(Luận văn) nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn bacillus thuringiensis phân lập tại thái nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC  - TRẦN CHUNG DŨNG lu an n va p ie gh tn to NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT SÂU TƠ TỪ VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG z m co l gm @ an Lu n va THÁI NGUYÊN - 2019 ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC  - TRẦN CHUNG DŨNG lu an n va p ie gh tn to NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT SÂU TƠ TỪ VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS PHÂN LẬP TẠI THÁI NGUYÊN d oa nl w Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 42 02 01 ll u nf va an lu m oi LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG z at nh z @ m co l gm Người hướng dẫn khoa học: TS Trương Phúc Hưng Cơ quan: Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên an Lu n va THÁI NGUYÊN - 2019 ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn si i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, cho phép bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới TS Trương Phúc Hưng giáo viên hướng dẫn khoa học, người tạo điều kiện động viên suốt q trình thực luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán phịng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học tạo điều kiện cho thực thí nghiệm phạm vi luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán Phịng Di truyền vi sinh vật viện Cơng nghệ sinh học giúp đỡ tơi q trình tơi thực luận văn lu an Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo, cô giáo, va n đồng nghiệp, bạn bè quan tâm, động viên dẫn cho để tn to hồn thành luận văn ie gh Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình ln p chỗ dựa vững cho tơi suốt q trình thực luận văn w d oa nl Học viên an lu ll u nf va Trần Chung Dũng oi m z at nh z m co l gm @ n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN an Lu LỜI CAM ĐOAN si ii Tôi xin cam đoan thực tồn cơng trình hướng dẫn TS Trương Phúc Hưng Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa công bố luận văn khác Tôi xin chịu hồn tồn trách nhiệm cam đoan Thái Nguyên, ngày 20 tháng 04 năm 2019 Tác giả lu an n va Trần Chung Dũng p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN si iii STT Viết tắt Viết đầy đủ Bp Base pair DNA Deoxyribonucleotide a xid E.coli Escherichia coli kDa Kilo Dalton lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu MỤC LỤC n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN si iv Lời cảm ơn i Lời cam đoan ii Mục lục iii Danh mục bảng vii Danh mục hình viii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu lu 2.1 Tuyển chọn số chủng Bacillus thurigiensis có hoạt tính diệt sâu tơ an va cao Thái Nguyên n 2.2 Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho q trình lên men chủng vi khuẩn gh tn to Bacillus thuringiensis p ie 2.3 Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập oa nl w Nội dung nghiên cứu d 3.1 Phân lập xác định đặc điểm hình thái số chủng vi khuẩn B an lu thuringiensis từ mẫu đất thu Thái Nguyên có khả diệt sâu u nf va 3.2 Sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao 3.3 Tối ưu điều kiện nuôi cấy tạo chế phẩm sinh học từ loài vi khuẩn B ll oi m thuringiensis có hoạt tính diệt sâu tơ cao z at nh CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I Tổng quan vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) z gm @ 1.1 Lược sử nghiên cứu ứng dụng Bt 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng Bt giới l m co 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng Bt Việt Nam 1.2 Đại cương vi khuẩn Bt an Lu 1.2.1 Sự phân bố Bt http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN n va 1.2.2 Đặc điểm hình thái si v 1.2.3 Phân biệt B.thuringiensis với loài khác chi Bacillus 1.2.4 Đặc điểm sinh hóa 1.2.5 Phân loại Bt 10 1.2.6 Đặc điểm loài phụ Bacillus thuringiensis var kurstaki 11 1.2.7 Tính chất ni cấy 12 1.3.1 Độc tố Bt 13 1.3.2 Cơ chế tác động protein tinh thể lên côn trùng 15 II Tổng quan sâu tơ (côn trùng thử nghiệm) 17 III Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học B thuringiensis 19 lu an 3.1 Phương pháp lên men bề mặt 20 va 3.2 Lên men chìm 20 n tn to CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23 ie gh 2.1 Vật liệu 23 p 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23 nl w 2.1.2 Hóa chất thiết bị 23 oa 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 d 2.2.1 Phương pháp phân lập Bacillus thuringiensis 24 an lu va 2.2.2 Phân loại Bacillus thuringiensis phương pháp huyết u nf miễn dịch 25 ll 2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học 25 oi m z at nh 2.2.4 Phương pháp lên men vi sinh vật 26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 z 3.1 Phân lập, tuyển chọn phân loại chủng Bacillus thuringiensis 28 @ gm 3.1.1 Phân lập chủng B thuringiensis 28 m co l 3.1.2 Sự đa dạng hình thái tinh thể chủng B thuringiensis phân lập 29 3.1.3 Phân loại Bt phương pháp huyết 30 an Lu 3.2 Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) chủng Bacillus thiringiensis phân lập 31 n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN si vi 3.3 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm Bt phịng thí nghiệm 32 3.3.1 Ảnh hưởng điều kiện lên men đến sinh trưởng chủng TC2.5 32 3.3.2 Lên men TC 2.5 tạo chế phẩm 34 3.3.3 Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ chế phẩm Bt – TC2.5 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN si vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc điểm phân biệt lồi nhóm chi Bacillus Bảng 1.2 Phân loại độc tố Cry1 Bt var kurstaki trùng đích 11 Bảng 3.1 Sự phân bố hình dạng tinh thể chủng Bacillus thuringiensis 25 Bảng 3.2 Kết thử hoạt tính diệt sâu tơ sau ngày thử nghiệm 27 Bảng 3.3 Ảnh hưởng pH ban đầu đến sinh trưởng chủng TC 2.5 28 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng chủng TC 2.5 29 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN si viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1A Chủng Bt mang bào tử tinh thể Hình 1.1B Hình dạng tế vào tinh thể số loài Bt Hình 1.2 Phản ứng ngưng kết vi khuẩn Bt với kháng nguyên lông roi H 10 Hình 1.3 Cấu trúc khơng gian chiều protein Cry 2Aa 13 Hình 1.4 Cơ chế tác động độc tố 15 Hình 1.5 Chu kỳ sống sâu tơ Plutella xylostella 16 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus thuringiensi 24 lu an Hình 3.2 Hình ảnh tế bào sinh dưỡng, bào tử tinh thể vi khuẩn Bt quan n va sát kính hiển vi quang học 26 tn to Hình 3.3 Hình ảnh ngưng kết chủng TC 2.5 (2) chủng đối chứng 4D4(1) 27 gh Hình 3.4 Chế phẩm Bt dạng bột sau lên men 30 p ie Hình 3.5 Thử hoạt tính diệt sâu tơ với chế phẩm Bt-TC2.5 31 d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va http://lrc.tnu.edu.vn ac th Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN si 27 300C, 200 vòng/phút, thời gian nhân giống - 10 Dịch nuôi cấy (chứa tế bào giai đoạn sinh trưởng) sử dụng để làm giống cho thí nghiệm [34] 2.2.4.2 Lên men vi khuẩn Bacillus thuringiensis bình tam giác Sử dụng bình tam giác 500 ml chứa 100 ml mơi trường vô trùng bổ sung 1% dịch giống Lên men máy lắc ổn nhiệt 30 ± 0,10C, tốc độ lắc 200 vịng/phút, thời gian ni 48giờ [34] 2.2.5 Phương pháp tính tần suất lu an - Tần số (n) số lần xuất giá trị mẫu số liệu va n - Tần suất (f) tỉ số tần số n kích thước mẫu N: to p ie gh tn fi= ni/N d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 28 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập, tuyển chọn phân loại chủng Bacillus thuringiensis 3.1.1 Phân lập chủng B thuringiensis Để phân lập tuyển chọn chủng B.thuringiensis có hoạt tính diệt trùng cánh (Diptera), 30 mẫu đất, thu thập địa điểm: đất đồi chè Tân Cương, đất trồng rau Túc Duyên, đất trồng hoa mầu Trại Cau tỉnh Thái Nguyên Mẫu đất sử dụng để phân lập theo phương pháp trình lu an bày mục 2.2.1 Các khuẩn lạc riêng rẽ, đặc trưng cho nhóm Bc – Bt tách va n từ mẫu phân lập tương ứng với mẫu đất nghiên cứu sau tiến hành quan gh tn to sát kính hiển vi quang học vật kính dầu Tiêu nhuộm đơn với ie Fushin Qua đó, lựa chọn chủng Bt có khả hình thành bào tử p tinh thể Khuẩn lạc Bt có đặc điểm: trịn, có màu trắng sữa, có mép nhăn oa nl w khơng (Hình 3.1) Các mẫu đất tiến hành phân lập theo phương pháp d nêu Sau ngày nuôi cấy, đĩa thạch chứa môi trường MPA mọc lên tử thuộc chi bacillus ll u nf va an lu số khuẩn lạc khác nhau, chủ yếu khuẩn lạc loài sinh bào oi m Khuẩn lạc Bt z at nh z m co l gm @ an Lu Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Bt n va ac th si 29 Từ 30 mẫu đất thu thập Thái Nguyên, phân lập 152 chủng thuộc chi Bacillus Trong đó, xác định 81 chủng Bacillus thuringiensis sinh tinh thể sau nhuộm quan sát kính hiển vi quang học vật kính dầu Có 23 tổng số 30 mẫu đất chứa vi khuẩn Bacillus thuringiensis Tần suất xuất 0,76 số Bt 0,53 So với tài liệu cơng bố Ngơ Đình Bính cộng tần suất xuất số Bt Việt Nam lần luợt 0,63 0,3 Trong đó, số liệu giới cơng bố là: 0,38 -0,85 [20] 0,2 – 0,5 [17], Như vậy, mẫu đất mà chúng tơi phân lập có số Bt cao lu an Tiến hành làm tiêu khuẩn lạc có hình thái bên ngồi đặc trưng va n cho nhóm vi khuẩn Bacillus quan sát đĩa phân lập nhuộm với tn to thuốc nhuộm Fushin bazơ để quan sát kính hiển vi quang học độ phóng ie gh đại 1000 lần để kiểm tra khả hình thành bào tử tinh thể p 3.1.2 Sự đa dạng hình thái tinh thể chủng B thuringiensis phân lập nl w Các protein tinh thể Bt có dạng: hình lưỡng tháp, hình ovan, hình lập d oa phương hình khơng xác định Các chủng khác có khả sinh tinh an lu thể có hình dạng khác Bằng phương pháp quan sát sơ trực tiếp u nf va kính hiển vi quang học vật kính dầu với tiêu nhuộm đơn fushin, tiến hành phân loại hình dạng tinh thể cho chủng Bt phân lập ll oi m (bảng 3.1) z at nh Bảng 3.1 Sự phân bố hình dạng tinh thể chủng Bacillus thuringiensis z Số chủng 42 17 15 m co l gm Tỉ lệ (%) 51,58 21 18,51 4,93 1,23 2,45 an Lu Hình dạng Hình lưỡng tháp Hình cầu Hình lập phương Hình cầu, hình lưỡng tháp Hình lập phương, hình cầu Cầu-Lưỡng tháp-Lập phương @ STT n va ac th si 30 Từ số liệu thống kê bảng 3.1 ta thấy chủng Bt phân lập sinh tinh thể, chủng sinh tinh thể hình lưỡng tháp chiếm ưu (51,58%) Ngồi ta thấy cịn có chủng Bt sinh loại tinh thể (6,16%) loại tinh thể (2,45%) Điều thể tính đa dạng hình dạng tinh thể chủng Bt phân lập Thái Nguyên qua cho thấy Bt có phổ diệt trùng rộng từ côn trùng cánh vảy, cánh cứng, hai cánh tới giun tròn thực vật Tế bào sinh dưỡng Bào tử Tinh thể độc lu an n va p ie gh tn to d oa nl w lu va an Hình 3.2 Hình ảnh tế bào sinh dưỡng, bào tử tinh thể vi khuẩn Bt u nf quan sát kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 vật kính dầu ll 3.1.3 Phân loại Bt phương pháp huyết oi m z at nh Vi khuẩn Bt chia thành nhiều loài khác nhau, loài mang đặc điểm riêng biệt Trong số loài Bt lồi Bt var z gm @ kustaki có khả diệt trùng cánh vảy Chính tiến m co dụng typ huyết H3a, 3b,3c l hành sàng lọc loài Bt var kustaki từ chủng phân lập cách sử an Lu n va Với kit huyết miễn dịch chuẩn nhận từ phòng Di truyền Vi sinh vật ac th si 31 tiến hành sàng lọc chủng Bt var kustaki cách sử dụng typ huyết H3a, 3b, 3c Với phương pháp phân loại trình bày phần 2.3.3, kết 39 tổng số 81 chủng nghiên cứu khẳng định thuộc lồi kustaki thơng qua phản ứng ngưng kết với typ huyết H3a, 3b, 3c lu an n va p ie gh tn to nl w Hình 3.3 Hình ảnh ngưng kết chủng TC 2.5 (2) chủng đối chứng d oa 4D4(1) an lu 3.2 Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ (Plutella xylostella) chủng u nf va Bacillus thiringiensis phân lập ll Các chủng Bt phân lập pha loãng tới nồng độ 1x105 1x107 bt/ml m oi nước cất vô trùng Thử nghiệm theo phương pháp nhúng đĩa Thiery z at nh Frachon trình bày phần vật liệu phương pháp nghiên cứu Chúng z tơi lựa chọn thử hoạt tính cho chủng Bt var kustaki phân lập @ m co l bày bảng sau: gm Tỷ lệ sâu chết theo dõi ngày Kết thử nghiệm trình an Lu n va ac th si 32 Bảng 3.2 Kết thử hoạt tính diệt sâu tơ sau ngày thử nghiệm STT Tên chủng Tỷ lệ sâu chết (%) lu an 107 bào tử/ml TrC 1.3 76,66 83,33 TC2.7 86,66 93,33 TC 2.5 100 100 TD 1.8 70 83,33 TD 1.6 86,66 100 n va Đối chứng 105 bào tử/ml tn to Từ bảng 3.2 cho thấy: sau ngày thử nghiệm hoạt tính diệt sâu gh p ie chủng nghiên cứu cao Ở nồng độ 107 baò tử, tỷ lệ sâu chết từ tất w chủng thí nghiệm 80% Có hai chủng đạt tỷ lệ diệt sâu 100% oa nl chủng TC 2.5 diệt 100% số sâu thí nghiệm nồng độ 105 b tử Từ kết d thí nghiệm lựa chọn chủng TC 2,5 để tiến hành nghiên lu va an cứu tạo chế phẩm diệt sâu sinh học u nf 3.3 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm Bt phịng thí nghiệm ll 3.3.1 Ảnh hưởng điều kiện lên men đến sinh trưởng chủng TC2.5 oi m z at nh 3.3.1.1 Ảnh hưởng pH Vi khuẩn Bacillus thuringiensis giống tất vi sinh vật khác, z có cấu trúc bé nhỏ đơn giản nên chịu tác động trực tiếp yếu tố @ gm ngoại cảnh, đó, pH tác nhân ảnh hưởng trực tiếp tới m co l sinh trưởng hình thành sản phẩm lên men vi sinh vật Để xác định pH thích hợp cho sinh trưởng Bacillus thuringiensis, thí nghiệm an Lu tiến hành sau: dịch lên men, điều chỉnh độ pH: 5,0; 6,0; 6,5; n va 7,0; 7,5; 8,0; 9,0 Tiến hành thí nghiệm bình nón 500 ml với dung ac th si 33 tích mơi trường 100 ml, nhiệt độ lên men 30oC, thời gian lên men 48 giờ, tốc độ lắc 200 vòng/phút Kết nghiên cứu thể bảng 3.5 Bảng 3.3 Ảnh hưởng pH ban đầu đến sinh trưởng chủng TC 2.5 5,0 Mật độ tế bào (CFU/ml) 2,3 x106 6,0 1,5 x108 6,5 2,2x108 7,0 2,4 x108 7,5 4,5x108 8,0 1,1 x107 9,0 5,5 x106 Độ pH môi trường lu an n va p ie gh tn to Kết nghiên cứu bảng 3 cho thấy chủng TC 2.5 sinh trưởng tốt môi trường trung tính Ở thí nghiệm có pH ban đầu thấp (pH5) pH cao nl w (pH9) khả sinh trưởng TC 2.5 không tốt, mật độ tế bào đạt 106 d oa CFU/ml, tương đương với mật độ cấp giống ban đầu, thấp hàng trăm lần an lu so với mật độ tế bào đạt thí nghiệm có pH trung tính Ở thí va nghiệm có pH ban đầu từ 6,5 – 7,5 mật độ tế bào đạt dịch canh ll u nf trường sau 48 lên men tương đương Như vậy, vi khuẩn Bacillus oi m thuringiensis sinh trưởng tốt mơi trường có pH ban đầu từ 6,5 – 7,5 z at nh 3.3.1.2 Ảnh hưởng nhiệt độ Trong tự nhiên tuỳ thuộc nhóm vi sinh vật, mà nhiệt độ sinh trưởng khác z Ở nhiệt độ thích hợp, vi sinh vật sinh trưởng mạnh, tạo nhiều sinh khối @ gm sản phẩm phụ Ngược lại, nhiệt độ khơng thích hợp gây ức chế m co l phát triển tiêu diệt vi sinh vật Do vậy, cần xác định nhiệt độ tốt ưu cho trình lên men Thí nghiệm thực nhiệt độ: 20oC, 25oC, 30oC, an Lu 35oC, 40oC, 45oC n va Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng chủng TC 2.5 ac th si 34 Mật độ tế bào (oC) (CFU/ml) 20 6,5 x 107 25 2,8 x 108 30 5,49 x 108 35 4,3 x 108 40 8,5 x 107 45 2,3 x 106 lu Nhiệt độ lên men an n va to gh tn Kết nghiên cứu bảng 3.4 cho thấy: nhiệt độ có ảnh hưởng mạnh đến p ie sinh trưởng chủng TC 2.5 Chủng TC 2.5 sinh trưởng mạnh khoảng nhiệt độ từ 25 – 35oC, nhiệt độ mật độ tế bào, bào tử đạt 4,19x108 oa nl w CFU/ml Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu d Ngơ Đình Bính cộng ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng an lu Bacillus thuringiensis Theo đó, nhiệt độ sinh trưởng tốt vi khuẩn u nf va Bacillus thuringiensis 28±1oC (Ngô Đình Bính,2011; Tien et al., 2013; Trang ll et al., 2012) Ở nhiệt độ 20oC vi khuẩn B thuringiensis sinh trưởng chậm, oi m 40oC bắt đầu ức chế sinh trưởng z at nh 3.3.2 Lên men TC 2.5 tạo chế phẩm Sau nghiên cứu sơ yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men z gm @ tiến hành lên men sản xuất tạo chế phẩm điều kiện PH=7, nhiệt độ: 30oC, lắc l 200 vòng/phút thời gian 72 Sau kết thúc lên men thu sinh khối m co đặt tủ âm tiến hành đông khô, thu chế phẩm dạng bột an Lu n va ac th si 35 lu an n va Hình 3.4 Chế phẩm Bt dạng bột sau lên men tn to 3.3.3 Thử nghiệm hoạt tính diệt sâu tơ chế phẩm Bt – TC2.5 p ie gh Để đánh giá hoạt tính sinh học chế phẩm Bt-TC 2.5 tiến nl w hành thí nghiệm thử hoạt tính diệt sâu tơ chế phẩm Các thí nghiệm tiến d oa hành điều kiện nhiệt độ, ánh sáng thông thường, bố trí thí nghiệm an lu trình bày chương (Vật liệu phương pháp nghiên cứu) u nf va Q q trình thử hoạt tính cho thấy, 100% sâu chết sau ngày nghiên cứu sau ăn có chứa chế phẩm BT- TC2.5 Như vậy, chủng TC2.5 sau ll m oi lên men tạo chế phẩm điều kiện giữ hoạt tính diệt z at nh sâu cao z m co l gm @ an Lu n va ac th si 36 lu an A B va n (A): Sâu tơ chết ăn to gh tn tẩm dịch chế phẩm Bt – TC25 (B): Sâu tơ cịn sống lơ đối chứng dương với ngâm p ie nuớc cất nl w Hình 3.5 Thử hoạt tính diệt sâu tơ với chế phẩm Bt-TC2.5 sau ngày d oa thí nghiệm ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1) Đã thử nghiệm hoạt tính diệt sâu chủng Bt var kustaki Kết cho thấy, nồng độ 107 bào tử/ml hoạt tính diệt sâu cao chủng TC 2.5 có khả diệt 100% sâu thử nghiệm nồng độ 105 Chủng TC 2.5 lựa chọn để lên men tạo chế phẩm diệt sâu tơ 2) , Đã xác định khoảng nhiệt độ 28±1oC độ pH từ 6,5 – 7,5 thích hợp cho lên men chế phẩn Bt thử nghiệm 3) Đã thành công việc tạo chế phẩm Bt-TC2.5 có hoạt tính diệt lu an sâu tơ cao va n Kiến nghị to tn Tiếp tục nghiên cứu sâu chủng TC 2.5 tối ưu hoá quy trình lên p ie gh men sản xuất chế phẩm Bt quy mô công nghiệp d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đái Duy Ban (2006), Công nghệ gen, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quang Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt (2002), Thu nhận huyết miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis, Kỷ yếu 2001 -2002, Viện Công nghệ Sinh học, trang 296 – 302 Ngơ Đình Bính (2005),Giáo trình thuốc trừ sâu sinh học Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Thanh Hạnh, Nguyễn lu an Quỳnh Châu, Ngơ Đình Bính (2004), Nghiên cứu đa dạng sinh học n va vi khuẩn Bacillus thuringiensis Việt Nam Báo cáo khoa học, nghiên cứu Nguyên 2004, NXB KHKT trang 59 – 62 ie gh tn to Khoa học sống định hướng Nông lâm nghệp miền núi, Thái p Nguyễn Lân Dũng (1981), Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại nl w trồng, NXB KHKT d oa Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật an lu học, NXB giáo dục va Hồng Thị Lợi (2003), Giáo trình trùng học nông nghiệp tập 2, NXB u nf Nông nghiệp Hà Nội, trang 122 – 167 ll Phan Cự Nhân, Nguyễn Minh Công, Đặng Hữu Lanh Di truyền học, tập 1, oi m z at nh NXB Đại học Sư Phạm, trang 49 – 53 Khuất Hữu ( 2003), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen z NXBKHKT Trang137 – 140, 206 – 210 @ gm 10 Đặng Trọng Lương, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống, Trần Duy Quý Hội nghị sinh học toàn quốc, trang 1371-1376 m co l (1999), Thiết kế lại cấu trúc gen Bt để chuyển vào hai mầm, Báo cáo an Lu n va ac th si 39 Tài liệu Tiếng Anh 11 Attathom T, Chanpaisang J, and Hongrattanameteekul W Bacillus thuringiensis Isolation, Indentification, and Bioasay 1994 In Bacillus thuringiensis, Biotechology and Environmental Benefits, pp70 – 86 12 Barjac D H and Bonnefoi A (1962), Essai de classification biochimique et serologique de 24 souches de Bacillus du type B Bacillus thuringiensis Entomophaga, 7, pp – 31 13 Barjac D H (1981), Identification of H- serotypes of Bacillus thuringiensis 36 – 42 Burges H.D (edited), In microbial control of pests and plant lu an Diseasis 1970 – 1980 n va 14 Barjac D H & Frachon E (1990), Classification of Bacillus thuringiensis tn to strains, Entomophaga 35, pp 233 – 240 rice plants expressing synthetic cryIA(b) and cryIA(c) genes are highly p ie gh 16 Cheng X Y, Sardana R, Kaplan H et al (1998), Agrobacterium transformed toxic to striped stem borer and yellow stem borer Pp: 154-172 w oa nl 17 Chicott, C N., Wigley, P J 1993 Insecticidal activity of Bacillus d thuringiensis crytal protein Proceedings of the 2nd Canberra Bacillus lu va an thuringiensis meeting P 43-52 u nf 17 Dams A, L.F., T.E Visick, ADN H.R.Whiteley (1989), A20 – ll Kilodaltonprotein is required for efficient production of the Bacillus m oi thuringiensis var israelensis 27 – Kilodalton crystal protein in E coli J z at nh Bacteriol 171, pp 521 – 30 z 18 Didier, L.D Ameller, ADN M.Marguerite (1993), Lecadet Diverst ty of @ Bacillus thuringiensis toxin ADN Genes Pp 34 -45 gm l 19 Dwu, XL Cao, Y.Y Bai, ADN AI Aronson (1991), Sequensing of an an Lu FEMS microbial Lett 81 – 31 m co operon containing a novel δ-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis 20 Ereclus D, Deléclese A and Lecadet M Diversity of Bacillus thuringiensis n va ac th si 40 toxin and genes (1993), In Bacillus thuringiensis an environmental pesticide Theory and Practice Dited by P F Entwistle, J S Cory, M J Bailey and S Higgs, pp 37 – 60 21 Federici, B.A., Park, H.W & Bideshi, D.K 2010 Overview of the Basic Biology of Bacillus thuringiensis with Emphasis on Genetic Engineering of Bacterial Larvicides for Mosquito Control The Open Toxinology Journal., 3, 83-100 22 Frankenhuyzen V K The challenge of Bacillus thuringiensis In Bacillus thuringiensis an environmental pesticide: Theory and Practice Edited by lu an P F Entwistle, J S Cory, M J Bailey and S Higgs 1993, pp – 23 n va 23 http://www.thainguyen.gov.vn tn to 24 http://www.en.wikipedia.org/wiki/Lepidoptera # cite_note-cgillott-5 ie gh 25 J Li, D J Derbyshire, B Promdonkoyt and D J Ellart (2001), Structural p - endotoxin fromimplicatios for ransformation of Bacillus nl w thuringiensis.water –soluble to membrane –inserted forms, Biochemical oa Society: pp 571- 577 d 26 Http: //web.utk.edu lu va an 27 Navon, A (2000), Bacillus thuringiensis insecticides in crop protection- u nf reality and prospects, Crop Protection, 19, pp 669-676 ll 28 Lacey, L.A., Frutos, R., Kaya, H.K & Vail, P (2001), Insect pathogens as m oi biological control agents: Do they have a future? Biological Control, 21, z at nh pp: 230-248 z 29 Bauce, E., Carisey, N., Dupont, A & van Frankenhuyzen (2004), Bacillus @ l protection against spruce.pp: 621-630 gm thuringiensis subsp kurstaki aerial spray prescriptions for balsam fir stand m co 30 Crickmore (2006), Beyond the spore - past and future developments of 101, pp: 616-619 an Lu Bacillus thuringiensis as a biopesticide Journal of Applied Microbiology, n va ac th si 41 31 Hernstadt, C., Soares, G.G., Wilcox, E.R & Edwards, D.L (1986), A new strain of Bacillus thuringiensis with activity against coleopteran insects Bio/Technology, 4, pp 305-308 32 Barton, K.A., Whiteley, H.R & Yang, N.S (1987) Bacillus thuringiensis delta-endotoxin expressed in transgenic Nicotiana tabacum provides resistance to Lepidopteran insects Plant Physiology, 85, pp:1103-1109 32 Perlak, F.J., Deaton, R.W., Armstrong, T.A., Fuchs, R.L., Sims, S.R., Greenplate, J.T & Fischhoff, D.A (1990) Insect resistant cotton plants Bio-Technology, 8, 939-943 lu an 33 Fujimoto, H., Itoh, K., Yamamoto, M., Kyozuka, J & Shimamoto (1993), n va Insect resistant rice generated by introduction of a modified delta- 1155 ie gh tn to endotoxin gene of Bacillus thuringiensis Bio-Technology, 11, pp 1151- p 34 Yezza A., Tyagi R D., Valero J R and Surampalli R Y (2005) nl w Bioconversion of industrial wastewater and wastewater sludge in Bacillus d oa Thuringiensis based biopesticides in pilot fermentor, Bioresource an lu Technology 97, pp 1850-1857 va 35 Yu, H.Y., Li, Y.H & Ming Wu, K.M ( 2011), Risk Assessment and ll u nf Ecological Effects of Transgenic Bacillus thuringiensis Crops on Non- oi m Target Organisms Journal of Integrative Plant Biology, 53, pp 520–538 (2010), ISAAA Briefs z at nh 36 James, C 2010 Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops z 37 James, C (2013), Global status of commercialized biotech/GM crops: 2013 gm @ ISAAA Briefs 729 m co l 38 Capinera, J.L ( 2001), Handbook of Vegetable Pests Academic Press pp an Lu n va ac th si