Mục tiêu của luận án là phát hiện đặc điểm đột biến gen β globin trên bệnh nhân β thalassemia và người mang đột biến dị hợp tử bằng các kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR, ARMSPCR và giải trình tự gen Sanger;...
i VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÝ THỊ THANH HÀ LÝ THỊ THANH HÀ NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN GLOBIN VÀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2018 ii VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC L LÝ THỊ THANH HÀ THANH HÀ NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN GLOBIN VÀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trần Vân Khánh Trường Đại học Y Hà Nội GS.TS Trương Nam Hải Viện Công nghệ sinh học Hà Nội - 2018 i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận án tơi nhận hỗ trợ, tạo điều kiện nhiều người thông cảm, sẻ chia, động viên giúp đỡ Tôi xin trân trọng cảm ơn luôn ghi nhớ! Tôi vô biết ơn PGS TS Trần Vân Khánh, Phó giám đốc Trung tâm gen protein, Trường đại học Y Hà Nội giúp đỡ góp ý tận tình cho tơi q trình thực luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn GS.TS Trương Nam Hải, Viện Công nghệ sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hướng dẫn, bảo cho thời gian qua Tôi xin cảm ơn vị lãnh đạo Bệnh viện Nhi Trung Ương Khoa Di truyền Sinh học phân tử, tạo điều kiện giúp đỡ trình thực nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể Phòng cơng nghệ gen Viện nghiên cứu tế bào gốc công nghệ gen Vinmec giúp đỡ chặng đường qua Tôi thực xúc động tự hào hỗ trợ nhiệt tình, động viên, chia sẻ các đồng nghiệp nơi công tác, giúp tơi hồn thành nhiệm vụ nghiên cứu này! Bố, mẹ người mang đến với sống;chồng động viên yêu thương vô bờ bến! Tôi xin chia sẻ thành với bố, mẹ gia đình Họ động lực để luôn cố gắng không ngừng Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả Lý Thị Thanh Hà ii sLỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả Lý T Lý Thị Thanh Hà hị Thanh Hà iii MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cấu trúc dạng phân tử Hemoglobin 1.1.1 Cấu trúc phân tử Hb người bình thường 1.1.2 Các dạng phân tử hemoglobin 1.2 Bệnh thalassemia 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Dịch tễ học bệnh thalassemia 1.2.3 Cơ chế bệnh sinh 1.2.4 Đặc điểm lâm sàng bệnh β thalassemia 1.2.5 Đặc điểm cận lâm sàng bệnh thalassemia 10 1.2.6 Chẩn đoán bệnh thalassemia 10 1.3 Đột biến gen globin 11 1.3.1 Cấu trúc gen globin 11 1.3.2 Các dạng đột biến gen globin vài chế đột biến tổng hợp chuỗi globin 13 1.3.3 Tương quan kiểu gen kiểu hình 15 1.3.4 Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen β globin 16 1.3.5 Phát người lành mang gen bệnh 22 1.4 Chẩn đoán trước sinh bệnh thalassemia 23 1.4.1 Dịch nước ối (Amniotic fluid sampling) 24 1.4.2 Mẫu gai rau (Chorionic villus sampling - CVS) 24 1.4.3 Chẩn đốn tiền phơi (Pre-implantation genetic diagnosis - PGD) 26 1.5 Tình hình nghiên cứu bệnh thalassemia Việt Nam 26 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 28 iv 2.2 Đối tượng nghiên cứu 28 2.2.1 Nhóm bệnh nhân bị bệnh thalassemia thể nặng 28 2.2.2 Nhóm người mang gen bệnh thalassemia 28 2.2.3 Nhóm làm chẩn đốn trước sinh 29 2.3 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân 29 2.4 Trang thiết bị cần thiết 29 2.4.1 Trang thiết bị 29 2.4.2 Hóa chất 29 2.5 Phương pháp nghiên cứu 32 2.6 Quy trình xác định đột biến gen globin 32 2.6.1 Thu thập mẫu máu tách DNA từ mẫu máu ngoại vi 32 2.6.2 Kỹ thuật tách DNA tổng số từ máu ngoại vi tế bào ối 33 2.6.3 Phương pháp điện di DNA gel agarose 33 2.6.4 Kỹ thuật PCR xác định đột biến gen β globin 34 2.6.5 Kỹ thuật giải trình tự gen xác định đột biến gen β globin 36 2.6.6 Kỹ thuật Gap PCR 37 2.6.7 Nuôi cấy tế bào ối 37 2.7 Vấn đề đạo đức 38 2.8 Sơ đồ nghiên cứu 39 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 40 3.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu 40 3.2 Kết xác định đột biến gen β globin 40 3.2.1 Kết tách chiết DNA 40 3.2.2 Kết xác định đột biến bệnh nhân mắc thalassemia thể nặng 48 3.2.3 Kết xác định đột biến gen β globin người mang gen bệnh thalassemia 67 v 3.2.4 Kết chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia 81 CHƯƠNG BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 88 4.1 Vai trò kỹ thuật Multiplex ARMS PCR, giải trình tự gen Gap PCR chẩn đốn xác định bệnh thalassemia 88 4.1.1 Kỹ thuật Multiplex ARMS PCR 88 4.1.2 Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger 90 4.1.3 Kỹ thuật Gap PCR 91 4.2 Đặc điểm tỷ lệ đột biến đột biến gen globin nhân thalassemia bệnh viện Nhi Trung ương 91 4.2.1 09 đột biến sàng lọc kỹ thuật Multiplex PCR 91 4.2.2 Đặc điểm tỷ lệ đột biến gen β globin bệnh nhân thalassemia bệnh viện Nhi Trung ương 92 4.2.3 Một số ca khơng điển hình có lâm sàng đặc biệt 93 4.3 Đặc điểm tỷ lệ đột biến gen globin người mang gen thalassemia bệnh viện Nhi Trung ương 97 4.4 Chẩn đoán trước sinh bệnh thalassemia 100 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 103 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 104 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH 105 TÀI LIỆU THAM KHẢO 116 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT PCR Polymerase Chain Reaction, phản ứng đồng trùng hợp C-ARMS-PCR Combine-Amplification Refractory Mutation System-PCR, GAP-PCR PCR khoảng cách RT-PCR Reverse transcrip PCR MLPA Multiplex ligation dependent probe amplification Sequencing Giải trình tự gen Multiplex Phản ứng đa mồi ASO Allele specific oligonucleotide dot blot, lai đặc hiệu oligo RDB Reserve dot blot, lai ngược RE - PCR Restriction enzyme – PCR, phản ứng PCR sử dụng enzyme cắt giới hạn Hb Hemoglobin CO2 Carbon dioxide CO Carbon monoxide NO Nirtric oxide O2 Oxygen Chuỗi alpha β Chuỗi beta γ Chuỗi gamma δ Chuỗi delta vii ε Chuỗi epsilon ζ Chuỗi zeta (2β2) Hemoglobin A (2δ2) Hemoglobin A2 (ζ2ε2) Hemoglobin Gower1 (2ε2) Hemoglobin Gower2 (ζ2γ2) Hemoglobin Porland (2γ2) Hemoglobin F HPFH Hội chứng tồn dư huyết sắc tố bào thai di truyền HPLC Điện di hemogobin sắc ký lỏng cao áp / Người mang gen kết hợp mang gen thalassemia /E Người mang gen kết hợp mang gen HbE RBC (1012/L) Red Blood Cells, số lượng hồng cầu HGB (g/dL) Khối lượng hemoglobin (g/dL) HCT (%) Hematocrit (%) MCV (fL) Mean Corpuscular Volume, thể tích trung bình hồng cầu MCH (pg) Mean Corpuscular Hemoglobin, số lượng hemoglobin trung bình hồng cầu (pg) MCHC (%) Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration, nồng độ hemoglobin trung bình hồng cầu (%) cffDNA Cell free fetal DNA, ADN tự thai nhi NIPD Non invasive Prenatal Diagnosis, chẩn đoán trước sinh không xâm lấn viii PGD Pre-implantation genetic diagnosis, chẩn đoán tiền làm tổ IVF In vitro fertilization, thụ tinh ống nghiệm EQA External Quality Assessment, tổ chức ngoại kiểm WHO World Health Organization, tổ chức y tế giới TIF Thalassemia International Fondation, Hiệp hội Thalassemia quốc tế BV Nhi TƯ Bệnh Viện Nhi Trung Ương DT-SHPT Khoa Di truyền - Sinh Học Phân Tử ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần globin Hb bình thường Bảng 1.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh thalassemia 11 Bảng 1.3 Kiểu hình, kiểu gen bệnh thalassemia 16 Bảng 1.4 Các kĩ thuật sinh học phân tử áp dụng phát đột biến gây bệnh thalassemia 17 Bảng 1.5 Tình hình mang gen bệnh thalassemia Việt Nam 26 Bảng 1.6 Tỉ lệ loại đột biến thalassemia người Việt Nam 27 Bảng 2.1 Tên trình tự mồi sử dụng quy trình xác định 09 đột biến trên gen β globin 31 Bảng 2.2 Các bước sàng lọc gene β globin 34 Bảng 2.3 Bộ mồi sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen β globin 36 Bảng 3.1 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo nhóm 40 Bảng 3.2 Tần số tỷ lệ đột biến gen β globin bệnh nhân thalassemia 41 Bảng 3.3 Tần số tỷ lệ đột biến gen β globin bệnh nhân thalassemia theo vị trí đột biến 42 Bảng Kiểu gen kiểu hình 214 bệnh nhân thalassemia 43 Bảng 3.5 Tần số tỷ lệ đột biến gen β globin đối tượng người mang gen bệnh 69 Bảng 3.6 Kết sàng lọc xét nghiệm công thức máu điện di huyết sắc tố bệnh nhân mã số WBbT110706 74 Bảng 3.7 Kết sàng lọc xét nghiệm công thức máu điện di huyết sắc tố bệnh nhân mã số PWBbT120505M 75 Bảng 3.8 Kết sàng lọc xét nghiệm công thức máu điện di huyết sắc tố bệnh nhân mã số WBbT150926 77 x Bảng 3.9 Kết sàng lọc xét nghiệm công thức máu điện di huyết sắc tố bệnh nhân mã số PWBbT120505F 78 Bảng 3.10 Kết sàng lọc xét nghiệm công thức máu điện di huyết sắc tố gia đình có kiểu gen kết hợp thalassemia 80 Bảng 3.11 Kết số lượng tỷ lệ thai nhi chẩn đoán trước sinh 83 Bảng 3.12 Kết tần số tỷ lệ alen đột biến chẩn đoán trước sinh cho thai nhi 83 Bảng 3.13 Tần số tỉ lệ kiểu gen đột biến xuất 178 thai nhi 84 Bảng 4.1 Các đột biến gen β globin phổ biến số quần thể giới 92 xi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ Hình 1.1 Thành phần globin Hb bình thường Hình 1.2 Sơ đồ chế bệnh sinh Thalassemia Hình 1.3 Cấu trúc trình tổng hợp chuỗi β globin 13 Hình 1.4 Nguyên lý kĩ thuật ARMS-PCR 18 Hình 1.5 Thủ thuật chọc ối chẩn đoán trước sinh 24 Hình 1.6 Thủ thuật lấy bệnh phẩm chẩn đoán trước sinh 25 Hình 2.1 Quy trình xác định đột biến gen globin 32 Hình 2.2 Sơ đồ mồi quy trình xác định đột biến gen β globin 37 Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu 39 Hình 3.1 Kết multiplex ARMS PCR bệnh nhân mã số WBbT081203 có đột biến CD41/42(-TCTT), CD17 (AAG-TAG) 45 Hình 3.2 Kết ARMS PCR bệnh nhân mã số WBbT081203 phát kiểu gen CD41/42(-TCTT) (A) CD17 (AAG-TAG) (B) 46 Hình 3.3 Kết giải trình tự gen bệnh nhân mã số WBbT081203 với đột biến dị hợp tử CD41/42(-TCTT) (A) CD17 (AAG-TAG) (B) 47 Hình 3.4 Kết multiplex ARMS PCR bệnh nhân mã số WBbT140713 có đột biến IVS1-1 (G-T) 48 Hình 3.5 Kết ARMS PCR bệnh nhân mã số WBbT140713 phát kiểu gen IVS1-1(G-T) 49 Hình 3.6 Kết multiplex ARMS PCR bệnh nhân mã số WBbT140713 có đột biến IVS2-654 (C-T) 49 Hình 3.7 Kết ARMS PCR bệnh nhân mã số WBbT140713 phát kiểu gen IVS2-654(C-T) 50 Hình 3.8 Kết giải trình tự gen bệnh nhân mã số WBbT140713 với đột biến dị hợp tử IVS1-1 (G-T) (A) IVS2-654 (C-T) (B) 51 Hình 3.9 Kết multiplex ARMS PCR bệnh nhân mã số WBbT130504 có đột biến -28(A-G) 51 xii Hình 3.10 Kết ARMS PCR bệnh nhân mã số WBbT130504 phát kiểu gen -28(A-G) 52 Hình 3.11 Kết multiplex ARMS PCR bệnh nhân mã số WBbT130504 có đột biến CD71/72(+A) 53 Hình 3.12 Kết ARMS PCR bệnh nhân mã số WBbT130504 phát kiểu gen CD71/72(+A) 54 Hình 3.13 Kết giải trình tự gen bệnh nhân mã số WBbT130504 với đột biến dị hợp tử CD71/72 (+A) 55 Hình 3.14 Kết multiplex ARMS PCR bệnh nhân mã số WBbT101215 có đột biến -28(A-G) 55 Hình 3.15 Kết ARMS PCR bệnh nhân mã số WBbT101215 phát kiểu gen -28(A-G) 56 Hình 3.16 Kết multiplex ARMS PCR bệnh nhân mã số WBbT101215 có đột biến IVS1-5 (G-C) 57 Hình 3.17 Kết ARMS PCR bệnh nhân mã số WBbT101215 phát kiểu gen IVS1-5 (G-C) 57 Hình 3.18 Kết multiplex ARMS PCR bệnh nhân mã số WBbT130310 có đột biến CD41/42(-TCTT) 58 Hình 3.19 Kết ARMS PCR bệnh nhân mã số WBbT130310 phát kiểu gen CD41/42(-TCTT) 59 Hình 3.20 Kết multiplex ARMS PCR bệnh nhân mã số WBbT130310 có đột biến CD95 (+A) 59 Hình 3.21 Kết ARMS PCR bệnh nhân mã số WBbT130310 phát kiểu gen CD95 (+A) 60 Hình 3.22 Kết multiplex ARMS PCR bệnh nhân mã số WBbT090304 có đột biến CD41/42(-TCTT) 61 Hình 3.23 Kết ARMS PCR bệnh nhân mã số WBbT090304 phát kiểu gen CD41/42(-TCTT) 61 xiii Hình 3.24 Kết ARMS PCR bệnh nhân mã số WBbT090304 phát kiểu gen HbE (GAG-AAG)-CD26 62 Hình 3.25 Kết giải trình tự gen bệnh nhân mã số WBbT090304 với với đột biến dị hợp tử HbE (GAG-AAG)-CD26 63 Hình 3.26 Kết giải trình tự gen bệnh nhân mã số WBbTS150926 với đột biến dị hợp tử c.441-442ins AC 64 Hình 3.27 Kết giải trình tự gen bệnh nhân mã số WBbTS150926 với đột biến dị hợp tử c.-140C>T 64 Hình 3.28 Kết giải trình tự gen bệnh nhân mã số WBbTS150926 với đột biến dị hợp tử c.-138C>T 65 Hình 3.29 Kết xác định đột biến gen bệnh nhân mã số PWBbT120505F gia đình 66 Hình 3.30 Hình ảnh điện di ADN tổng số tách chiết từ máu ngoại vi đối tượng nghiên cứu 68 Hình 3.31 Kết điện di bước sàng lọc đột biến CD41/42(-TCTT), CD17(AAG-TAG), IVS1-1(G-T), -28 (A-G) cặp bố mẹ có mã số WBbT090803 WBbT090804 71 Hình 3.32 Kết điện di bước sàng lọc đột biến IVS2-654(C-T), CD71/72(+A), IVS1-5(G-C), CD95 (+A) cặp bố mẹ có mã số WBbT090803 WBbT090804 72 Hình 3.33 Kết điện di bước sàng lọc đột biến HbE (CD26) cặp bố mẹ có mã số WBbT090803 WBbT090804 72 Hình 3.34 Kết điện di tìm kiểu gen đột biến người mẹ mã số WBbT090804 Thay hình khác 73 Hình 3.35 Kết giải trình tự tìm đột biến điểm gặp bệnh nhân mã số WBbT110706 75 Hình 3.36 Kết giải trình tự tìm đột biến điểm gặp bệnh nhân mã số PWBbT120505M 76 xiv Hình 37 Kết giải trình tự tìm đột biến điểm gặp bệnh nhân mã số WBbTS150926 77 Hình 3.38 Kết điện di phát đột biến đoạn lớn người bố Hình 3.39 Kiểu gen kết hợp đột biến gen β globin α globin gia đình có vừa bị Beta thalassemia thể nặng phù thai di Alpha thalassemia thể nặng 81 Hình 3.40 Quy trình chẩn đốn trước sinh cho bệnh Beta thalassemia 82 Hình 3.41 Kết chẩn đốn trước sinh gia đình bệnh nhân sản phụ mã số AFbT120605, Nguyễn Thị Th 85 Hình 3.42 Kết chẩn đốn trước sinh gia đình bệnh nhân sản phụ mã số AFbT110705, Hà Thị V 86 Hình 3.43 Kết chẩn đốn trước sinh gia đình bệnh nhân sản phụ mã số AFbT121061 Nguyễn Phương D 86 Hình 3.44 Kết chẩn đốn trước sinh gia đình sản phụ mã số AFbT150302, Lò Thị Bích Th 87 ĐẶT VẤN ĐỀ Beta thalassemia (β Thalassemia) bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, gây thiếu máu tan máu phổ biến Việt Nam, gây đột biến gen Beta globin ( globin) nằm nhiễm sắc thể (NST) 11 (NC Khanh 1985) Tần suất mang gen bệnh khác dân tộc Kinh 1,49%, Mường 20,6%, Tày 11% (Saovaros Svasti, Hieu et al 2002) Bệnh nhân người mang đột biến gen thalassemia (đồng hợp tử) thalassemia kết hợp với HbE Biểu lâm sàng da xanh, niêm mạc nhợt, biến dạng xương, gan lách to, xạm da hồng cầu bệnh nhân dễ bị phá hủy tăng tạo máu tủy (BV Viên 2001) Việc quản lý bệnh nhân β Thalassemia bao gồm vấn đề phòng ngừa trường hợp bệnh mới, điều trị bệnh nhân Thalassemia thể nặng truyền máu thường xuyên tầm soát, phát người mang gen Điều trị bệnh β thalassemia chủ yếu truyền máu, thải sắt suốt đời chữa trị ghép tế bào gốc, liệu pháp gen đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao phải có nguồn tế bào gốc phù hợp Việc gây gánh nặng kinh tế tâm lý cho gia đình có người nhà bị bệnh β Thalassemia, cho tồn xã hội Vì việc phòng bệnh xem chiến lược việc giải vấn đề Thalassemia cộng đồng Biện pháp phòng ngừa bệnh β Thalassemia hữu hiệu chẩn đoán trước sinh, nhằm phát thai nhi bị bệnh cặp vợ chồng có bị bệnh muốn sinh lần tiếp sau cặp vợ chồng trước sau kết hôn chẩn đoán người mang gen bệnh Đột biến gen β globin phần lớn đột biến điểm Mỗi chủng tộc dân tộc khác lại mang đột biến tần suất khác Bệnh β Thalasemia chẩn đoán xác định dựa vào đặc điểm lâm sàng xét nghiệm huyết học Tuy nhiên, xét nghiệm di truyền phân tử xác định đột biến gen β globin điều kiện thiết yếu để thực chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia 2 Phân tích kiểu gen khơng giúp khẳng định chẩn đoán số trường hợp xét nghiệm thành phần Hb khơng điển hình mà giúp chẩn đoán thể bệnh nặng trung gian, sở để lên kế hoạch điều trị tốt cho bệnh nhân Phân tích kiểu gen sở thiết yếu cho thực hành tư vấn tiền hôn nhân, tư vấn di truyền cho cặp vợ chồng người mang gen bệnh chẩn đoán trước sinh bệnh β Thalassemia, giúp giảm tỷ lệ ca bệnh cộng đồng Đây xem biện pháp phòng bệnh hiệu cần thiết để ngăn ngừa giảm bớt nguy sinh em bé mắc thể bệnh nặng Phân tích kiểu đột biến gen giúp nghiên cứu kiểu đột biến gen bệnh khác dân tộc (Weatherall 2007) Ở quốc gia khác giới, có nhiều nghiên cứu tần suất đột biến gen nghiên cứu lâm sàng dân tộc khác người Thái Lan, Philippin, Malaysia, Trung Quốc, Hàn Quốc (Kazazian, Dowling et al 1986, Park, Lee et al 2002, Peng, Liu et al 2003, Tan, George et al 2004, Viprakasit, Tanphaichitr et al 2004) Đã có số nghiên cứu mối liên quan kiểu gen kiểu hình bệnh nhân thalassemia (Galanello, Ruggeri et al 1983, Galanello, Barella et al 2002, Gabbianelli, Morsilli et al 2008, Sripichai, Munkongdee et al 2008, Sharma and Saxena 2009, Viprakasit, Lee-Lee et al 2009, Nuinoon, Makarasara et al 2010) Thái Lan nước làm tốt tư vấn di truyền chẩn đoán trước sinh với 10 trung tâm (Dhamcharee, Romyanan et al 2001) Ở Việt Nam có nhiều nghiên cứu bệnh thalassemia chủ yếu nghiên cứu lâm sàng, tần suất bệnh thông qua xét nghiệm điện di huyết sắc tố Gần có số nghiên cứu tần suất bệnh dựa vào kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC), tần suất mang gen dựa kỹ thuật sinh học phân tử mơ hình nghiên cứu số lượng bệnh nhân tham gia nghiên cứu chưa lớn, chưa đủ để đưa số tỷ lệ đột biến đặc trưng người Việt Nam nói chung người miền Bắc nói riêng Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu đột biến gen β globin chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia bệnh viện Nhi Trung ương” thực nhằm mục tiêu nghiên cứu sau: Phát đặc điểm đột biến gen β globin bệnh nhân β thalassemia người mang đột biến dị hợp tử kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR, ARMSPCR giải trình tự gen Sanger Chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia kỹ thuật sinh học phần tử từ tế bào ối 4 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CẤU TRÚC VÀ CÁC DẠNG PHÂN TỬ HEMOGLOBIN 1.1.1 Cấu trúc phân tử Hb người bình thường Thalassemia rối loạn di truyền bất thường trình tổng hợp hemoglobin mà nguyên nhân thay đổi tỷ lệ tổng hợp chuỗi globin Bình thường loại chuỗi α globin “không α” globin cặp đôi với theo tỷ lệ 1:1, đột biến gen làm giảm ngừng sản xuất loại chuỗi globin định vài chuỗi (α, β, γ, δ) gây cân chuỗi globin Loại chuỗi globin tổng hợp bình thường trở nên dư thừa khơng cặp đơi, tích tụ tế bào hồng cầu gây phá hủy hồng cầu Thông thường người ta chia bệnh thalassemia làm loại, giảm không tổng hợp chuỗi α globin gây bệnh α thalassemia rối loạn tổng hợp chuỗi β globin gây thể bệnh β thalassemia Hình 1.1 Thành phần globin Hb bình thường (Nguồn: http://www.tutorialpoint.org/ProvaBiswas/HB_page1.html) Hemoglobin (Hb), hay gọi huyết sắc tố, chất chứa tế bào hồng cầu, có nhiệm vụ vận chuyển oxy từ phế nang đến tổ chức vận chuyển chuyển hóa tổ chức H+ CO2 đến thận phổi để đào thải Cấu trúc phân tử Hb gồm hai phần: phần Globin phần HEM Phần Globin có chất protein, đặc trưng cho lồi Ở người, phần globin cấu tạo từ chuỗi polypeptide, giống gắn với đôi Mỗi chuỗi polypeptide gắn với HEM Vì vậy, phân tử Hb có đơi chuỗi polypeptide HEM, có khả vận chuyển phân tử oxy 5 1.1.2 Các dạng phân tử hemoglobin Trong trình phát triển cá thể người, loại chuỗi polypeptide có chuyển đổi, loại chuỗi thay chuỗi giai đoạn sống Phân tích cấu trúc loại Hb khác người, tác giả Igram, Schoeden Brautnixer, Koemberg Hill chia chuỗi polypeptide loại sau đây: Chuỗi alpha (α), chuỗi beta (β), chuỗi gamma (), chuỗi delta (δ), chuỗi epsilon (ε ), chuỗi theta (ζ) Các chuỗi (ζ) chuỗi (ε) tồn tuần đầu thời kỳ bào thai, sau nhanh chóng thay chuỗi (α), (β), (), (δ) Các chuỗi tồn suốt đời mức độ khác Ở người trưởng thành gặp chủ yếu chuỗi (α), (β) số chuỗi (δ) chuỗi () Các loại chuỗi (β), (), (δ) kết hợp cặp với chuỗi (α) nên loại chuỗi gọi chung chuỗi “khơng α” Bảng 1.1 Thành phần globin Hb bình thường Loại Hb Thành phần Thời kỳ xuất globin HbA1 α2 β2 Bào thai tuần, Hb người bình thường HbA2 α2δ2 Thai nhi gần sinh, Hb người bình thường HbF α2γ2 Bào thai tuần, Hb chủ yếu thai nhi Hb Gower ζ2ε2 Phôi thai 2-3 tuần, tháng đầu thai Hb Gower α2ε2 Xuất có Hb Gower Hb PorlDNA ζ2γ2 Phôi thai - tuần đầu Bình thường phân tử Hb có cặp chuỗi polypeptide phần globin Các loại Hb khác có thành phần chuỗi polypeptide khác Gen α globin hoạt động tương đối sớm, từ cuối tháng đầu thời kỳ bào thai tồn suốt q trình phát triển cá thể Trong đó, tổ hợp gen β globin hoạt động thay đổi theo giai đoạn phát triển có thay cách trình tự chuỗi chuỗi khác 1.2 BỆNH THALASSEMIA 1.2.1 Khái niệm Thalassemia nhóm bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, đặc trưng suy giảm thiếu hụt tổng hợp chuỗi α β globin phân tử Hemoglobin (Cao and Galanello 2010) Tùy theo thiếu hụt xảy chuỗi α hay β globin mà gọi bệnh α hay β Thalassemia Đây bệnh di truyền phổ biến giới nguyên nhân gây thiếu máu, tan máu hàng đầu trẻ em 1.2.2 Dịch tễ học bệnh thalassemia Theo ước tính hiệp hội Thalassemia quốc tế (TIF), giới có khoảng 1,5% dân số giới người lành mang gen bệnh β Thalassemia, có khoảng 100.000 trẻ sơ sinh với bệnh thiếu máu β thalassemia sinh năm (Colah, Gorakshakar et al 2010) Bệnh thiếu máu β Thalassemia xảy phổ biến nước Địa Trung Hải, Bắc Phi, Trung Đông, Ấn Độ, Trung Á Đông Nam Á, tập trung chủ yếu châu Phi, Ấn Độ Đơng Nam Á, có Việt Nam 1.2.3 Cơ chế bệnh sinh Trong hội chứng Thalassemia có tượng chung thiếu hụt loại chuỗi polypeptit phần globin, gây dư thừa tương đối loại chuỗi (Cousens, Gaff et al 2010) Hiện tượng xảy mức độ khác phụ thuộc vào thể bệnh, song hậu gây ra: - Giảm tổng hợp Hb thiếu phần globin - Mất cân chuỗi α “khơng α” Người bình thường có hai gen β globinnằm NST tương đồng số 11 (β/β) Nếu hai gen bị đột biến (dị hợp tử β+ thalassemia β0 thalassemia), gọi người mang gen bệnh hay gọi thể nhẹ Nếu đột biến xảy hai gen hai NST gọi thể trung gian thể nặng tùy thuộc vào mức độ gây giảm tổng hợp chuỗi β globin Tỷ lệ mắc bệnh hai giới nam nữ Nếu bố mẹ mang gen dị hợp tử với đột biến, nguy lần sinh thai nhi người lành mang gen bệnh 50%, thai nhi người hồn tồn khỏe mạnh khơng mang gen bệnh 25%, thai nhi mắc bệnh β thalassemia thể nặng 25% Hiện tượng thứ nhất: giảm tổng hợp Hb Là hậu trực tiếp việc thiếu hụt tổng hợp phần globin thiếu loại chuỗi polypeptit nên làm giảm tổng hợp Hb Biểu hồng cầu nhược sắc tăng sinh hồng cầu non tủy Ở thể nhẹ, cân chuỗi α chuỗi β không nặng nề nên biểu giảm tổng hợp Hb không rõ rệt Hiện tượng thứ hai: cân loại chuỗi globin thiếu hụt loại chuỗi globin Việc thiếu hụt loại chuỗi globin gây dư thừa tương đối loại Trong bệnh β Thalalassemia thiếu hụt chuỗi β gây dư thừa chuỗi α globin Do tính chất lý hóa chuỗi α “khơng α” khác nên rối loạn chuỗi dư thừa gây khác Các chuỗi α dư thừa tạo thành hạt tủa xuống màng hồng cầu nguyên sinh chất hồng cầu Với hồng cầu máu ngoại vi, hạt tủa làm cho màng hồng cầu độ mềm dẻo, hồng cầu trở thành tế bào cứng nên khó vượt qua “màng lọc” lách Mặt khác làm cho màng tăng diện tiếp xúc, dễ bị tác nhân oxy hóa phá hủy Đồng thời làm thay đổi tính thấm màng hồng cầu nên kali bên tế bào ngồi huyết tương Những tác hại hạt tủa làm hồng cầu bị vỡ sớm gây nên tượng tan máu Còn tủy xương, hạt tủa gắn lên nguyên sinh chất màng hồng cầu non, làm cho hồng cầu bị chết trước trưởng thành, dẫn đến tăng sinh mạnh hồng cầu non tủy, gây nên biến dạng xương, tăng hấp thu sắt gây nhiễm sắt cho thể Hình 1.2 Sơ đồ chế bệnh sinh Thalassemia (Nguồn : Dương Bá Trực 1996) Hiện tượng hồng cầu non bị chết sớm không đến giai đoạn trưởng thành gọi tượng sinh hồng cầu không hiệu Đây chế chủ yếu gây biến đổi lâm sàng huyết học bệnh nhân β Thalassemia thể nặng Việc đột biến gen dẫn đến không tổng hợp giảm tổng hợp chuỗi globin, thay vào tăng tổng hợp chuỗi chuỗi để tạo thành HbF (22), tăng tổng hợp chuỗi chuỗi để taọ thành HbA2 ( 22) Vì vậy, người mang gen bệnh người bị bệnh thalassemia có số HbF HbA2 cao bình thường Nếu hai gen globin bị đột biến dần đến chức hoàn toàn, khơng sản xuất chuỗi globin, gọi 0 thalassemia, người bệnh khơng có HbA1 Nếu hai gen globin bị đột biến sản xuất chuỗi globin gọi + thalassemia thalassemia phối hợp với HbE tạo thành thể phối hợp thalassemia/HbE Thể có hồng cầu F từ 10-80% HbE 1.2.4 Đặc điểm lâm sàng bệnh β thalassemia 1.2.4.1 Thể nhẹ Người mang Thalassemia thể nhẹ thường mang đột biến gen Thalassemia Biểu lâm sàng: có thiếu máu nhẹ, MCV nhỏ, HbA2 tăng cao từ 3,5 đến 8,0%; HbF thường nhỏ 5% Những đối tượng không cần điều trị, truyền máu 1.2.4.2 Thể trung gian Bệnh nhân Thalassemia thể trung gian mang đột biến gen Thalassemia Biểu lâm sàng: thiếu máu nhẹ thể nặng nên thường phát bệnh sau tuổi Nhiều trường hợp không cần phải truyền máu định kỳ, truyền máu Hb < 70g/L Xét nghiệm thường có Hb >7g/dl, HbF 20 - 100%, HbA2 < 7% Bệnh nhân biểu bệnh rõ lách to, gan to, biến dạng xương mặt, chậm phát triển bệnh diễn biến lâu không truyền máu đủ Người có HbE/ Thalassemia thường biểu bệnh thể trung gian Các trường hợp Thalassemia thể trung gian thể gặp, dễ bỏ sót số dùng cho mục đích sàng lọc bệnh Thalassemia không đặc trưng 1.2.4.3 Thể nặng Thalassemia đồng hợp tử đa số thể nặng, bệnh thường phát sớm tuổi, thiếu máu nặng rõ, đòi hỏi phải truyền máu định kỳ, thường - tuần/ lần Xét nghiệm Hb thường < 7g/dl, HbA2 < 4; HbF >50% Nếu không điều trị điều trị không đầy đủ biểu rõ lâm sàng: mặt huyết tán mạn tính với mũi tẹt, gò má cao, bướu trán, bướu đỉnh, gan lách to, xạm da Ở giai đoạn muộn có biến chứng như: chậm dậy thì, đái tháo đường, loãng xương, suy tim Những bệnh nhân thường có tuổi thọ nhỏ 20 tuổi (Khanh.1985, Old, Traeger-Synodinos et al 2005, Weatherall 2005) Một số trường hợp HbE/ Thalassemia biểu thể nặng 10 1.2.5 Đặc điểm cận lâm sàng bệnh thalassemia 1.2.5.1 Xét nghiệm công thức máu Xét nghiệm công thức máu xét nghiệm việc phát người mang gen bị bệnh Thalassemia nói chung bệnh thalassemia nói riêng Kết xét nghiệm công thức máu đưa lại số thể tích trung bình hồng cầu (MCV), số lượng huyết sắc tố trung bình tìm thấy tế bào hồng cầu thể (MCH), lượng huyết sắc tố thể tích máu (Hb) Với người mang gen bệnh bị bệnh Thalassemia, số giảm, mức độ giảm phụ thuộc vào tùy dạng đột biến số lượng đột biến xảy 1.2.5.2 Điện di huyết sắc tố hemoglobin Mục đích phương pháp điện di huyết sắc tố tìm thành phần hemoglobin, đặc biệt thành phần hemoglobin bất thường Kết hợp với kết xét nghiệm công thức máu, bước đầu định hướng thể bệnh Thalassemia thường gặp Đối với việc chẩn đoán bệnh Beta thalassemia, người mang gen bệnh thường có số HbA2 ≥ 3,5%, số HbF tăng cao kiểu gen bệnh nhân kết hợp dị hợp tử hai đột biến đồng hợp tử đột biến Hiện nay, phương pháp điện di huyết sắc tố Cellulo acetat pH 6,8 sử dụng phổ biến, cho phép xác định thành phần hemoglobin mẫu máu bệnh nhân Tuy nhiên, trường hợp Beta thalassemia khơng điển hình, phương pháp không hemoglobin bất thường chiếm tỉ lệ ít, dẫn đến việc điểm cho xét nghiệm chẩn đốn xác định khơng hướng Điện huyết sắc tố phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) phương pháp lý tưởng để khắc phục nhược điểm trên, phương pháp nhiều nơi sử dụng chương trình sàng lọc người mang gen cộng đồng sàng lọc sơ sinh 1.2.6 Chẩn đoán bệnh thalassemia Theo tiêu chuẩn hội Thalassemia quốc tế (TIF) 2003, chẩn đoán bệnh thalassemia ban đầu dựa vào biểu lâm sàng: tan máu, thiếu máu mức độ nhẹ, trung bình nặng (Old, Traeger-Synodinos et al 2005) Có thể có vàng da, 11 gan lách to, chậm lớn, mặt thalassemia Có thể có tiền sử truyền máu chưa phải truyền máu Xét nghiệm công thức máu diện di Hb đóng vai trò quan trọng chẩn đốn bệnh ban đầu Tất trường hợp mắc bệnh có biểu thiếu máu mức độ khác nhau: Hb 2,6-13,3g/dl; MCV