Nghiên cứu bệnh nhiễm độc tố botulin của vi khuẩn clostridium botulinum trên vịt tại một số tỉnh đồng bằng sông cửu long tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI Mã ngành: 62 64 01 02 NGUYỄN THU TÂM NGHIÊN CỨU BỆNH NHIẾM ĐỘC TỐ BOTULIN CỦA VI KHUẨN Clostridium botulinum TRÊN VỊT TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Cần Thơ- 2020 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN ĐỨC HIỀN Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại:……………………………., Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc … … ngày …… tháng … năm ……… Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CƠNG BỐ Nguyễn Thu Tâm, Đặng Ngọc Lễ 2014 Khảo sát triệu trứng bệnh tích chuột bạch tiêm dịch bệnh phẩm dịch ruột từ vịt chạy đồng nghi trúng độc botulin Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số Nông nghiệp 2014 107-110 Nguyễn Thu Tâm, Lý Thị Liên Khai, Nguyễn Đức Hiền 2016 Phân lập định danh ci khuẩn Clostridium spp từ đất ruộng huyện Phú Tân Châu Phú, tỉnh An Giang Tạp chí NN & PTNT, chun đề Nơng nghiệp xanh tháng 11/2016 73-77 Nguyễn Thu Tâm, Trần Thị Phận, Nguyễn Đức Hiền 2016 Phân lập định danh vi khuẩn Clostridium botulinum từ vịt bị liệt mềm cổ huyện Tân Phú Tri Tôn, tỉnh An Giang Tạp chí NN & PTNT, chun đề Nơng nghiệp xanh, tháng 11/2016 147-150 Nguyễn Thu Tâm, Nguyễn Đức Hiền, Hồ Thị Việt Thu 2016 Chẩn đoán bệnh “Cúm cần” vịt phương pháp thử nghiệm chuột bạch Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số Nông nghiệp 2016 125-130 Nguyễn Thu Tâm, Nguyễn Đức Hiền, Hồ Thị Việt Thu 2016 Phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum ốc bươu (Pila conica) cua đồng (Somannia theplusa) thành phố Cần Thơ, tỉnh An Giang Kiên Giang Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số Nông nghiệp 2016 131-134 Chương GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Đồng sơng Cửu Long (ĐBSCL) với hệ thống sơng ngịi chằng chịt khí hậu nóng ẩm mưa nhiều, nhiều ánh sáng, diện tích trồng lúa lớn rộng khắp, có nhiều động thực vật thủy sinh,… điều kiện thuận lợi để chăn ni vịt quanh năm, đặc biệt nuôi vịt chạy đồng Số lượng vịt nuôi theo phương thức chạy đồng ĐBSCL khoảng 31,5 triệu con, chiếm 70% đàn vịt vùng chiếm 40% tổng đàn vịt nước Phương thức ni có ưu điểm tận dụng thức ăn tự nhiên có sẵn lúa rơi vãi sau thu hoạch nông dân nhằm giảm đáng kể chi phí chăn ni Nhưng, điều mối đe dọa lớn cho ngành thú y khơng thể kiểm sốt mơi trường chăn thả dẫn đến nguy xảy dịch bệnh cao Một bệnh phổ biến đàn vịt chạy đồng Đồng Sông Cửu Long bệnh “limberneck” hay bệnh “cúm cần” theo cách đặt tên địa phương Bệnh cúm cần bệnh thủy cầm ngoại độc tố botulin vi khuẩn Clostridium botulinum gây ra; Thế nên, nhà khoa học gọi bệnh botulism Vi khuẩn Clostridium botulinum vi khuẩn kị khí tuyệt đối, có nha bào sinh bào tử hình oval, thường tồn đất, vùng bùn lắng trầm tích, xác lồi nhuyễn thể, ruột loài động vật cạn nước, sinh độc tố thần kinh botulinum neurotoxin mạnh, phá huỷ hoàn toàn thần kinh trung ương (Todar, 2009) Vịt ăn phải độc tố xuất triệu chứng liệt mềm cổ, liệt mí mắt, liệt cánh, liệt chân tử số cao, gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho người chăn nuôi (Rocke and Friend, 1998) Hiện nay, nhà khoa học nhân y thú y giới nghiên cứu botulism người loại gia cầm Tuy nhiên, nghiên cứu thông tin tình hình bệnh botulism, yếu tố nguy đặc điểm sinh học vi khuẩn Clostridium botulinum Việt Nam nói chung, Đồng sơng Cửu Long nói riêng cịn hạn chế Với mong muốn, thông qua nghiên cứu vẻ nên tranh toàn diện vi khuẩn Clostridium botulinum bệnh botulism vịt chay đồng Đồng sông Cửu Long Từ đó, đề tài “Nghiên cứu bệnh nhiễm độc tố botulin vi khuẩn Clostridium botulinum vịt số tỉnh Đồng sông Cửu Long” tiến hành 1.2 Mục tiêu đề tài - Đánh giá tần suất lưu hành bệnh botulism đàn vịt chạy đồng Đồng sông Cửu Long - Xác định diện vi khuẩn C botulinum xác định type độc lực botulin VCĐ - Đánh giá lưu hành vi khuẩn C botulinum phân lập môi trường nuôi VCĐ - Xác định khả gây bệnh chủng C botulinum phân lập ĐBSCL 1.3 Những điểm luận án - Đã đưa chứng khoa học xác thực lưu hành bệnh liệt mềm cổ vi khuẩn C botulinum vịt số tỉnh Đồng sông Cửu Long - Xác định yếu tố nguy gây bệnh botulinum vịt chạy đồng Đồng sông Cửu Long - Xác định type độc tố vi khuẩn Clostridium botulinum gây bệnh liệt cổ vịt - Kỹ thuật mouse bioassay áp dụng để xác định bệnh nhiễm độc tố botulin vi khuẩn Clostridium botulinum vịt Việt Nam 1.4 Ý nghĩa khoa học luận án Đây cơng trình Việt Nam nghiên cứu cách có hệ thống bệnh bệnh botulism vịt chay đồng Đồng sơng Cửu Long Từ xây dựng quy trình khoa học chẩn đoán xác định bệnh, đồng thời sở khoa học việc xây dựng qui trình phịng trị bệnh botulism vịt chạy đồng Đồng sơng Cửu long nói riêng, nước nói chung Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu 3.1.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu tiến hành từ tháng 10 năm 2013 đến tháng 10 năm 2018 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 3.1.2.1 Địa điểm thu thập mẫu Mẫu thu thập tỉnh thành phố Vùng đồng sông Cửu Long (ĐBSCL) bao gồm An Giang, Hậu Giang, Kiên Giang thành phố Cần Thơ 3.1.2.2 Phân tích mẫu ni chuột thí nghiệm Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn thử độc tố chuột phịng thí nghiệm Thú Y chun ngành 3, Bộ môn Thú Y, khoa Nông nghiệp, Đại học Cần Thơ 3.1.2.3 Thí nghiệm thực địa Thử nghiệm độc tố vi khuẩn C botulinum vịt đẻ thực Công ty TNHH Một thành viên chăn ni Vemedim, xã Thới Thạnh, huyện Ơ Mơn, Thành phố Cần Thơ 3.2 Trang thiết bị dụng cụ hóa chất Dụng cụ thiết bị Mẫu phiếu điều tra (phần phụ lục) - Thu thập thông tin từ niên giám thống kê Chi cục chăn nuôi Thú Y tổng đàn gia cầm, thời tiết, khí hậu, tình hình chăn ni vịt dịch bệnh địa điểm thu thập mẫu - Dụng cụ cần thiết phịng thí nghiệm vi sinh Hóa chất môi trường - Cồn 96o, cồn 70o, nước cất, dầu cedar, Crystal violet, Lugol, Safranine, Bromocresole purple, Gelatin Phosphat Buffer… (Merck, Đức) - Kháng sinh: sử dụng loại kháng sinh amikacin, ampicillin, amoxicillin, ceftiofur, cephalexin, doxycycline, florfenicol, fosfomycin, marbofloxacin, norfloxacin (Oxoid, Anh) - Ống chuẩn Mac Farland 0, (Biorad) - Môi trường Môi trường NB: Nutrient broth (Merck, Đức) Môi trường TSA: Tryptis Soy Agar (Merck, Đức) Môi trường CMM: Cooked Meat Media (Oxoid, Anh) Môi trường EYA: Egg Yorlk Agar (Merck, Đức) Môi trường Thioglycollate (Merck, Đức) Môi trường SFP Agar Base (Difco, Mỹ) Môi trường MHA: Mueller Hinton Agar (Merck, Đức) Các loại đường: Lactose, glucose, maltose, saccarose (Merck, Đức) Bộ phản ứng sinh hóa API 20A (Biorad) Máu cừu (cơng ty Nam Khoa- TP HCM) Môi trường TPGY broth: 5% Trypticase, 0.5% Pepton, 0.4% Glucose, 2% Yeast extract, 0.1% Sodium thioglycolate Môi trường CMM (Cooked Meat Medium) (Oxoid, Anh) Kháng độc tố dạng lỏng (antitoxins) type C, D, E (10UI/ml) (Statens Serum Institut, Đan Mạch) 3.3 Nội dung nghiên cứu 3.3.1 Nội dung 1: Tình hình bệnh botulism vịt chạy đồng (VCĐ) Đồng sông Cửu Long 3.3.1.1 Mục tiêu Đánh giá tần suất lưu hành bệnh botulism đàn vịt chạy đồng Đồng sông Cửu Long 3.3.1.2 Đối tượng nghiên cứu Vịt chạy đồng mắc bệnh botulism nuôi dưỡng địa bàn Đồng sông Cửu Long Những vịt chia theo mục đích ni bao gồm vịt thịt vịt đẻ Vịt thịt nuôi thả đồng từ 4-18 tuần tuổi, vịt đẻ bắt đầu tính tuổi sau 24 tuần tuổi 3.3.1.3 Phương pháp nghiên cứu a Tình hình chăn ni VCĐ ĐBSCL - Điều tra hồi cứu tình hình chăn ni vịt chạy đồng Phòng thống kê Chi cục Chăn nuôi Thú y địa điểm thu thập mẫu Tại đây, nhóm nghiên cứu thu thập thông tin tổng đàn VCĐ, thuận lợi bất lợi điều kiện tự nhiên chăn nuôi vịt theo phương thức chạy đồng từ năm 2012-1014 b Tình hình bệnh botulism vịt chạy đồng (VCĐ) Đồng sông Cửu Long - Điểu tra cắt ngang tiến cứu tình hình bệnh botilism VCĐ địa điểm thu thập mẫu - Cỡ mẫu nghiên cứu : Phân bố mẫu tỉnh cần khảo sát trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Phân bố mẫu khảo sát địa điểm lấy mẫu Địa điểm Tỉnh An Giang Thành phố Cần Thơ Tỉnh Hậu Giang Tỉnh Kiên Giang Tổng Vịt thịt (con) 20.000 19.000 18.000 22.000 79.000 Vịt đẻ (con) 25.800 28.700 25.350 31.200 108.505 Bước Điều tra Trong trình điều tra thu mẫu địa bàn hợp tác với thú y địa phương để biết tình hình đàn VCĐ địa bàn quản lý, hỏi chủ ni tình hình sức khỏe đàn vịt đồng thời quan sát trạng thái thần kinh trình vận động vịt Nếu đàn vịt có xuất triệu chứng bệnh botulism xù lông, giảm ăn, yếu chân, liệt mềm cổ, liệt mí mắt, liệt cánh, liệt chân tiến hành lập phiếu điều tra (Phụ lục 1), đồng thời thương lượng mua mẫu vịt bệnh để nghiên cứu + Bước 2: Lấy mẫu Mẫu bệnh phẩm lấy vịt bệnh sống vừa chết (1) Trên vịt bệnh sống, lấy khoảng 5-10 ml máu từ tỉnh mạch cổ, mổ khảo sát bệnh tích đại thể nội quan, thu bệnh phẩm nội quan phân ống tiêu hóa gan (2) trường hợp vịt vừa chết tiến hành mổ kháo sát lấy mẫu giống Mỗi đàn vịt lấy từ 1-5 bệnh phẩm 3.3.1.4 Chỉ tiêu theo dõi + Tỷ lệ bệnh botulism VCĐ ĐBSCL + Tần suất xuất triệu chứng lâm sàng bệnh botulism + Tần suất xuất bệnh tích bệnh botulism 3.3.2 Nội dung Phân lập vi khuẩn C botulinum xác định độc tố botulin VCĐ mắc bệnh botulism 3.3.2.1 Mục tiêu Xác định diện vi khuẩn C botulinum xác định type độc lực botulin VCĐ 3.3.2.2 Đối tượng nghiên cứu Huyết bệnh phẩm VCĐ bệnh botulism nộidung 3.3.2.3 Phương pháp tiến hành a Phân lập vi khuẩn C botulinum bệnh phẩm vịt bệnh Phân lập vi khuẩn C botulinum bệnh phẩm vịt bệnh theo Lindstrom and Korkeala (2006) qui trình có cải tiến trình bày Hình 3.1 Chất chứa ruột, gan Đất, nước, cua ốc Cấy trực tiếp lên môi trường thạch máu SFP Chọn khuẩn lạc điển hình, khơ dẹt Nhuộm Gram (trực khuẩn, Gr+, có nha bào, thuần) Kiểm tra đặc tính sinh hóa API 20A Xác định vk Clostridium botulinum giữ giống CMM/ thioglycolate Cấy (các khuẩn lạc đồng nhất) Cấy vào môi trường CMM (Tất bước thực ủ yếm khí 370C/24-48h) Hình 3.1 Qui trình ni cấy, phân lập vi khuẩn Clostridium botulinum (Lindstrom and Korkeala, 2006) qui trình có cải tiến Hình 3.2: Khuẩn lạc vi khuẩn C botulinum thạch máu Hình 3.3: Khuẩn lạc VK C botulinum mơi trường SFP Hình 3.4: Hình ảnh nha bào vi khuẩn C botulinum KHV (X 100) b Kiểm tra đặc tính sinh hóa API 20A (theo hướng dẫn nhà sản xuất) Bảng 3.2 Đặc tính sinh hóa vi khuẩn C botulinum PI20A c Xác định độc tố botulin vi khuẩn C botulinum - Chuẩn bị huyết thanh: Huyết rả đông, lọc qua màng lọc 0,45 µm thu dịch lọc vô trùng - Chuẩn bị động vật thí nghiệm: chuột SPF có nguồn gốc từ viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh, tiếp tục ni ngày để thích nghi với mơi trường sống trước tiến hành thí nghiệm - Bố trí thí nghiệm Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm Thí nghiệm I Thí nghiệm II Đói chứng Số lượng (con) 400 400 20 Liều (ml/con) 0,5 0,5 0,5 Dịch lọc huyết kiểm tra khơng có diện vi khuẩn cách cáy môi trường thạch máu mơi trường SFP, ủ điều kiện hiếu khí kỵ khí 37oC 24 Mẫu huyết sử dụng thí nghiệm phải đảm bảo vơ trùng Cách đọc kết Nếu chuột thí nghiệm I xuất triệu chứng liệt chân, liệt mí mắt, xù lông, thở bụng chết, đồng thời chuột thí nghiệm II Cách đọc kết Sau ngày chuột thí nghiệm cịn khỏe mạnh bình thường kết luận huyết mang type độc tố tương ứng; nghĩa độc tố huyết bị trung hòa kháng độc tố tương ứng thêm vào Chuột thí nghiệm đối chứng: ln ln khỏe mạnh khơng có biểu khác thường Phương pháp xác định type độc tố botulin huyết vịt theo CDC (1998) trình bày tron Hình 3.7 3.3.2.4 Chỉ tiêu theo dỏi -Tỷ lệ diện vi khuẩn bệnh phẩm -Tỷ lệ huyết có độc tố -Tỷ lệ lưu hành type độc tố -Tần suất xuất triệu chứng lâm sàng đặc trưng chuột bị nhiểm độc tố botulin -Tần xuất xuất bệnh tích đại thể chuột bị nhiểm độc tố botulin 3.3.3 Nội dung Xác định các yếu tố nguy gây bệnh botulism VCĐ ĐBSCL 3.3.3.1 Mục tiêu Đánh giá lưu hành vi khuẩn C botulisum xác định khả gây bệnh chủng phân lập môi trường nuôi VCĐ 3.3.3.2 Đối tượng nghiên cứu: môi trường chăn nuôi: đất, nước, cua, ốc 3.3.3.4 Phương pháp thực a lấy mẫu Song song với việc lấy mẫu VCĐ bệnh botulism mẫu mơi trường ni có đàn vịt bệnh thu thấp bao gồm đất, nước, cua ốc Cỡ mẫu phân bố bảng 3.5 Bảng 3.5 Phân bố mẫu môi trường nuôi Địa điểm Bùn đất (mẫu) Nước (mẫu) An Giang 159 159 Cần Thơ 141 141 Hậu Giang 144 144 Kiên Giang 156 156 Tổng cộng 600 600 10 Cua (mẫu) 63 42 50 61 216 Ốc (mẫu) 106 94 96 104 400 Tổng 645 563 582 646 2.436 Đối với mẫu đất nước, số lượng mẫu cần lấy mẫu Đất ngập nước lấy mẫu độ sâu 5-10 cm Mỗi mẫu có khối lượng khoảng 25-30g Mẫu nước lấy khoảng50-100ml lọ vô trùng Đối với mẫu cua, ốc: lấy 2-3 mẫu cua, ốc, trữ lọ vô trùng, chọn cua, ốc chết cua nhỏ, ốc nhỏ cịn sống (vịt nuốt được) Tất mẫu bảo quản lạnh (Giovanna Franciosa et al., 1996) b Phân lập vi khuẩn C botulinum từ đất, nước, cua, ốc Phương pháp thực tiến hành mô tả phân lập vi khuẩn C botulinum mục 3.3.2.3 3.3.3.5 Chỉ tiêu theo dõi Tỷ lệ diện vi khuẩn mẫu đất nước ruộng Tỷ lệ diện vi khuẩn mẫu cua, ốc 3.3.4 Nội dung Tính gây bệnh vi khuẩn C botulinum phân lập vịt bệnh 3.3.4.1 Mục tiêu: Xác định khả gây bệnh chủng C botulinum phân lập 3.3.4.2 Đối tượng nghiên cứu: chủng C botulinum phân lập nội dung nội dung 3.3.4.3 Phương pháp tiến hành a Kiểm tra độ mẫn cảm kháng sinh vi khuẩn C botulinum Sử dụng phương pháp kháng sinh đồ dựa khuếch tán kháng sinh thạch đĩa Kirby-Bauer (Bauer et al., 1966) Đánh giá mức độ nhạy cảm kháng sinh dựa đường kính vịng vơ khuẩn theo tiêu chuẩn Clinical and Laboratory Standards Institute (2019) - Phương pháp thực kháng sinh đồ: Chuẩn bị canh trùng vi khuẩn Clostridium botulinum cho đạt nồng độ 108 CFU/ml (bằng cách so độ đục với ống chuẩn Mc Farland 0, 5) Dùng que tăm vô trùng nhúng vào canh trùng, ép vào thành ống nghiệm cho bớt nước ria khắp mặt thạch MHA 11 Bảng 3.6: Tiêu chuẩn đường kính vịng vơ khuẩn số loại kháng sinh (CLSI, 2019) Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) Hàm lượng STT Loại kháng sinh Mẫn cảm trung (μg) Nhạy Kháng bình Amikacin 30 ≥ 17 15-16 ≤ 14 Ampicillin 10 ≥ 17 14-16 ≤ 13 Amoxicillin 25 ≥ 18 14-17 ≤ 13 Ceftiofur 30 ≥ 21 18-20 ≤ 17 Cephalexin 30 ≥ 18 15-17 ≤ 14 Doxycycline 30 ≥13 10-12 ≤9 Florfenicol 30 ≥19 15-18 ≤14 Fosformycin 200 ≥16 13-15 ≤12 Marbofloxacin ≥18 16-17 ≤15 10 Norfloxacin 10 ≥17 13-16 ≤12 b Thử nghiệm độc tố botulin vịt - Chuẩn bị canh khuẩn chứa độc tố botulin Quy trình chuẩn bị canh khuẩn chứa độc tố botulin theo Cook et al (1998) trình bày Hình 3.6 Chọn vài khuẩn lạc Clostridium botulinum môi trường TSA (khuẩn lạc mẫu giám định khả gây chết chuột thí nghiệm Cấy Mơi trường TPGY broth Ủ yếm khí canh khuẩn 37oC/24giờ Mơi trường CMM (Cooked Meat Medium) Ủ yếm khí 37oC/5 ngày Lấy 10 ml huyễn dịch CMM Ly tâm 12.000 vòng/phút, 15 phút/5oC Thu phần nước lọc qua màng lọc 0,45 µm Dung dịch mẫu có chứa độc tố botulin Hình 3.6 Sơ đồ quy trình chuẩn bị canh khuẩn chứa độc tố botulin 12 Thí nghiệm xác định LD50 (liều gây chết 50% vịt) Dịch có chứa độc tố chuẩn bị theo Hình 3.6 Tổng cộng 90 vịt sử dụng để xác định liều LD50 qua hai đường tiêm uống Lô I thử nghiệm độc tố C botulinum qua đường uống với liều ml, ml, ml, 10 ml Mỗi nồng độ tiến hành với vịt mẫu canh khuẩn Lô II thử nghiệm độc tố C botulinum qua đường tiêm tĩnh mạch cánh với liều ml, ml, ml, ml, ml, ml tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch cánh vịt Mỗi nồng độ tiến hành với vịt mẫu canh khuẩn Bố trí thí nghiệm thử độc tố botulin vịt trình bày Bảng 3.7 Bảng 3.7 Bố trí thí nghiệm để xác định liều LD50 độc tố botulin Thí nghiệm Liều (ml) Số mẫu kiểm tra (mẫu) Số vịt khảo sát (con) Đường cấp Tĩnh mạch Đường uống 3 3 3 3 9 9 9 9 10 Xác định liều gây chết 50% động vật thí nghiệm mẫu canh khuẩn lấy giá trị trung bình Cơng thức xác định liều gây chết 50% động vật thí nghiệm theo Reed Muench (1938) LD50 = - x (b-a) + a A: Tỉ lệ phần trăm (%) chết sát 50% B: Tỉ lệ phần trăm (%) chết sát 50% a: Nồng độ pha loãng A b: Nồng độ pha loãng B Chuẩn bị vịt thí nghiệm: Vịt có tầm vóc nhỏ, lông mướt, mắt tinh anh, nhanh nhẹn Chuồng trại môi trường nuôi đảm bảo điều kiện tốt cho vịt sinh sống phát triển Trước thực thí nghiệm, vịt đưa vào chuồng thí nghiệm ổn định ngày cho quen với điều kiện chuồng Tiêm truyền độc tố botulin cho vịt: Độc tố tiêm vào tĩnh mạch cánh vịt cho uống thiết kế thí nghiệm Sau tiêm, tiếp tục chăm sóc, ni dưỡng theo dõi tình trạng sức khỏe vịt ngày 13 Khảo sát triệu chứng Vịt thí nghiệm sau tiêm cho uống độc tố botulin quan sát, ghi nhận tình trạng sức khỏe thông qua việc quan sát biểu lâm sàng Nhưng thông tin ghi chép vào phiếu theo dõi cá thể lần/ngày (6 giờ, 12 giờ, 18 sau tiêm uống đến vịt chết) Ghi nhận biểu bên vịt như: tình trạng đứng, hoạt động, lơng, tiếng kêu, phản ứng bị dồn đuổi, tình hình ăn uống, quan sát nhịp thở, tình trạng phân, tình trạng bơi lội Khảo sát bệnh tích Vịt thí nghiệm mổ khám chết vừa chết, quan sát ghi vào biên mổ khám để tìm dấu hiệu bệnh tích hệ thống thần kinh (não), hơ hấp (khí quản, phổi), tuần hồn (tim), tiêu hóa (thực quản, dày tuyến, dày cơ, ruột non, ruột già, hậu môn), da, cơ, mô liên kết, mô lympho quan nội tạng khác gan, lách, thận Chụp hình bệnh tích điển hình bệnh nhiễm độc tố botulin vịt để làm tài liệu 3.3.4.3 Chỉ tiêu theo dõi: - Tỷ lệ vịt chết ngày sau tiêm uống liều tiêm/uống với dấu hiệu đặc trưng trúng độc botulin - Tần suất xuất triệu chứng lâm sàng đặc trưng bệnh botulism vi khuẩn C botulinum - Tần suất xuất bệnh tích nội tạng 3.6 Xử lý số liệu Số liệu xử lý phương pháp thống kê phân tích sử dụng phần mềm Excel (Chi-quare Yates Fixer’s), Minitab 16.0 với độ tin cậy 95% 14 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Tình hình bênh botulism vịt chạy đồng Đồng sông Cửu Long (ĐBSCL) 4.1.1 Bệnh botulism vịt chạy đồng Đồng sơng Cửu Long: trình bày Bảng 4.1 Bảng 4.1: Tỷ lệ vịt bệnh botulism Đồng sông Cửu Long Địa phương Số đàn Số khảo sát (con) An Giang Cần Thơ Hậu Giang Kiên Giang Tổng 53 47 48 52 200 45.800 44.700 43.350 53.200 187.050 Vịt bệnh botulism Số lượng (con) Tỷ lệ (%) 558 1,22 497 1,11 547 1,26 633 1,19 2.235 1,19 Bảng 4.1 thể hiện, vịt bệnh botulism tỉnh Hậu Giang chiếm tỷ lệ cao (1,26%) Tuy nhiên, tỷ lệ vịt bệnh tỉnh khảo sát khác khơng có ý nghĩa thống kê Điều kết luận vịt chạy đồng tỉnh Đồng sông Cửu Long có khả mắc phải ngoại độc tố thần kinh botulin vi khuẩn C botulinum, gây triệu chứng liệt cổ, liệt mi mắt, liệt cánh liệt chân mà người dân địa phương gọi bệnh cúm cần 4.1.2 Tình hình vịt bệnh botulism theo mục đích ni: trình bày Bảng 4.2 Bảng 4.2 Tỷ lệ vịt bệnh botulism theo mục đích ni Mục đích nuôi SL khảo sát (con) Vịt thịt 99.676 Vịt đẻ 87.374 Tổng 187.050 SL bệnh (con) 905 1.330 2.235 Tỷ lệ (%) 0,91a 1,52b 1,19 Vịt thịt nuôi thả đồng từ 4-12 tuần tuổi, đến tuần thứ 12 (bán thịt) người dân bắt đầu tuyển chọn vịt đẻ từ bầy vịt thit nuôi kéo dài nhiều năm để khai thác trứng Như vậy, vịt đẻ bắt đầu sau 12 tuần tuổi Bảng 4.2 thể hiện, tỷ lệ vịt đẻ mắc bệnh botulism (1,52%) cao vit thịt (0,91%) Bởi vịt đẻ có thời gian ni dài, có hội tiếp xúc với mầm bệnh nhiều nên khả chúng bị ngộ độc chết ăn phải thức ăn nhiễm độc cao Kết nghiên cứu phù hợp với nhận định Boroff & Reilly (1959); Gross & Smith (1971) Hơn nữa, Haagsma (1987) cho thủy cầm ngộ độc botilin, sau điều trị khỏi bệnh miễn dịch 15 4.1.3 Triệu chứng lâm sàng đặc trưng bệnh botulism vịt Bảng 4.3 Tuần suất xuất triệu chứng lâm sàng vịt bệnh botulism (n=2.235) Triệu chứng SL (con) Tỷ lệ (%) Giảm ăn Ủ rũ, Xù lông, vận động 1532 68,55 Liệt cổ 1965 87,92 Liệt mí mắt, đồng tử dãn 2013 90,07 Liệt chân 1783 79,78 Tiêu chảy phân trắng- xanh 1586 70,96 Tiêu chảy máu 768 34,36 Bảng 4.3 thể hiện, triệu chứng liệt cổ, liệt mí mắt đồng tử dãn liệt chân xuất tần suất cao 87,92%, 90,07%, 79,78% Độc tố botulin phá hủy thần kinh trung ương, gây ức chế dây thần kinh cơ, thần kinh vận động có miệng, mắt Vì thể, làm cho vịt từ yếu chân giảm vận động đến bại liệt, cổ, mắt bị mềm Năm 2010, tác giả Na-Ri Shin báo cáo trận dịch ngộ độc botulin vịt chim hoang dã Tác giả cho triệu chứng chủ yếu khảo sát 2000 trường hợp ngộ độc vịt bị liệt cổ, liệt mí mắt Một số triệu chứng khác vịt tiêu chảy máu (34,36%) 4.1.4 Bệnh tích đại thể vịt bệnh botulism Bảng 4.4 : Tần suất xuất bệnh tích đại thể vịt bệnh botulism (n=420) Bệnh tích SL (con) Tỷ lệ (%) Phổi phù - xuất huyết 362 86,19 Gan xuất huyết 401 95,48 Thận xuất huyết 57 13,57 Lách sưng - xuất huyết 40 9,52 Ruột sinh hơi, trống thức ăn 387 92,14 Xuất huyết bệnh tích thường gặp vịt có triệu chứng liệt mềm cổ Trong Bảng 4.4 cho thấy bệnh tích gan, phổi xuất huyết chiếm tỷ lệ cao 95,48%, 86,19%, bệnh tích ruột sinh chiếm tỷ lệ cao 92,14% Kết phù hợp với kết nghiên cứu Jensen and Duncan (1980), tác giả nghiên cứu độc tố botulin thuỷ cầm hoang dã gây nhiễm cho vịt trời độc tố botulin thấy hầu hết trường hợp vịt chết ngộ độc botulin liệt hô hấp, xuất huyết phổi, gan, phù phổi 16 4.2 Phân lập vi khuẩn C botulinum xác định độc tố botulin VCĐ mắc bệnh botulism 4.2.1 Phân lập vi khuẩn C botulinum bệnh phẩm vịt bệnh botulism Bảng 4.5: Tỷ lệ vi khuẩn C botulinum diện bệnh phẩm vịt bệnh botulism Loại mẫu Phân Gan Địa điểm SLPL SLHDVK Tỷ lệ SLPL SLHDVK Tỷ lệ (%) (mẫu) (mẫu) (%) (mẫu) (mẫu) An Giang 52 28 53,05 53 26 49,06 Cần Thơ 49 21 42,86 49 21 42,86 Hậu Giang 50 27 54,00 50 19 38,00 Kiên Giang 58 30 51,72 59 25 42,37 Tổng 209 106 50.72 116 91 43.13 Bảng 4.5 thể hiện, tỷ lệ diện vi khuẩn C botulinum mẫu phân vịt bệnh chiếm tỷ lệ cao mẫu gan vi khuẩn C botulinum với tỷ lệ 50,72% 43,13% Tuy nhiên tỷ lệ khác nhâu khơng có ý nghĩa thống kê (P>0,05); đồng thời tỷ lệ vi khuẩn C botulinum diện phân gan vịt bệnh tỉnh nghiên cứu khác khơng có ý nghĩa thống kê 4.1.2 Xác định độc tố huyết vịt bệnh botulism thừ nghiệm chuột bạch 4.1.2.1 Kết gây độc chuột Bảng 4.6 Tỷ lệ chuột bị nhiễm độc botulin huyết vịt bệnh botulism Lô đối chứng (n = Lô I (n = 200) Lô II (n = 200) 20) Tình trạng chuột Tỷ lệ Tỷ lệ Tỷ lệ SL (con) SL (con) SL (con) (%) (%) (%) Chuột chết 0 0 126 63 Bất thường (*) 74 37 0 0 Bình thường 0 20 100 200 100 Nhiễm bệnh 200 100 0 0 SL: số lương, (*): Chuột ủ rũ, bỏ ăn xù lông, tiêu chảy, thở bụng Kết bảng 4.4 cho thấy, Lô I- không xử lý nhiệt xuất 63% chuột chết 37% chuột bất thường; Lơ II với 100% chuột bình thường Kết thí nghiệm hồn tồn trùng khớp với giả thuyết ban đầu đặt phù hợp với mô tả CDC- Hoa Kỳ (1998) Như vậy, vịt có triệu chứng mềm cổ liệt chân nuôi chạy đồng ĐBSCL độc tố botulin vi khuẩn C botulinum 17 4.1.2.2 Kết xác định type độc tố botulin Kết (1) (2) (3) Bảng 4.7 Xác định type độc tố botulin (n=126) Type C Type D Type E Type C+D Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ Số Tỷ lệ mẫu (%) mẫu (%) mẫu (%) mẫu (%) 49 26 51 38,89 20,64 40,48a 72 22 32 57,14 17,46 25,40b Type C+E Số Tỷ lệ mẫu (%) Đối chứng Số Tỷ lệ mẫu (%) 65 51,59 25 19,84 36 28,57b 0 0 12 100 3,97 1,59 (1) Khơng trung hịa(chuột chết), (2) Trung hòa phần (chuột xuất triệu chứng bệnh lý khơng chết), (3) Chuột khỏe mạnh bình thường Bảng 4.7 rằng, tỷ lệ mẫu huyết chứa độc tố botulin type C cao, chiếm 40,48%; mẫu huyết chứa độc tố botulin type E với tỷ lệ 28,57%, thấp mẫu huyết chứa độc tố botulin type D với 25,40% tỷ lệ khác có ý nghĩa (P