Khóa luận tốt nghiệp phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn sinh collagenase ngoại bào

lỗ thHỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM - HOÀNG THỊ THẢO NGUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN SINH COLLAGENASE NGOẠI BÀO Hà Nội - 2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN SINH COLLAGENASE NGOẠI BÀO Người thực : Hoàng Thị Thảo Nguyên Mã SV : 620896 Khóa : K62 Lớp : Quản lý thực phẩm Giáo viên hướng dẫn : TS Bạch Thị Mai Hoa Giáo viên hướng dẫn : TS Nguyễn Thị Lâm Đồn Địa điểm thực tập Viện Cơng Nghệ Sinh Học : Hà Nội - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài kết nghiên cứu riêng với giúp đỡ tận tình giáo viên hướng dẫn Các số liệu, kết trình bày khóa luận trung thực chưa sử dụng Các thơng tin, trích dẫn rõ nguồn gốc xin chịu trách nhiệm số liệu khóa luận Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Hoàng Thị Thảo Nguyên i LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn chân thành, xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS Bạch Thị Mai Hoa – Phịng cơng nghệ lên men, Viện công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TS Nguyễn Thị Lâm Đồn – Khoa Cơng Nghệ Thực Phẩm, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam, người cô tận tâm, định hướng nghiên cứu, hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt để tơi hồn thành khóa luận Tơi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến cán phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người tận tình bảo, giúp đỡ tơi suốt q trình làm khóa luận tốt nghiệp Tơi trân trọng cảm ơn thầy giáo, cô giáo khoa Công nghệ Thực Phẩm giúp đỡ trang bị cho tơi kiến thức hữu ích đồng hành suốt thời gian học tập nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới người thân gia đình ln bên tơi, chăm sóc, động viên tơi tồn thể anh chị, bạn bè giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Hoàng Thị Thảo Nguyên ii C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii PHẦN THỨ NHẤT: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN THỨ HAI: TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 2.1 Xạ khuẩn 2.1.1 Xạ khuẩn phân bố tự nhiên 2.1.2 Cấu tạo xạ khuẩn 2.1.3 Đặc điểm hình thái, trình sinh trưởng phát triển xạ khuẩn 2.1.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 2.1.5 Sự hình thành bào tử 2.2 Phân loại xạ khuẩn 2.2.1 Lịch sử phân loại xạ khuẩn 2.2.2 Theo đặc điểm hình thái tính chất ni cấy 2.2.3 Theo đặc điểm sinh lý, sinh hóa 10 2.2.4 Theo phân loại số 10 2.2.5 Phân loại xạ khuẩn giải trình tự gen 16s – rRNA 11 2.2.6 Phân loại theo Chương trình xạ khuẩn quốc tế (ISP) 12 2.3 Collagen 13 2.3.1 Phân tử collagen 13 2.3.2 Các loại collagen cấu tạo chúng 15 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn iii C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 2.3.3 Ứng dụng collgen 15 2.3.4 Collagenase 18 PHẦN THỨ BA: VẬT LIỆU- NỘI DUNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 22 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 3.1.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất dùng cho nghiên cứu 22 3.1.3 Môi trường nghiên cứu 23 3.1.4 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 27 3.2 Nội dung nghiên cứu 27 3.3 Phương pháp nghiên cứu 27 3.3.1 Phương pháp bảo quản giống 27 3.3.2 Phân lập tuyển chọn xạ khuẩn 28 3.3.3 Phương pháp xác định định tính collagenase 28 3.3.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học để phân loại xạ khuẩn 29 PHẦN THỨ TƯ: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính collagenase 33 4.2 Xác định định tính collagenase 38 4.3 Đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn tuyển chọn 39 4.3.1 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn 39 4.3.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 43 PHẦN THỨ NĂM: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 54 5.1 Kết luận 54 5.2 Đề nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn iv C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Sự phân bố amino acid chuỗi peptide 14 Bảng 3.1 Danh mục thiết bị sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 3.2 Danh mục xuất xứ hóa chất sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 4.1 Kết phân lập xạ khuẩn 34 Bảng 4.2 Hoạt tính chủng xạ khuẩn 36 Bảng 4.3 Đặc điểm hình thái, ni cấy chủng XKC1, XKC3 XKD1 42 Bảng 4.4 Khả sử dụng nguồn cacbon khác chủng xạ khuẩn 43 Bảng 4.5 Khả sử dụng nguồn nito chủng xạ khuẩn 46 Bảng 4.6 Khả chịu muối chủng xạ khuẩn 48 Bảng 4.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn 50 Bảng 4.8 Ảnh hưởng pH đến phát triển chủng xạ khuẩn 51 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn v C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Các sợi liên kết collagen 13 Hình 2.2 Cấu trúc tropocollagen 14 Hình 4.1 Kết phân lập mẫu XKA 33 Hình 4.2 Kết phân lập mẫu XKB 33 Hình 4.3 Kết phân lập mẫu XKC 34 Hình 4.4 Kết phân lập mẫu XKD 34 Hình 4.5 Các chủng xạ khuẩn mẫu XKA 35 Hình 4.6 Các chủng xạ khuẩn mẫu XKB 35 Hình 4.7 Các chủng xạ khuẩn mẫuXKC 35 Hình 4.8 Các chủng xạ khuẩn mẫu XKD 36 Hình 4.9 Khả thủy phân chất gellatin chủng xạ khuẩn 37 Hình 4.10 Khả phân hủy chất collagen chủng xạ khuẩn .38 Hình 4.11 Khả thủy phân chất casein (a), gelatin (b) , collagen (c) chủng XKC1 38 Hình 4.12 Khả phân giải chất casein (a), gelatin (b), collagen (c) chủng XKC3 .39 Hình 4.13 Khả phân giải chất casein (a), gelatin (b), collagen (c) chủng XKD1 .39 Hình 4.14 Đặc điểm hình thái chủng CKC3 qua thời gian ni cấy môi trường ISP1 40 Hình 4.15 Đặc điểm hình thái chủng XKC3 qua thời gian ni cấy môi trừng ISP2 40 Hình 4.16 Đặc điểm hình thái chủng XKC3 qua thời gian nuôi cấy môi trường ISP4 40 Hình 4.17 Chủng XKC3 cấy mơi trường ISP6 41 Hình 4.18 Chủng XKC3 cấy môi trường ISP7 41 Hình 4.19 Chủng XKC1 cấy mơi trường ISP1 41 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn vi C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.20 Chủng XKC1 cấy mơi trường ISP4 41 Hình 4.21 Chủng XKC1 cấy môi trường ISP7 41 Hình 4.22 Chủng XKD1 cấu môi trường ISP 41 Hình 4.23 Chủng XKD1 cấy mơi trường ISP 42 Hình 4.24 Chủng XKD1 cấy môi trường ISP7 42 Hình 4.25 Khả sử dụng nguồn cacbon chủng CKC1 44 Hình 4.26 Khả sử dụng nguồn cacbon chủng XKC3 .45 Hình 4.27 Khả sử dụng nguồn cacbon chủng XKD1 .45 Hình 4.28 Khả sử dụng nguồn nito chủng XKC1 47 Hình 4.29 Khả sử dụng nguồn nito chủng XKC3 47 Hình 4.30 Khả sử dụng nguồn nito chủng XKD1 47 Hình 4.31 Khả chịu muối chủng XKC1 48 Hình 4.32 Khả chịu muối chủng XKC3 49 Hình 4.33 Khả chịu muối chủng CKD1 49 Hình 4.34 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả phát triển chủng 50 Hình 4.35 Ảnh hưởng pH đến phát triển XKC1 52 Hình 4.36 Ảnh hưởng pH đến phát triển XKC3 52 Hình 4.37 Ảnh hưởng pH đến phát triển XKD1 53 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn vii C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT w/v Khối lượng / thể tích g/l Gam/lit EDTA Ethylenediaminetracetic aicd Cs Cộng Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn viii C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Cellobiose + - ± D-Glucose ± - ± Lactose ++ ± ++ Myo-Inositol ++ ++ ++ Ghi chú: ++ Phát triển tốt + Phát triển bình thường ± phát triển - khơng phát triển Qua bảng 4.4 ta thấy, chủng XKC1 mọc tốt mơi trường có bổ sung D- raffinase, Lactose Myo-Inositol Phát triển yếu môi trường D-Glucose Chủng XKC1 dễ dàng nuôi cấy phát triển tốt nguồn Lactose, nguồn có giá thành thấp phổ biến Hình 4.25 Khả sử dụng nguồn cacbon chủng CKC1 Chủng XKC3 mọc tốt mơi trường có bổ sung Myo-Inositol mọc yếu môi trường L-rhamnose, Glucose, D-fructose Không mọc môi trường bổ sung Cellobiose D-Glucose XKC3 chủng dễ dàng ni cấy mọc tốt mơi trường có bổ sung Glucose, nguồn phổ biến với giá thành rẻ Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 44 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.26 Khả sử dụng nguồn cacbon chủng XKC3 Chủng XKD1 mọc tốt môi trường L-rhamnose, Lactose Myo-Inositol Mọc mơi trường có bổ dung D-fructose D-Glucose Cũng giống XKC1, chủng XKD1 mọc tốt mơi trường có bổ sung Lactose ưu điểm cho việc ni cấy sau Hình 4.27 Khả sử dụng nguồn cacbon chủng XKD1 Khả đồng hóa nguồn cacbon tiêu quan trọng để phân loại xạ khuẩn sử dụng môi trường ISP Kết cho thấy, chủng xạ khuẩn nghiên cứu có khả đồng hóa tốt nguồn cacbon khác Nguồn cacbon cụ thể sử dụng có hiệu chủng khơng hiệu chủng khác 4.3.2.2 Khả sử dụng nguồn Nitơ Để đánh giá khả sử dụng nguồn nitơ, tiến hành nuôi cấy xạ khuẩn mơi trường ISP8 có bổ sung nguồn nitơ khác với tỉ lệ 1% Kết thể bảng 4.5 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 45 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng 4.5 Khả sử dụng nguồn nito chủng xạ khuẩn STT Nguồn Nito Chủng xạ khuẩn XKC1 XKC3 XKD1 L-Asparagin monohydrat + + + Pepton ++ + ± L-Leucin ± - ± L-Arginine monohydrat + - + L-Isoleucin ++ - + L-Valine + - ± L-Methionine + - ± N-axetyl-D-glucose-amine + - + Cao nấm men ++ + ± 12 L-Cysteine + - + 13 L-Threonine + ± ± 14 L-Tryptophan ± - ± 15 L-Lysine + - + 18 Amino hydroxy-methyl + + + ± ± + 1,3 promo 20 ISP Ghi chú: ++ Phát triển tốt + Phát triển bình thường ± Phát triển yếu – không phát triển Qua bảng ta thấy chủng XKC1 phát triển tốt nguồn pepton, LIsoleucin, cao nấm men Phát triển yếu nguồn L-Asparagin monohydrat, LArginine monohydrat, L-Valine, L-Methionine, L-Cysteine Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 46 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.28 Khả sử dụng nguồn nito chủng XKC1 Chủng XKC3 phát triển nguồn Pepton, Cao nấm men Khơng có khả phát triển nguồn L-Leucin, L-Arginine monohydrat, L-Isoleucin, LValine, L-Methionine, L-Tryptophan, L-Lysine Hình 4.29 Khả sử dụng nguồn nito chủng XKC3 Các nguồn nitơ pepton, cao nấm men sử dụng rộng rãi phòng vi sinh dùng để nuôi cấy nhiều loại vi khuẩn khác Đặc biệt việc sử dụng peptone cao nấm men việc nuôi cấy để thu hồi enzyem có lợi giá thành thấp so với nguồn nito khác Chủng XKD1 phát triển nguồn L-Asparagin monohydrat, L-Arginine monohydrat, L-Isoleucin, N-axetyl-D-glucose-amine, L-Cysteine, L-Tryptophan phát triển yếu nguồn Pepton, L-Leucin, L-Valine, L-Methionine Hình 4.30 Khả sử dụng nguồn nito chủng XKD1 So với chủng XKC1 XKC3 việc ni cấy chủng XKD1 tốn nguồn ninơ L-Asparagin monohydrat, L-Arginine monohydrat có giá thành cao khơng phổ biến cao nấm men peptone Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 47 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 4.3.2.3 Khả chịu muối Theo Larsen (1986) vi sinh vật chịu ưa muối nhóm thành nhóm theo nhu cầu muối chúng, sinh vật chịu nồng độ muối thấp sinh trưởng môi trường nước biển với nồng độ muối từ 2-3% Các sinh vật thuộc nhóm chịu muối trung bình sinh trưởng nồng độ NaCl từ 5-20% (w/v) Nhóm sinh vật chịu nồng độ muối cao sinh trưởng nồng độ muối bão hịa, khơng sinh trưởng nồng độ NaCl thấp 12% (Larsen ,1986) Để kiểm tra khả chịu muối, cấy chủng xạ khuẩn môi trường ISP2 có bổ sung NaCl với nồng độ khác Kết bảng 4.6 Bảng 4.6 Khả chịu muối chủng xạ khuẩn Chủng Nồng độ NaCl ( %) 10 13 15 XKC1 ++ ++ ± ± ± - - - - XKC3 ++ ++ + ± ± - - - - XKD1 ++ ± ± ± ± ± - - - Ghi chú: ++ Phát triển tốt +Phát triển bình thường ± phát triển – khơng phát triển Qua bảng 4.6 ta thấy chủng xạ khuẩn thuộc nghiên cứu chịu nồng độ muối tới 7% nên xếp vào nhóm chịu muối trung bình Khi nồng độ muối môi trường tăng lên, khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn giảm dần Hình 4.31 Khả chịu muối chủng XKC1 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 48 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.32 Khả chịu muối chủng XKC3 Hình 4.33 Khả chịu muối chủng CKD1 4.3.2.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả phát triển chủng xạ khuẩn Mỗi vi sinh vật phát triển tốt khoảng nhiệt độ định Ngồi khoảng nhiệt độ vi sinh vật bị hạn chế phát triển, chí khơng phát triển Đối với nhiệt độ thấp thường không gây chết vi sinh vật mà tác động lên khả chuyển hóa hợp chất, ức chế hoạt động hệ enzyme, thay đổi khả trao đổi chất chúng Vì chúng làm vi sinh vật khả phát triển Cũng có nhiều trường hợp vi sinh vật bị chết từ từ nhiệt độ thấp không xảy đột ngột nhiệt độ cao ( Bạch Thị Mai Hoa, 2005) Do đó, việc xác định nhiệt độ sinh trưởng tối ưu cho chủng cần thiết q trình ni cấy.Các chủng xạ khuẩn ni môi trường ISP2 điều kiện nhiệt độ khác Kết trình bày bảng 4.7 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 49 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng 4.7 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn Chủng xạ Nhiệt độ ( oC ) khuẩn 20 30 37 XKC1 - + ++ ++ XKC3 - ± ++ ++ XKD1 - ± ++ ++ Chú thích : ++ Phát triển tốt + Phát triển bình thường ± phát triển - không phát triển C1 D1 C3 oC C1 C3 20 oC D1 D1 30 oC C1 C3 37 oC Hình 4.34 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả phát triển chủng Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 50 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Cả ba chủng thuộc nhóm ưa ấm (mesophilic), cần nhiệt độ khoảng 20-40oC, không sinh trưởng nhiệt độ 4oC sinh trưởng tốt nhiệt độ 30oC Theo số nghiên cứu trước, chủng có hoạt tính collagen có hoạt tính mạnh mẽ nhiệt độ 35oC – 37oC chủng Pseudomonas sp Manisha Gautam Wamik Azmi, 2017) Nhiệt độ ủ tương tự 37oC sử dụng để sản xuất collagenase Bacillus licheniformis (Baehaki , 2012) 4.3.2.5 Ảnh hưởng pH đến phát triển chủng xạ khuẩn Rất nhiều nghiên cứu rằng, pH có ý nghĩa định đến nhiều chủng vi sinh vật, tác động sâu sắc đến trình trao đổi chất chúng Giới hạn hoạt động vi sinh vật thường nằm khoảng pH từ 4-11 Xạ khuẩn thuộc nhóm ưa môi trường kiềm, hầu hết phát triển tốt pH 7-8, cao pH 11 thấp pH Để xác định ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng phát triển xạ khuẩn, chúng tơi cấy chủng mơi trường ISP2 có độ pH khác nhau, nuôi 30oC 37oC, sau - ngày quan sát sinh trưởng Kết trình bày bảng 4.8 Bảng 4.8 Ảnh hưởng pH đến phát triển chủng xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn pH 10 11 XKC1 ++ + ± - ± ± - XKC3 ++ ± ++ + ± ++ - XKD1 ++ + + ± ± ++ - Ghi chú: ++ phát triển tốt + phát triển bình thường ± phát triển - không phát triển Dựa vào bảng 4.8 cho thấy chủng xạ khuẩn phát triển tốt khoảng pH từ 9-10, phát triển tốt pH 5-7 không phát triển pH 11 Điều phù hợp với nghiên cứu trước cho vi khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật phát Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 51 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an triển tốt môi trường trung tính kiềm, cao 10 thấp Đặc điểm sinh trưởng chủng xạ khuẩn đồng với hoạt tính tối ưu enzyme collagenase từ vi khuẩn Hình 4.35 Ảnh hưởng pH đến phát triển XKC1 Hình 4.36 Ảnh hưởng pH đến phát triển XKC3 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 52 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.37 Ảnh hưởng pH đến phát triển XKD1 Theo số nghiên cứu trước, chủng có hoạt tính collagenase có khả phát triển mơi trường có pH từ 6-8 chủng Bacillus sp (Hashinaga cs, 1996), Treptomyces exfoliatus (Jain, R cs, 2010) Zygosaccharomyces rouxii (Okamono cs, 2001) phát triển mạnh mơi trường có pH từ 7,0 – 7,2 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 53 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an PHẦN THỨ NĂM: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Sau trình nghiên cứu tiến hành thí nghiệm em đưa số kết luận sau: - Đã phân lập tuyển chọn thành cơng chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp collagenase ngoại bào, chủng XKC1, XKC3 XKD1 - Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn XKC1 như: + Có màu trắng ngà, khuẩn ty chất tiết mơi trường có màu xám + Chủng xạ khuẩn XKC1 sinh chất phân hủy casein, gelatin, collagen + Có khả phát triển nhiệt độ 20 oC – 37 oC, pH thích hợp từ 5-10, sinh trưởng mơi trường có nồng độ NaCl từ 1-5% + Có khả đồng hóa nhiều loại đường khác D-fructose, Draffinase, D-Glucose , Lactose, Myo-Inositol 5.2 Đề nghị Do tình hình dịch Covid diễn phức tạp đề tài nghiên cứu bị chậm so với tiến độ nghiên cứu đề Do thời gian em xin đề nghị được: - Tiếp tục nghiên cứu đặc điểm hình thái, ni cấy chủng XKC1, XKC3 XKD1; - Tiếp tục nghiên cứu định danh chủng XKC1, XKC3 XKD1 cách chụp kính hiển vi điện tử quét để xác định cuống sinh bào tử; - Tách 16SRNA ba chủng để xác định trình tự gen so sánh với ngân hàng gen để xác định tên chủng; - Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh enzyme collagensase từ chủng CKC1, CKC3 XKD1; - Nghiên cứu ứng dụng collagenase từ chủng chủng CKC1, CKC3 XKD1 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 54 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bạch Thị Mai Hoa (2005), “Nghiên cứu đột biến điểm đặc tính collagenase tái tổ hợp từ chủng Lysinibacillus sphaericus phân lập Việt Nam” Hồ Thị Hà Châu Công Lương (2016) “ Tinh xác định đặc tính collagen từ da cá Tra Lê Gia Hy (1994) “ Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh Đạo ôn Thối cổ rễ phân lập Việt Nam” Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học, Hà Nội Lương Thị Hương Giang (2011), “Tuyển chọn nghiên cứu hoạt tính sinh học số chủng xạ khuẩn phân lập núi Pháo – Đại Từ - Thái Nguyên ” Ngơ Đình Bính, Vũ Thị Nhung (1992) “Đặc tính phân loại hai chủng xạ khuẩn 5820 THTN23” Tạp chí Sinh học, tập 14, số ( 9/1992) Nguyễn Đức Lượng (1996) “ Công nghệ vi sinh vật” Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Đặng Đức Trạch, Dương Đức Tiến (1972) “ Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học” Tập Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998) Sinh Vật học Nhà xuất giáo dục 10 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đồn Xn Mượu, Phạm Văn Ty (1978), “Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học” - tập 3, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 11 Nguyễn Như Hiền (2006), Giáo trình Sinh học tế bào, NXB Giáo Dục, Hà Nội 12 Nguyễn Thành Đạt (2005), Cơ sở sinh học vi sinh vật, tập 1, NXB ĐHSP, Hà Nội Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 55 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 13 Nguyễn Xuân Thành Nguyễn Bá Hiên, Hoàng Hải, Vũ Thị Hoan (2005), Vi sinh vật công nghiệp, NXB Giáo dục, Hà Nội 14 Phạm Thị Phương oanh (2009), “Nghiên cứu khả tách chiết, tinh enzyme collagenase từ nội tạng tôm sú Khảo sát yếu tố ảnh hưởng hoạt tính trước sau sắc ký”, Đại học Nơng lâm thànhh phố Hồ Chí Minh Tài liệu nước 15 A.L.Demain.1981 Actinomycete culture colection: A brief outline Actinomycetologica 16 Ana Sofia Duarte, Antonio Correia and Ana Cristina Esteves (2014) , “ Bacterial collagenase -a review”, informa healthcare, 21, pp 106- 126 17 Baehaki, A., Suhartono, M.T., Sakarno, S.D., Sitanggang, A.B., Setyahadi, S., Meinhardt, F , (2012) “Purification and characterization of collagenase from Bacillus licheniformis F11.4 Afr J Microbiol Res”, Vol 6, pp 2373-2379 18 Bond MD., Wart HEV (1984) “ Purification and separation of individual collagenase from Clostridium histolyticum using red hye ligand chromatography” Biochemistry (US), 23, pp.3077-3085 19 Demina N S., S V Lysenko (1996) , “ Collagenolytic enzymes synthesized by microorganisms”, Mikrobiologiia, 65 (3), pp.293-304 20 Garg, FHSaA, (1997) “ Handbook of Biodegradable Polymers Collagen: Characterization, Processing and Medical Applications 21 Gautam M., and Azmi W (2017), “Sceening and Isolation of Collagenase Producing Microorgamism from Proteins Waste Found in Himalaya Region” Journal of Applied Biotechnology Reports,4, 558-565 22 George P Rédei (2008), Encyclopedia of Genetics, Genomics, Proteomics and Informatics, 3rd, Springer, pp 1709 – 1712 23 International Streptomycetes Project,1975 24 Jain, R., Jain, P.C., (2010) “Production and partial characterization of collagenase of Streptomyces exfoliates CFS 1068 using poultry feather” Ind J Exp Biol, Vol.48, pp 174-178 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 56 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 25 Juarez Z E., M Wstinson (1999) “ An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues”, Infect Immun, 67(1), pp.271- 278 26 Keswanit J and Whitman W.B (2001), “Relationship of 16S rRNA sequence similarity to DNA hybridization in prokaryotes”, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51, pp 667 – 678 27 Larsen, H (1986) Halophilic and halotolerant microorganism an overview historical perspective FEMS Microbiol Biotechnol., 24: 2235-2241 28 Lima, C.A., Rodrigues, P.M.B., Porto, T.S., Viana, D.A., Lima Filho, J.S., Porto, A.L.F., Carneiro – daCunha, MG., Production of a collagenase from Candida albicans URM3622 Biochem Eng J, 2009, Vol 43, pp 315-320 29 Merkel J.R., J.H Dreisbach and H B Ziegler ( 1975), “ Collagenolytic activity of some marine bacteria”, Appl Microbiol , 29(2), pp.145 – 151 30 Nagano H., To K A (2000), “ Purification of collagenase and specificity of its related enzyme from Bacillus subtilis FS-2”, Biosci Biotechnol Biochem, 64 (1), pp.181-183 31 Okamoto, M., Yonejima, Y., Tsujimoto, Y., Suzuki, Y., Watanabe, K., ( 2001) “ A thermostable collagenolytic protease with a very large molecular mass produced by thermophilic Bacillus sp Strai MO-1” App Microbiol Biotechnol, Vol 57, pp 103- 108 32 Waksman, S.A (1961), “Classification, identification and description of genera and species”, The Actinomycetes, vol 2, The Williams and Wilkins Co., Baltimore 33 Williams and Wilkin (1989), Bergey’s maunual of systematic Bacteriology, Vol 4, pp 2451 – 2492 34 Wolfgang Friess (1997), “ Collagen- biomaterial for drug delivery”, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 45,pp.113-136 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn 57 C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn