NGHIÊN cứu đột BIẾN ở một số VÙNG TRỌNG điểm và mức độ METHYL hóa GEN CDH1 ở BỆNH NHÂN UNG THƯ dạ dày LAN tỏa DI TRUYỀN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ====== NGÔ DIỆU HOA NGHI£N CứU ĐộT BIếN MộT Số VùNG TRọNG ĐIểM Và MứC Độ METHYL HóA GEN CDH1 BệNH NHÂN UNG THƯ Dạ DàY LAN TỏA DI TRUYềN Chuyờn ngnh: Húa sinh Mã số: 60720106 LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS ĐẶNG THỊ NGỌC DUNG HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn nhận giúp đỡ nhiệt tình thầy cơ, đồng nghiệp, bạn bè gia đình Nhân d ịp tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Ban giám hiệu, Phòng đào tạo sau đại học Bộ mơn Hố sinh Trường Đại học Y Hà Nội Ban giám đốc Bệnh viện K Tân Triều, bệnh viện Đại học Y Hà Nội, bệnh viện Việt Đức tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập nghiên cứu Đặc biệt tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đặng Thị Ngọc Dung - người thầy tận tình dạy bảo trực tiếp hướng dẫn cho tơi q trình học tập thực nghiên cứu đề tài Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS TS Tạ Thành Văn – Hiệu phó, trưởng Bộ mơn Hố sinh, giảng viên trường Đại học Y Hà Nội động viên, tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập th ực nghiên cứu đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể bác sỹ, y tá, đồng nghiệp t ại khoa Hoá sinh, khoa giải phẫu bệnh, khoa ngoại Tam Hiệp, khoa ngoại Tân Triều, khoa Nội 3, phòng nội soi, phòng KHTH bệnh viện K Tân Triều, khoa giải phẫu bệnh bệnh viện Việt Đức, Trung tâm ki ểm chuẩn chất lượng xét nghiệm Y học giúp đỡ trình h ọc tập, thực nghiên cứu đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô hội đồng thông qua đề cương, thầy cô hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp cho ý kiến quý báu để tơi thực hồn thành luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới nh ững người thân gia đình bạn bè, người ln bên, giúp đ ỡ động viên suốt trình học tập nghiên cứu đề tài, đ ể tơi n tâm học tập, vượt qua khó khăn hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2017 Ngô Di ệu Hoa LỜI CAM ĐOAN Tôi Ngô Diệu Hoa, lớp BSNT hóa sinh khóa 40, Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa Sinh, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn PGS.TS Đặng Thị Ngọc Dung Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên c ứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày 16 tháng 11 năm 2017 Tác gi ả Ngô Di ệu Hoa DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TĂT CT Chụp cắt lớp vi tính H pylori Helicobacter pylori IARC International Agency for Research on Cancer (Tổ chức nghiên cứu ung th quốc tế) MSP Methylation – Specific PCR ( PCR đặc hiệu methyl hóa) PET Chụp cắt lớp phát Positron UTDD Ung thư dày MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược ung thư dày 1.1.1 Dịch tễ học 1.1.2 Các yếu tố nguy ung thư dày: .3 1.1.3 Giải phẫu bệnh ung thư dày 1.1.4 Chẩn đoán UTDD 1.1.5 Điều trị tiên lượng UTDD 1.2 Ung thư dày lan tỏa di truyền 1.2.1 Định nghĩa .9 1.2.2 Đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng 10 1.3 Ung thư dày lan tỏa di truyền đột biến gen CDH1 11 1.3.1 Sơ lược gen CDH1 11 1.3.2 Cơ chế gây bệnh UTDD lan tỏa di truyền đột biến gen CDH113 1.3.3 Nghiên cứu giới đột biến gen CDH1 ung thư dày lan tỏa 14 1.3.4 Methyl hóa gen CDH1 coi chế phân từ thứ UTDD lan tỏa di truyền 17 1.3.5 Nghiên cứu giới tăng cường methyl hóa vùng promoter gen CDH1 ung thư dày lan tỏa .18 1.3.6 Nghiên cứu methyl hóa DNA ung thư Việt Nam 20 1.4 Kỹ thuật sinh học phân tử phát đột biến gen CDH1 20 1.4.1 Kỹ thuật PCR 20 1.4.2 Điện di kiểm tra sản phẩm 21 1.4.3 Kỹ thuật giải trình tự gen 22 1.5 Kỹ thuật sinh học phân tử phát tình trạng tăng cường methyl hóa vùng promoter gen CDH1: 23 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .26 2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn 27 2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ .27 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 27 2.3 Thiết kế nghiên cứu 27 2.4 Cỡ mẫu .27 2.5 Phương pháp nghiên cứu 27 2.5.1 Kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi 27 2.5.2 Tách chiết DNA tổng số từ mô 28 2.5.3 Kỹ thuật PCR khuếch đại đột biến mầm gen CDH1 28 2.5.4 Kỹ thuật phân tích methyl hóa promoter gen CDH1 29 2.5.5 Giải trình tự gen 32 2.6 Phương pháp phân tích số liệu 33 2.7 Vấn đề đạo đức nghiên cứu .33 2.8 Quy trình nghiên cứu 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 34 3.1 Xác định đột biến gen số vùng trọng điểm gen CDH1 bệnh nhân ung thư dày lan tỏa di truyền 34 3.1.1 Đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu .34 3.1.2 Đột biến gen CDH1 exon 9,15: 34 3.1.3 Đột biến exon 9,15 gen CDH1 .37 3.2 Phân tích mức độ methyl hóa vùng promoter gen CDH1 bệnh nhân ung thư dày di truyền 38 3.2.1 Tách DNA từ mẫu mô bệnh nhân: .38 3.2.2 Đánh giá trình xử lý bisulfit mẫu DNA mơ: 40 3.2.3 Kết xác định phân bố đảo CpG xung quanh vị trí khởi đầu phiên mã gen CDH1 .41 3.2.4 Kết MSP xác định methyl hóa promoter CDH1 .43 3.2.5 Phân tích tình trạng methyl hóa vùng promoter gen CDH1 bênh nhân UTDD lan tỏa di truyền: 45 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 47 KẾT LUẬN 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại mô bệnh học ung thư biểu mô dày Tổ chức Y tế Thế giới năm 2010 so sánh với phân loại Lauren .7 Bảng 1.2 Bảng thống kê tần suất mắc đột biến gen CDH1 UTDD lan tỏa di truyền 15 Bảng 3.1 Đặc điểm tuổi giới bệnh nhân nghiên cứu 34 Bảng 3.2 Kết đo nồng độ độ tinh mẫu DNA sau tách chiết từ máu ngoại vi bệnh nhân 35 Bảng 3.3 Kết đo nồng độ độ tinh mẫu DNA sau tách chiết từ mẫu mô bệnh nhân 40 Bảng 3.4 Kết khuyếch đại methyl unmethyl 25 mẫu tế bào ung thư 10 mẫu tế bào lành .45 Bảng 3.5 Tỷ lệ methyl hóa unmethyl nhóm bệnh nhân nghiên cứu: .45 Bảng 3.6 Tỷ lệ methyl hóa unmethyl hóa gen CDH1 theo giới 46 Bảng 3.7 Tỷ lệ methyl hóa khơng methyl hóa vùng promoter gen CDH1 vùng tế bào ung thư vùng tế bào lành 46 Bảng 4.1 Đặc điểm tuổi khởi phát bệnh nhóm nghiên cứu so sánh với nghiên cứu khác 48 Bảng 4.2 So sánh phương pháp phân tích tình trạng methyl hóa vùng promoter gen 54 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Phân loại ung thư dày sớm Hình 1.2 Phân loại ung thư biểu mơ dày theo Lauren .6 Hình 1.3 Hình ảnh vi thể chủ yếu tế bào nhẫn niêm mạc dày 10 Hình 1.4 Vị trí gen CDH1 .11 Hình 1.5 Vị trí E-cadherin vai trò kết dính tế bào – tế bào 13 Hình 1.6 Con đường tín hiệu tế bào qua trung gian E-cadherin 14 Hình 1.7 Lược đồ gen đột biến dòng mầm CDH1 14 Hình 1.8 Tình trạng methyl hóa promoter bệnh nhân UTDD lan tỏa di truyền 19 Hình 1.9 Các bước kỹ thuật PCR .21 Hình 1.10 Sơ đồ phản ứng SnuPE 23 Hình 3.1 Kết đo quang nồng độ DNA bệnh nhân mã số B73 35 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi exon gel agarose 1.5% 36 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi exon 15 gel agarose 1.5% 37 Hình 3.4 Hình ảnh giải trình tự sản phẩm PCR exon gen CDH1 bệnh nhân B285 .38 Hình 3.5 Kết đo quang nồng độ DNA bệnh nhân mã số (MS) tiêu 28049 (B73) 39 Hình 3.6 Đánh giá xử lý bisulfit gen GADPH 41 Hình 3.7: Kết khảo sát đảo CpG sử dụng phần mềm MethPrimer 42 Hình 3.8 Kết MSP phát methyl hóa CDH1 43 Hình 3.9 Kết giải trình tự mẫu methyl mẫu unmethyl vùng promoter gen CDH1 bệnh nhân mã B335 44 63 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu xác định đột biến gen exon 9, 15 tình tr ạng tăng cường methyl hóa 16 bệnh nhân UTDD lan tỏa di truy ền rút số kết luận sau: Xác định 1/16 (6.25%) bệnh nhân nhóm đủ tiêu chuẩn ch ẩn đốn UTDD lan tỏa di truyền có đột biến dị hợp tử thay C thành T vị trí 1278 exon 09 gen CDH1 gây bi ến đổi acid amin Prolin thành Leucin vị trí acid amin số 385 Đây đ ột biến chưa công bố Xác định tỷ lệ methyl hóa vùng promoter gen CDH1 75% Xác định tỷ lệ methyl hóa vùng promoter gen CDH1ở vùng tế bào ung thư 76,9% vùng tế bào lành 66,7% Sự sai khác tỷ lệ methyl hóa vùng khơng có ý nghĩa thống kê (p> 0,05) Tình trạng methyl hóa gen CDH1 khơng ph ụ thu ộc vào giới tính bệnh nhân Phát tình trạng tăng cường methyl hóa vùng promoter gen CDH1 đột biến điểm exon mẫu bệnh nhân B285 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ferlay J., Shin H.R., Bray F., (2008), “Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008”, International Journal of Cancer, 127: pp 2893-2917 Fock K.M., Ang T.L., (2010), “Epidemiology of Helicobacter pylori infection and gastric cancer in Asia”, Journal of Gastroenterology and Hepatology, 25(3): pp 479-486 Alberts SR1, Cervantes A, van de Velde CJ (2003).Gastric cancer: epidemiology, pathology and treatment Henson DE1, Dittus C, Younes M,(2004), Differential trends in the intestinal and diffuse types of gastric carcinoma in the United States, 1973-2000: increase in the signet ring cell type S Kaneko , T Yoshimura, (2001), Time trend analysis of gastric cancer incidence in Japan by histological types, 1975-1989., Guilford P, Hopkins J, Harraway J: E-cadherin germline mutations in familial gastric cancer Nature 1998, 392: 402–5., Corso G1, Pedrazzani C, Pinheiro H, (2010), E-cadherin genetic screening and clinico-pathologic characteristics of early onset gastric cancer., Mateus AR, Simões-Correia J, Figueiredo J, (2009), E-cadherin mutations and cell motility: a genotype–phenotype correlation, 315: 1393–402., Mark L Steinberg, Bor-Jang Hwang, (2008), E-cadherin gene alterations in gastric cancers in different ethnic populations., 10 Giovanni Corso1, Daniele Marrelli, Valeria Pascale1, (2012) , Frequency of CDH1 germline mutations in gastric carcinoma coming from high- and low-risk areas:metanalysis and systematic review of the literature., 11 Parry Guilford, Vanessa Blair, Helen More, (2007) A short guide to hereditary diffuse gastric cancer 12 Grady WM, Willis J, Guilford PJ, et al (2006) Methylation of the CDH1 promoter as the second genetic hit in hereditary diffuse gastric cancer.:16–17 13 Corso G, Roviello F, Paredes J, et al,(2007), Characterization of the Ecadherin germline missense mutation and implication for clinical managemen:1061–1067 14 Barber M, Murrell A, Ito Y,(2008), Mechanisms and sequelae of Ecadherin silencing in hereditary diffuse gastric cancer J Pathol, 216:295– 306., 15 Estimating the Global Burden of Cancer in 2013; 14.9 Million New Cases Worldwide 16 Crew, K.D and A.I Neugut (2006), Epidemiology of gastric cancer World J Gastroenterol, 12(3), 354-362 17 Trần Văn Huy, (2002), “Tình hình phân bố số bệnh lý tiêu hóa gan mật khoa Nội Tiêu hóa - Bệnh viện Trung Ương Huế từ 1998-2000”, Y học Thực hành: tr 43-45 18 Nguyễn Duy Hiển (2007), Ung thư dày Nhà xuất Y học Hà Nội 19 Hoàng Trọng Thảng (2006), Ung thư dày Bệnh tiêu hóa gan mật, 183-193 20 Nishino, Y., et al (2006), Tobacco smoking and gastric cancer risk: an evaluation based on a systematic review of epidemiologic evidence among the Japanese population Jpn J Clin Oncol, 36(12),800-7 21 Gonzalez, C.A., et al (2003), Smoking and the risk of gastric cancer in the European Prospective Investigation Into Cancer and Nutrition (EPIC) Int J Cancer, 107(4), 629-34 22 Abrams J A., Wang T.C., (2010), “Adenocarcinoma and other Tumors of the Stomach”, Sleisenger and Fordtran's gastrointestinal and liver disease: pathophysiology/diagnosis/management, 9th ed, Philadelphia: pp 887-908., 23 Zhang QB, Nakashabendi IM, Mokhashi MS,(1996), Association of cytotoxin production and neutrophil activation by strains of Helicobacter pylori isolated from patients with peptic ulceration and chronic gastritis Gut: 38:841–845 24 Pignatelli B, Bancel B, Estève J, (1998) , Inducible nitric oxide synthase, anti-oxidant enzymes and Helicobacter pylori infection in gastritis and gastric precancerous lesions in humans Eur J Cancer Prev.7:439–447 25 Wang YZ, Cao YQ, Wu JN,(2005) , Expression of nitric oxide synthase in human gastric carcinoma and its relation to p53, PCNA World J Gastroenterol 2005;11:46–50 26 Nguyễn Thị Hương (2006), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng kết điều trị phẫu thuật ung thư dày sớm bệnh viên K 27 Lại Phú Thưởng, Nguyễn Bá Đức, Nguyễn Thị Hồi Nga ,(2006), "Tình hình ghi nhận ung thư giai đoạn 2001- 2004 qua ghi nhận ung thư tỉnh thành Việt Nam", Tạp chí Y học thực hành, tr 9-17., 28 Yatsuya H., Toyoshima H., Tamakoshi A., et al., (2004), “Individual and joint impact of family history and Helicobacter pylori infection on the risk of stomach cancer: a nested case-control study”, British Journal of Cancer, 91: 929-934., 29 Kim, M.A., et al (2005), Clinicopathologic and protein expression differences between cardia carcinoma and noncardia carcinoma of the stomach Cancer, 103(7), 1439-46 30 Japanese Gastric Cancer Association (2011), “Japanese classification of gastric carcinoma”, 3rd English ed Gastric Cancer, 14: pp 101-112., 31 Nassim El Hajj, Scott Sittler, Nancy Lammert , (2012), Gastric cancer: Classification, histology and application of molecular pathology, J Gastrointest Oncol 2012 Sep; 3(3): 251–261 32 Yeung H.W., Macapinlac H., Karpeh M., et al., (1998), “Accuracy of FDG-PET in gastric cancer Preliminary experience”, Clinical Positron Imaging, 1: pp 213-221., 33 Benson, A.B (2008), Advanced gastric cancer: an update and future directions Gastrointest Cancer Res, 2(4 Suppl), S47-53., 34 Pardeep Kaurah, MSc, CCGC and David G Huntsman, MD, (2014), Hereditary Diffuse Gastric Cancer, GeneReviews., 35 Oliveira, C., et al (2004), Genetic screening for familial gastric cancer Hered Cancer Clin Pract, 2(2), 51- 70 36 Gayther SA, Gorringe KL, Ramus SJ, Identification of germ-line Ecadherin mutations in gastric cancer families of European origin Cancer Res 1998;58:4086–9 37 Charlton, A., et al (2004), Hereditary diffuse gastric cancer: predominance of multiple foci of signet ring cell carcinoma in distal stomach and transitional zone Gut, 53(6), 814-20 38 Oliveira, C., R Seruca, and F Carneiro (2009), Hereditary gastric cancer Best Pract Res Clin Gastroenterol, 23(2), 147-57 39 Graziano, F., B Humar, and P Guilford (2003), The role of the Ecadherin gene (CDH1) in diffuse gastric cancer susceptibility: from the laboratory to clinical practice Ann Oncol, 14(12), 1705-13 40 Takeichi, M (1995), Morphogenetic roles of classic cadherins Curr Opin Cell Biol, 7(5), 619-27 41 Christofori, G and H Semb (1999), The role of the cell-adhesion molecule E-cadherin as a tumour-suppressor gene Trends Biochem Sci, 24(2), 73-6., 42 Handschuh, G., et al (1999), Tumour-associated E-cadherin mutations alter cellular morphology, decrease cellular adhesion and increase cellular motility Oncogene, 18(30), 4301-12 43 A García de Herreros and J Baulida, (2012), “Cooperation, amplification, and feed-back in epithelial-mesenchymal transition,” Biochimica et Biophysica Acta: Reviews on Cancer, vol 1825, no 2, pp 223–228, 2012 44 M Katoh, (2005), “Epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer (Review),” International Journal of Oncology, vol 27, no 6, pp 1677–168 45 U Cavallaro and G Christofori,(2004), “Cell adhesion and signalling by cadherins and Ig-CAMs in cancer,” Nature Reviews Cancer, vol 4, no 2, pp 118–132 46 Xin Liu and Kent-Man Chu, (2014), Review Article E-Cadherin and Gastric Cancer: Cause, Consequence, and Applications, BioMed Research International Volume 2014 47 Oliveira, C., et al (2004), Genetic screening for familial gastric cancer Hered Cancer Clin Pract, 2(2), 51-64 48 Gianpaolo Suriano et al, (2005), Characterization of a Recurrent Germ Line Mutation of the E-Cadherin Gene: Implications for GeneticTesting and Clinical Management, Clin Cancer Res 11(15):5401-9 49 Bacani JT, Soares M, Zwingerman R, (2006), CDH1/E-cadherin germline mutations in early-onset 43(11):867-72., gastric cancer, J Med Genet 50 Carla Oliveira, et al, (2002), Screening E-Cadherin In Gastric Cancer Families Reveals Germline Mutations Only In Hereditary, Human mutation 19:510517 51 Bostjan Humar et al, (2002), Novel germline CDH1 mutations in hereditary diffuse gastric cancer families, Hum Mutat ;19(5):518-25 52 Frances M Richards et al, (1999), Germline E-cadherin gene (CDH1) mutations predispose to familial gastric cancer and colorectal cancer, Hum Mol Genet (4):607-10 53 Kazuya Shinmura, (1999), Familial gastric cancer: clinicopathological characteristics, RER phenotype and germline p53 and E-cadherin mutations, Carcinogenesis ;20(6):1127-31 54 Caroline Aquino Moreira-Nunes et al, (2014), Genetic screening analysis of patients with hereditary diffuse gastric cancer from northern and northeastern Brazil, Hered Cancer Clin Pract ;12(1):18 55 Simon A, (1998), Identification of Germ-Line E-cadherin Mutations in Gastric Cancer Families of European Origin, Cancer research 58, 4096 56 Dussaulx-Garin L, (2001), A new mutation of E-cadherin gene in familial gastric linitis plastica cancer with extra-digestive dissemination, Eur J Gastroenterol Hepatol.13(6):711-5., 57 Gisela Keller, (1999), Diffuse Type Gastric and Lobular Breast Carcinoma in a Familial Gastric Cancer Patient with an E-Cadherin Germline Mutation, Am J Pathol 155(2):337-42 58 H More, (2007), Identification of Seven Novel Germline Mutations in the Human E-Cadherin (CDH1)Gene, Hum Mutat ;28(2):203 59 A R Brooks-Wilson, (2004), Germline E-cadherin mutations in hereditary diffuse gastric cancer: assessment of 42 new families and review of genetic screening criteria, J Med Genet 20;41(7):508-17 60 Egle Avizienyte, (2001), E-cadherin is not frequently mutated in hereditary gastric cancer, J Med Genet 38(1):49-52., 61 Pardeep Kaurah, (2007), Founder and Recurrent CDH1 Mutations in Families With Hereditary Diffuse Gastric Cancer, JAMA 297(21):236072 62 Kyong - Ah yoon, ( 1999), Germline mutations of E - cadherin in Korean familial gastric cancer patients, J Hum Genet 44(3):177-80 63 Marica Garziera, (2013), Identification and Characterization of CDH1 Germline Variants in Sporadic Gastric Cancer Patients and in Individuals at Risk of Gastric Cancer, PLoS One 29;8(10) 64 Jonsson BA, Bergh A, Stattin P, (2002), Germline mutations in Ecadherin not explain association of hereditary prostate cancer, gastric cancer and breast cancer, Int J Cancer 2002 Apr 20;98(6):838-43., 65 Yuanying Zhang, (2006), Germline mutations and polymorphic variants in MMR, E-cadherin and MYH genes associated with familial gastric cancer in Jiangsu of China, Int J Cancer 119(11):2592-6 66 Antonette El-Husny, (2006), CDH1 mutations in gastric cancer patients from northern Brazil identified by Next- Generation Sequencing (NGS), Genet Mol Biol 2016 May 13;39(2):189-98 67 F Roviello, (2006), Hereditary diffuse gastric cancer and E-cadherin: Description of the first germline mutation in an Italian family, Eur J Surg Oncol 33(4):448-51 68 Carla Oliveira, (2004), E-Cadherin (CDH1) and p53 rather than SMAD4 and Caspase-10 germline mutations contribute to genetic predisposition in Portuguese gastric cancer patients, Eur J Cancer 40(12):1897-903 69 T Frebourg, (2006), Cleft lip/palate and CDH1/E-cadherin mutations in families with hereditary diffuse gastric cancer, J Med Genet ;43(2):138-42 70 RebeccaWilcox, (2011), Hereditary Diffuse Gastric Cancer Multidisciplinary Case Report with Review of the Literature, Pathology Research International 11 1123-1129 71 Ying Wang, (2002), Ile–Leu Substitution (I415L) in Germline Ecadherin Gene (CDH1) in Japanese Familial Gastric Cancer, Jpn J Clin Oncol 33(1)17–20., 72 Mayrbaeurl B, (2010), Germline mutation of the E-cadherin gene in three sibling cases with advanced gastric cancer: clinical consequences for the other family members, Eur J Gastroenterol Hepatol 22(3):306-10 73 G Keller, (2004), Germline mutations of the E-cadherin(CDH1) and TP53genes, rather than of RUNX3 and HPP1, contribute genetic predisposition in German gastric cancer patients, J Med Genet 41(6):e89 74 Tomonori, (2002), ), E-cadherin gene variants in gastric cancer families whose probands are diagnosed with diffuse gastric cancer, Int J Cancer 101(5):434-41 75 Olivier Caron, M.D,(2009), Usefulness of Prophylactic Gastrectomy in a Novel Large Hereditary Diffuse Gastric Cancer (HDGC) Family, Am J Gastroenterol 103(8):2160-1 76 Carla Oliveira, (2009), Germline CDH1 deletions in hereditary diffuse gastric cancer families, Hum Mol Genet 18(9):1545-55 77 Haroon Rashid, Khursheed Alam, Dil Afroze, (2016), Hypermethylation Status of E-Cadherin Gene in Gastric Cancer Patients in a High Incidence Area, Asian Pac J Cancer Prev 17(6):2757-60 78 Anne M Slavotinek, Edwin M Stone, Kirk Mykytyn,(2000), Methylation of the CDH1 promoter as the second genetic hit in hereditary diffuse gastric cancer, Nature Genetics ,26.1 (Sep 2000): 16-7., 79 Hugo Pinheiro, Renata Bordeira-Carric, (2009), Allele-specific CDH1 downregulation and hereditary diffuse gastric cancer, Hum Mol Genet 19(5):943-52., 80 Richards FM, McKee SA, Rajpar MH, Cole TR, Evans DG, Jankowski JA, McKeown C, Sanders DS, Maher ER Germline E-cadherin gene (CDH1) mutations predispose to familial 81 Guilford PJ, Hopkins JB, Grady WM, Markowitz SD et al E-cadherin germline mutations define an inherited cancer syndrome dominated by diffuse gastric cancer Hum Mutat 1999;14:249–255 82 Keller G, Vogelsang H, Becker I et al Diffuse type gastric and lobular breast carcinoma in a familial gastric cancer patient with an E-cadherin germline mutation Am J Pathol 1999; 155:337–342 83 BC Cancer Agency researcher—inspired by her own family cancer experience—leads study to help those at risk of deadly hereditary stomach cancer, 2015 84 Khuất Hữu Thanh (2006) Nguyên lý kỹ thuật gen Kỹ thuật gen – Nguyên lý ứng dụng, Nhà xuất khoa học kỹ thuật 102-12 85 Chacon-Cortes D, Griffiths LR Methods for extracting genomic DNA from whole blood samples: current perspectives, 2014 86 Djurkin Kušec, I., Radišić, Ž., Komlenić, M., Kušec, G, Comparison of commercial dna kits and traditional dna extraction procedure in pcr detection of pork in dry/fermented sausages 2015 87 Gianpaolo S., MariaJ., David H E-cadherin germline missense mutations and cell phenotype: evidence for the independence of cell invasion on the motile capabilities of the cells 200 88 G.Corsoab, Rovielloa J.P Characterization of the P373L E-cadherin germline missense mutation and implication for clinical management Author links open overlay panel, 2007., 89 Burcu S., Emre Baris, Tulin Oygur et al Comparison of Methods for the Extraction of DNA from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Archival Tissues,2014., 90 Sergey K and Martyn B DNA Methylation Analysis: Choosing the Right Method, 2016 91 Reem A., Zainab A, Mol Bi Region of interest methylation analysis: a comparison of MSP with MS-HRM and direct BSP, 2017 92 Kague E1 Methylation status of CDH1 gene in samples of gastric mucous from Brazilian patients with chronic gastritis infected by Helicobacter pylori Arq Gastroenterol 2010 Jan-Mar;47(1):7-12 93 Li L.C., Dahiya R (2002), “MethPrimer: designing primers for methylation PCRs”, Bioinformatics, 18(11), pp 1427-1431 94 Long-Cheng Li and Rajvir Dahiya MethPrimer: designing primers for methylation PCRs, 2002 95 Giovanni C., Joana C and Daniele M Somatic Mutations and Deletions of the E-Cadherin Gene Predict Poor Survival of Patients With Gastric Cancer , , Journal of Clinical Oncology 31, no 2013 868-875 96 Carla S.anb Hugo P of Epigenetic and Genetic 2nd Hits in CDH1 During Hereditary Diffuse Gastric Cancer Syndrome Progression , gastroenterology , June 2009.(136) P.2137–2148 97 Graziano F, et al Prognostic analysis of E-cadherin gene promoter hypermethylation in patients with surgically resected, node-positive, diffuse gastric cancer Clin Cancer Res 2004 98 Gyeong H., Hyeon J and Kyu S 2003 .Aberrant CpG Island Hypermethylation of Chronic Gastritis, in Relation to Aging, Gender, Intestinal Metaplasia, and Chronic Inflammation Am J Pathol 163(4): 1551–1556 99 Phạm Thị Bích (2011) Phân tích biến đổi gen CXCL12 bệnh nhân ung thư đại trực tràng Luận văn thạc sỹ Trường ĐH khoa học tự nhiên 2011 100 Goffin J, Eisenhauer E DNA methyltransferase inhibitors—state of the art Ann Oncol 2002; 13: 1699–1716., 101 Baylin SB., Belinsky SA , Herman JG Aberrant methylation of gene promoters in cancer Concepts, misconcepts and promise J Natl Cancer Inst 2000; 92: 1460–1461 102 K Christman, “5-Azacytidine and 5-aza-2′-deoxycytidine as inhibitors of DNA methylation: mechanistic studies and their implications for cancer therapy,” Oncogene, vol 21, no 35, pp 5483–5495, 2002 103 R L Momparler, “Epigenetic therapy of cancer with 5-aza-2′deoxycytidine (decitabine),” Seminars in Oncology, vol 32, no 5, pp 443–451, 2005 104 C Zhao and X Bu, “Promoter methylation of tumorrelated genes in gastric carcinogenesis,” Histology and Histopathology, vol 27, no 10, pp 1271–1282, 2012 PHỤ LỤC 1: BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU Mã bệnh án: Bệnh viện: Mã bệnh nhân: Phần hành Họ tên: Tu ổi: Gi ới: □ Nam □ N ữ Địa chỉ: Điện thoại: Nghề nghiệp: Dân t ộc: Người thân: .Đi ện tho ại: Điều trị nội trú tại: Ngày vào viện: ./ / Ngày vi ện: ./ ./ Phần nghiên cứu 2.1 Lý vào viện □ Đau thượng vị □ Sút cân □ Khó nuốt □ Xu ất huy ết tiêu hóa □ Khác 2.2 Tiền sử 2.2.1 Tiền sử thân - Hút thuốc lá: □ Có số điếu/ngày: Th ời gian: - Uống rượu: □ Có số ml/ngày: Th ời gian: - Tiền sử bệnh nội khoa: Viêm loét dày □ Có Th ời gian: □ Khơng Điều trị □ Có □ Không - Kết điều trị: □ Khỏi □ Không khỏi □ Khác - Tiền sử ngoại khoa: □ Phẫu thuật cắt dày □ Khác 2.2.2 Tiền sử gia đình (3 thệ: ơng bà, cha mẹ anh chị em ruột thịt) - Người thân mắc KDD □ Có □ Khơng - Số người mắc 1□ 2□ Nhi ều h ơn □ - Tuổi mắc < 50 □ > 50 □ - Có điều trị bệnh viện □ Thời gian: - Khác: 2.2.3 Triệu chứng lâm sàng Đau thượng vị  Thiếu máu  Gầ y sút cân  Váng da, vàng mắ t  Buồn nôn/nôn  Gan lớn  Báng  Chán ăn  Ấn thượng vị đau  Nôn máu và/hoặ c ngồi phân đen  Hạch nách  Khó nuốt  Hạch thượng đòn  2.2.3 Hình ảnh nội soi dày Ngày nội soi: □ Bình thường □ Có t ổn th ương - Vị trí: □ Hang vị; □ Tiền mơn vị; □ Hang mơn vị; □ Tâm vị; □ Phình vị; □ Thân vị; □ Bờ cong nhỏ; □ Bờ cong lớn □ Khác: - Kích thước: □ 3cm □ Khác: - Tổn thương: 2.2.4 Kết mô bệnh học Mã tiêu bản: Bác sĩ Nơi đọc Mô bệnh học: UTDD thể nhẫn Kết luận: K dày thể nhẫn Có tính chất gia đình  Giai đo ạn: GHI CHÚ: Mẫu nghiên cứu: Loại mẫu Ngày lấy Ngày tách chiết Lưu mẫu/vị trí Ống chống đơng EDTA Ống huyết Mẫu mơ GPB Kết phân tích gen Gen Kết Thời gian Lặp lại CDH1 GHI CHÚ: Người xem xét Nghiên c ứu viên PHỤ LỤC 2: DANH SÁCH BỆNH NHÂN NGOẠI TRÚ TỰ NGUYỆN THAM GIA NGHIÊN CỨU STT Mã bệnh nhân B4 B277 B144 B335 B444 B445 B97 Họ tên Phạm Văn H Nguyễn Thị Tr Trịnh Thị Huyền C Đinh Trọng K Đinh Trọng Tr Nguyễn Đức H Nguyễn Thị B Giới Nam Nữ Nữ Nam Nam Nam Nữ Tuổi 29 23 33 49 75 39 67 Xác nhận giáo viên hướn g dẫn PGS.TS Đặng Thị Ngọc Dung ... CDH1 bệnh nhân ung thư dày lan tỏa di truyền với mục tiêu chính: Xác định đột biến gen exon 9, 15 gen CDH1 bệnh nhân ung thư dày lan tỏa di truyền Phân tích mức độ methyl hóa vùng promoter gen CDH1. .. QUẢ NGHIÊN CỨU 34 3.1 Xác định đột biến gen số vùng trọng điểm gen CDH1 bệnh nhân ung thư dày lan tỏa di truyền 34 3.1.1 Đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu .34 3.1.2 Đột biến gen. .. mắc đột biến gen CDH1 UTDD lan tỏa di truyền BẢNG THỐNG KÊ TẦN SUẤT MẮC ĐỘT BIẾN GEN CDH1 TRONG UTDD LAN TỎA DI TRUYỀN E Số người mang Tổng số Tài liệu tham x đột biến/ số người Tỷ lệ Đột biến