Giáo trình vi sinh vật thú y

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN BÁ HIÊN, TRẦN THỊ LAN HƯƠNG, ĐẶNG HỮU ANH VŨ THỊ NGỌC, CAO THỊ BÍCH PHƯỢNG Chủ biên: NGUYỄN BÁ HIÊN GIÁO TRÌNH VI SINH VẬT THÚ Y NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP - 2022 ii LỜI NĨI ĐẦU "Vi sinh vật Thú y" môn học sở quan trọng xuyên suốt ngành Thú y Có thể nói, từ mơn học sở Bệnh lý học Thú y, Miễn dịch học Thú y, Chẩn đoán bệnh Thú y môn học chuyên môn ngành Bệnh Truyền nhiễm Thú y, Dịch tễ học Thú y, Bệnh Ngoại khoa Thú y, Sinh sản gia súc, Kiểm nghiệm thú sản, Vệ sinh Thú y cần có hiểu biết kiến thức cốt lõi môn học Đã 20 năm nay, giáo trình “Vi sinh vật Thú y” chưa biên soạn lại Vì thế, nhiều thơng tin mới, kiến thức chưa bổ sung Để thực yêu cầu đào tạo sinh viên bậc đại học chuyên ngành Thú y thuộc chương trình Bộ Giáo dục Đào tạo, đáp ứng mong muốn nhà Thú y hoạt động lĩnh vực chuyên môn, cung cấp tài liệu mới, đại cho sinh viên học tập, nghiên cứu, biên soạn Giáo trình Vi sinh vật Thú y Chủ biên Giáo trình PGS.TS Nguyễn Bá Hiên, thầy có nhiều kinh nghiệm đồng nghiệp biên soạn giáo trình cho mơn học như: Vi sinh vật Bệnh truyền nhiễm vật nuôi, Vi sinh vật thú y, Vi sinh vật học công nghiệp, Miễn dịch học Thú y, Miễn dịch học ứng dụng, Bệnh truyền nhiễm thú y, Bệnh truyền lây người động vật… Cấu trúc giáo trình gồm 35 chương, chia thành phần lớn: Vi khuẩn học chuyên khoa Virus học chuyên khoa Kiến thức giáo trình viết theo họ Vi sinh vật nhóm tác giả biên soạn cụ thể sau:  PGS.TS Nguyễn Bá Hiên biên soạn lời Mở đầu  PGS.TS Nguyễn Bá Hiên, TS Trần Thị Lan Hương, ThS Vũ Thị Ngọc ThS Cao Thị Bích Phượng biên soạn Phần - Vi khuẩn học chuyên khoa, gồm 18 chương  PGS.TS Nguyễn Bá Hiên, TS Trần Thị Lan Hương TS Đặng Hữu Anh biên soạn Phần - Virus học chuyên khoa, gồm 17 chương Trong trình biên soạn, cập nhật kiến thức mới, thể tính bản, tính đại, tính khoa học, tính hệ thống chương trình mơn học Hy vọng sách giáo trình học tập tốt cho sinh viên tài liệu tham khảo hữu ích cho cán chuyên ngành Để biên soạn sách này, chúng tơi có sử dụng số hình ảnh tư liệu nhiều đồng nghiệp, xin cảm ơn tác giả iii Mặc dù cố gắng đọc, học, tham khảo nhiều tài liệu bậc tiền bối trong, nước cập nhật kinh nghiệm thực tế khả người viết có hạn nên khơng tránh khỏi nhiều thiếu sót Rất mong dẫn đóng góp ý kiến bạn đọc xa gần để sách hoàn thiện lần xuất sau Xin trân trọng cảm ơn! Nhóm tác giả iv MỤC LỤC LỜI NÓI ĐẦU iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xii DANH MỤC BẢNG xvi DANH MỤC HÌNH .xix MỞ ĐẦU I KHÁI NIỆM VỀ MÔN HỌC .1 II SƠ LƯỢC LỊCH SỬ MÔN HỌC III VỊ TRÍ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA MÔN HỌC IV NỘI DUNG CHƯƠNG TRÌNH MƠN HỌC BẢNG ĐƠN VỊ PHÂN LOẠI VI SINH VẬT BẢNG PHÂN LOẠI VI SINH VẬT THÚ Y (Tính đến năm 2018) Phần VI KHUẨN HỌC CHUYÊN KHOA Chương HỌ ACTINOMYCETACEAE .0 1.1 GIỐNG XẠ KHUẨN ACTINOMYCES .0 1.1.1 Loài Actinomyces bovis 1.2 GIỐNG TRỰC KHUẨN TRUEPERELLA 1.2.1 Loài Trueperella pyogenes Chương HỌ BACILLACEAE .9 2.1 GIỐNG BACILLUS 2.1.1 Loài Bacillus anthracis (Trực khuẩn nhiệt thán) Chương HỌ BRUCELLACEAE .27 3.1 GIỐNG BRUCELLA 27 3.1.1 Đặc điểm hình thái 29 3.1.2 Đặc tính ni cấy 29 3.1.3 Đặc tính sinh hóa 30 3.1.4 Cấu trúc kháng nguyên 31 3.1.5 Miễn dịch .31 3.1.6 Sức đề kháng 32 v 3.1.7 Tính gây bệnh 32 3.1.8 Chẩn đoán 33 3.1.9 Phòng điều trị 38 Chương HỌ CLOSTRIDIACEAE 41 4.1 GIỐNG CLOSTRIDIUM 41 4.1.1 Loài Clostridium botulinum (Trực khuẩn gây ngộ độc thịt) 41 4.1.2 Loài Clostridium chauvoei (Trực khuẩn ung khí thán) 49 4.1.3 Lồi Clostridium septicum (Trực khuẩn thủy thũng ác tính) 55 4.1.4 Loài Clostridium noyvi (Trực khuẩn thủy thũng) 58 4.1.5 Lồi Clostridium perfringens (Trực khuẩn sinh có giáp mơ) 60 4.1.6 Lồi Clostridium tetani (Trực khuẩn uốn ván) 66 4.2 KIỂM NGHIỆM TRỰC KHUẨN YẾM KHÍ 71 4.2.1 Lấy bệnh phẩm 72 4.2.2 Tiến hành kỹ thuật 72 Chương HỌ CORYNEBACTERIACEAE 74 5.1 GIỐNG CONYNEBACTERIUM .74 5.1.1 Loài Corynebacterium pseudotuberculosis (Vi khuẩn giả lao) 74 Chương HỌ ENTEROBACTERIACEAE 77 6.1 GIỐNG ESCHERICHIA 77 6.1.1 Loài Escherichia coli 77 6.1.2 Khảo sát Escherichia coli O157:H7 88 6.2 GIỐNG SALMONELLA 94 6.2.1 Giới thiệu chung giống Salmonella 94 6.2.2 Một số type Salmonella gây bệnh động vật .105 6.3 GIỐNG SHIGELLA 114 6.3.1 Đặc điểm hình thái 116 6.3.2 Đặc tính ni cấy 116 6.3.3 Đặc tính sinh hóa 117 6.3.4 Sức đề kháng .117 6.3.5 Các yếu tố gây bệnh 117 6.3.6 Tính gây bệnh 118 6.3.7 Chẩn đoán 118 6.3.8 Phòng điều trị 119 vi 6.4 KIỂM NGHIỆM MỘT SỐ VI KHUẨN HỌ ENTEROBACTERIACEAE .119 6.4.1 Quan sát khuẩn phân loại khuẩn lạc số môi trường 119 6.4.2 Tiến hành thử nghiệm oxidase 120 6.4.3 Định danh vi khuẩn họ Enterobacteriaceae 120 Chương HỌ ERYSIPELOTRICHACEAE 123 7.1 GIỐNG ERYSIPELOTHRIX 123 7.1.1 Loài Erysipelothrix rhusiopathiae (Trực khuẩn đóng dấu lợn) 123 Chương HỌ FLAVOBACTERIACEAE 135 8.1 GIỐNG RIEMERELLA 135 8.1.1 Loài Riemerella anatipestifer 135 Chương HỌ LEPTOSPIRACEAE 140 9.1 GIỐNG LEPTOSPIRA 140 9.1.1 Đặc điểm hình thái 143 9.1.2 Đặc tính ni cấy 144 9.1.3 Cấu tạo kháng nguyên 144 9.1.4 Sức đề kháng .144 9.1.5 Tính gây bệnh 145 9.1.6 Chẩn đoán 146 9.1.7 Phòng điều trị 152 Chương 10 HỌ LISTERIACEAE 155 10.1 GIỐNG LISTERIA 155 10.1.1 Loài Listeria monocytogenes .155 Chương 11 HỌ MYCOBACTERIACEAE 161 11.1 GIỐNG MYCOBACTERIUM .161 11.1.1 Loài Mycobacterium tuberculosis (Trực khuẩn lao) 161 Chương 12 HỌ MYCOPLASMATACEAE 175 12.1 GIỐNG MYCOPLASMA 175 12.1.1 Loài Mycoplasma gallisepticum 175 Chương 13 HỌ NOCARDIACEAE 194 13.1 GIỐNG RHODOCOCCUS 194 13.1.1 Loài Rhodococcus equi 194 Chương 14 HỌ ORNITHOBACTERIACEAE 197 vii 14.1 GIỐNG ORNITHOBACTERIUM 197 14.1.1 Loài Ornithobacterium rhinotracheale 197 Chương 15 HỌ PASTEURELLACEAE 203 15.1 GIỐNG ACTINOBACILLUS 203 15.1.1 Loài Actinobacillus pleuropneumoniae 203 15.2 GIỐNG HAEMOPHILUS 213 15.2.1 Loài Haemophilus parasuis .213 15.3 GIỐNG PASTEURELLA 217 15.3.1 Loài Pasteurella multocida .218 Chương 16 HỌ PSEUDOMONADACEAE 229 16.1 GIỐNG BURKHOLDERIA 229 16.1.1 Loài Burkholderia mallei 229 16.1.2 Loài Burkholderia pseudomallei .234 16.2 GIỐNG PSEUDOMONAS 237 16.2.1 Loài Pseudomonas aeruginosa 237 Chương 17 HỌ STAPHYLOCOCCACEAE 244 17.1 GIỐNG STAPHYLOCOCCUS .244 17.1.1 Đặc điểm hình thái 245 17.1.2 Đặc tính ni cấy 245 17.1.3 Đặc tính sinh hóa 246 17.1.4 Phân loại kháng nguyên .246 17.1.5 Phân loại Bacteriophage 247 17.1.6 Các độc tố độc lực tụ cầu khuẩn 247 17.1.7 Sức đề kháng .251 17.1.8 Tính gây bệnh 252 17.1.9 Chẩn đoán 253 17.1.10 Phòng trị bệnh 255 Chương 18 HỌ STREPTOCOCCACEAE 256 18.1 GIỐNG STREPTOCOCCUS 256 18.1.1 Loài Streptococcus equi 256 18.1.2 Loài Streptococcus pneumoniae (Phế cầu khuẩn) .259 18.1.3 Loài Streptococcus suis .263 viii Phần VIRUS HỌC CHUYÊN KHOA 273 Chương 19 HỌ ADENOVIRIDAE 273 19.1 GIỐNG ATADENOVIRUS 273 19.1.1 Virus gây hội chứng giảm đẻ gà (Egg drop syndrome - EDS) .273 19.2 GIỐNG AVIADENOVIRUS 276 19.2.1 Virus gây bệnh viêm gan thể vùi (Inclusion body hepatitis - IBH) 276 Chương 20 HỌ ANELLOVIRIDAE 278 20.1 GIỐNG GYROVIRUS 278 20.1.1 Virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm gà .278 Chương 21 HỌ ARTERIVIRIDAE 284 21.1 GIỐNG ARTERIVIRUS 284 21.1.1 Virus gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn .284 Chương 22 HỌ ASFARVIRIDAE .290 22.1 GIỐNG ASFIVIRUS 290 22.1.1 Virus gây bệnh dịch tả lợn châu phi 290 Chương 23 HỌ BIRNAVIRIDAE 297 23.1 GIỐNG AVIBIRNAVIRUS 297 23.1.1 Virus Gumboro - Infectious bursal disease virus (IBDV) 297 Chương 24 HỌ CIRCOVIRIDAE 303 24.1 GIỐNG PORCINE CIRCOVIRUS (PCV) 303 24.1.1 Porcine circovirus type (PCV2) .303 Chương 25 HỌ CORONAVIRIDAE 308 25.1 GIỐNG ALPHACORONAVIRUS 309 25.1.1 Virus gây bệnh tiêu chảy cấp lợn 309 25.1.2 Virus gây bệnh viêm dày ruột truyền nhiễm lợn .315 25.1.3 Virus gây viêm phúc mạc truyền nhiễm mèo 317 25.1.4 Coronavirus gây bệnh chó (Canine coronavirus) 319 25.2 GIỐNG BETACORONAVIRUS 321 25.2.1 Virus gây hội chứng tiêu chảy hô hấp bò 321 25.3 GIỐNG GAMMACORONAVIRUS .325 25.3.1 Virus gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm gà (Infectious Bronchitis Virus - IBV) 325 ix Chương 26 HỌ FLAVIVIRIDAE 334 26.1 GIỐNG FLAVIVIRUS 334 26.1.1 Virus Tembusu 334 26.2 GIỐNG PESTIVIRUS 336 26.2.1 Virus gây bệnh dịch tả lợn cổ điển (Pestivirus C - Classical swine fever virus - CSFV) 336 Chương 27 HỌ HERPESVIRIDAE 349 27.1 GIỐNG MARDIVIRUS 349 27.1.1 Virus gây bệnh dịch tả vịt (Anatid herpesvirus 1/Duck Virus Enteritis DVE) 349 27.1.2 Virus gây bệnh viêm khí quản truyền nhiễm gà (Gallid alphaherpesvirus 1/Infectious laryngotracheitis virus - ILTV) 356 27.1.3 Virus gây bệnh Marek’s (Marek’s disease virus - MDV) 361 27.2 GIỐNG VARICELLOVIRUS 368 27.2.1 Virus gây bệnh giả dại lợn (Suid alphaherpesvirus (SHV-1), Aujeszky’s disease virus (ADV) Pseudorabies virus (PRV) 368 Chương 28 HỌ ORTHOMYXOVIRIDAE 372 28.1 GIỐNG ALPHAINFLUENZAVIRUS 372 28.1.1 Virus cúm gia cầm (Influenza A virus - AIV) 372 Chương 29 HỌ PARAMYXOVIRIDAE 388 29.1 GIỐNG AVULAVIRUS 388 29.1.1 Virus gây bệnh Newcastle (Avian paramyxovirus-1/Newcastle disease virus - NDV) 388 29.2 GIỐNG MORBILLIVIRUS 397 29.2.1 Virus gây bệnh care chó (Canine distemper virus - CDV) 397 Chương 30 HỌ PARVOVIRIDAE .406 30.1 GIỐNG PARVOVIRUS 406 30.1.1 Parvovirus gây bệnh chó (Canine Parvovirus - CPV2) 406 30.1.2 Parvovirus gây bệnh giảm bạch cầu mèo (Feline Panleukopenia Virus FPV) 410 30.1.3 Parvovirus gây bệnh khô thai lợn (Porcine Parvovirus - PPV) .412 30.2 GIỐNG DEPENDOVIRUS 415 30.2.1 Parvovirus gây bệnh thủy cầm .415 Chương 31 HỌ PICORNAVIRIDAE .418 x Có thể dùng số phản ứng kết hợp bổ thể, ELISA, PCR giúp xác định có mặt virus bệnh phẩm b Chẩn đoán huyết học Sử dụng phản ứng ELISA, phản ứng trung hòa để xác định kháng thể ALSV 34.1.1.6 Phòng bệnh a Vệ sinh phòng bệnh Thực tốt chế độ chăm sóc ni dưỡng, phịng bệnh, vệ sinh Thú y Nuôi nhốt riêng loại gà, chọn nuôi gà bố mẹ khoẻ để lấy gà làm giống Để tạo đàn gà bệnh, cần thực nghiêm túc, giám sát chặt chẽ quy trình ấp nở, đảm bảo vệ sinh Thú y Gà mẹ lựa chọn để trì nịi giống cần đảm bảo số tiêu chuẩn sau: - Có miễn dịch, khơng mang virus - Khơng có miễn dịch, khơng mang virus - Chỉ cần khơng có virus máu mà khơng quan tâm đến trạng thái miễn dịch Phải kiểm tra qua hệ để chắn đàn gà không mang virus Lựa chọn giống gà có miễn dịch tự nhiên với bệnh b Phòng bệnh vacxin Hiện nay, chưa có vacxin phịng bệnh cho gà 468 Chương 35 HỌ RHABDOVIRIDAE Họ Rhabdoviridae có tới 30 giống với gần 200 loài khác Trong đó giống Lyssavirus có tầm quan trọng y học thú y Mục tiêu chương này là trình bày giống Lyssavirus 35.1 GIỐNG LYSSAVIRUS Tên giống có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, “Lyssa” có nghĩa thịnh nộ giận Lyssavirus lây nhiễm nhiều loài động vật có vú bao gồm người, chúng gây bệnh dại gây tử vong Virus truyền lây qua nước bọt, thường vết cắn động vật bị nhiễm bệnh Giống Lyssavirus có 16 lồi có Rabies lyssavirus gây bệnh dại (Lyssa) động vật người Các nghiên cứu trình tự gen kháng nguyên giống Lyssavirus có lồi liên quan chặt chẽ với nhau, chia serotype genotyp (Bảng 17.1) Bằng phương pháp sử dụng kháng thể đơn dòng, kỹ thuật giải trình tự gen, người ta phát nhiều subtype serotype Lyssavirus gây nên bệnh có triệu chứng lâm sàng phân biệt với bệnh dại cổ điển Giữa RABV có miễn dịch chéo với DUUV, EBLV ABLV; MOKV hay LBV khơng có Bảng 35.1 Phân loại virus dại Tên loài virus Genotyp serotype Phân bố Classical rabies virus (virus dại cổ điển - RABV) genotyp 1, serotype Khắp các châu lục, trừ Nam cực Lagos bat virus (LBV) genotyp 2, serotype Trung Phi và Nam Phi Mokola virus (MOKV) genotyp 3, serotype Trung Phi Duvenhage virus (DUUV) genotyp 4, serotype Nam Phi EBLV genotyp Châu Âu EBLV genotyp European bat lyssavirus (EBLV): chia làm biotyp Australian bat lyssavirus (ABLV) genotyp (chưa định serotype) Châu Úc 35.1.1 Virus dại (Rabies lyssavirus) Bệnh dại có khắp nơi giới, trừ châu Úc (tuy nhiên, có tài liệu thơng báo phát thấy virus dại loài dơi châu Úc) Cho đến nay, số nước khu vực khống chế hay toán bệnh dại Anh, Nhật Bản, New Zealand, Đài Loan, Malaysia, Hungary, Mỹ hầu hết đảo vùng Caribê Nhiều 469 nước châu Âu thơng báo tốn bệnh dại Thụy Sĩ (1999), Hà Lan, Đức, Bỉ, Luxembourg (2001), Pháp (2000), Cộng hòa Czeck (2004) Theo thống kê Tổ chức y tế giới (WHO - World Health Organization), bệnh dại ước tính gây 60.000 ca tử vong hàng năm toàn giới, với 40-50% ca tử vong bệnh dại trẻ em 15 tuổi Mỗi năm có khoảng 10 triệu người điều trị sau phơi nhiễm sau tiếp xúc với động vật nghi mắc bệnh dại Phần lớn trường hợp mắc bệnh dại người bị chó dại cắn, đặc biệt châu Phi châu Á Ngược lại, bệnh dại động vật hoang dã mối đe dọa lớn Bắc Mỹ Ở Việt Nam, bệnh dại gây nhiều thiệt hại cho người gia súc Trong nhiều năm, nhờ có chương trình tiêm phịng vacxin dại rộng rãi cho đàn chó ý thức người dân nâng cao nên tỷ lệ người tử vong bệnh dại giảm dần Số người tử vong bệnh dại năm 2000, 2001, 2003 47 người, 60 người 30 người; đến năm 2004, số tử vong bệnh dại lại tăng lên 82 người Đặc biệt, từ năm 2016 đến nay, bệnh dại có chiều hướng gia tăng Theo thông báo Bộ Y tế năm 2016, số người tử vong bệnh dại nước 39 người; năm 2017 74 người, năm 2018 94 người; năm 2019 thống kê có 75 người, tháng đầu năm 2020 có 57 người tử vong bệnh dại 29 tỉnh thành Việt Nam 35.1.1.1 Đặc điểm hình thái cấu trúc Virus dại có hình trụ, đầu trịn, đầu dẹt giống hình viên đạn, kích thước trung bình virion khoảng 70-80 × 130-240nm, loại virus có vỏ bọc lipid với đầu nhọn dài 6-7nm Các virion Rhabdovirus có đường kính khoảng 45-100 × 100-430nm, chuỗi nucleocapsid cuộn xoắn có hình trụ, đầu trịn, đầu dẹt nhìn giống hình viên đạn hình nón; bao quanh lớp vỏ bọc với gai nhọn dài sợi glycoprotein dài - 10nm Bộ gen sợi ARN mạch đơn, kích thước khoảng 11-15kb mã hóa loại protein N-P-M-G-L Trong đó, N (nucleoprotein) thành phần nucleocapsid virus; P phosphoprotein đóng vai trò polymerase virus; M (matrix protein) virion protein bên tạo điều kiện cho virion nảy chồi cách liên kết với nucleocapsid với vùng tế bào chất glycoprotein; G (glycoprotein) gai nhú bề mặt virion chịu trách nhiệm liên kết với thụ thể tế bào vật chủ, chia thành G1 G2 có vai trị tính gây bệnh virus; ngồi ra, protein G tạo kháng thể trung hòa virus tạo khả miễn dịch qua trung gian tế bào L (ARN polymerase) ARN polymerase có chức phiên mã chéo ARN Các chủng virus dại phân lập từ bệnh phẩm tự nhiên gọi "virus dại đường phố" (street virus), chủng virus dại cường độc có khả gây bệnh cho người động vật (thời gian nung bệnh thỏ 17 ngày, người 40 ngày) Nếu đem virus 470 tiêm truyền nhiều lần qua thỏ, sau lần tiêm truyền, thời gian ủ bệnh rút ngắn lại (chỉ 3-5 ngày), tiêm cho người động vật không mắc bệnh mà tạo miễn dịch, gọi chủng virus dại cố định "fixed virus" Nguồn: https://www.who-rabies-bulletin.org/site-page/virus-structure Hình 35.1 Cấu trúc virus dại Có thể tìm thấy thể Negri não động vật mắc bệnh dại mà không phát thấy bệnh khác Thể Negri dấu hiệu bệnh lý đặc trưng bệnh dại nhà bác học Adelchi Negri (Italia) phát năm 1903 não súc vật chết bệnh dại Thể Negri có hình dạng thay đổi (hình trịn, hình trứng hình bầu dục), kích thước từ 0,5-30µm, thường định vị bào tương nơron thần kinh, chủ yếu sừng Amon, tế bào tiểu não Bản chất tiểu thể Negri đến chưa rõ Hình 35.2 Thể Negri tế bào não chó dại (mũi tên) H&E x100 Hình 35.3 Thể Negri màu nâu đen hạt ribonucleoprotein tế bào não chó dại (mũi tên) IHC x100 - Có ý kiến cho "khuẩn lạc", tập hợp hạt virus hình thành trình nhân lên virus, hạt virus khơng giải phóng khỏi tế bào thành phần cấu trúc virus chưa lắp ráp thành công 471 - Cũng có ý kiến cho biến đổi tế bào não virus gây nên Bằng phương pháp nhuộm Giemsa, Mann's, Seller's, thấy tiểu thể Negri 35.1.1.2 Đặc tính ni cấy - Trên phơi: virus nhân lên ni cấy phơi gà, phơi vịt Virus dại thích ứng phơi gà sau nhiều lần cấy truyền Phôi gà 4-7 ngày tuổi, tiêm virus vào túi lịng đỏ Phơi gà 11-13 ngày tuổi, tiêm virus vào màng nhung niệu Virus nhân lên mô thần kinh số mô khác phôi gà, ngày thứ hiệu giá virus đạt tối đa Virus nhân lên phôi gà làm phơi chậm phát triển khơng chết, tìm thấy thể Negri não phơi gà - Trên môi trường tế bào, virus nhân lên tốt nhiều loại tế bào, đặc biệt tế bào Vero (African green monkey kidney) BHK-21 (baby hamster kidney) tế bào lưỡng bội người Virus gây hủy hoại tế bào sau nhiều lần cấy truyền tìm thấy thể Negri tế bão bị nhiễm virus dại Người ta thường sử dụng loại tế bào CCL-131 (tế bào não phôi Neuroblastoma cell line), tế bào BHK-21 Các tế bào nuôi môi trường nuôi cấy tế bào Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) bổ sung 5% huyết bào thai bê (FCS - fetal calf serum) tủ ấm 36°C có 5% CO2 Virus dại đường phố thích nghi môi trường tế bào, cho kết sau 18 giờ, phịng thí nghiệm thường ni cấy virus 48-96 Sự có mặt virus mơi trường ni cấy tế bào khẳng định FAT - Trên động vật: + Tiêm thỏ: tiêm huyễn dịch óc cần xét nghiệm vào não thỏ qua đường giác mạc vào tiền phòng hậu phòng mắt, sau 12-25 ngày thỏ phát bệnh có triệu chứng co dãn đồng tử, rối loạn hô hấp, liệt chân, kiệt sức chết Phương pháp cho kết chậm + Tiêm cho chuột: dùng 5-10 chuột 3-4 tuần tuổi (12-14g), chuột đẻ ngày tuổi, tiêm hỗn dịch bệnh phẩm vào não (nếu có thể, sử dụng chuột SPF - specific pathogen free), 0,05ml Bệnh phẩm óc, tuyến nước bọt vật chết bệnh dại, nghiền nước sinh lý vơ trùng có thêm kháng sinh diệt tạp khuẩn, tiêm huyễn dịch vào não chuột Theo dõi 28 ngày, chuột liệt chết ngày kiểm tra lại phản ứng FAT Với chủng virus dại đường phố, thường gây chết chuột sau ngày Nếu chuột phát triển bình thường, kết âm tính Với chuột nhỏ, kiểm tra chuột ngày 5, 7, 11 sau gây bệnh Nhược điểm phương pháp tốn kém, có ưu điểm thu lượng lớn virus để định type thực phịng thí nghiệm thơng thường 472 35.1.1.3 Sức đề kháng Virus dại có sức đề kháng yếu với điều kiện ngoại cảnh - Virus dại mẫn cảm với sức nóng: 56ºC virus chết sau 30 phút, 60ºC sau 5-10 phút, 70ºC chết Virus tồn lâu nhiệt độ lạnh, 0ºC virus sống 912 tháng, -20ºC virus tồn nhiều năm Virus tồn 7-10 ngày não động vật mắc bệnh 20oC, vài tuần 4°C 3-4 năm nhiệt độ âm - Các chất sát trùng thông thường, đặc biệt dung môi hịa tan lipid diệt virus (ví dụ: formol 1%, cresol 3% betapropiolactone 0,1%, cồn iod 5%, cồn 70o, xà phòng…) - Virus dại bị bất hoạt nhanh ánh sáng mặt trời, tia cực tím, tia X - Rhabdovirus ổn định phạm vi pH = 5-10 35.1.1.4 Tính gây bệnh Trong tự nhiên, lồi động vật có vú cảm nhiễm với virus dại mức độ khác nhau, cao chó, chó sói, cáo, mèo, cáo, chồn, dơi ăn thịt; tiếp đến trâu, bò, lợn, khỉ, gấu, chuột Con vật mắc bệnh lứa tuổi Người mẫn cảm với bệnh Bệnh dại phát chủ yếu đàn chó nhiều nước, bệnh lây lan mạnh động vật hoang dã Ở châu Âu, bệnh xảy đàn cáo, chó sói, chó rừng Khi động vật hoang dã mắc bệnh, chúng bị chết hàng loạt mà lây nhiễm cho người động vật hóa Ở châu Mỹ, chồn dơi lồi động vật mang tàng trữ bệnh dại Đối với châu Á Việt Nam, chó ni coi vật mắc bệnh đồng thời động vật tàng trữ mầm bệnh Trong phịng thí nghiệm, dùng nước bọt động vật mắc bệnh dại (hoặc não) gây bệnh cho hầu hết động vật có vú Cách gây bệnh tốt tiêm vào bên màng cứng não, tủy sống, hốc mắt tiêm bắp Tiêm da khơng gây bệnh cho chó, gây bệnh cho 75% thỏ Nếu làm tổn thương dây thần kinh, bôi xoa hỗn dịch virus lên vết thương da, việc gây bệnh thực nghiệm đạt 50% thỏ chó Dùng não, nước bọt vật mắc bệnh để gây bệnh đường miệng (cho ăn) không đạt kết Tuy nhiên, người ta gây bệnh thực nghiệm thành công cho thỏ cách nhỏ virus cường độc vào niêm mạc mắt niêm mạc mũi lành lặn Gây bệnh thực nghiệm cách tiêm vào não vật thể thể dại điên cuồng Có thể gây bệnh cho chuột cách tiêm xoang bụng 35.1.1.5 Chất chứa virus Trong thể vật bệnh, virus có nhiều hệ thần kinh não, tủy sống, sừng Amon, chất xám vỏ não, tuyến nước bọt 473 Hầu hết chó, mèo chồn thải virus nước bọt từ đến ngày trước xuất thay đổi hành vi Những trường hợp khỏi bệnh (hãn hữu), tuyến nước bọt động vật mắc dại virus đến ngày thứ Thời gian virus phát tán nước bọt sở cho việc nhốt giữ động vật bình thường mặt lâm sàng (ít 14 ngày sau cắn người coi an toàn với bệnh) Đối với dơi, thời gian xác định có virus nước bọt 135 ngày trước vật phát bệnh lâm sàng Đây loại động vật nguy hiểm chúng di chuyển xa hàng trăm kilomet Ở động vật mắc bệnh, mắt, giác mạc thường có virus Nước tiểu, gan, lách, tuyến thượng thận, phổi chứa vius khơng thường xun 35.1.1.6 Chẩn đốn Vì bệnh dại phát dẫn đến tử vong, việc chẩn đốn virus bệnh dại người hay súc vật tiến hành sau chết, phịng thí nghiệm chun khoa làm vật cắn người, bị đánh chết chết sau thời gian theo dõi Chẩn đoán trở thành chẩn đoán khẩn cấp, vật bị dại hay nghi ngờ dại cắn người, địi hỏi điều trị dự phòng cho tất người súc vật khác bị cắn hay có tiếp xúc với nó, qua thực tất biện pháp phịng bệnh cho người súc vật Chẩn đoán bệnh dại người chủ yếu dựa vào triệu chứng lâm sàng đặc trưng bệnh tiền sử phơi nhiễm với virus dại Chẩn đoán xác định bệnh dại kỹ thuật xét nghiệm: phát kháng nguyên (FAT), phân lâp virus, kỹ thuật sinh học phân tử (RT - PCR), phát kháng thể (ELISA, RFFIT, FAVN) Tuy nhiên, thực tế tính nguy hiểm bệnh dại nên bị động vât nghi dại cắn, người bệnh phải giám sát điều trị dự phòng khẩn cấp mà khơng chờ chẩn đốn xác định bệnh dại động vật xét nghiệm Việc chẩn đoán quan trọng cần thiết làm công việc nguy hiểm cho người xét nghiệm Khi chó cắn người, việc bắt nhốt chó lại theo dõi biểu tiến triển bệnh thời gian, triệu chứng lâm sàng rõ khơng phải chẩn đốn phịng thí nghiệm, nghi ngờ tiến hành chẩn đoán phương pháp sau: a Chẩn đoán virus học * Lấy mẫu bệnh phẩm: đầu chó, mèo mắc bệnh, chết Người lấy mẫu bệnh phẩm xét nghiệm bệnh dại phải sử dụng bảo hộ cá nhân gồm găng tay dày đeo lớp găng tay, kính bảo vệ mắt, trang y tế, tạp dề, ủng cao su Cố định phần đầu xác chó, mèo, dùng dao cắt đầu vị trí đốt Atlas sau gáy 474 * Bao gói bảo quản: Bọc lớp nilon cho vào hộp bảo ơn có đá lạnh để bảo quản; dán nhãn, ghi rõ bệnh phẩm lấy Chuyển bệnh phẩm đến phịng thử nghiệm quan có thẩm quyền công nhận Bệnh phẩm phải gửi kèm theo phiếu gửi mẫu bệnh phẩm, ghi rõ bệnh sử, triệu chứng, đặc điểm dịch tễ Nếu chưa gửi xét nghiệm giữ ngăn mát tủ lạnh từ 2°C đến 8°C tối đa 48 * Kiểm tra thể Negri: Bệnh phẩm não động vật nghi mắc bệnh dại chết hay bị giết, ngâm vào dung dịch glycerin 50% Áp phiến kính in vết miếng óc vùng sừng Amon, sau nhuộm phương pháp nhuộm Giemsa Sellers Mann Bằng phương pháp nhuộm Giemsa quan sát thấy tiểu thể Negri bắt màu đỏ tươi, hồng cầu bắt màu hồng, tế bào thần kinh có màu xanh thẫm Với phương pháp nhuộm Sellers, tiểu thể Negri bắt màu đỏ tươi hồng tím tiêu bản, cịn ngun sinh chất tế bào thần kinh có màu xanh hồng, nhân màu xanh thẫm, hồng cầu có màu đỏ gạch Phương pháp cho kết nhanh phải dùng bệnh phẩm tươi Đơi khơng tìm thấy tiểu thể Negri khơng có nghĩa vật khơng bị bệnh dại * Tiêm động vật thí nghiệm: xem mục 17.1.1.4 * Ni cấy tế bào: xem mục 17.1.1.4 b Chẩn đoán huyết học - Phản ứng miễn dịch huỳnh quang * Nguyên lý Khi dùng kháng thể (γ globulin miễn dịch) kháng kháng thể (kháng γ globulin miễn dịch) nhuộm màu thuốc nhuộm huỳnh quang, cho tác động với kháng nguyên cần chẩn đoán cố định tiêu bản, có tương ứng kháng nguyên kháng thể chúng kết hợp với bám chặt phiến kính nên rửa nước kháng nguyên huỳnh quang kháng thể huỳnh quang khơng bị trơi Xem tiêu kính hiển vi huỳnh quang, dùng tia tử ngoại làm nguồn sáng kích thích thấy phát sáng, phản ứng dương tính Cịn kháng ngun kháng thể khơng tương ứng khơng có kết hợp đặc hiệu, kháng thể huỳnh quang kháng kháng thể huỳnh quang trôi rửa nước, nên quan sát kính hiển vi huỳnh quang khơng thấy phát sáng * Thuốc nhuộm huỳnh quang Thuốc nhuộm huỳnh quang sử dụng phản ứng để nhuộm kháng thể kháng kháng thể gọi chung Fluorocrom Các thuốc nhuộm huỳnh quang phải đạt tiêu chuẩn sau: 475 - Không làm tổn thương tới miễn dịch kháng thể - Phải kết hợp chặt chẽ, bền vững dễ dàng với kháng thể - Với lượng ít, gây tượng huỳnh quang rõ - Thuốc phải có màu đặc trưng, dễ sử dụng dễ phân biệt với màu khác Hiện hay dùng loại thuốc nhuộm huỳnh quang sau: - Lixamin Rodamin B (RB200) - Acid - Dimethylamino naphthalene sulfonic (DANS) - Fluorescein isothiocyanate (FITC) Thuốc RB200 phát màu huỳnh quang đỏ - vàng cam, DANS phát huỳnh quang vàng lục Muốn quan sát tượng phát quang phản ứng rõ, cần phải tách gama globulin khỏi huyết trước nhuộm huỳnh quang (tức cô đặc kháng thể) cách làm lắng cặn phân tử globulin với sulfat muối, sau thẩm tích globulin để loại trừ amoniac * Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (Direct Fluorescent Antibody Test) Kỹ thuật dùng kháng thể đặc hiệu nhuộm màu để phát kháng nguyên nghi dại, phản ứng có độ nhạy xác cao (95-99%), cho kết sau vài Phản ứng tiến hành trực tiếp tiêu bệnh phẩm dùng để xác định có mặt kháng nguyên virus dại tế bào nuôi cấy não chuột gây nhiễm virus - Chuẩn bị kháng nguyên chẩn đoán: Dùng bệnh phẩm não, nước bọt áp kính vào vùng sừng Ammon động vật nghi mắc bệnh dại, cố định tiêu ether, aceton hơ nóng lửa đèn cồn - Chuẩn bị kháng thể đặc hiệu nhuộm huỳnh quang: Dùng virus dại gây tối miễn dịch cho thỏ, lấy máu chắt huyết thanh, tách phần gama globulin có huyết miễn dịch đem nhuộm màu thuốc nhuộm huỳnh quang - Tiến hành phản ứng: Sau cố định kháng nguyên lên tiêu bản, nhỏ 1-2 giọt kháng thể đặc hiệu chống dại nhuộm màu huỳnh quang lên tiêu bản, để 37oC 30 phút nhiệt độ phòng giờ, đem rửa nước, làm khơ, quan sát kính hiển vi huỳnh quang + Phản ứng dương tính: có kết hợp đặc hiệu kháng nguyên kháng thể, tiêu có phát sáng màu xanh cây, kết luận bệnh phẩm có chứa virus dại + Phản ứng âm tính: khơng có kết hợp kháng thể kháng ngun, khơng phát sáng, bệnh phẩm khơng có virus dại * Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp Kỹ thuật không dùng kháng thể đặc hiệu (kháng thể 1) nhuộm màu huỳnh quang mà dùng kháng thể kháng gama globulin (kháng thể 2) loài vật dùng để 476 chế kháng thể đặc hiệu đem nhuộm màu huỳnh quang Như vậy, kháng thể đặc hiệu có hai chức năng, chức kháng thể kháng nguyên cần chẩn đoán chức kháng nguyên kháng thể kháng gama globulin nhuộm màu huỳnh quang Do đó, cần nhuộm màu kháng thể kháng gama globulin chẩn đốn nhiều bệnh truyền nhiễm - Chuẩn bị kháng nguyên chẩn đoán: giống phần chuẩn bị phản ứng trực tiếp - Chuẩn bị kháng thể kháng gama globulin: Dùng gama globulin thỏ tiêm cho gà trống, sau 2-3 tuần lễ máu gà có nhiều kháng thể chống gama globulin thỏ, lấy máu gà, chắt huyết thanh, tách phần gama globulin thu kháng thể kháng gama globulin thỏ - Chuẩn bị kháng thể đặc hiệu: Giống phần chuẩn bị phản ứng trực tiếp, kháng thể không nhuộm màu - Tiến hành phản ứng: Sau cố định kháng nguyên tiêu bản, nhỏ 1-2 giọt kháng thể đặc hiệu, kháng nguyên kháng thể tương ứng, chúng kết hợp chặt chẽ với nhau, không phát sáng xem lạnh kháng thể đặc hiệu khơng nhuộm màu Nhỏ tiếp 1-2 giọt kháng thể kháng gama globulin nhuộm màu lên tiêu bản, để tác động thời gian rửa nước, để khô, quan sát kính hiển vi huỳnh quang thấy phát sáng có kết hợp tầng, tầng 1: kháng nguyên kháng thể đặc hiệu, tầng 2: kháng thể đặc hiệu với kháng gama globulin, phản ứng dương tính Kết luận bệnh phẩm có chứa virus dại Trong trường hợp kháng nguyên nghi không tương ứng với kháng thể đặc hiệu bệnh dại khơng có kết hợp tầng 1, nhỏ kháng thể kháng gama globuhn nhuộm màu lên tiêu bản, kháng thể bị trơi rửa nước, nên quan sát kính hiển vi huỳnh quang khơng thấy phát sáng, phản ứng âm tính, bệnh phẩm khơng chứa virus dại c Phương pháp chẩn đốn khác Có thể sử dụng phương pháp chẩn đoán như: ELISA gián tiếp (enzyme linked immunosorbent assay), Viral genomic sequencing, RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction), phản ứng trung hòa (virus neutralisation) 35.1.1.9 Phòng chống bệnh a Biện pháp đàn chó Biện pháp phòng chống bệnh dại hữu hiệu khâu quản lý đàn chó Trong việc quản lý đàn chó biện pháp sau có ý nghĩa cả: - Đăng ký ni chó, phạt giết chó thả rơng 477 - Tiêm phịng bắt buộc bệnh dại cho chó - Giết chết động vật mắc nghi bệnh dại, bắt nhốt giết chó vơ chủ Tại nơi có chó, mèo dại phải diệt hết đàn chó, mèo tiếp xúc với vật bị dại Nghiêm cấm bán chó, mèo nơi có dịch dại sang nơi khác để hạn chế lây lan dịch - Các biện pháp đeo rọ mõm, dây xích có ý nghĩa kết hợp với biện pháp thực thành thị b Phòng bệnh vacxin * Với chó Tiêm phịng triệt chó ni vacxin Vacxin dùng cho động vật bao gồm nhiều loại sản xuất cách giảm độc virus dại qua động vật, qua phôi qua tế bào nuôi cấy Vacxin Rabisin (Merial - Pháp) vacxin vơ hoạt dùng để phịng bệnh dại cho chó, mèo, ngựa, trâu bị, dê cừu; tiêm gia súc từ tuần tuổi trở lên Vacxin sản xuất môi trường tế bào, vô hoạt betapropiolactone, bổ trợ aluminium hydroxide Tiêm da tiêm bắp Liều lượng ml/con * Với người Thường không tiêm vacxin phòng dại trước nhiễm trừ số trường hợp người làm cơng tác thú y, người làm phịng thí nghiệm liên quan đến bệnh dại, cán kiểm lâm, người hay săn bắn khách du lịch chuẩn bị đến nơi tiềm tàng mầm bệnh Một số loại vacxin phòng bệnh dại người: - Vacxin Fuenzalida: sản xuất từ việc nuôi cấy virus não chuột Trong q trình chiết tách virus khó loại bỏ tất thành phần không cần thiết protein myelin não chuột Chính thành phần tồn dư này, đặc biệt lượng myelin (một thành phần sợi thần kinh) tồn dư, gây tổn thương hệ thần kinh người tiêm phòng như: viêm não - màng não, viêm tủy - màng não, viêm tủy cắt ngang Những tổn thương xảy với tỷ lệ khoảng 1/8.000 - 1/27.000 trường hợp tiêm vacxin Người lớn tiêm mũi, cách ngày tiêm lần; liều lượng 0,2 ml/lần; tiêm da Tiêm nhắc lại mũi vào ngày 21 30 sau tiêm mũi thứ Trẻ em < 15 tuổi: tiêm mũi cách ngày tiêm lần; liều lượng 0,1 ml/lần, tiêm da Tiêm nhắc lại mũi vào ngày 21 30 sau mũi tiêm thứ Trong tháng, phải tiêm lần số lượng lần tiêm thứ giảm 20-50% tùy theo vết cắn thời gian bị cắn lần trước; bác sỹ định - Vacxin Verorab Pháp: sản xuất từ việc ni cấy virus tế bào Vero, khơng cịn lượng myelin tồn dư khơng gây bệnh lý não sau tiêm 478 phòng Người lớn tiêm mũi vào ngày 0, 3, 7, 14 28 sau bị động vật dại cắn; liều lượng ml/lần vào delta cánh tay - Vacxin Vnukovo: chế từ chủng virus dại Vnukovo-32 nuôi cấy môi trường tế bào thận chuột hamster Syrian (Syrian hamster kidney cell) sau 30-38 lần cấy chuyển vô hoạt virus tia cực tím Liều lượng ml/lần vào ngày 0, 3, 7, 14, 30 90 sau bị động vật dại cắn Người lớn tiêm vào delta; trẻ em < tuổi tiêm bắp đùi trước Vacxin tuyệt đối không tiêm vào mông Trong năm gần đây, WHO khuyến cáo nước nên chuyển dần sang việc sử dụng vacxin phòng dại cấy tế bào, ngưng việc sử dụng vacxin Fuenzalida Tuy nhiên, điều kiện kinh tế, nước ta sử dụng hai loại vacxin kể để người dân lựa chọn c Điều trị Gia súc bị dại không chữa trị, phải tiêu diệt ngay, xử lý, chôn sâu tiêu độc khu vực nhốt gia súc Với người bị chó cắn, phải xử lý vết thương xà phòng, rượu, cồn, cồn pha lỗng, theo dõi chó cắn vịng 15 ngày, chó phát dại thời gian phải tiêm vacxin Nếu người bị dại cắn, phải dùng kháng huyết dại tiêm sớm tốt (không 72 sau bị cắn), đồng thời tiêm vacxin phịng dại 479 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHÍNH Bộ TCVN 8400:2010: Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán bệnh động vật Bộ TCVN 8400:2011: Bệnh động vật - Quy trình chẩn đốn bệnh động vật Bộ TCVN 8400:2014: Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán bệnh động vật Bộ TCVN 8400:2019: Bệnh động vật - Quy trình chẩn đốn bệnh động vật Carter, G R & Cole Jr, J R (Eds.) (2012) Diagnostic procedure in veterinary bacteriology and mycology Academic Press Dwight C Hirsh, Yuan Chung Zee (1999) Veterinary Microbiology, Blackwell Science Fenner, F J., Bachmann, P A & Gibbs, E P J (2014) Veterinary virology Academic Press http://www.oie.int http://www.vetbact.org/?artid = 10 https://talk.ictvonline.org/ 11 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy 12 Markey, B., Leonard, F., Archambault, M., Cullinane, A & Maguire, D (2013) Clinical veterinary microbiology e-book Elsevier Health Sciences 13 Nguyễn Bá Hiên & Nguyễn Minh Tâm (2007) Giáo trình Vi sinh vật - Bệnh truyền nhiễm vật nuôi (dùng cho trường THCN) Nhà xuất Hà Nội 14 Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thúy, Nguyễn Văn Giáp, Đặng Hữu Anh, Trương Hà Thái & Chu Thị Thanh Hương (2020) Giáo trình Bệnh truyền nhiễm Thú y Nhà xuất Học viện Nông nghiệp 15 Nguyễn Bá Hiên, Trần Xuân Hạnh, Phạm Quang Thái & Hồng Văn Năm (2010) Cơng nghệ chế tạo sử dụng vacxin thú y Việt Nam Nhà xuất Nông nghiệp 16 Nguyễn Bá Hiên & Trần Thị Lan Hương (2010) Giáo trình Miễn dịch học ứng dụng Nhà xuất Nông nghiệp 17 Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên & Trần Thị Lan Hương (2001) Giáo trình Vi sinh vật Thú y Nhà xuất Nông nghiệp 18 Nguyễn Như Thanh, Bùi Quang Anh & Trương Quang (2001) Giáo trình Dịch tễ học Thú y Nhà xuất Nông nghiệp 19 Quinn, P J., Markey, B K., Leonard, F C., FitzPatrick, E S & Fanning, S (2015) Concise review of veterinary microbiology 480 20 Quinn, P J., Markey, B K., Leonard, F C., Hartigan, P., Fanning, S & Fitzpatrick, E (2011) Veterinary microbiology and microbial disease John Wiley & Sons 21 Samanta, I (2013) Veterinary bacteriology New India Publishing Agency 22 Saif Y.M., H.J Barnes, J.R.Glisson, A.M Fadly, L.R McDougald & D.E Swayne (2003) Diseases of Poultry, 11th edition, Iowa State Press, Iowa, USA 23 Songer, J G & Post, K W (2004) Veterinary Microbiology-E-Book: Bacterial and Fungal Agents of Animal Disease Elsevier Health Sciences 24 Võ Tấn Đại, Dương Tấn Đạt (2016) So sánh hiệu chẩn đốn bệnh Care chó phương pháp xét nghiệm nhanh kỹ thuật RT-PCR, phân tích đoạn gen Hemagglutinin virus gây bệnh Khoa học kỹ thuật Thú y, XXII (8): 29-36 481 NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP Trâu Quỳ - Gia Lâm - Hà Nội Điện thoại: 0243 876 0325 - 024 6261 7649 Email: nxb@vnua.edu.vn www.nxb.vnua.edu.vn Chịu trách nhiệm xuất ThS ĐỖ LÊ ANH Giám đốc Nhà xuất bản Biên tập TRẦN THỊ HỒI ANH Thiết kế bìa ĐÀO THỊ HƯƠNG Chế vi tính TRẦN THỊ HỒI ANH ISBN: 978-604-924-675-3 NXBHVNN-2022 In 180 cuốn, khổ 19 × 27cm Cơng ty TNHH In Ánh Dương Địa chỉ: Bình Minh - Trâu Quỳ - Gia Lâm - Hà Nội Số đăng ký kế hoạch xuất bản: 463-2022/CXBIPH/11-18/ĐHNN Số định xuất bản: 18/QĐ-NXB-HVN ngày 12/4/2022 In xong nộp lưu chiểu: quý II năm 2022 482