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội; Trưởng khoa Di truyền & Sinh học phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu TW, người Thầy định hướng nghiên cứu, trực tiếp hướng dẫn thực nghiên cứu; hỗ trợ tơi suốt q trình học tập tạo điều kiện tốt sở vật chất để tơi thực hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc đến PGS.TS Đồng Văn Quyền, Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người Thầy tận tình hướng dẫn, bảo, truyền đạt cho tơi kiến thức kinh nghiệm quý báu trình học tập nghiên cứu khoa học tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Thị Mai, Giám đốc Trung tâm hemophilia; bác sỹ, điều dưỡng Trung tâm hemophilia, Viện Huyết học – Truyền máu TW; tập thể cán khoa Tiếp nhận máu hợp tác hỗ trợ tơi q trình thu thập mẫu nghiên cứu Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bệnh nhân hemophilia B, người nhà bệnh nhân người hiến máu giúp đỡ để tơi có số liệu luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: - Ban giám đốc, Phòng đào tạo Học viện Khoa học Công nghệ; Khoa Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện thuận lợi, hỗ trợ giúp đỡ suốt trình học tập thực luận án - Các thầy cô tham gia giảng dạy chuyên ngành Di truyền học, truyền đạt kiến thức q báu cho tơi q trình học tập an an tien si TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com iv - ThS Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào tạo, Viện Cơng nghệ sinh học tận tình hướng dẫn tơi để hồn thành thủ tục hành suốt q trình học tập Học viện Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp yêu quý Khoa Di truyền & Sinh học phân tử, Viện Huyết học – Truyền máu TW sẵn sàng hỗ trợ, chia sẻ với suốt q trình thực hiên nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin chân thành biết ơn gia đình ln bên tôi, cổ vũ, động viên chỗ dựa vững để yên tâm học tập thực luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Người viết cam đoan NCS Vũ Thị Bích Hường an an tien si TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ii LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC v DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH x DANH MỤC BẢNG ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bệnh hemophilia B 1.1.1 Một số dấu mốc lịch sử phát nghiên cứu bệnh hemophilia B 1.1.2 Khái quát bệnh hemophilia B 1.2 Cấu trúc chức yếu tố IX trình đơng máu 10 1.2.1 Các yếu tố đông máu 10 1.2.2 Vai trò yếu tố IX q trình đơng máu 11 1.2.3 Cấu trúc yếu tố IX q trình hoạt hóa yếu tố IX 13 1.2.4 Mối tương tác yếu tố IX với nhân tố hoạt hóa đồng yếu tố 15 1.3 Phân tích di truyền bệnh hemophilia B 18 1.3.1 Vai trò phân tích di truyền bệnh hemophilia B 18 1.3.2 Đặc điểm đột biến gen F9 19 1.3.3 Đặc điểm đa hình nucleotide liên kết với gen F9 27 1.4 Các kỹ thuật phân tích di truyền bệnh hemophilia B 30 1.4.1 Kỹ thuật phân tích đột biến 31 1.4.2 Kỹ thuật phân tích liên kết 36 1.5 Tình hình nghiên cứu biến đổi di truyền gen F9 38 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 38 1.5.2 Tình hình nghiên cứu nước 42 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 2.1 Đối tượng nghiên cứu 45 2.2 Phương pháp nghiên cứu 46 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 46 an an tien si TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com vi 2.2.2 Cơng thức tính cỡ mẫu nghiên cứu đa hình nucleotide 46 2.2.3 Các bước nghiên cứu 46 2.3 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 50 2.3.1 Hóa chất 50 2.3.2 Vật tư – Trang thiết bị 51 2.4.1 Thu thập mẫu nghiên cứu 52 2.4.2 Tách chiết ADN 52 2.4.3 Thiết kế trình tự mồi để khuếch đại gen tổng hợp yếu tố IX 52 2.4.4 Khuếch đại phân đoạn a1-a8 kỹ thuật Longrange PCR .53 2.4.5 Tinh sản phẩm Longrange PCR khuếch đại vùng gen F9 54 2.4.7 Khẳng định kết giải trình tự gen F9 NGS 55 2.4.8 Khẳng định đoạn/lặp đoạn gen F9 kỹ thuật MLPA 56 2.4.9 Phân tích đột biến gen từ liệu giải trình tự 56 2.4.10 Phân tích đa hình nucleotide gen F9 từ liệu giải trình tự 58 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 60 3.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 60 3.1.2 Chuẩn bị vật liệu nghiên cứu 61 3.2 Xây dựng quy trình giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX 62 3.2.1 Thiết kế mồi khuếch đại toàn gen F9 62 3.2.2 Tối ưu quy trình LR- PCR khuếch đại vùng gen F9 63 3.2.3 Chuẩn bị thư viện ADN 67 3.2.4 Giải trình tự với quy trình NGS tối ưu 68 3.2.5 Khẳng định kết giải trình tự NGS 70 3.3 Giải trình tự gen F9 mẫu nghiên cứu 73 3.4 Phân tích đột biến gen 100 bệnh nhân nghiên cứu 76 3.5.1 Kiểu đột biến gen 80 3.5.2 Tác động đột biến đến cấu trúc, hoạt động gen 80 3.5.3 Đánh giá mức độ lặp lại đột biến bệnh nhân nghiên cứu 81 3.6 Tương quan kiểu đột biến gen mức độ bệnh 82 3.7 Lập đồ đột biến gen F9 bệnh nhân hemophilia B Việt Nam .83 3.7.1 Phân bố đột biến gen F9 83 3.7.2 Phân bố đột biến domain phân tử FIX 84 an an tien si TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com vii 3.7.3 Bản đồ đột biến gen F9 bệnh nhân hemophilia B Việt Nam 3.8 Phân tích đa hình nucleotide gen F9 3.8.1 Khảo sát đa hình nucleotide gen mã hoá yếu tố IX 3.8.2 Tần suất alen đa hình quần thể người bình thường 3.8.3 Phân tích liên kết đa hình nucleotide 3.8.4 Lựa chọn đa hình có giá trị thông tin cao 3.8.5 Xác nhận hiệu đa hình gia đình người bệnh CHƯƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 4.2 Xây dựng quy trình NGS giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX 4.2.1 Thiết kế mồi khuếch đại gen F9 4.2.2 Tối ưu quy trình LR-PCR khuếch đại vùng gen F9 4.2.3 Chuẩn bị thư viện ADN 4.2.4 Giải trình tự gen F9 với quy trình tối ưu 4.2.5 Đánh giá kết giải trình tự NGS 4.3 Giải trình tự gen F9 mẫu nghiên cứu 4.4 Phân tích đột biến gen 100 bệnh nhân nghiên cứu 4.5 Đặc điểm kiểu đột biến gen gặp nghiên cứu 4.6 Mối tương quan kiểu đột biến gen mức độ bệnh 4.7 Bản đồ đột biến gen F9 bệnh nhân hemophilia B Việt Nam 4.7.1 Phân bố đột biến gen F9 4.7.2 Phân bố đột biến phân tử protein yếu tố IX 4.8 Đa hình di truyền gen F9 4.8.1 Khảo sát đa hình nucleotide gen F9 4.8.2 Tần suất alen đa hình nghiên cứu 4.8.3 Phân tích mối liên kết di truyền đa hình nucleotide 4.8.4 Lựa chọn đa hình có giá trị thông tin cao 4.8.5 Khẳng định hiệu đa hình KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI TÀI LIỆU THAM KHẢO an an tien si TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com TT an an tien si TT 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 an an tien si TT 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 an an tien si TT 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 an an tien si TT Tên mẫu 207 MG07 208 MG08 209 MG09 210 MG10 211 MG11 212 MG12 213 MG13 214 MG14 215 MG15 216 MG16 217 MG17 218 MG18 219 MG19 220 MG20 221 MG21 222 MG22 223 MG23 51 an an tien si TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com Phụ lục 02: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN F9 CỦA 100 BỆNH NHÂN HEMOPHILIA B STT Mã BN Năm Giới sinh tính HB01 1999 Nam HB02 1994 Nam HB03 2012 Nam HB04 2010 Nam HB05 2003 Nam HB06 2009 Nam HB07 1981 Nam HB08 2005 Nam HB09 2013 Nam 10 HB10 1983 Nam 11 HB11 1995 Nam 12 HB12 1988 Nam 13 HB13 1984 Nam STT Mã BN Năm Giới luan an tien si TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com sinh tính 14 HB14 2012 Nam 15 HB15 1991 Nam 16 HB16 1985 Nam 17 HB17 2015 Nam 18 HB18 1975 Nam 19 HB19 1953 Nam 20 HB20 1988 Nữ 21 HB21 1964 Nam 22 HB22 2013 23 HB23 1984 Nam 24 HB24 1980 Nam 25 HB25 2000 Nam 26 HB26 1998 Nam 27 HB27 1981 Nam 28 HB28 1989 Nam 29 HB29 2012 Nam 30 HB30 2013 Nam STT Mã BN Năm Giới luan an tien si Nam FIX 0.4 sinh tính 31 HB31 1980 Nam 32 HB32 1998 Nam 33 HB33 1985 Nam 34 HB34 1955 Nam 35 HB35 1977 Nam 36 HB36 2015 Nam 37 HB37 2006 Nam 38 HB38 2007 Nam 39 HB39 2005 Nam 40 HB40 2005 Nam 41 HB41 1980 Nam 42 HB42 2015 Nam 43 HB43 1980 Nam 44 HB44 1990 Nam 45 HB45 1992 Nam 46 HB46 2010 Nam 54 luan an tien si TIEU LUAN MOI download : skknchat123@gmail.com Năm Giới sinh tính HB47 1976 Nam 48 HB48 1980 Nam 49 HB49 1970 Nam 50 HB50 1989 Nam 51 HB51 2016 Nam 52 HB52 2003 Nam 53 HB53 1991 Nam 54 HB54 1990 Nam 55 HB55 2012 Nam 56 HB56 2009 Nam 57 HB57 1975 Nam 58 HB58 2008 Nam 59 HB59 2011 Nam 60 HB60 1981 Nam 61 HB61 2012 Nam STT Mã BN 47 62 HB62 1993 Nam 63 HB63 1993 Nam 64 HB64 2012 Nam luan an tien si Năm Giới sinh tính HB65 2007 Nam 66 HB66 1981 Nam 67 HB67 1985 Nam 68 HB68 1950 Nam 69 HB69 1998 Nam 70 HB70 2015 Nam 71 HB71 2011 Nam 72 HB72 2015 Nam 73 HB73 2012 Nam 74 HB74 2014 Nam 75 HB75 1997 Nam 76 HB76 1948 Nam 77 HB77 2000 Nam 78 HB78 2009 Nam 79 HB79 1992 Nam 80 HB80 1973 Nam STT Mã BN 65 81 HB81 luan an tien si 2004 Nam STT Mã BN Năm Giới sinh tính 82 HB82 2008 Nam 83 HB83 1998 Nam 84 HB84 2017 Nam 85 HB85 2012 Nam 86 HB86 2017 Nam 87 HB87 1980 Nam 88 HB88 2004 Nam 89 HB89 2006 Nam 90 HB90 2017 Nam 91 HB91 2006 Nam 92 HB92 2011 Nam 93 HB93 2014 Nam 94 HB94 2014 Nam 95 HB95 2014 Nam 96 HB96 2002 Nam 97 HB97 2011 Nam 98 HB98 2017 Nam 99 HB99 2018 Nam 100 HB100 2012 Nam luan an tien si ... tích đột biến gen 100 b? ??nh nhân nghiên cứu 4.5 Đặc điểm kiểu đột biến gen gặp nghiên cứu 4.6 Mối tương quan kiểu đột biến gen mức độ b? ??nh 4.7 B? ??n đồ đột biến gen F9 b? ??nh nhân hemophilia B. .. [60]; đột biến g.-35 G >A Ala317Val Ireland [61] 1.3.2.3 Đột biến dẫn tới thể b? ??nh hemophilia B Leyden Đột biến mô tả đột biến xảy vùng gen mã hóa Đột biến dẫn đến kiểu hình hemophilia B Leyden đột. .. thực để tìm hiểu đa hình nucleotide gen F9 người Việt Nam; nghiên cứu đột biến gen F9 liên quan đến b? ??nh hemophilia B tiến hành vài nghiên cứu cỡ mẫu chưa nhiều liệu đột biến gen b? ??nh nhân thiếu