Nghiên cứu đột biến và đa hình di truyền trên gen mã hóa yếu tố IX ở người bệnh hemophilia b

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN VÀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN TRÊN GEN MÃ HÓA YẾU TỐ IX Ở BỆNH NHÂN HEMOPHILIA B LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN VÀ ĐA HÌNH DI TRUYỀN TRÊN GEN MÃ HÓA YẾU TỐ IX Ở BỆNH NHÂN HEMOPHILIA B Chuyên ngành : Di truyền học Mã số : 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: Hà Nội, 2022 ii LỜI CAM ĐOAN Tơi , nghiên cứu sinh khóa II, năm 2016, chuyên ngành Di truyền học, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn hai thầy TS Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Người viết cam đoan NCS iii LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Đảng Ủy, Ban Lãnh đạo Viện Huyết học – Truyền máu TW cho phép dự tuyển, tham gia khóa đào tạo Tiến sĩ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến TS , Phó trưởng mơn Huyết học – Truyền máu, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội; Trưởng khoa Di truyền & Sinh học phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu TW, người Thầy định hướng nghiên cứu, trực tiếp hướng dẫn thực nghiên cứu; hỗ trợ tơi suốt q trình học tập tạo điều kiện tốt sở vật chất để thực hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc đến PGS TS , Phó Viện trưởng Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người Thầy tận tình hướng dẫn, bảo, truyền đạt cho kiến thức kinh nghiệm quý báu trình học tập nghiên cứu khoa học tạo điều kiện thuận lợi giúp hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS , Giám đốc Trung tâm hemophilia; bác sỹ, điều dưỡng Trung tâm hemophilia, Viện Huyết học – Truyền máu TW; tập thể cán khoa Tiếp nhận máu hợp tác hỗ trợ tơi q trình thu thập mẫu nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến bệnh nhân hemophilia B, người nhà bệnh nhân người hiến máu giúp đỡ để tơi có số liệu luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: - Ban giám đốc, Phòng đào tạo Học viện Khoa học Công nghệ; Khoa Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện thuận lợi, hỗ trợ giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực luận án - Các thầy cô tham gia giảng dạy chuyên ngành Di truyền học, truyền đạt kiến thức q báu cho tơi q trình học tập iv - ThS , chuyên viên phụ trách đào tạo, Viện Cơng nghệ sinh học tận tình hướng dẫn tơi để hồn thành thủ tục hành suốt q trình học tập Học viện Tơi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp yêu quý Khoa Di truyền & Sinh học phân tử, Viện Huyết học – Truyền máu TW sẵn sàng hỗ trợ, chia sẻ với tơi suốt q trình thực hiên nghiên cứu Cuối cùng, xin chân thành biết ơn gia đình ln bên tơi, cổ vũ, động viên chỗ dựa vững để yên tâm học tập thực luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Người viết cam đoan NCS v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ii LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC v DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH x DANH MỤC BẢNG ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 Tổng quan bệnh hemophilia B 1 Một số dấu mốc lịch sử phát nghiên cứu bệnh hemophilia B 1 Khái quát bệnh hemophilia B Cấu trúc chức yếu tố IX q trình đơng máu 10 Các yếu tố đông máu 10 2 Vai trị yếu tố IX q trình đông máu 11 Cấu trúc yếu tố IX q trình hoạt hóa yếu tố IX 13 Mối tương tác yếu tố IX với nhân tố hoạt hóa đồng yếu tố 15 Phân tích di truyền bệnh hemophilia B 18 Vai trị phân tích di truyền bệnh hemophilia B 18 Đặc điểm đột biến gen F9 19 3 Đặc điểm đa hình nucleotide liên kết với gen F9 27 Các kỹ thuật phân tích di truyền bệnh hemophilia B 30 Kỹ thuật phân tích đột biến 31 Kỹ thuật phân tích liên kết 36 Tình hình nghiên cứu biến đổi di truyền gen F9 38 Tình hình nghiên cứu giới 38 Tình hình nghiên cứu nước 42 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 Đối tượng nghiên cứu 45 2 Phương pháp nghiên cứu 46 2 Thiết kế nghiên cứu 46 vi 2 Công thức tính cỡ mẫu nghiên cứu đa hình nucleotide 46 2 Các bước nghiên cứu 46 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 50 Hóa chất 50 Vật tư – Trang thiết bị 51 Thu thập mẫu nghiên cứu 52 Tách chiết ADN 52 Thiết kế trình tự mồi để khuếch đại gen tổng hợp yếu tố IX 52 4 Khuếch đại phân đoạn a1-a8 kỹ thuật Longrange PCR 53 Tinh sản phẩm Longrange PCR khuếch đại vùng gen F9 54 Khẳng định kết giải trình tự gen F9 NGS 55 Khẳng định đoạn/lặp đoạn gen F9 kỹ thuật MLPA 56 Phân tích đột biến gen từ liệu giải trình tự 56 10 Phân tích đa hình nucleotide gen F9 từ liệu giải trình tự 58 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 60 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 60 Chuẩn bị vật liệu nghiên cứu 61 Xây dựng quy trình giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX 62 Thiết kế mồi khuếch đại toàn gen F9 62 2 Tối ưu quy trình LR- PCR khuếch đại vùng gen F9 63 3 Chuẩn bị thư viện ADN 67 Giải trình tự với quy trình NGS tối ưu 68 Khẳng định kết giải trình tự NGS 70 3 Giải trình tự gen F9 mẫu nghiên cứu 73 Phân tích đột biến gen 100 bệnh nhân nghiên cứu 76 Kiểu đột biến gen 80 Tác động đột biến đến cấu trúc, hoạt động gen 80 Đánh giá mức độ lặp lại đột biến bệnh nhân nghiên cứu 81 Tương quan kiểu đột biến gen mức độ bệnh 82 Lập đồ đột biến gen F9 bệnh nhân hemophilia B Việt Nam 83 Phân bố đột biến gen F9 83 Phân bố đột biến domain phân tử FIX 84 vii Bản đồ đột biến gen F9 bệnh nhân hemophilia B Việt Nam 84 Phân tích đa hình nucleotide gen F9 Khảo sát đa hình nucleotide gen mã hoá yếu tố IX Tần suất alen đa hình quần thể người bình thường Phân tích liên kết đa hình nucleotide Lựa chọn đa hình có giá trị thơng tin cao Xác nhận hiệu đa hình gia đình người bệnh CHƯƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Chuẩn bị mẫu nghiên cứu Xây dựng quy trình NGS giải trình tự gen mã hóa yếu tố IX 11 Thiết kế mồi khuếch đại gen F9 11 2 Tối ưu quy trình LR-PCR khuếch đại vùng gen F9 12 Chuẩn bị thư viện ADN 14 4 Giải trình tự gen F9 với quy trình tối ưu 14 Đánh giá kết giải trình tự NGS 15 Giải trình tự gen F9 mẫu nghiên cứu 15 4 Phân tích đột biến gen 100 bệnh nhân nghiên cứu 16 Đặc điểm kiểu đột biến gen gặp nghiên cứu 20 Mối tương quan kiểu đột biến gen mức độ bệnh 21 Bản đồ đột biến gen F9 bệnh nhân hemophilia B Việt Nam 22 Phân bố đột biến gen F9 22 Phân bố đột biến phân tử protein yếu tố IX 23 Đa hình di truyền gen F9 26 Khảo sát đa hình nucleotide gen F9 26 Tần suất alen đa hình nghiên cứu 28 Phân tích mối liên kết di truyền đa hình nucleotide 30 Lựa chọn đa hình có giá trị thông tin cao 31 Khẳng định hiệu đa hình 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ 37 CĨ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt FIX Tên đầy đủ Factor IX Chú thích Yếu tố IX Hemophilia Bệnh lý rối loạn đông máu thiếu B hụt FIX F9 Gen mã hóa yếu tố IX DNA Deoxyribonucleic Acid Phân tử ADN PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng tổng hợp chuỗi LD-PCR Long Distance PCR Phản ứng tổng hợp chuỗi dài NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự hệ Restriction Fragment Length Đa hình chiều dài đoạn cắt giới Polymorphism hạn Multiplex Ligation-dependent Phương pháp multiplex PCR phát Probe Amplification số lượng bất thường Kb Kilo base Đơn vị đo chiều dài ADN SNP Single nucleotide polymorphism Đa hình đơn nucleotide VNTR Variable Number Tandem Repeat Các trình tự ADN lặp lại ngắn 5’UTR 5′ Untranslated Region Vùng khơng mã hóa đầu 5’ 3’UTR 3′ Untranslated Region Vùng khơng mã hóa đầu 3’ WHO World Health Organization Tổ chức Y tế giới RFLP MLPA EAHDA European Association for Haemophilia and Allied Disorders UKHCDO CDC HGVS Hiệp hội bệnh hemophilia rối loạn đông máu Châu Âu United Kingdom Haemophilia Tổ chức bác sỹ thuộc Trung tâm Centre Doctors’ Organisation hemophilia Vương quốc Anh The Centers for Disease Control Trung tâm kiểm sốt phịng chống and Prevention bệnh dịch Human Genome Variation Society PolyPhen-2 Polymorphism Phenotyping v2 SIFT Sorting Intolerant From Tolerant Hiệp hội biến đổi gen người Phần mềm dự đoán tác động biến đổi axit amin đến cấu trúc chức phân tử protein ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Kích thước exon intron gen F9 người 14 Bảng Tần suất alen số đa hình quần thể khác 30 Bảng 1: Trình tự mồi giải trình tự gen F9 phương pháp Sanger 51 Bảng Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu 60 Bảng Kết nồng độ độ tinh số mẫu ADN 61 Bảng 3 Phân đoạn ADN trình tự mồi thiết kế 62 Bảng Thành phần phản ứng LR-PCR khuếch đại đoạn a1-a8 66 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng LR-PCR cho đoạn a1, a2, a5, a6, a7 67 Bảng Chu trình nhiệt phản ứng LR-PCR cho đoạn a3 a4 67 Bảng Chu trình nhiệt độ phản ứng LR-PCR cho đoạn a8 67 Bảng Danh sách 16 đột biến 77 Bảng Danh sách 58 đột biến phát nghiên cứu 77 Bảng 10 Đặc điểm kiểu đột biến gen gặp nghiên cứu 77 Bảng 11 Tác động đột biến đến cấu trúc, hoạt động gen 80 Bảng 12 Mức độ lặp lại đột biến bệnh nhân nghiên cứu 82 Bảng 13 Tương quan kiểu đột biến gen mức độ bệnh 82 Bảng 14 Danh sách 12 SNP phát từ liệu giải trình tự 86 Bảng 15 Tần suất alen đa hình gặp nghiên cứu 87 Bảng 16 : Thống kê đồng biểu đa hình nucleotide 88 Bảng 17 Phân nhóm SNP theo mức độ liên kết 92 Bảng 18 Bộ SNP có giá trị thông tin 92 Bảng Tỷ lệ đột biến số nghiên cứu giới 105 Bảng Tần suất alen đa hình số quần thể khác 114 Bảng Tần suất alen đa hình MseI quần thể giới 115 Bảng 4 Tần suất dị hợp tử số đa hình liên kết với gen F9 quần thể 119 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 Green, P M , et al , Molecular pathology of haemophilia B Embo j, 1989 8(4): p 1067-72 (EAHAD), E A o H a A D , Coagulation Factor IX Variant Database http://www factorix org March 2016 Saad, S , et al , First report on UK database of haemophilia B mutations and pedigrees UK Haemophilia Centres Thromb Haemost, 1994 71(5): p 56370 Liu, J Z , et al , The human factor IX gene as germline mutagen test: samples from Mainland China have the putatively endogenous pattern of mutation Hum Mutat, 2000 16(1): p 31-6 Ketterling, R P , et al , Deletions with inversions: report of a mutation and review of the literature Hum Mutat, 1993 2(1): p 53-7 Knobloch, O , et al , Recurrent mutations in the factor IX gene: founder effect or repeat de novo events Investigation of the German haemophilia B population and review of de novo mutations Hum Genet, 1993 92(1): p 408 Nielsen, L R , et al , Detection of ten new mutations by screening the gene encoding factor IX of Danish hemophilia B patients Thromb Haemost, 1995 73(5): p 774-8 Green, P M , et al , Haplotype analysis of identical factor IX mutants using PCR Thromb Haemost, 1992 67(1): p 66-9 Bottema, C D , et al , Missense mutations and evolutionary conservation of amino acids: evidence that many of the amino acids in factor IX function as "spacer" elements Am J Hum Genet, 1991 49(4): p 820-38 Koeberl, D D , et al , Mutations causing hemophilia B: direct estimate of the underlying rates of spontaneous germ-line transitions, transversions, and deletions in a human gene Am J Hum Genet, 1990 47(2): p 202-17 Driscoll, M C , E Bouhassira, and L M Aledort, A codon 338 nonsense mutation in the factor IX gene in unrelated hemophilia B patients: factor IX338 New York Blood, 1989 74(2): p 737-42 Huang, M N , et al , Molecular defect in factor IXHilo, a hemophilia Bm variant: Arg Gln at the carboxyterminal cleavage site of the activation peptide Blood, 1989 73(3): p 718-21 Thompson, A R , et al , Factor IX mutations: rapid, direct screening methods for 20 new families with hemophilia B Thromb Res, 1992 65(2): p 289-95 Taylor, S A , et al , A mutation adjacent to the beta cleavage site of factor IX (valine 182 to leucine) results in mild haemophilia Bm Br J Haematol, 1990 75(2): p 217-21 Tartary, M , et al , Detection of a molecular defect in 40 of 44 patients with haemophilia B by PCR and denaturing gradient gel electrophoresis Br J Haematol, 1993 84(4): p 662-9 Chen, S H , et al , Three point mutations in the factor IX genes of five hemophilia B patients Identification strategy using localization by altered epitopes in their hemophilic proteins J Clin Invest, 1989 84(1): p 113-8 Odom, M W , et al , Five novel point mutations: two causing haemophilia B and three causing factor X deficiency Mol Cell Probes, 1994 8(1): p 63-5 Potapov, V and J L Ong, Examining Sources of Error in PCR by SingleMolecule Sequencing PLoS One, 2017 12(1): p e0169774 43 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 Yohe, S , et al , Clinical validation of targeted next-generation sequencing for inherited disorders 2015 139(2): p 204-210 Rehm, H L , et al , ACMG clinical laboratory standards for next-generation sequencing Genet Med, 2013 15(9): p 733-47 Hartman, P , et al , Next generation sequencing for clinical diagnostics: Five year experience of an academic laboratory Mol Genet Metab Rep, 2019 19: p 100464 Zahari, M , et al , Mutational Profiles of F8 and F9 in a Cohort of Haemophilia A and Haemophilia B Patients in the Multi-ethnic Malaysian Population Mediterr J Hematol Infect Dis, 2018 10(1): p e2018056 Bottema, C D , et al , The pattern of spontaneous germ-line mutation: relative rates of mutation at or near CpG dinucleotides in the factor IX gene Hum Genet, 1993 91(5): p 496-503 Green, P , et al , Haemophilia B mutations in a complete Swedish population sample: a test of new strategy for the genetic counselling of diseases with high mutational heterogeneity 1991 78(3): p 390-397 Gao, W , et al , Characterization of missense mutations in the signal peptide and propeptide of FIX in hemophilia B by a cell-based assay Blood Adv, 2020 4(15): p 3659-3667 Bentley, A , et al , Defective propeptide processing of blood clotting factor IX caused by mutation of arginine to glutamine at position− 1986 45(3): p 343-348 Ware, J , et al , Factor IX San Dimas: Substitution of glutamine for arg− in the propeptide leads to incomplete γ-carboxylation and altered phospholipid binding properties 1989 264(19): p 11401-11406 Lodish, H and S L J B M B E Zipursky, Molecular cell biology 2001 29: p 126-133 Kojima, T , et al , Possible absence of common polymorphisms in coagulation factor IX gene in Japanese subjects 1987 Graham, J , et al , The varying frequencies of five DNA polymorphisms of Xlinked coagulant factor IX in eight ethnic groups 1991 49(3): p 537 Driscoll, M C , et al , A second BamHI DNA polymorphism and haplotype association in the factor IX gene 1988 Winship, P and I J B J H Peake, A clinically useful RFLP in the 5'flanking region of the factor IX gene 1992 80: p 26a Machado, F B , et al , Informativeness of a novel multiallelic marker-set comprising an F8 intron 21 and three tightly linked loci for haemophilia A carriership analysis Haemophilia, 2011 17(2): p 257-66 Ljung, R C J B s c h , Prenatal diagnosis of haemophilia 1996 9(2): p 243-257 Shetty, S , et al , Factor VIII and IX gene polymorphisms and carrier analysis in Indian population 1997 54(4): p 271-275 44 PHỤ LỤC Phụ lục 01: KẾT QUẢ KIỂM TRA NỒNG ĐỘ VÀ ĐỘ TINH SẠCH CỦA CÁC MẪU ADN TT Tên mẫu Nồng độ Đơn vị A260 A280 260/280 260/230 Loại mẫu HB1 108 ng/µl 176 146 19 52 DNA HB2 94 ng/µl 88 983 91 51 DNA HB3 150 ng/µl 002 569 91 51 DNA HB4 108 ng/µl 162 137 19 25 DNA HB5 93 ng/µl 859 974 91 49 DNA HB6 225 ng/µl 513 399 88 48 DNA HB7 100 ng/µl 006 059 89 46 DNA HB8 183 ng/µl 66 936 89 46 DNA HB9 188 ng/µl 774 986 19 45 DNA 10 HB10 138 ng/µl 77 474 88 44 DNA 11 HB11 164 ng/µl 298 717 92 44 DNA 12 HB12 103 ng/µl 059 082 19 43 DNA 13 HB13 113 ng/µl 273 22 86 43 DNA 14 HB14 83 ng/µl 672 881 19 42 DNA 15 HB15 125 ng/µl 517 337 88 42 DNA 16 HB16 113 ng/µl 267 171 94 41 DNA 17 HB17 175 ng/µl 517 861 89 41 DNA 18 HB18 178 ng/µl 574 898 88 41 DNA 19 HB19 94 ng/µl 881 004 87 24 DNA 20 HB20 116 ng/µl 325 23 89 24 DNA 21 HB21 144 ng/µl 881 531 88 24 DNA 22 HB22 187 ng/µl 757 953 92 24 DNA 23 HB23 188 ng/µl 777 01 88 24 DNA 24 HB24 190 ng/µl 816 997 91 24 DNA 25 HB25 104 ng/µl 087 102 89 39 DNA 26 HB26 138 ng/µl 773 454 91 39 DNA 27 HB27 157 ng/µl 155 671 89 39 DNA 28 HB28 194 ng/µl 889 043 19 39 DNA 29 HB29 85 ng/µl 703 872 95 38 DNA 30 HB30 149 ng/µl 995 594 88 38 DNA 31 HB31 169 ng/µl 395 78 91 38 DNA 45 46 TT Tên mẫu Nồng độ Đơn vị A260 A280 260/280 260/230 Loại mẫu 32 HB32 175 ng/µl 51 824 92 38 DNA 33 HB33 216 ng/µl 336 28 19 38 DNA 34 HB34 258 ng/µl 167 744 88 38 DNA 35 HB35 178 ng/µl 569 859 92 37 DNA 36 HB36 121 ng/µl 42 267 91 36 DNA 37 HB37 132 ng/µl 639 402 88 36 DNA 38 HB38 184 ng/µl 685 942 19 36 DNA 39 HB39 329 ng/µl 592 486 89 36 DNA 40 HB40 82 ng/µl 647 847 94 35 DNA 41 HB41 120 ng/µl 24 27 89 35 DNA 42 HB42 149 ng/µl 979 516 96 35 DNA 43 HB43 165 ng/µl 309 734 91 35 DNA 44 HB44 169 ng/µl 389 784 19 35 DNA 45 HB45 87 ng/µl 739 888 96 34 DNA 46 HB46 92 ng/µl 852 984 88 34 DNA 47 HB47 124 ng/µl 487 314 89 34 DNA 48 HB48 169 ng/µl 39 799 88 34 DNA 49 HB49 182 ng/µl 642 921 19 34 DNA 50 HB50 215 ng/µl 306 248 91 34 DNA 51 HB51 252 ng/µl 045 646 91 34 DNA 52 HB52 260 ng/µl 202 719 91 34 DNA 53 HB53 267 ng/µl 34 816 19 34 DNA 54 HB54 299 ng/µl 995 177 89 34 DNA 55 HB55 453 ng/µl 072 77 19 34 DNA 56 HB56 89 ng/µl 787 953 88 33 DNA 57 HB57 93 ng/µl 867 989 89 33 DNA 58 HB58 124 ng/µl 496 276 96 33 DNA 59 HB59 177 ng/µl 541 83 93 33 DNA 60 HB60 206 ng/µl 132 161 91 33 DNA 61 HB61 227 ng/µl 546 397 19 33 DNA 62 HB62 747 ng/µl 14 942 939 88 33 DNA 63 HB63 93 ng/µl 864 994 88 32 DNA 64 HB64 125 ng/µl 504 33 88 32 DNA 65 HB65 159 ng/µl 193 17 88 32 DNA 66 HB66 291 ng/µl 839 084 89 32 DNA 47 TT Tên mẫu Nồng độ Đơn vị A260 A280 260/280 260/230 Loại mẫu 67 HB67 297 ng/µl 948 146 89 32 DNA 68 HB68 467 ng/µl 349 945 89 32 DNA 69 HB69 138 ng/µl 77 456 19 31 DNA 70 HB70 175 ng/µl 501 845 19 31 DNA 71 HB71 214 ng/µl 28 261 89 31 DNA 72 HB72 221 ng/µl 438 337 19 31 DNA 73 HB73 244 ng/µl 881 506 95 31 DNA 74 HB74 258 ng/µl 161 697 91 31 DNA 75 HB75 268 ng/µl 363 81 91 31 DNA 76 HB76 275 ng/µl 512 891 91 31 DNA 77 HB77 334 ng/µl 697 526 19 31 DNA 78 HB78 408 ng/µl 173 259 92 31 DNA 79 HB79 506 ng/µl 10 122 324 19 31 DNA 80 HB80 600 ng/µl 12 011 334 19 31 DNA 81 HB81 742 ng/µl 14 848 862 89 31 DNA 82 HB82 93 ng/µl 87 986 19 23 DNA 83 HB83 100 ng/µl 008 062 89 23 DNA 84 HB84 118 ng/µl 372 231 93 23 DNA 85 HB85 119 ng/µl 396 278 87 23 DNA 86 HB86 130 ng/µl 617 394 88 23 DNA 87 HB87 142 ng/µl 844 506 89 23 DNA 88 HB88 151 ng/µl 032 567 93 23 DNA 89 HB89 172 ng/µl 447 819 19 23 DNA 90 HB90 185 ng/µl 688 456 91 29 DNA 91 HB91 189 ng/µl 797 99 91 23 DNA 92 HB92 200 ng/µl 009 108 19 23 DNA 93 HB93 220 ng/µl 403 342 88 23 DNA 94 HB94 242 ng/µl 846 556 19 23 DNA 95 HB95 246 ng/µl 926 606 89 23 DNA 96 HB96 360 ng/µl 212 767 91 23 DNA 97 HB97 409 ng/µl 18 299 19 23 DNA 98 HB98 517 ng/µl 10 355 506 88 23 DNA 99 HB99 747 ng/µl 14 958 953 88 23 DNA 100 HB100 1084 ng/µl 21 683 11 429 19 23 DNA 101 NK1 90 ng/µl 95 29 DNA 18 923 48 TT Tên mẫu Nồng độ Đơn vị A260 A280 260/280 260/230 Loại mẫu 102 NK2 93 ng/µl 388 75 94 29 DNA 103 NK3 111 ng/µl 235 177 19 29 DNA 104 NK4 119 ng/µl 38 265 88 29 DNA 105 NK5 207 ng/µl 149 179 19 29 DNA 106 NK6 207 ng/µl 15 177 91 29 DNA 107 NK7 234 ng/µl 688 456 91 29 DNA 108 NK8 234 ng/µl 699 473 19 29 DNA 109 NK9 247 ng/µl 943 538 95 29 DNA 110 NK10 247 ng/µl 95 26 19 29 DNA 111 NK11 255 ng/µl 112 669 92 29 DNA 112 NK12 276 ng/µl 531 889 91 29 DNA 113 NK13 303 ng/µl 063 211 89 29 DNA 114 NK14 305 ng/µl 115 179 92 29 DNA 115 NK15 314 ng/µl 29 268 92 29 DNA 116 NK16 363 ng/µl 261 762 93 29 DNA 117 NK17 410 ng/µl 21 274 92 29 DNA 118 NK18 629 ng/µl 12 588 687 88 29 DNA 119 NK19 752 ng/µl 15 057 955 89 29 DNA 120 NK20 798 ng/µl 15 965 403 19 29 DNA 121 NK21 158 ng/µl 167 683 88 28 DNA 122 NK22 169 ng/µl 388 75 94 28 DNA 123 NK23 198 ng/µl 963 095 89 28 DNA 124 NK24 268 ng/µl 371 854 88 28 DNA 125 NK25 280 ng/µl 613 956 19 28 DNA 126 NK26 290 ng/µl 816 082 89 28 DNA 127 NK27 324 ng/µl 482 417 19 28 DNA 128 NK28 382 ng/µl 648 048 89 28 DNA 129 NK29 426 ng/µl 534 552 87 28 DNA 130 NK30 451 ng/µl 021 751 19 28 DNA 131 NK31 474 ng/µl 486 96 91 28 DNA 132 NK32 479 ng/µl 582 041 19 28 DNA 133 NK33 99 ng/µl 997 056 89 27 DNA 134 NK34 121 ng/µl 436 29 89 27 DNA 135 NK35 170 ng/µl 415 805 89 27 DNA 136 NK36 336 ng/µl 731 502 92 27 DNA 49 TT Tên mẫu Nồng độ Đơn vị A260 A280 260/280 260/230 Loại mẫu 137 NK37 438 ng/µl 763 513 94 27 DNA 138 NK38 453 ng/µl 064 778 19 27 DNA 139 NK39 474 ng/µl 498 875 95 27 DNA 140 NK40 627 ng/µl 12 542 706 87 27 DNA 141 NK41 898 ng/µl 17 969 575 88 27 DNA 142 NK42 1395 ng/µl 27 902 14 846 88 27 DNA 143 NK43 84 ng/µl 691 889 19 26 DNA 144 NK44 90 ng/µl 809 949 91 26 DNA 145 NK45 96 ng/µl 929 992 94 26 DNA 146 NK46 143 ng/µl 861 512 89 26 DNA 147 NK47 159 ng/µl 192 666 92 26 DNA 148 NK48 186 ng/µl 739 963 19 26 DNA 149 NK49 240 ng/µl 801 491 93 26 DNA 150 NK50 321 ng/µl 419 393 89 26 DNA 151 NK51 365 ng/µl 314 844 19 26 DNA 152 NK52 586 ng/µl 11 732 18 19 26 DNA 153 NK53 138 ng/µl 777 48 88 25 DNA 154 NK54 140 ng/µl 809 499 87 25 DNA 155 NK55 152 ng/µl 046 62 88 25 DNA 156 NK56 155 ng/µl 103 633 19 25 DNA 157 NK57 217 ng/µl 354 291 19 25 DNA 158 NK58 224 ng/µl 493 344 92 25 DNA 159 NK59 240 ng/µl 809 409 2 25 DNA 160 NK60 269 ng/µl 384 825 91 25 DNA 161 NK61 317 ng/µl 35 343 19 25 DNA 162 NK62 355 ng/µl 109 651 95 25 DNA 163 NK63 1231 ng/µl 24 63 12 979 19 25 DNA 164 NK64 96 ng/µl 924 012 19 24 DNA 165 NK65 102 ng/µl 048 042 97 24 DNA 166 NK66 124 ng/µl 489 279 95 24 DNA 167 NK67 154 ng/µl 095 607 93 24 DNA 168 NK68 166 ng/µl 329 655 2 24 DNA 169 NK69 172 ng/µl 455 827 89 24 DNA 170 NK70 224 ng/µl 495 409 87 24 DNA 171 NK71 270 ng/µl 411 839 91 24 DNA 50 TT Tên mẫu Nồng độ Đơn vị A260 A280 260/280 260/230 Loại mẫu 172 NK72 271 ng/µl 435 889 88 24 DNA 173 NK73 409 ng/µl 192 313 19 24 DNA 174 NK74 497 ng/µl 942 265 89 24 DNA 175 NK75 642 ng/µl 12 853 788 89 24 DNA 176 NK76 737 ng/µl 14 741 973 85 24 DNA 177 NK77 185 ng/µl 717 937 92 23 DNA 178 NK78 364 ng/µl 281 836 19 23 DNA 179 NK79 365 ng/µl 304 878 88 23 DNA 180 NK80 619 ng/µl 12 383 414 93 23 DNA 181 NK81 921 ng/µl 18 435 887 86 23 DNA 182 NK82 113 ng/µl 264 194 19 22 DNA 183 NK83 364 ng/µl 279 763 93 22 DNA 184 NK84 364 ng/µl 288 82 91 22 DNA 185 NK85 114 ng/µl 29 196 92 21 DNA 186 NK86 156 ng/µl 126 651 89 21 DNA 187 NK87 157 ng/µl 148 674 88 21 DNA 188 NK88 176 ng/µl 523 882 87 21 DNA 189 NK89 331 ng/µl 636 508 89 21 DNA 190 NK90 401 ng/µl 021 245 89 21 DNA 191 NK91 481 ng/µl 624 135 87 21 DNA 192 NK92 699 ng/µl 13 991 558 85 21 DNA 193 NK93 94 ng/µl 883 998 89 22 DNA 194 NK94 140 ng/µl 805 465 91 22 DNA 195 NK95 155 ng/µl 099 616 92 22 DNA 196 NK96 277 ng/µl 556 965 87 22 DNA 197 NK97 89 ng/µl 799 954 89 19 DNA 198 NK98 131 ng/µl 623 371 91 19 DNA 199 NK99 180 ng/µl 602 895 19 19 DNA 200 NK100 204 ng/µl 084 151 19 19 DNA 201 MG01 254 ng/µl 15 965 403 19 19 DNA 202 MG02 546 ng/µl 10 937 634 94 19 DNA 203 MG03 110 ng/µl 213 168 19 18 DNA 204 MG04 147 ng/µl 947 15 96 18 DNA 205 MG05 170 ng/µl 407 798 89 18 DNA 206 MG06 287 ng/µl 758 028 19 18 DNA 51 TT Tên mẫu Nồng độ Đơn vị A260 A280 260/280 260/230 Loại mẫu 207 MG07 96 ng/µl 932 014 91 17 DNA 208 MG08 235 ng/µl 715 508 88 17 DNA 209 MG09 406 ng/µl 128 24 92 17 DNA 210 MG10 87 ng/µl 741 917 19 16 DNA 211 MG11 110 ng/µl 214 185 87 16 DNA 212 MG12 249 ng/µl 99 636 89 16 DNA 213 MG13 193 ng/µl 874 06 88 15 DNA 214 MG14 479 ng/µl 592 51 88 14 DNA 215 MG15 85 ng/µl 716 868 98 13 DNA 216 MG16 89 ng/µl 796 935 92 13 DNA 217 MG17 140 ng/µl 799 508 86 13 DNA 218 MG18 151 ng/µl 031 558 94 13 DNA 219 MG19 527 ng/µl 10 556 558 19 13 DNA 220 MG20 563 ng/µl 11 265 998 88 13 DNA 221 MG21 280 ng/µl 603 924 92 11 DNA 222 MG22 99 ng/µl 981 04 91 07 DNA 223 MG23 127 ng/µl 552 371 86 07 DNA Phụ lục 02: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN F9 CỦA 100 BỆNH NHÂN HEMOPHILIA B Biến đổi STT Mã BN Năm Giới % Mức Có sinh tính FIX độ bệnh Biến đổi Loại ức chế nucleotide (HGVS cDNA) axit amin (HGVS protein) đột biến Vị trí Domain HB01 1999 Nam Trung bình khơng c 881G>A p Arg294Gln missense exon SP HB02 1994 Nam 01 Nặng không c 1135C>T p Arg379* nonsense exon SP HB03 2012 Nam 06 Nặng không c 1276A>G p Thr426Ala missense exon SP HB04 2010 Nam 0,6 Nặng không c 128G>A p Arg43Gln missense exon PRO HB05 2003 Nam C p Cys128Arg missense exon EGF1 HB06 2009 Nam T p Arg226Trp missense exon AP HB07 1981 Nam 01 Nặng không c 1135C>T p Arg379* nonsense exon SP HB08 2005 Nam 01 Nặng không c 689G>T p Gly230Val missense exon SP HB09 2013 Nam A p Ser430Arg missense exon SP 10 HB10 1983 Nam 03 Nặng không c 1213G>A p Asp405Asn missense exon SP 11 HB11 1995 Nam 01 Nặng không c 1213G>A p Asp405Asn missense exon SP 12 HB12 1988 Nam 01 Nặng không c 127C>T p Arg43Trp missense exon PRO 13 HB13 1984 Nam 01 Nặng không c 1213G>A p Asp405Asn missense exon SP STT Mã BN Năm Giới % Mức Có Biến đổi nucleotide Biến đổi Loại Vị trí Domain 52 sinh tính FIX độ bệnh ức chế (HGVS cDNA) axit amin đột biến (HGVS protein) 53 14 HB14 2012 Nam 04 Nặng không del_exon - large del exon EGF2 15 HB15 1991 Nam 01 Nặng không c 677G>A p Arg226Gln missense exon AP 16 HB16 1985 Nam 02 Nặng không c 433T>C p Cys145Arg missense exon EGF2 17 HB17 2015 Nam 32 Trung bình khơng c 881G>A p Arg294Gln missense exon SP 18 HB18 1975 Nam 02 Nặng không c 470G>T p Cys157Phe missense exon EGF2 19 HB19 1953 Nam 0,3 Nặng không c 1135C>T p Arg379* nonsense exon SP 20 HB20 1988 Nữ 21 Trung bình khơng c 881G>A (Đồng hợp tử) p Arg294Gln missense exon SP 21 HB21 1964 Nam Trung bình khơng c 881G>A p Arg294Gln missense exon SP 22 HB22 2013 04 Nặng không c 874C>T p Gln292* nonsense exon SP 23 HB23 1984 Nam 01 Nặng không c 1243C>A p His415Asn missense exon SP 24 HB24 1980 Nam 01 Nặng không c 344A>G p Tyr115Cys missense exon EGF1 25 HB25 2000 Nam 0,4 Nặng không c 956T>C p Leu319Pro missense exon SP 26 HB26 1998 Nam 0,1 Nặng không c 952delC p Leu318Phefs*8 frameshift exon SP 27 HB27 1981 Nam 0,5 Nặng không c 253-1G>C splice site splice site intron - 28 HB28 1989 Nam 0,2 Nặng không c 755G>C p Cys252Ser missense exon SP 29 HB29 2012 Nam 01 Nặng không c 1069G>C p Gly357Arg missense exon SP 30 HB30 2013 Nam 05 Nặng không c 223C>T p Arg75* nonsense exon GLA STT Mã BN Năm Giới % Mức Có Biến đổi nucleotide Biến đổi Loại Vị trí Domain Nam sinh tính FIX độ bệnh ức chế (HGVS cDNA) axit amin đột biến (HGVS protein) 54 31 HB31 1980 Nam 02 Nặng không c 1213G>A p Asp405Asn missense exon SP 32 HB32 1998 Nam 03 Nặng không c 1369A>T p Lys457* nonsense exon SP 33 HB33 1985 Nam 01 Nặng không c 422G>A p Cys141Tyr missense exon EGF2 34 HB34 1955 Nam 03 Nặng không c 383G>A p Cys128Tyr missense exon EGF1 35 HB35 1977 Nam 05 Nặng không c 1243C>A p His415Asn missense exon SP 36 HB36 2015 Nam 04 Nặng không c 1213G>A p Asp405Asn missense exon SP 37 HB37 2006 Nam 05 Nặng không c 206G>A p Cys69Tyr missense exon GLA 38 HB38 2007 Nam 09 Nặng không c 88G>T p Val30Phe missense exon PRO 39 HB39 2005 Nam 04 Nặng không c 761G>A p Gly254Asp missense exon SP 40 HB40 2005 Nam 07 Nặng không c 1136G>A p Arg379Gln missense exon SP 41 HB41 1980 Nam 03 Nặng không c 1135C>T p Arg379* nonsense exon SP 42 HB42 2015 Nam 02 Nặng không c 127C>T p Arg43Trp missense exon PRO 43 HB43 1980 Nam 05 Nặng không c 206G>A p Cys69Tyr missense exon GLA 44 HB44 1990 Nam 03 Nặng không c 278-3A>G Splice site Splice site intron - 45 HB45 1992 Nam 02 Nặng không c 127C>T p Arg43Trp missense exon PRO 46 HB46 2010 Nam 05 Nặng không c 1331A>G p Tyr444Cys missense exon SP STT 55 Mã BN Năm Giới % Mức Có sinh tính FIX độ bệnh ức chế Biến đổi Biến đổi nucleotide axit amin (HGVS cDNA) (HGVS protein) Loại đột biến Vị trí Domain 47 HB47 1976 Nam 22 Trung bình khơng c 881G>A p Arg294Gln missense exon SP 48 HB48 1980 Nam 04 Nặng không c 223C>T p Arg75* nonsense exon GLA 49 HB49 1970 Nam 09 Nặng không c 947T>C p Ile316Thr missense exon SP 50 HB50 1989 Nam 05 Nặng không c 1220G>C p Cys407Ser missense exon SP 51 HB51 2016 Nam 07 Nặng không c 127C>T p Arg43Trp missense exon PRO 52 HB52 2003 Nam 03 Nặng không c348-349insGA pGlu116Glufs*15 frameshift exon EGF1 53 HB53 1991 Nam 13 Trung bình khơng c 881G>A p Arg294Gln missense exon SP 54 HB54 1990 Nam 05 Nặng không c 838+1G>A splice site splice site intron - 55 HB55 2012 Nam 01 Nặng không c 1220G>A p Cys407Tyr missense exon SP 56 HB56 2009 Nam Trung bình khơng c 128G>A p Arg43Gln missense exon PRO 57 HB57 1975 Nam 02 Nặng không c 470G>T p Cys157Phe missense exon EGF2 58 HB58 2008 Nam 44 Trung bình khơng c 881G>A p Arg294Gln missense exon SP 59 HB59 2011 Nam 03 Nặng không c 1024A>C p Thr342Pro missense exon SP 60 HB60 1981 Nam Trung bình khơng c 881G>A p Arg294Gln missense exon SP 61 HB61 2012 Nam 15 Trung bình không c 127C>T p Arg43Trp missense exon PRO 62 HB62 1993 Nam 28 Trung bình khơng c 881G>A p Arg294Gln missense exon SP 63 HB63 1993 Nam 09 Nặng không c 128G>A p Arg43Gln missense exon PRO 64 HB64 2012 Nam 23 Trung bình khơng c 137G>T p Arg46Met missense exon PRO STT 56 Mã BN Năm Giới % Mức Có sinh tính FIX độ bệnh ức chế Biến đổi Biến đổi nucleotide axit amin (HGVS cDNA) (HGVS protein) Loại Vị trí Domain đột biến 65 HB65 2007 Nam 0,1 Nặng không c 956T>C p Leu319Pro missense exon SP 66 HB66 1981 Nam 0,2 Nặng không c 1004G>A p Cys335Tyr missense exon SP 67 HB67 1985 Nam 0,1 Nặng không c 206G>A p Cys69Tyr missense exon GLA 68 HB68 1950 Nam 11 Trung bình khơng c 881G>A p Arg294Gln missense exon SP 69 HB69 1998 Nam 10 Nhẹ không c 149G>A p Gly50Asp missense exon GLA 70 HB70 2015 Nam 0,1 Nặng không c 1238G>A p Gly413Glu missense exon SP 71 HB71 2011 Nam 01 Nặng không c 676C>T p Arg226Trp missense exon AP 72 HB72 2015 Nam 02 Nặng không c 1159-1161del p Lys387del small del exon SP 73 HB73 2012 Nam 01 Nặng không c 1213G>A p Asp405Asn missense exon SP 74 HB74 2014 Nam A p Arg226Gln missense exon AP 75 HB75 1997 Nam 01 Nặng không c 1369A>T p Lys457* nonsense exon SP 76 HB76 1948 Nam >5 Nhẹ không c 942T>A p His314 Gln missense exon SP 77 HB77 2000 Nam 36 Trung bình khơng c 881G>A p Arg294Gln missense exon SP 78 HB78 2009 Nam 12 Trung bình khơng c 881G>A p Arg294Gln missense exon SP 79 HB79 1992 Nam 03 Nặng không c 1060del A p Ser354Valfs*14 small del exon SP 80 HB80 1973 Nam 01 Nặng không c 914A>G p Tyr305Cys missense exon SP 81 HB81 2004 Nam 45 Trung bình khơng c -21C>T - - promoter - STT 57 Mã BN Năm Giới % Mức Có sinh tính FIX độ bệnh ức chế Biến đổi Biến đổi nucleotide axit amin (HGVS cDNA) (HGVS protein) Loại đột biến Vị trí Domain 82 HB82 2008 Nam 02 Nặng khơng c 215A>G p Glu72Gly missense exon GLA 83 HB83 1998 Nam Trung bình khơng c 520+13A>G - splice site intron - 84 HB84 2017 Nam 02 Nặng không c 1181T>A p Met394Lys missense exon SP 85 HB85 2012 Nam 01 Nặng không c 277+4A>G - splice site intron - 86 HB86 2017 Nam 01 Nặng không c 1084A>T P Lys362* nonsense exon SP 87 HB87 1980 Nam 20 Nhẹ không c 149G>A p Gly50Asp missense exon GLA 88 HB88 2004 Nam 03 Nặng không c 349T>A p Cys117Ser missense exon EGF1 89 HB89 2006 Nam 03 Nặng không c 1369A>T p Lys457* nonsense exon SP 90 HB90 2017 Nam 01 Nặng không c 349T>A p Cys117Ser missense exon EGF1 91 HB91 2006 Nam 01 Nặng không c 718T>C p Trp240Arg missense exon SP 92 HB92 2011 Nam G - splice site intron - 93 HB93 2014 Nam