Xác nhận giá trị sử dụng quy trình lamp phát hiện gen độc tố type a, b của vi khuẩn clostridium botulinum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO - BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG NGUYỄN ĐỨC TRƢỞNG H P XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG QUY TRÌNH LAMP PHÁT HIỆN GEN ĐỘC TỐ CỦA VI KHUẨN Clostridium botulinum TYPE A, B U H LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 8720601 HÀ NỘI, 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO - BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG NGUYỄN ĐỨC TRƢỞNG H P XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG QUY TRÌNH LAMP PHÁT HIỆN GEN ĐỘC TỐ CỦA VI KHUẨN Clostridium botulinum TYPE A, B U LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 8720601 H NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS ĐẶNG THỊ THÙY DƢƠNG TS DƢƠNG HỒNG QUÂN HÀ NỘI, 2022 i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài này, tơi TS Đặng Thị Thùy Dương TS Dương Hồng Quân nhiệt tình hướng dẫn, chỉnh sửa giúp đỡ suốt thời gian qua Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến hai quý thầy cô hướng dẫn Tơi xin trân trọng cảm ơn TS Lê Huy Hoàng ThS Tăng Thị Nga, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương TS Phạm Bảo Yên toàn thể thành viên nhóm nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu sản xuất quy trình LAMP phát nhanh gen độc tố Clostridium botulinum gây bệnh ngộ độc thịt” mã số 02/2021/ĐX cho phép tham gia đề tài, sử dụng phần số liệu tạo điều kiện thuận lợi để tơi H P thực hồn thành luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, quý Thầy Cô Trung tâm Xét nghiệm, quý Thầy Cô Trường Đại học Y tế công cộng ln tận tình hướng dẫn giúp đỡ, tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu trường Tôi xin chân thành cảm ơn ban Giám đốc, tập thể khoa Vi sinh bệnh viện Đa U khoa tỉnh Hải Dương giúp đỡ, hỗ trợ tạo điều kiện tốt cho để hồn thành khóa học Tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, vợ tơi ln đồng hành tơi thời gian vừa qua H Ngồi xin gửi lời cám ơn đến Thầy Cô hội đồng đánh giá kết nghiên cứu đề tài tơi Các Thầy Cơ có nhiều đóng góp q báu, dẫn giúp tơi hồn thiện đề tài tốt Đề tài bước khởi đầu nghiệp học tập nghiên cứu khoa học mình, nh ng lời cảm ơn chưa đủ để nói hết nh ng tình cảm thật đáng quý tất người bên giúp đỡ Tôi s mang theo nh ng tình cảm suốt hành trang đời ii MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .3 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn Clostridium botulinum 1.1.1 Đặc điểm hình thể tính chất sinh vật hóa học Clostridium botulinum .4 1.1.2 Tính chất ni cấy 1.1.3 Phân nhóm độc tố .5 1.1.4 Thực phẩm thường gây ngộ độc C botulinum 1.2 Dịch tễ học C botulinum giới Việt Nam H P 1.2.1 Trên giới 1.2.2 Tại Việt Nam 1.3 Xác nhận giá trị sử dụng phương pháp 1.3.1 Định nghĩa xác nhận giá trị sử dụng phương pháp 1.3.2 Mục đích xác nhận giá trị sử dụng phương pháp U 1.3.3 Phân biệt xác nhận phương pháp (Verification) xác nhận giá trị sử dụng phương pháp (Validation) 10 1.3.4 Các thông số xác nhận giá trị sử dụng phương pháp định tính sử dụng H nghiên cứu 11 1.3.4.1 Giới hạn phát (LOD) 12 1.3.4.2 Độ nhạy (Se) 12 1.3.4.3 Độ đặc hiệu (Sp) 12 1.3.4.4 Tỷ lệ dương tính giả 13 1.3.4.5 Tỷ lệ âm tính giả 13 1.3.4.6 Độ 13 1.3.4.7 Hệ số Kappa 14 1.4 Các phương pháp xác định độc tố C botulinum 15 1.4.1 Thử nghiệm gây chết chuột 15 1.4.2 Phương pháp miễn dịch học 15 iii 1.4.3 Quy trình ni cấy phân lập phát độc tố vi khuẩn C botulinum type A, B……………………………………………………………………………… 16 1.4.4 Phương pháp sinh học phân tử .17 1.5 Kỹ thuật LAMP 18 1.5.1 Lịch sử phát triển kỹ thuật LAMP 18 1.5.2 Nguyên lý chung kỹ thuật LAMP 18 1.5.3 Thành phần phản ứng LAMP 19 1.5.4 Cơ chế phản ứng LAMP 20 1.5.5 Ưu, nhược điểm kỹ thuật LAMP .21 1.5.5.1 Ưu điểm kỹ thuật LAMP 21 H P 1.5.5.2 Nhược điểm kỹ thuật LAMP 22 1.5.6 Ứng dụng LAMP chẩn đoán tác nhân gây bệnh 27 1.5.7 Nghiên cứu nước ứng dụng quy trình LAMP phát C botulinum 27 1.5.8 Nghiên cứu nước đánh giá quy trình LAMP phát C U botulinum 28 1.5.9 Nghiên cứu sản xuất kít LAMP phát nhanh gen độc tố Clostridium botulinum gây bệnh ngộ độc thịt 29 H Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .31 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 31 2.2 Đối tượng nghiên cứu 31 2.1.1 Nghiên cứu xác định giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả: 31 2.1.1 Nghiên cứu so sánh quy trình LAMP với quy trình ni cấy phân lập phát gen độc tố vi khuẩn C botulinum type A, B 31 2.3 Thiết kế nội dung nghiên cứu 32 2.3.1 Thiết kế thí nghiệm xác định giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả quy trình LAMP phát gen độc tố vi khuẩn C botulinum type A, B 32 2.3.1.1 Thí nghiệm xác định giới hạn phát mẫu: 32 iv 2.3.1.2 Thí nghiệm xác định độ đặc hiệu, độ nhạy, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ dương tính giả 34 2.3.2 Thiết kế thí nghiệm so sánh quy trình LAMP với quy trình ni cấy phát độc tố vi khuẩn C botulinum type A, B .34 2.3.3 Sơ đồ nghiên cứu 36 2.4 Cỡ mẫu 37 2.5 Phương pháp chọn mẫu 37 2.6 Phương pháp thu thập số liệu 37 2.7 Các biến số nghiên cứu 38 2.8 Các quy trình sử dụng nghiên cứu 39 H P 2.8.1 Quy trình tạo mẫu gây nhiễm thực nghiệm C botulinum .39 2.8.2 Quy trình LAMP với cặp mồi thiết kế đặc hiệu phát gen độc tố vi khuẩn C botulinum type A, B 39 2.8.2.1 Thành phần phản ứng LAMP 40 2.8.2.2 Các bước tiến hành 42 2.9 U Phương pháp phân tích số liệu: 45 2.10 Vấn đề đạo đức nghiên cứu .46 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48 3.1 H Xác định giá trị sử dụng quy trình LAMP phát gen độc tố vi khuẩn C botulinum type A, B 48 3.1.1 Mẫu thực phẩm (MMO) 48 3.1.2 Mẫu thực phẩm (MPC) 52 3.1.3 Mẫu lâm sàng (MP) 57 3.2 So sánh quy trình LAMP với quy trình ni cấy phân lập phát gen độc tố vi khuẩn C botulinum type A, B 62 3.2.1 So sánh kết xét nghiệm C botulinum type A, B quy trình LAMP với quy trình ni cấy phân lập phát gen độc tố .62 3.2.2 Kết so sánh khả áp dụng quy trình LAMP với quy trình ni cấy phân lập phát gen độc tố .66 Chƣơng BÀN LUẬN 69 v 4.1.Xác nhận giá trị sử dụng quy trình LAMP phát gen độc tố vi khuẩn C botulinum type A, B .69 4.1.1 Giới hạn phát (LOD) mẫu quy trình LAMP phát gen độc tố vi khuẩn C botulinum type A, B .70 4.1.2 Độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả quy trình LAMP phát gen độc tố vi khuẩn C botulinum type A, B mẫu…………………………………………………………………………………70 4.1.3 So sánh quy trình LAMP với quy trình PCR phát độc tố vi khuẩn C botulinum type A, B 71 4.2 So sánh quy trình LAMP với quy trình ni cấy phân lập phát gen độc tố H P vi khuẩn C botulinum type A, B 73 4.2.1 So sánh kết quy trình LAMP với quy trình ni cấy phân lập phát gen độc tố vi khuẩn C botulinum type A, B 73 4.2.2 So sánh khả áp dụng quy trình LAMP với quy trình ni cấy phân lập phát gen độc tố vi khuẩn C botulinum type A, B 75 U KẾT LUẬN 78 KHUYẾN NGHỊ 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 H PHỤ LỤC 89 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxy Ribonucleic bp : Base pair BoNT : Botulinum neurotoxin CDC : Trung tâm kiểm soát phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ CFU : Colony Forming Units CLSI : Clinical and Laboratory Standards Institute CS : Cộng ELISA : Enzyme – Linked Immunosorbent Assay Kappa : Hệ số Kappa LAMP : Loop – Mediated Isothermal Amplification LOD : Giới hạn phát MMO : Mẫu mật ong MP : Mẫu phân MPC : Mẫu pate chay NIHE : Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương PCR : Polymerase Chain Reaction Real – time PCR : Real – time Polymerase Chain Reaction SARS–CoV–2 Se Sp H U H P : Severe acute respiratory syndrome corona virus : Độ nhạy : Độ đặc hiệu vii DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1 Hình ảnh vi khuẩn C botulinum kính hiển vi điện tử .4 Hình 1.2 Hình ảnh khuẩn lạc C botulinum ni cấy thạch EYA Hình 1.3 Hình ảnh cấu trúc phân tử độc tố C botulinum type A, B .6 Hình 1.4 Hình ảnh ghi nhận toàn cầu ngộ độc thịt trẻ sơ sinh theo quốc gia từ năm 1976–2006 Hình 1.5 Hình ảnh vị trí thiết kế mồi LAMP 19 Hình 1.6 Hình ảnh tạo vật liệu khởi đầu 20 Hình 1.7 Hình ảnh tái kéo dài chuỗi ADN 21 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu……………………………………………….36 H P Hình 2.2 Hình ảnh tách chiết ADN từ mẫu thu thập 42 Hình Xác định giới hạn phát quy trình LAMP phát gen độc tố vi khuẩn C botulinum type A mẫu thực phẩm (MMO)…………………48 Hình 3.2 Xác định giới hạn phát sơ cấp quy trình LAMP phát gen độc tố vi khuẩn C botulinum type B mẫu thực phẩm (MMO) 49 U Hình 3.3 Kết xác định giới hạn phát quy trình LAMP phát gen độc tố vi khuẩn C botulinum type A mẫu thực phẩm (MPC) .53 Hình 3.4 Kết xác định giới hạn phát giai đoạn quy trình LAMP H phát gen độc tố vi khuẩn C botulinum type B mẫu thực phẩm (MPC) .54 Hình 3.5 Kết xác định giới hạn phát quy trình LAMP phát gen độc tố vi khuẩn C botulinum type A mẫu lâm sàng (MP) .58 Hình 3.6 Kết xác định giới hạn phát quy trình LAMP phát gen độc tố vi khuẩn C botulinum type B mẫu lâm sàng (MP) .59 Hình 3.7 Hình ảnh kết sáu mẫu MP dương tính quy trình LAMP xác định gen độc tố vi khuẩn C botulinum type A 63 Hình Hình ảnh kết sáu mẫu MMO mẫu dương tính quy trình LAMP xác định gen độc tố vi khuẩn C botulinum type A 63 Hình 3.9 Hình ảnh kết sáu mẫu MP dương tính quy trình LAMP xác định gen độc tố vi khuẩn C botulinum type B 65 viii Hình 3.10 Hình ảnh kết sáu mẫu MMO dương tính quy trình LAMP xác định gen độc tố vi khuẩn C botulinum type B 65 H P H U 108 Bƣớc Mơ tả Tạo dịng gen BoNT/A; BoNT/B: - Sản phẩm PCR sau gắn vào vector pGEM-t easy (Promega, Mỹ) theo hướng dẫn sử dụng sinh phẩm Dòng khuẩn lạc tái tổ hợp sàng lọc môi trường LB agar bổ sung kháng sinh, sau đó, ni cấy thu sinh khối tách plasmid để phục vụ cho việc xây dựng đường chuẩn làm đối chứng dương Kiểm tra plasmid điện di: - Khuếch đại gen mã hóa BoNT type A BoNT type B phương pháp PCR, kiểm tra sản phẩm nối tách plasmid Kiểm tra kích H P thước kết điện di Giải trình tự plasmid mang gen mã hóa độc tố botulinum type A, B để khẳng định trình tự ADN chứng dƣơng chuẩn q trình nhân dịng: - Kết giải trình máy giải trình tự tự động 3500, kết U phân tích cơng cụ Nucleotide BLAST sở d liệu NCBI H Khẳng định tính đặc hiệu ADN chứng dƣơng chuẩn đặc hiệu vi khuẩn C botulinum type A, B - Từ điện di sản phẩm PCR với cặp mồi F3-B3 tiến hành thực phản ứng LAMP để phát BoNT type A, B Khẳng định trình tự ADN chứng dương chuẩn trình nhân dòng 109 PHỤ LỤC IX ĐƠN XIN SỬ DỤNG SỐ LIỆU THỨ CẤP H P H U 110 H P H U 111 H P H U 112 H P H U 113 H P H U 114 H P H U 115 H P H U 116 H P H U 117 H P H U 118 H P H U 119 H P H U 120 H P H U 121 H P H U 122 H P H U