Phân lập, định danh virus viêm gan vịt ở một số tỉnh đồng bằng sông cửu long và sản xuất kháng thể phòng bệnh tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã ngành: 62 42 01 07 TÊN NCS: PHẠM CÔNG UẨN PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VIRUS VIÊM GAN VỊT Ở MỘT SỐ TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ SẢN XUẤT KHÁNG THỂ PHÒNG BỆNH Cần Thơ, 2019 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: PGS.TS Hồ Thị Việt Thu Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: Phòng Bảo vệ luận án tiến sĩ, Lầu 2, Nhà Điều hành, Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc ………… ngày ……… tháng …… năm ……… Phản biện 1: ………………………… Phản biện 2: ………………………… Phản biện 3: ………………………… CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG ……………………………………… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Phạm Cơng Uẩn Hồ Thị Việt Thu, 2014 Phân lập định danh virus viêm gan vịt type tỉnh Hậu Giang Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số chuyên đề: Nông nghiệp, 2: 116-121 Phạm Công Uẩn Hồ Thị Việt Thu, 2016 Khảo sát độc lực tính gây bệnh chủng virus viêm gan vịt A genotype phơi vịt Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Số chuyên đề: Nông nghiệp, 42: 710 Phạm Công Uẩn Hồ Thị Việt Thu, 2018 Khảo sát độc lực virus viêm gan vịt phân lập từ đàn vịt tỉnh Hậu Giang Tạp chí Khoa học Trường Đại Học Cần Thơ Số chuyên đề: Nông nghiệp, 54 (1B):1-6 PHẦN MỞ ĐẦU CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết luận án Bệnh viêm gan vịt virus bệnh nguy hiểm gây tổn thất lớn cho ngành chăn nuôi vịt tỷ lệ bệnh chết cao Hiện nay, bệnh phổ biến phát triển nhanh đàn vịt con, đặc biệt đồng sông Cửu Long Tuy nhiên chưa nhiều nghiên cứu bệnh nđược thực hiện, cho nên, bệnh mối đe dọa lớn đến sức khỏe đàn vịt ảnh hưởng đến hiệu kinh tế người chăn nuôi vịt vùng Việc xác định loại virus gây bệnh chủ yếu tự nhiện sử dụng chúng làm kháng nguyên việc sản xuất vacxin kháng thể điều cần thiết cơng tác phòng trị bệnh đặc hiệu, nhằm bảo vệ sức khỏe đàn vịt cách tốt Xuất phát yêu cầu thực tiễn trên, nghiên cứu “Phân lập, định danh virus viêm gan vịt số tỉnh đồng sông Cửu Long sản xuất kháng thể phòng bệnh” thực 1.2 Mục tiêu luận án Phân lập, định danh virus gây bệnh viêm gan vịt từ ổ dịch tự nhiên Nghiên cứu mối quan hệ di truyền nguồn gốc virus viêm gan vịt phân lập Sản xuất kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà, thử nghiệm phòng trị bệnh từ chủng virus phân lập 1.3 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Phân lập định danh virus gây bệnh viêm gan vịt tỉnh ĐBSCL Nội dung 2: Nghiên cứu mối quan hệ di truyền chủng virus gây viêm gan vịt phân lập tai tỉnh đồng sông Cửu Long Nội dung 3: Khảo sát độc lực tính gây bệnh chủng virus DHAV-3 đại diện, ký hiệu: DHAV3-HG2 Nội dung 4: Sản xuất kháng thể kháng virus viêm gan vịt công nghệ tạo kháng thể IgY gà ứng dụng phòng, trị bệnh 1.4 Thời gian địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu thực từ năm 2012 đến năm 2016 Mẫu bệnh phẩm vịt bệnh viêm gan virus thu thập từ thành phố Cần Thơ tỉnh Vĩnh Long, Trà Vinh, Kiên Giang, Hậu Giang Việc phân lập, định danh virus thực phòng thí nghiệm Virus học (Bộ mơn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp Sinh Học ứng dụng) phòng Sinh học phân tử viện Cơng Nghệ Sinh Học, Đại học Cần Thơ Việc giải trình tự nucleotide thực công ty Macrogen, Hàn Quốc 1.5 Những đóng góp luận án Xác định virus viêm gan vịt type I genotype (DHAV-3) tác nhân chủ yếu gây bệnh viêm gan vịt ĐBSCL Chủng DHAV-3 đồng trình tự nucleotide đoạn gen khảo sát từ vị trí nucleotide 2.842 đến vị trí nucleotide 3.081 thuộc tổ hợp gen P2 gen DHAV-3 phân dòng thành nhóm riêng biệt so sánh với chủng DHAV-3 khác nước châu Á Sản xuất thành công kháng thể IgY tinh chế từ chủng DHAV-3 phân lập ĐBSCL thử nghiệm phòng trị bệnh viêm gan vịt đạt hiệu điều kiện thí nghiệm 1.6 Bố cục luận án Luận án dài 173 trang, gồm chương: giới thiệu, lược khảo tài liệu, vật liệu phương pháp nghiên cứu, kết thảo luận, kết luận đề nghị, phần tài liệu tham khảo phụ lục Luận án có 30 Bảng, 32 Hình 1141 tài liệu tham khảo PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bệnh viêm gan vịt virus gây ba loại virus khác gọi virus viêm gan vịt type I, type II type III Virus viêm gan vịt type I hay gọi virus viêm gan vịt A (DHAV) thuộc họ Picornaviridae, chi Avihepatovirus DHAV có kiểu gen khác virus viêm gan vịt type I genotype (DHAV-1), virus viêm gan vịt type I genotype (DHAV-2) virus viêm gan vịt type I genotype (DHAV-3) Virus viêm gan vịt type II phân loại Astrovirus vịt type ( DAstV-1 ), virus viêm gan vịt type III Astrovirus vịt type ( DAstV-2 ) thuộc họ Astroviridae DAstV-1 báo cáo chủ yếu Anh, DAstV-2 báo cáo Mỹ (OIE, 2010) ĐBSCL khu vực sản xuất vịt quan trọng nước bệnh viêm gan virus vịt xảy thường xuyên, gây thiệt hại lớn cho người chăn ni vịt chưa có nghiên cứu bệnh Do đó, việc xác định loại virus gây bệnh chủ yếu tự nhiện sử dụng chúng làm kháng nguyên việc sản xuất vacxin kháng thể điều cần thiết công tác phòng trị bệnh đặc hiệu, nhằm bảo vệ sức khỏe đàn vịt cách tốt Ngày nay, với phát triển công nghệ sinh học phân tử, đặc biệt kỹ thuật gen, nên việc xác định chủng virus gây bệnh, nghiên cứu đặc điểm di truyền mối quan hệ nguồn gốc chúng sở quan trọng để xây dựng qui trình phòng trị bệnh cách hiệu CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương pháp phân lập, định danh nghiên cứu di truyền virus 3.1.1 Phương pháp phân lập virus viêm gan vịt môi trường phôi trứng vịt 92 huyễn dịch bệnh phẩm (HDBP) gan, lách từ 92 đàn vịt nghi ngờ bệnh thu thập ĐBSCL tiêm vào xoang niệu mô phôi vịt 12 ngày tuổi, huyễn dịch bệnh phẩm tiêm vào phơi; sau theo dõi: thời gian phơi chết; bệnh tích đại thể biểu phôi 3.1.2 Phương pháp tiêm truyền virus môi trường tế bào xơ phôi vịt Dịch niệu mô gan phôi trứng đồng tiếp tục cấy truyền môi trường tế bào xơ phơi vịt Sau thu dịch tế bào phục vụ cho việc định danh chuẩn độ virus kỹ thuật RT-PCR 3.2 Phân tích di truyền virus viêm gan vịt type I genotype 3.2.1 Giải trình tự nucleotide Mười sản phẩm RT-PCR đại diện, ký hiệu: DHAV-3-CT2, DHAV-3-CT6, DHAV-3-HG2, DHAV-3HG4, DHAV-3-KG1, DHAV-3-KG12, DHAV-3-TV2, DHAV-3-TV5, DHAV-3-VL3, DHAV-3-VL8 63 chủng virus phân lập dùng cho giải trình tự nucleotide dùng phân tích di truyền 3.2.2 Phân tích di truyền chủng DHAV-3 phân lập Việc phân tích di truyền 10 chủng DHAV-3 đại diện thực cách so sánh tương đồng nucleotide axít amin chủng với 31 chủng virus DHAV-3 từ Ngân hàng gen Thế giới, có chủng phân lập từ Việt Nam, chủng phân lập từ Hàn Quốc 23 chủng phân lập từ Trung Quốc Việc phân tích thực phần mềm BioEdit thiết lập mối quan hệ phả hệ phần mềm MEGA 5.1 3.3 Khảo sát độc lực 01 chủng DHAV-3-HG2 phôi vịt vịt 3.3.1 Xác định liều gây nhiễm 50% tế bào xơ phơi vịt (TCID50) Thí nghiệm (TN) tiến hành đĩa 96 giếng, dịch virus pha loãng theo bậc 10 từ 100 đến 10-10, độ pha loãng cho vào giếng cột, giếng 100 l, nồng độ pha loãng cao giếng đối chứng, giếng 100l môi trường trì Tính số TCID50 theo phương pháp Reed Muench (1938) Chỉ tiêu theo dõi: số TCID50/0,1ml 3.3.2 Xác định liều gây chết 50% phơi vịt bệnh lý phơi Bố trí TN: TN sử dụng 50 trứng vịt có phơi 12 ngày tuổi chia thành 10 lô, lô trứng vịt; lô TN tiêm dịch virus tương ứng với độ pha loãng từ 10-4 đến 10-12 lô đối chứng tiêm dung dịch nước sinh lý Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ chết phôi theo nồng độ virus; số ELD50; thời gian chết phôi trung bình theo nồng độ; tần suất xuất bệnh tích phôi 3.3.3 Xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm đặc điểm bệnh lý gây chủng virus DHAV-3-HG2 Bố trí TN: TN bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm nghiệm thức (NT) với lần lăp lại; có NT tương ứng với độ pha loãng từ 10-1 đến 10-5 NT đối chứng tiêm dung dịch nước sinh lý, NT sử dụng vịt Thời gian theo dõi đợt TN 14 ngày Chỉ tiêu theo dõi: Chỉ số LD50; số vịt chết theo thời gian; tần suất xuất triệu chứng; tần suất xuất bệnh tích; bệnh tích vi thể vịt TN 3.4 Sản xuất KT kháng virus DHAV-3 công nghệ tạo KT IgY gà ứng dụng phòng, trị bệnh 3.4.1 Sản xuất KT kháng virus DHAV-3 3.4.1.1 Tạo miễn dịch cho gà mái Bố trí TN Bảng 3.1, với khoảng cách lần tiêm tuần Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm gây miễn dịch gà mái Thí nghiệm Nghiệm Thức Số gà thí nghiệm Liều virus (ELD50/ml) Liều tiêm (ml) Đường tiêm Số lần tiêm 104/1 104 Cơ ức 104/2 104 Cơ ức 104/3 104 Cơ ức 106/1 106 Cơ ức 106/2 106 Cơ ức 106/3 106 Cơ ức 108/1 108 Cơ ức 108/2 108 Cơ ức 108/3 108 Cơ ức ĐC PBS Cơ ức 3.4.1.2 Tách chiết kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà Kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà tách chiết phương pháp kết tủa muối (NH4)2SO4 nồng độ bảo hòa 40%, sau thẩm tích để loại muối Dung dịch sau thẩm tích phân tích nồng độ protein phương pháp Bradford xác định HGKT IgY phương pháp trung hòa virus 3.4.1.3 Kiểm tra hiệu giá kháng thể IgY huyết gà mái lòng đỏ trứng gà Hiệu giá kháng thể (HGKT) IgY xác định phản ứng trung hòa virus Chỉ tiêu theo dõi: Liều KN tạo miễn dịch tốt nhất; Số lần tiêm KN gây đáp ứng miễn dịch kéo dài ổn định; Mối tương quan HGKT IgY huyết gà mái lòng đỏ trứng gà 3.4.1.4 Xác định liều an tồn dịch kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà tế bào xơ phơi vịt Bố trí TN: TN tiến hành đĩa 96 giếng với 10 nồng độ dịch IgY pha loãng theo số (1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, 1/512, 1/1024), nồng độ IgY ban đầu 13,5 mg/ml Mỗi nồng độ lặp lại lần [ĐC(-)] môi trường tế bào xơ phôi không cho dịch IgY vào mà cho mơi trường trì Chỉ tiêu theo dõi: Hình thái thảm tế bào (có hay khơng có CPE mức độ CPE); Giá trị OD sau nhuộm MMT (thể tỷ lệ tế bào sống) 3.4.1.5 Khảo sát hoạt tính kháng DHAV-3 dịch kháng thể IgY tế bào xơ phôi vịt 24 trước 24 sau gây nhiễm Bố trí TN: TN tiến hành đĩa 96 giếng với bốn nồng độ pha loãng dịch KT IgY theo bậc 10 từ 100 đến 10-3 cho vào môi trường tế bào DEF 24 trước 24 sau gây nhiễm với huyễn dịch DHAV-3 liều 500TCID50/0,1ml/giếng Nồng độ KT IgY ban đầu x= 1,68 mg/ml, nồng độ nồng độ KT IgY pha loãng theo bậc 10 Mỗi nồng độ lập lại 20 lần [ĐC(-)] tế bào xơ phôi cho mơi trường trì vào [ĐC(+)] mơi trường tế bào xơ phôi không cho dịch KT IgY vào cho dịch virus vào với liều 500TCID50/0,1ml/giếng Chỉ tiêu theo dõi: Hình thái thảm tế bào (có hay khơng có CPE mức độ CPE); giá trị OD (thể tỷ lệ tế bào sống) 3.4.1.6 Xác định liều bảo hộ 50% phơi vịt kháng thể IgY lòng đỏ TN thực phôi vịt 12 ngày tuổi bố trí Bảng 3.2 Tính liều bảo hộ 50% phôi vịt (EPD50) dựa vào số EPD50 tiến hành chọn liều KT IgY 10EPD50, 30EPD50, 50EPD50 để sử dụng cho TN phòng trị bệnh DHAV-3 Bảng 3.2 Bố trí TN xác định liều bảo hộ 50% phôi vịt kháng thể IgY Độ pha loãng kháng thể (100) 1/2 (10-0,3) 1/4 (10-0,6) 1/8 (10-0,9) 1/16 (10-1,2) 1/32 (10-1,5) 1/64 (10-1,8) 1/128 (10-2,1) 1/256 (10-2,4) 1/512 (10-2,7) 1/1024 (10-3,0) Liều virus (LD50) 102 102 102 102 102 102 102 102 102 102 102 Số lượng trứng vịt có phơi 5 5 5 5 5 Liều tiêm (kháng thể + virus) (ml) 0,1 + 0,1 0,1 + 0,1 0,1 + 0,1 0,1 + 0,1 0,1 + 0,1 0,1 + 0,1 0,1 + 0,1 0,1 + 0,1 0,1 + 0,1 0,1 + 0,1 0,1 + 0,1 Vịt trí tiêm Xoang niệu mô Xoang niệu mô Xoang niệu mô Xoang niệu mô Xoang niệu mô Xoang niệu mô Xoang niệu mô Xoang niệu mô Xoang niệu mô Xoang niệu mô Xoang niệu mô 3.4.2 Ứng dụng kháng thể IgY phòng, trị bệnh 3.4.2.1 Ứng dụng phòng bệnh Thí nghiệm khảo sát hiệu phòng bệnh DHAV -3 kháng thể IgY bố trí hồn tồn ngẫu nhiên vịt ngày tuồi với loại liều lần lặp lại, nghiệm thức sử dụng vịt Bố trí thí nghiệm thực qua Bảng 3.3 Sau cấp kháng thể 24 qua đường uống tiêm ức, vịt công cường độc virus DHAV -3 (chủng DHAV-3-HG2) với liều 103,3LD50 Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ vịt sống nghiệm thức sau cường độc virus Bảng 3.3 Thí nghiệm phòng bệnh DHAV-3 kháng thể IgY lòng đỏ kháng thể K.T.V Nghiệm thức Đường cấp Liều cấp KT (0,5ml/con) Uống Uống Uống Uống 10 EPD50 30 EPD50 50 EPD50 K.T.V 0,5ml/con ĐC (-) ĐC (+) Tiêm ức Tiêm ức Tiêm ức Tiêm ức Tiêm ức Tiêm ức 10 EPD50 Liều cấp virus (0,5ml/con) Số lần Lập lại 103,3LD50 103,3LD50 103,3LD50 3 Số vịt nghiệm thức (con) 5 103,3LD50 103,3LD50 5 5 5 3,3 30 EPD50 10 LD50 3,3 50 EPD50 K.T.V 0,5ml/con 0,5 ml IgY-âm 0,5 ml IgY-âm 10 LD50 103,3LD50 0,5 ml PBS 103,3LD50 3.4.2.2 Ứng dụng trị bệnh TN thử nghiệm hiệu trị bệnh DHAV -3 kháng thể IgY bố trí hồn tồn ngẫu nhiên vịt ngày tuổi với loại liều lần lặp lại, nghiệm thức sử dụng vịt TN bố trí Bảng 3.4 Sau cơng cường độc virus với liều 103,3LD50 sau 12 tiến hành tiêm kháng thể Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ vịt sống sau tiêm kháng thể Bảng 3.4 Thí nghiệm trị bệnh DHAV-3 KT IgY lòng đỏ kháng thể K.T.V Nghiệm thức ĐC (+) ĐC (-) Thời điểm cấp KT Đường cấp Sau 12 Sau 12 Sau 12 Sau 12 Sau 24 Sau 24 Sau 24 Sau 24 Sau 24 Sau 24 Tiêm ức Tiêm ức Tiêm ức Tiêm ức Tiêm ức Tiêm ức Tiêm ức Tiêm ức Tiêm ức Tiêm ức Liều virus (0,5ml/con) Liều cấp KT (0,5ml/con) 103,3LD50 10 EPD50 Số lần Lặp lại Số vịt thí nghiệm (con) 5 5 5 5 5 3,3 10 LD50 30 EPD50 3,3 10 LD50 50 EPD50 3,3 K.T.V ml/con 10 LD50 103,3LD50 10 EPD50 103,3LD50 30 EPD50 103,3LD50 50 EPD50 3,3 K.T.V ml/con 10 LD50 3,3 10 LD50 0,5ml IgY-âm 0,5ml PBS 0,5ml IgY-âm 3.5 Phương pháp xử lý số liệu Việc truy cập gen từ Ngân hàng Thế giới thực chương trình BLAST, việc sánh trình tự nucleotide axít amin thực phần mềm BioEdit, sơ đồ phả hệ thiết lập phần mềm MEGA 5.1 Các tỷ lệ xử lý phép thử Chi square, phần mềm Minitab 16.0 (Ryan et al, 1972) Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết phân lập định danh virus gây bệnh viêm gan vịt số tỉnh ĐBSCL 4.1.1 Kết phân lập virus viêm gan vịt môi trường phôi vịt Bảng 4.1 cho thấy, tổng số 92 mẫu huyễn dịch virus từ 92 đàn khảo sát 78 mẫu gây chết phơi với tỷ lệ trung bình 84,8% Thời gian gây chết phôi từ 48-72 Bảng 4.1 Kết phân lập virus gây bệnh viêm gan vịt phôi vịt Địa điểm lấy mẫu (tỉnh) Kiên Giang Hậu Giang Cần Thơ Vĩnh Long Trà Vinh Tổng Số phôi theo dõi Liều tiêm 22 0,2 25 0,2 0 28,0 14 56,0 15 0,2 0 20,0 60,0 12 0,2 0 25,0 18 0,2 0 22,2 0 22 23,9 92 (ml) 18-24 Số Tỷ phôi lệ chết (%) 0 Phôi chết theo thời gian (giờ) 24-48 48-72 72-96 Số Tỷ Số Tỷ Số Tỷ phôi lệ phôi lệ phôi lệ chết (%) chết (%) chết (%) 22,7 11 50,0 13,6 Tổng số phôi chết Tỷ lệ (%) 19 86,4 4,0 22 88,0 13,3 14 93,3 50,0 8,3 10 83,3 44,4 5,6 13 72,2 48 52,2 8,7 78 84,8 4.1.2 Kết cấy truyền virus viêm gan vịt môi trường tế bào xơ phôi vịt sơ cấp từ huyễn dịch bệnh phẩm từ phôi vịt Tất 78 dịch niệu mô gan phôi mẫu gây bệnh lý tế bào có nhiều dạng tế bào co tròn lại, sau kết cụm lại hay nối với tạo liên bào cuối tế bào hoại tử tạo thành vệt tan 4.1.3 Kết định danh virus viêm gan vịt kỹ thuật sinh học phân tử Sản phẩm RT-PCR khuếch đại chuỗi gen có kích thước 286 bp từ vị trí nucleotide 3.527 đến vị trí nucleotide 3.777 thuộc tổ hợp gen P2 gen DHAV-3 Hình 4.1 Phổ điện di sản phẩm RT-PCR gel agarose 1,5% Ghi chú: M: Marker kích thước 100bp Giếng 1, 2, 3, (KG1, KG5, KG8, KG12) Giếng 5, 6, (HG2, HG4, HG5) Giếng 8, 9, 10 (CT2, CT6, CT13) Giếng 11, 12, 13 (VL1, VL3, VL8) Giếng 14, 15, 16 (TV5, TV5, TV8) Bảng 4.2 cho thấy, 78 dịch tế bào có bệnh lý nghi ngờ có 56 mẫu dương tính với cặp mồi DHAV3F, DHAV-3R chiếm 71,8% (56/78), Kiên Giang (84,2%), Hậu Giang (81,8%), Trà Vinh (61,5%), Vĩnh Long (60,0%) Cần Thơ (57,1%) Kết cho thấy, DHAV-3 lưu hành phổ biến đàn vịt tỉnh thuộc khu vực ĐBSCL Chưa phát DHAV-1, DHAV-2 virus viêm gan vịt type II Bảng 4.2 Tỷ lệ dương tính type virus viêm gan vịt Địa điểm DHAV-1 DHAV-2 (tỉnh) (n) (+) %) (n) (+) Kiên Giang 19 0 19 Hậu giang 22 0 22 Cần Thơ 14 0 14 Vĩnh Long 10 0 Trà Vinh 13 Tổng cộng 78 DHAV-3 (%) DAsTV-1 (n) (+) (%) (n) (+) (%) 19 16 84,2 19 0 22 18 81,8 22 0 0 14 57,1 14 0 10 0 10 60,0 10 0 13 0 13 61,5 13 0 78 0 78 56 71,8 78 0 4.2 Kết khảo sát đặc điểm di truyền phân tử chủng DHAV-3 phân lập 4.2.1 Kết giải trình tự nucleotide sản phẩm RT-PCR Kết giải trình tự 10 sản phẩm RT-PCR tổng số 56 sản phẩm cho kết đoạn gen có kích thước 240 nucleotide 4.2.2 So sánh trình tự nucleotide axít amin 10 chủng phân lập với chủng khác Ngân hàng gen Thế giới Trong 10 chủng khảo sát chủng: DHAV-3-CT2, DHAV-3-CT6, DHAV-3-HG2, DHAV-3-HG4, DHAV-3-KG1, DHAV-3-KG12, DHAV-3-TV2, DHAV-3-TV5, DHAV-3-VL8 có tỷ lệ tương đồng nucleotide (98-100%) axít amin (97-100%) chủng DHAV-3-VL3 có tỷ lệ tương đồng cao nucleotide (93-94%) axit amin (89-92%) Hình 4.2 Mối liên hệ phả hệ chủng DHAV-3 phân lập với chủng DHAV-3 khác Ngân hàng gen Thế giới Ghi chú: dấu * chủng phân lập nghiên cứu này; dấu ** chủng phân lập từ Việt Nam Hình 4.2 cho thấy, mười chủng virus phân lập ĐBSCL tạo thành nhóm riêng có mối quan hệ gần gũi nguồn gốc với chủng DHAV-NT phân lập tỉnh Ninh Thuận Việt Nam chủng Trung Quốc DHAV-12-01, DHAV-B-N, DHAV-Du-090905 Các chủng DHAV-NT, DHAV-DN2 DHAV-NC phân lập vùng khác Việt Nam khu vực ĐBSCL phân thành nhánh khác Trong đó, Trong 23 chủng Trung Quốc chủng Hàn Quốc phân thành nhánh khác phả hệ 4.3 Kết khảo sát độc lực DHAV-3 phôi vịt vịt 4.3.1 Kết khảo sát độc lực tính gây bệnh DHAV-3 phơi vịt 4.3.1.1 Kết xác định liều gây chết 50% phôi vịt thí nghiệm Kết xác định liều gây chết 50% virus DHAV-3 phôi vịt cho thấy 0,2ml huyễn dịch có chứa 108,17LD50 (ELD50= 108,17/0,2ml) 4.3.1.2 Kết khảo sát thời gian chết phơi trung bình theo nồng độ Bảng 4.3 Thời gian chết phơi trung bình theo nồng độ dịch virus Số phôi chết theo thời gian (giờ) Độ pha loãng 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12 ĐC