2 tom tat luan an 4814

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TRUNG ƯƠNG NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP MỘT SỐ CHẤT CHUẨN ĐƯỢC CHIẾT XUẤT TỪ DƯỢC LIỆU ĐỂ GĨP PHẦN HỒN THIỆN TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG HY THIÊM VÀ VỐI VIỆT NAM Chuyên nghành : Kiểm nghiệm thuốc độc chất Mã số : 9720210 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2023 Cơng trình hồn thành tại: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phương Thiện Thương TS Nguyễn Thị Liên Phản biện 1:………………………………………… Phản biện 2:………………………………………… Phản biện 3:………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Viện họp tại: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Vào hồi:…………giờ…… ngày……… tháng ……năm Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Dược liệu đóng vai trị quan trọng việc chăm sóc sức khỏe người Tổ chức y tế giới ước tính khoảng 80% dân số giới có sử dụng dược liệu chăm sóc sức khỏe Những thập kỷ gần xu quay trở lại sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược ngày phổ biến làm tăng đáng kể nhu cầu dược liệu toàn giới Tại Việt Nam, “Chiến lược quốc gia phát triển ngành Dược Việt Nam giai đoạn đến năm 2020 tầm nhìn đến năm 2030” theo định số 68/QĐ-TTg ngày 10/01/2014 “Phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020 định hướng đến năm 2030” theo định số 1976/QĐ-TTg ngày 30/10/2013 Thủ tướng Chính phủ hướng đến tăng tỷ lệ thuốc sản xuất nước lên 80%, thuốc từ dược liệu chiếm 30%; 100% nguyên liệu sản xuất thuốc dược liệu tiêu chuẩn hóa Hy thiêm Siegesbeckia orientalis (L.) thuộc họ Cúc – Asteraceae Vối Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry thuộc họ Sim – Myrtaceae coi vị thuốc quý, nhân dân ta sử dụng lâu đời Đây vị thuốc đưa vào DĐVN V, danh mục thuốc thiết yếu Tuy nhiên chuyên luận DĐVN V cịn đơn giản, chưa có định tính, định lượng chất đánh dấu xu hướng chung Vối chưa thấy đưa vào Dược điển nước, Hy thiêm đưa vào Dược điển Hồng Kông Trung Quốc với yêu cầu định lượng chất đánh dấu kirenol HPLC Tuy nhiên số nghiên cứu Hy thiêm Việt Nam không chứa chứa kirenol, chứa lượng đáng kể darutosid diterpenoid chứng minh có tác dụng tương đương kirenol chống viêm, làm lành vết thương Một số nghiên cứu 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′,5′dimethylchalcon (CO1) thành phần flavonoid Vối, chứng minh có tác dụng chống viêm, phục hồi tế bào gan, làm giảm hấp thu glucose tế bào tế bào tạo mỡ nuôi cấy Xuất phát từ thực tế luận án “Nghiên cứu thiết lập số chất chuẩn chiết xuất từ dược liệu để góp phần hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng Hy thiêm Vối Việt Nam” thực với số mục tiêu nghiên cứu sau: - Chiết xuất, phân lập, tinh chế từ dược liệu Hy Thiêm hợp chất darutosid, từ Vối hợp chất CO1 đủ tinh khiết đủ khối lượng để thiết lập chất chuẩn gốc - Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu thiết lập chất chuẩn darutosid CO1 tinh chế - Thiết lập chất chuẩn gốc darutosid CO1 - Ứng dụng chất chuẩn thiết lập xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời darutosid kirenol dược liệu Hy thiêm; định tính, định lượng CO1 dược liệu nụ Vối, Vối Những đóng góp luận án Đã xây dựng quy trình chiết xuất, tinh chế darutosid hàm lượng 95% từ Hy thiêm quy mô >10 kg/mẻ - Đã xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập, tinh chế CO1 hàm lượng 95% từ nụ Vối quy mô >10 kg/mẻ - Đã xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu darutosid dùng cho thiết lập chất chuẩn gốc - Đã xây dựng thường quy kỹ thuật thực thiết lập 90 lọ chất chuẩn gốc darutosid hàm lượng 95,16 ± 0,05% theo nguyên trạng Theo dõi độ ổn định tháng - Đã xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu CO1 dùng cho thiết lập chất chuẩn gốc - Đã xây dựng thường quy kỹ thuật thực thiết lập 80 lọ chất chuẩn gốc CO1 hàm lượng 96,52 ± 0,05% theo nguyên trạng Theo dõi độ ổn định 30 tháng - Đã xây dựng thẩm định quy trình định tính, định lượng đồng thời kirenol darutosid Hy thiêm HPLC - Đã xây dựng thẩm định quy trình định tính, định lượng CO1 nụ Vối Vối HPLC Cấu trúc luận án Luận án gồm 131 trang, 41 hình 49 bảng Bố cục gồm phần: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan (29 trang); Đối tượng nội dung phương pháp nghiên cứu (15 trang); Kết nghiên cứu (64 trang); Bàn luận (20 trang); Kết luận kiến nghị (1 trang); Danh mục cơng trình cơng bố liên quan điến luận án (1 trang); Luận án có 103 tài liệu tham khảo 289 trang phụ lục NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƯƠNG TỔNG QUAN Đã tổng quan nội dung liên quan đến luận án gồm có: - Vai trị chất chuẩn kiểm nghiệm dược liệu sản phẩm từ dược liệu Hướng dẫn Tổ chức Y tế giới lựa chọn chất đánh dấu dược liệu - Tổng quan đối tượng nghiên cứu dược liệu Hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., có tài liệu Sigesbeckia orientalis L.) dược liệu Vối (Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry): vị trí phân loại, đặc điểm thực vật học phân bố, thành phần hóa học, tác dụng sinh học, tiêu chuẩn hóa chất lượng - Từ tổng quan trên, định hướng lựa chọn chất đánh dấu darutosid KTCL dược liệu Hy thiêm CO1 KTCL dược liệu Vối - Tổng quan chiết xuất, phân lập, tinh chế darutosid CO1 từ Hy thiêm Vối - Tổng quan chất chuẩn: khái niệm phân loại chất chuẩn hóa học gồm: chất chuẩn hóa học gốc (PCRS) chất chuẩn hóa học thứ cấp (SCRS) Khái niệm chất đánh dấu sử dụng kiểm nghiệm dược liệu, yêu cầu chất lượng, độ tinh khiết Tổng quan hướng dẫn thiết lập chất chuẩn theo ISO 17034 ISO Guide 35 - Tổng quan xác định đặc tính (characterization) chất chuẩn gốc hóa học: Theo hướng dẫn Int’P, EP, USP, WHO tiêu xác định đặc tính chất chuẩn gốc gồm liệu nhận dạng chất chuẩn gốc: cảm quan, nhiệt độ nóng chảy, phổ IR, NMR, MS, UV…; xác định độ tinh khiết chất chuẩn gốc hóa học phương pháp cân khối lượng: xác định tạp chất liên quan kỹ thuật HPLC/DAD, xác định tạp chất vô phương pháp cắn sau nung hay tro sulfat, xác định hàm lượng tạp chất bay khối lượng làm khơ phân tích nhiệt lượng TGA; xác định độ tinh khiết trực tiếp với hợp chất dạng tinh thể kỹ thuật DSC Xác định giá trị ấn định độ không đảm bảo đo theo ISO Guide 35, ISO 13528 CHƯƠNG : ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 08 mẫu dược liệu Hy thiêm, 08 mẫu dược liệu nụ Vối 08 mẫu dược liệu Vối thu hái địa phương thời điểm khác Bảng 2.1 Mẫu Dược liệu Hy thiêm dùng nghiên cứu Hy thiêm Địa điểm, thời gian thu hái HT1 Huyện Thạch Thành – Thanh Hóa, tháng 6/2019 HT2 Huyện Thạch Thành – Thanh Hóa, tháng 5/2020 (Vùng trồng Cơng ty CP Dược VTYT Thanh Hóa) Đã định danh Viện Dược liệu - Phụ lục HT3 Thành phố Thanh Hóa, tháng 4/2020 (Trung tâm nghiên cứu dược liệu Bắc Trung Bộ) HT4 Huyện Thạch Thành – Thanh Hóa, tháng 5/2021 (Vùng trồng Cơng ty CP Dược VTYT Thanh Hóa) HT5 Thành phố Thanh Hóa, tháng 5/2021 (Trung tâm nghiên cứu dược liệu Bắc Trung Bộ) HT6 Huyện Thạch Hà – Hà Tĩnh, tháng 6/2020 HT7 Thành phố Hịa Bình, tháng 6/2021 HT8 Huyện Thạch Thành – Thanh Hóa, tháng 5/2022 (Vùng trồng Công ty CP Dược VTYT Thanh Hóa) Bảng 2.2 Mẫu Dược liệu nụ Vối Vối dùng nghiên cứu Lá Vối Nụ Vối Địa điểm, thời gian thu hái LV1 NV1 Thành phố Bắc Giang, tháng 5/2021 LV2 NV2 Thành phố Hưng Yên, tháng 4/2019 LV3 NV3 Huyện Cẩm Xuyên - Hà Tĩnh, tháng 4/2021 LV4 NV4 Thành phố Yên Bái, tháng 4/2020 LV5 NV5 Thành phố Thanh Hóa, tháng 5/2019 Đã định danh Viện Dược liệu LV NV6 Huyện Đà Bắc, Hịa Bình, tháng 4/2019 LV NV Huyện Lý Nhân, Hà Nam, tháng 4/2019 LV NV Thành phố Cao Bằng, tháng 5/2020 2.2 HOÁ CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ 2.2.1 Hoá chất - Hoá chất, dung môi để chiết xuất, phân lập, tinh chế đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích Hố chất, dung mơi đạt tiêu chuẩn cho chạy HPLC NMR - Kirenol: chất chuẩn Dược điển Trung Quốc, hàm lượng: 100%, SKS: 111726-200601 - Silica gel (cỡ hạt 40-63 µm; 63-200 µm) pha thuận pha đảo RP18 - Cột sắc ký HPLC RP 18 (250 x 4,6 mm, µm) 2.2.2 Thiết bị nghiên cứu - Thiết bị nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc phân tích Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Viện Dược liệu, Viện KHCN Việt Nam Hàn Quốc, Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam 2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các nội dung nghiên cứu luận án bao gồm: - Chiết xuất, phân lập, tinh chế xác định cấu trúc chất darutosid từ Hy thiêm CO1 từ nụ Vối làm nguyên liệu thiết lập chuẩn - Xây dựng liệu phổ nhận dạng các chất darutosid CO1: nhiệt độ nóng chảy, phổ UV, IR, MS, NMR - Xây dựng phương pháp xác định tạp chất hữu cơ, vô tạp chất bay chất darutosid CO1 - Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu thiết lập chất chuẩn gốc định lượng darutosid CO1 - Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng darutosid CO1 - Xây dựng thẩm định phương pháp định tính, định lượng darutosid Hy thiêm; CO1 nụ Vối Vối - Áp dụng phương pháp xây dựng định tính, định lượng darutosid 08 mẫu Hy thiêm; CO1 08 mẫu nụ Vối, 08 mẫu Vối 2.3.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế xác định cấu trúc chất tinh khiết - Chiết xuất cách ngâm lạnh với ethanol 96% Dịch chiết cất thu hồi dung môi, phân tán lại nước lắc phân đoạn với dung môi nhexan, ethyl acetat Thu cao ethyl acetat - Phân lập chất sắc ký cột cổ điển nhồi silica gel pha thuận pha đảo RP18 gradient dung môi - Tinh chế chất tinh khiết sắc ký cột cổ điển nhồi hạt Silica gel pha đảo RP18 (với chất darutosid) sắc ký lỏng điều chế (với chất CO1) gradient dung môi - Xác định độ tinh khiết nguyên liệu thiết lập chất chuẩn HPLC/DAD sử dụng phương pháp chuẩn hố diện tích - Xác định cấu trúc phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) chiều (1HNMR, 13C-NMR, DEPT) chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ hồng ngoại (IR) 2.3.2 Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng - Xây dựng liệu nhận dạng chất tinh khiết làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn: Phổ 1H NMR, 13C NMR, HR-MS, IR, UV-VIS, nhiệt độ nóng chảy,… - Xây dựng thẩm định phương pháp xác định hàm lượng tạp chất liên quan (TCLQ) HPLC/DAD, phương pháp xác định hàm lượng tạp chất vô phép thử tro sulfat tạp chất bay TGA - Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho chất chuẩn gốc định lượng - Thiết lập chất chuẩn gốc định lượng  Đóng ống chất chuẩn, dán nhãn bảo quản ống chuẩn, nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn theo hướng dẫn ISO Guide 35  Đánh giá độ đồng q trình đóng ống  Xác định độ tinh khiết sắc kí HPLC/DAD PTN đạt tiêu chuẩn GLP ISO 17025 (Khoa Vật lý đo lường – Cơ sở Khoa Thiết lập chất chuẩn, Khoa Nghiên cứu phát triển – Cơ sở 2, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương) Mỗi PTN nhận ống chất chuẩn lấy ngẫu nhiên tiêu chuẩn sở để tiến hành phân tích TCLQ Tập hợp kết ba PTN tham gia (n = 18), đánh giá kết test ANOVA yếu tố, so sánh giá trị Ftn Ftb Khi Ftn < Ftb, kết trung bình PTN khác khơng có ý nghĩa, giá trị TCLQ lấy từ kết trung bình PTN  Độ tinh khiết sắc kí (%) = 100 (%) – hàm lượng TCLQ (%)  Xác định tạp bay TGA, tạp vô phương pháp tro sulfat  Xác định giá trị ấn định công bố phiếu kiểm nghiệm COA phương pháp cân khối lượng (mass-balance): Độ tinh khiết = Độ tinh khiết sắc kí × (100- % tạp bay - % tạp vô cơ)/100  Xác định độ không đảm bảo đo: Độ không đảm bảo đo hàm lượng TCLQ HPLC/DAD Mỗi chất chuẩn gửi đến PKN, phòng ống, tiến hành phân tích mẫu Xác định độ khơng đảm đo (loại A) PKN: 𝑢 = (N: Số lần lặp lại thí nghiệm; S: Độ lệch chuẩn) √ Độ khơng đảm bảo đo tổng hợp PKN (uTH) theo cơng thức tính độ khơng đảm bảo đo loại A hướng dẫn ISO Guide 35 𝑢 = ( ) √ = √ ∑( ) (p: số PTN; yi: kết PTN) theo luật lan truyền độ không đảm bảo đo (theo hướng dẫn NIST) 𝑢 = 𝑢 +𝑢 +⋯+𝑢 (p: số PTN; u1, u2, up: độ không đảm bảo đo PTN) Chọn uTH lớn độ không đảm bảo đo giá trị hàm lượng TCLQ độ tinh khiết sắc ký Độ không đảm bảo đo hàm lượng tạp bay TGA Mỗi chất chuẩn tiến hành phân tích mẫu ống Xác định độ không đảm đo (loại A): 𝑢 = (N: Số lần lặp lại thí nghiệm; S: Độ lệch chuẩn) √ Độ không đảm bảo đo lan truyền kết tro sulfat theo công thức: 𝑢 𝑢 ố ượ ẫ =𝑢 = 𝐻à𝑚 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑡𝑟𝑜 × ượ = ố ượ 𝑢 ố ượ 𝑢 + 𝑚 +𝑢 𝑢 ố ượ ẫ 𝑚 ẫ Do hàm lượng tro cuối trung bình kết mẫu thử nên độ không đảm bảo đo kết hàm lượng tro sulfat là: 𝑢 = × 𝑢 ượ +𝑢 ượ Độ không đảm bảo đo tổng hợp giá trị ấn định tính theo cơng thức: 𝑢 = 𝑢 ấ ê +𝑢 +𝑢 Độ không đảm bảo đo mở rộng độ tin cậy 95% công bố UCRS = x uCRS 2.3.3 Xây dựng phương pháp định tính định lượng đồng thời darutosid kirenol Hy thiêm 2.3.3.1 Khảo sát phương pháp chiết Khảo sát phù hợp phương pháp chiết theo Dược điển Trung Quốc dược liệu Hy thiêm thu hái Việt Nam Sau chiết theo Dược điển Trung Quốc, bã dược liệu chiết thêm lần nữa, cô cạn dịch chiết cách thủy, thêm ml methanol, lọc qua màng lọc 0,45 µm tiêm sắc ký HPLC Ghi lại diện tích pic quan tâm (nếu xuất hiện), từ tính hiệu suất chiết Điều chỉnh phương pháp chiết hiệu suất chiết thấp 2.3.3.2 Xây dựng thẩm định quy trình định tính, định lượng HPLC Xây dựng thẩm định quy trình định tính định lượng đồng thời thời kirenol darutosid Hy thiêm HPLC với tiêu chí độ đặc hiệu, độ thích hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ xác, độ xác trung gian, độ đúng, giới hạn pháp (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) theo hướng dẫn ICH Q2(R1)và AOAC Áp dụng phương pháp xây dựng định tính, định lượng đồng thời kirenol darutosid Hy thiêm thu hái vùng miền thời điểm khác 2.3.4 Xây dựng phương pháp định tính định lượng CO1 nụ Vối Vối 2.3.4.1 Khảo sát phương pháp chiết Khảo sát chiết dung môi methanol ethyl acetat cách lắc siêu âm đun hồi lưu cách thủy Kiểm tra đến dịch chiết không cho phản ứng tạo màu xanh đen với dung dịch sắt (III) clorid 5% Kiểm tra lại HPLC Lựa chọn dung môi phương pháp chiết nhanh, đơn giản, tiết kiệm 2.3.4.2 Xây dựng thẩm định quy trình định tính, định lượng HPLC Khảo sát phù hợp quy trình định lượng TCLQ nguyên liệu thiết lập chuẩn CO1 định tính, định lượng CO1 Vối nụ Vối lá, điều chỉnh quy trình (nếu cần) cho phù hợp với đối tượng mẫu dược liệu Thẩm định quy trình phân tích theo hướng dẫn ICH Q2(R1) AOAC Áp dụng phương pháp xây dựng định tính, định lượng CO1 Vối nụ Vối thu hái vùng miền thời điểm khác CHƯƠNG : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 3.1.1 Chiết xuất, tinh chế xác định cấu trúc darutosid Hy thiêm (đã định danh) chiết xuất dạng cao ethyl acetat tinh chế theo sơ đồ bên: Chất tinh chế tiến hành đo phổ HRESIMS, IR, 1D 2D-NMR trùng khớp với liệu phổ chất darutosid phân lập từ loài Siegesbeckia orientalis L., cho phép xác định chất tinh chế Hình 3.2 Sơ đồ tinh chế darutosid hợp chất darutosid 3.2.1.2 Tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu darutosid để thiết lập chuẩn định lượng Dựa kết thực nghiệm định tính xác định cấu trúc darutosid, kết xây dựng thẩm định phương pháp HPLC xác định TCLQ nguyên liệu darutosid, kết kiểm tra chất lượng nguyên liệu darutosid xây dựng tiêu chuẩn chất lượng ngun liệu darutosid Tính chất: Bột vơ định hình màu trắng, khó tan nước, tan methanol Định tính - Phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến (UV-VIS): Trong khoảng bước sóng từ 200 – 400 nm rõ cực đại hấp thụ, hấp thụ cao 200 nm không hấp thụ quang bước sóng lớn 240 nm - Phổ hồng ngoại (IR): Trong khoảng số sóng từ 4000 đến 400 cm-1 có đỉnh đặc trưng khoảng: 3398, 2937, 2837, 1647, 1457, 1387, 1363, 1079, 1028, 517 (± 20 cm-1) - Phổ khối (MS): Phổ HR-ESI-MS mẫu thử phải có pic ion m/z 529,30265 [C26H44O8+ HCOO]- - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) đo dung mơi CD3OD:  Có độ chuyển dịch hóa học đặc trưng δH ppm: 5,18; 4,35; 3,87; 3,73 – 3,66; 3,58; 3,48; 3,43 – 3,35; 3,33 – 3,29; 3,25; 3,18; 2,29; 2,10 – 1,94; 1,79; 1,72; 1,68 – 1,63; 1,62 – 1,53; 1,46 – 1,34; 1,22 – 1,09; 1,06; 0,98 – 0,89; 0,88; 0,85 (± 0,5 ppm)  Có độ chuyển dịch hóa học đặc trưng δC ppm: 139,9; 129,5; 101,9; 86,0; 78,3; 77,7; 77,5; 75,2; 71,9; 64,3; 63,0; 56,2; 52,1; 39,4; 39,0; 38,5; 38,1; 37,1; 33,3; 29,2; 24,4; 23,4; 23,1; 19,4; 17,3; 15,3 (± 0,5 ppm) Mất khối lượng làm khô (Tạp chất bay hơi): Không 3,0% Cắn sau nung (Tạp chất vô cơ): Không 0,2% Tạp chất liên quan: Tổng tạp không lớn 5,0% 3.2.2 Nguyên liệu CO1 để thiết lập chuẩn gốc định lượng 3.2.2.1 Xây dựng TĐPP HPLC xác định TCLQ nguyên liệu CO1 - Xây dựng phương pháp HPLC xác định độ TKSK TCLQ CO1 - Pha động: 11 Thời gian (phút) % Methanol % Nước % Acetonitril 40 50 10 40 80 10 10 60 40 50 10 - Dung dịch thử: Dung dịch mẫu thử nồng độ 0,1 mg/ ml methanol - Điều kiện sắc ký: Cột RP18 (25 cm  4,6 mm, µm); Detector quang phổ tử ngoại bước sóng 220 nm; Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút; Thể tích tiêm: 50 µl - Kiểm tra khả thích hợp hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký lặp lại lần dung dịch thử: Hệ số kéo pic (T): 0,8 ≤ T ≤ 1,5; Số đĩa lý thuyết pic khơng 20.000; Độ lệch chuẩn tương đối hàm lượng TKSK không lớn 2,0 %; Độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu pic khơng lớn 1,0 % - Thẩm định phương pháp xác định độ tinh khiết sắc kí tạp chất liên quan nguyên liệu CO1 theo hướng dẫn ICH A Mẫu trắng B Mẫu thử Hình 3.20: SKĐ xác định TCLQ nguyên liệu CO1 3.2.2.2 Tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu CO1 để thiết lập chuẩn gốc định lượng Dựa kết thực nghiệm định tính xác định cấu trúc CO1, kết xây dựng TĐPP HPLC xác định TCLQ, kết kiểm tra chất lượng nguyên liệu CO1, xây dựng TCCL nguyên liệu CO1 Tính chất: Tinh thể màu vàng, khơng tan nước, tan methanol Định tính - Điểm chảy: 125-127oC 12 - Phổ hấp thụ tử ngoại – khả kiến (UV-VIS): Trong khoảng bước sóng từ 200 – 400 nm cho cực đại hấp thụ (λmax) bước sóng 203 339 nm ± 2nm (logε ≈ 23.314,6 l mol-1 cm-1) - Phổ hồng ngoại (IR): Trong khoảng số sóng từ 4000 đến 400 cm-1 có đỉnh đặc trưng khoảng: 3328, 2941, 2360, 1628, 1544, 1357, 1167, 1113, 988, 761, 689 (± 20 cm-1) - Phổ khối (MS): Phổ ESI-MS mẫu thử phải có pic ion m/z 298,9 [M+H]+ 296,9 [M-H]- - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) đo dung môi DMSO:  Có độ chuyển dịch hóa học đặc trưng δH ppm: 13,60; 7,94; 7,77; 7,72 -7,75; 7,45 - 7,48; 3,61; 2,07; 2,02 (± 0,5 ppm)  Có độ chuyển dịch hóa học đặc trưng δC ppm: 192,4; 161,2; 161,1; 158,2; 142,3; 134,8; 130,3; 129,0; 128,3; 126,5; 110,1; 107,8; 107,1; 61,8; 8,9; 8,2 (± 0,5 ppm) Mất khối lượng làm khô (Tạp chất bay hơi): Không 0,5% Cắn sau nung (Tạp chất vô cơ): Không 0,2% Tạp chất liên quan: Tổng tạp không lớn 5,0% 3.3 THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN 3.3.1 Đóng lọ đánh giá đồng q trình đóng gói Sử dụng buồng đóng chuẩn chun dụng (Glove box Labconco) có kiểm sốt nhiệt độ, độ ẩm nạp khí nitơ buồng đóng - Đóng lọ thủy tinh màu nâu ml; Khối lượng/lọ: khoảng 10 mg - Điều kiện đóng: Độ ẩm: RH ≈ 4,0 %; Nhiệt độ: khoảng 25 oC; Nạp khí nitơ độ tinh khiết: 99,999 % - Thời gian sản xuất: 01 ngày - Số lượng ống chuẩn CO1: 80 lọ - Số lượng ống chuẩn darutosid: 90 lọ Lấy ngẫu nhiên 10 lọ tổng số lọ bán thành phẩm, phân tích phương pháp HPLC theo quy trình thẩm định, ghi lại diện tích pic Quy ước hàm lượng lọ 100 %, tính hàm lượng lọ cịn lại theo hàm lượng quy ước dựa vào diện tích pic khối lượng cân mẫu Kết độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) hàm lượng quy ước tính dựa vào khối lượng mẫu thử diện tích pic với nguyên 13 liệu CO1, nguyên liệu darutosid 0,52 % 0,52% (< 1,0 %) Các lô bán thành phẩm chất chuẩn đồng hàm lượng, quy trình đóng lọ ổn định 3.3.2 Xác định giá trị ấn định với chất chuẩn gốc định lượng - Xác định TKSK phương pháp HPLC: Kết thu từ 03 PTN cho thấy hàm lượng TKSK chất chuẩn darutosid 96,96%, với độ không đảm bảo đo u = 0,025%; Hàm lượng TKSK chất chuẩn CO1 96,67%, với độ không đảm bảo đo u = 0,025% - Xác định tạp chất bay phương pháp TGA: Hàm lượng tạp chất bay chất chuẩn darutosid 1,82%, với độ không đảm bảo đo u = 0,010%; Hàm lượng tạp chất bay chất chuẩn CO1 0,00% - Xác định tạp chất vô phương pháp tro sulfat: Hàm lượng tạp chất vô chất chuẩn darutosid 0,04%, với độ không đảm bảo đo u = 10-7(%); Hàm lượng tạp chất vô chất chuẩn CO1 0,15%, với độ không đảm bảo đo u = 10-7(%) - Từ kết xác định giá trị ấn định độ không đảm bảo đo mở rộng độ tin cậy 95% chất chuẩn Chất chuẩn darutosid Chất chuẩn CO1 NSX: 08/11/2021 NSX: 21/02/2020 Lô: E0121382.01 Lô: E0120358.01 HL: 95,16 ± 0,05% HL: 96,52 ± 0,05% theo nguyên trạng theo nguyên trạng Hình 3.24 Các chất chuẩn thiết lập 3.3.3 Theo dõi độ ổn định chất chuẩn thiết lập Theo dõi độ ổn định tiến hành theo phương pháp truyền thống Các chất chuẩn bảo quản nhiệt độ 2-8oC, định kỳ tiến hành kiểm tra xác định hàm lượng TCLQ theo quy trình phân tích HPLC 14 thẩm định Mỗi lần thực 06 mẫu thử 06 lọ chuẩn, đánh giá biến đổi hàm lượng từ đưa kết luận độ ổn định chất chuẩn thiết lập Theo ISO guide 35, chất chuẩn xem ổn định thỏa mãn công thức: | ≤𝑘 𝑢 +𝑢 − 𝑥 , k=2 độ tin cậy 95% xcrs xmon tương ứng hàm lượng TKSK thời điểm thiết lập chuẩn thời điểm kiểm tra độ ổn định; ucrs umon độ không đảm bảo đo tương ứng với giá trị xcrs xmon Kết chất chuẩn CO1 ổn định thời gian 30 tháng chất chuẩn darutosid ổn định thời gian bảo quản 09 tháng 3.4 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CHẤT ĐÁNH DẤU TRONG DƯỢC LIỆU NỤ VỐI, LÁ VỐI VÀ HY THIÊM 3.4.1 Xây dựng thẩm định quy trình định tính định lượng đồng thời kirenol darutosid Hy thiêm HPLC Đối tượng nghiên cứu: mẫu Hy thiêm định danh tên khoa học Viện Dược liệu Xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời kirenol darutosid Hy thiêm HPLC Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn ICH AOAC - Dung dịch chuẩn: Kirenol darutosid nồng độ tương ứng khoảng µg/ml 140 µg/ml methanol Lọc qua màng lọc 0,45 µm - Dung dịch thử: Cân xác khoảng g bột dược liệu Hy thiêm vào bình nón nút mài 100 ml, thêm xác 50 ml methanol, cân xác định khối lượng, đun sôi hồi lưu cách thủy 70oC giờ, lau khơ bình, để nguội nhiệt độ phòng, cân, bổ sung methanol cần, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 µm - Pha động: Thời gian (phút) Nước (% tt/tt) Acetonitril (% tt/tt) 0-40 76 24 40-70 76-50 24-50 70-80 50-76 50-24 - Điều kiện sắc ký: Cột Waters C18 (250 x 4,6 mm, µm);Detector UV: 215 nm; Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút; Thể tích tiêm mẫu: 20 µ.l - Kiểm tra khả thích hợp hệ thống sắc ký: |𝑥 15 Tiến hành sắc ký lặp lại lần với dung dịch chuẩn hỗn hợp: Hệ số đối xứng (T): 0,8 ≤ T ≤ 1,5; Số đĩa lý thuyết khơng 5000 với pic kirenol pic darutosid; Độ lệch chuẩn tương đối diện tích pic khơng lớn 2,0 %; Độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu không lớn 1,0 % A Dung dịch chuẩn B Dung dịch thử Hình 3.28 SKĐ thẩm định độ đặc hiệu dung dịch thử Hy thiêm Kết khảo sát hàm lượng kirenol darutosid Hy thiêm Áp dụng phương pháp xây dựng để định lượng 08 mẫu Hy thiêm thu hái vào thời gian địa điểm khác nhau, kết hàm lượng kirenol darutosid tính theo dược liệu khơ kiệt trình bày bảng sau: Bảng 3.35: Hàm lượng kirenol darutosid Hy thiêm Mẫu Hàm lượng kirenol mg/g) Hàm lượng darutosid (mg/g) HT1 0,429 ± 0,001 (n=3) 0,434 ± 0,001 (n=3) HT2 0,159 ± 0,002 (n=12) 2,325 ± 0,024 (n=12) HT3 < LOD (n=3) 0,479 ± 0,001 (n=3) HT4 < LOD (n=3) 2,602 ± 0,006 (n=3) HT5 0,093 ± 0,002 (n=12) 0,721 ± 0,001 (n=12) HT6 0,036 ± 0,001 (n=3) 1,075 ± 0,001 (n=3) HT7 0,058 ± 0,001 (n=3) 1,213 ± 0,021 (n=3) HT8 < LOD (n=3) 0,837 ± 0,014 (n=3) 3.4.2 Xây dựng thẩm định quy trình định tính định lượng CO1 nụ Vối Vối HPLC Đối tượng nghiên cứu: mẫu Vối (LV) nụ Vối (NV) định danh tên khoa học Viện Dược liệu Xây dựng phương pháp định tính, định lượng CO1 LV NV HPLC Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn ICH AOAC 16 - Dung dịch chuẩn: Dung dịch chuẩn CO1 nồng độ khoảng 0,01 mg/ml methanol Lọc qua màng lọc 0,45 µm - Dung dịch thử Vối: Cân xác khoảng g bột Vối nghiền mịn chiết 25 ml methanol, lắc siêu âm 50 ºC 30 phút x lần Gạn dịch chiết vào bình định mức 100 ml Lọc, hút xác 3,0 ml dịch lọc cho vào bình định mức 10 ml thêm methanol vừa đủ Lọc qua màng lọc 0,45 µm - Dung dịch thử nụ Vối: Cân xác khoảng g bột nụ Vối nghiền mịn chiết 50 ml methanol, lắc siêu âm 50 ºC 30 phút x lần Gạn dịch chiết vào bình định mức 200 ml Lọc, hút xác 5,0 ml dịch lọc cho vào bình định mức 20 ml thêm methanol vừa đủ Lọc qua màng lọc 0,45 µm - Pha động: Thời gian (phút) % Methanol % Nước % Acetonitril 40 50 10 40 80 10 10 60 40 50 10 - Điều kiện sắc ký: Cột RP18 (25 cm  4,6 mm, µm); Detector quang phổ tử ngoại bước sóng 220 nm; Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút; Thể tích tiêm: 50 µl - Kiểm tra khả thích hợp hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký lặp lại lần dung dịch chuẩn: Hệ số kéo đuôi (T): 0,8 ≤ T ≤ 1,5; Số đĩa lý thuyết pic khơng 20.000; Độ lệch chuẩn tương đối diện tích pic khơng lớn 2,0 %; Độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu không lớn 1,0 % SKĐ chuẩn CO1 SKĐ nụ Vối SKĐ Vối Hình 3.31 SKĐ dung dịch thử nụ Vối Vối Kết khảo sát hàm lượng CO1 nụ Vối Vối 17 Áp dụng phương pháp xây dựng để định lượng 08 mẫu nụ Vối 08 mẫu Vối thu hái vùng miền khác nhau, kết hàm lượng CO1 tính theo dược liệu khơ kiệt trình bày bảng sau: Bảng 3.43: Hàm lượng CO1 mẫu nụ Vối Vối Mẫu Hàm lượng CO1 (mg/g) Mẫu Hàm lượng CO1 (mg/g) NV1 6,87 ± 0,09 (n=3) LV1 3,34 ± 0,05 (n=3) NV2 10,32 ± 0,17 (n=3) LV2 3,64 ± 0,08 (n=3) NV3 7,54 ± 0,10 (n=3) LV3 1,77 ± 0,03 (n=3) NV4 9,46 ± 0,16 (n=3) LV4 5,28 ± 0,11 (n=3) NV5 8,93 ± 0,03 (n=12) LV5 3,41 ± 0,02 (n=12) NV6 7,15 ± 0,02 (n=3) LV6 3,35 ± 0,01 (n=3) NV7 8,39 ± 0,01 (n=3) LV7 3,11 ± 0,02 (n=3) NV8 7,46 ± 0,05 (n=3) LV8 2,44 ± 0,02 (n=3) Như mẫu khảo sát, hàm lượng CO1 nụ Vối dao động khoảng 6,87-10,32 mg/g; Vối dao động khoảng 1,77 – 5,28 mg/g CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 VỀ CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP, TINH CHẾ CÁC CHẤT ĐỂ LÀM NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN 4.1.1 Lựa chọn hợp chất Vối Hy thiêm cần phân lập Tổng quan tài liệu tham khảo cho thấy diterpenoid thành phần Hy thiêm, đến khoảng 30 hợp chất diterpenoid Kirenol chứng minh có tác dụng chống viêm giảm đau cục Darutosid chứng minh có tác dụng chống viêm, làm lành vết thương Năm 2020, Yu-Sang Li cộng nghiên cứu so sánh tác dụng chống viêm giảm đau darutosid kirenol chuột thực nghiệm tế bào nuôi cấy Kết darutosid kirenol chứng minh tương đương khả làm tăng ngưỡng chịu đau, giảm phản ứng viêm với mơ hình gây viêm chuột thí nghiệm, giải phẫu mô bệnh học cho thấy hợp chất ngăn cản thâm nhiễm tế bào viêm cách gắn vào cyclooxygenase-2 Theo Dược điển Trung Quốc hàm lượng kirenol Hy thiêm phải khơng 0,050% Theo Dược điển Hồng Kông, hàm lượng kirenol Hy thiêm phải khơng 0,079% Theo Dược điển Việt Nam V, Hy thiêm chưa định lượng chất đánh dấu, định lượng chất chiết 18 ethanol 96% phương pháp cân Một số nghiên cứu gần rằng, Hy thiêm trồng số vùng Việt Nam khơng chứa chứa kirenol, chứa lượng đáng kể darutosid Tổng quan tài liệu tham khảo cho thấy flavonoid thành phần nụ Vối Vối Trong đó, CO1 thành phần flavonoid Vối Hợp chất CO1 chứng minh có tác dụng chống viêm thực nghiệm; tác dụng phục hồi tế bào gan bị tổn thương chuột thực nghiệm; tác dụng làm giảm hấp thu glucose tế bào cơ, tế bào tạo mỡ, chuột béo phì thực nghiệm; tác dụng diệt ký sinh trùng mà không gây hại cho tế bào vật chủ CO1 chứng minh có tác dụng ức chế phát triển dòng tế bào ung thư gan, phổi, tiết niệu, tụy, mật Các tác dụng sinh học chứng minh thực nghiệm nêu phù hợp với cơng dụng Vối nêu DĐVN V trị ăn uống tiêu, đầy bụng, viêm dày, viêm ruột cấp, lỵ trực trùng, tiểu đường, sát trùng Lá Vối nụ Vối đưa vào DĐVN V: định tính phương pháp hóa học phương pháp sắc ký lớp mỏng (so sánh với dược liệu đối chiếu), định lượng chất chiết ethanol, chưa sử dụng chất đánh dấu để định tính định lượng; chưa thấy đưa vào Dược điển nước khác Theo hướng dẫn Tổ chức Y tế giới năm 2017 “Lựa chọn chất đánh dấu có nguồn gốc dược liệu kiểm nghiệm dược liệu thuốc có nguồn gốc từ dược liệu”, darutosid phù hợp làm chất đánh dấu định tính, định lượng Hy thiêm; CO1 phù hợp làm chất đánh dấu định tính, định lượng nụ Vối Vối 4.1.2 Về chiết xuất tinh chế chất Một khó khăn lớn việc thiết lập chất chuẩn gốc chiết xuất, tinh chế từ dược liệu khối lượng nguyên liệu tinh chế đảm bảo độ tinh khiết 95% phải có khối lượng đủ lớn để đánh giá đầy đủ loại tạp gồm xác định tạp vô cơ, tạp bay hơi, xây dựng thẩm định phương pháp xác định tạp chất liên quan Do phải đảm bảo có g chất tinh khiết đồng Vì bắt buộc phải nâng quy mơ hiệu suất chiết suất, tinh chế Dựa vào thành phần hóa học, độ tan chất cần chiết xuất, sở tổng quan tài liệu, sử dụng ethanol 96% dung mơi chiết xuất, sau lắc phân đoạn thu cao ethyl acetat 19 Với chất darutosid, từ kết khảo sát TLC, đề tài sử dụng cột silicagel pha thuận với hệ dung môi phân cực tăng dần để tách thành cao chiết ethyl acetat giàu diterpenoid thành phân đoạn Phân đoạn giàu diterpenoid tiếp tục phân lập cột silicagel pha đảo RP18 với hệ dung môi phân cực giảm dần tách phân đoạn khác từ A → F Phân đoạn C tiếp tục tinh chế qua cột silicagel pha đảo RP18 để thu chất tinh khiết darutosid đáp ứng yêu cầu nguyên liệu thiết lập chất chuẩn Với chất CO1, dựa vào nghiên cứu khảo sát nhiều hệ dung môi, luận án lựa chọn phân lập CO1 cột silicagel pha thường, sử dụng hỗn hợp dung môi phân cực n-Hexan – Ethyl acetat (8:1) để rửa giải loại chất tan dung mơi phân cực, sau sử dụng dung môi phân cực n-Hexan – Ethyl acetat (4:1) để rửa giải CO1 Hợp chất CO1 thu có hàm lượng khoản 86% tiếp tục tinh chế sắc ký lỏng điều chế cột pha đảo hệ dung môi ACN – nước (7:3), thu hợp chất CO1 hàm lượng tinh khiết sắc ký > 95% đáp ứng yêu cầu thiết lập chất chuẩn 4.1.3 Về xây dựng liệu nhận dạng Theo hướng dẫn Int’P, WHO, USP thiết lập chất chuẩn gốc, việc xây dựng liệu nhận dạng chất chuẩn gốc có vai trò quan trọng Từ kết xác định cấu trúc chất CO1 darutosid phổ 1D, 2D-NMR, HR-MS, IR, UV-VIS, …cho thấy phổ chất phân lập trùng với liệu công bố chất 4.2 VỀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN NGUYÊN LIỆU TLCC 4.2.1 Định tính, xác định cấu trúc chất chuẩn gốc Bằng cách đo phổ 1H-NMR, 13C-NMR, 2D-NMR, MS, IR nguyên liệu thiết lập chuẩn, kết hợp so sánh với liệu cơng bố, từ xác định cấu trúc phân tử, xây dựng liệu nhận dạng phổ Với chất tinh khiết dạng kết tinh (CO1), nhiệt độ nóng chảy thơng số đặc trưng, xác định phương pháp mao quản phương pháp phân tích nhiệt vi sai (DSC) theo hướng dẫn DĐVN V USP 4.2.2 Xác định độ tinh khiết chất chuẩn gốc định lượng Độ tinh khiết chất chuẩn gốc tính theo cơng thức massbalance: Độ tinh khiết(%)= 100-%tạp chất hữu -%tạp bay -%tạp vô 20  Xác định tạp chất bay Luận án sử dụng phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng (ThermoGravimetric Analysis – TGA) theo EP 10 USP 2022 phương pháp có độ lặp lại tốt, đòi hỏi khối lượng mẫu thử cần dùng nhỏ (10-20 mg) Thực nghiệm cho thấy tổng tạp chất bay chất CO1 darutosid 0,0% 1,8%, từ đưa giới hạn cho phép thử tạp chất bay không lớn 0,5% với chất chuẩn gốc CO1 3,0% với chất chuẩn gốc darutosid  Xác định tạp chất vô Theo hướng dẫn EP 10 TLCC, tạp chất vơ xác định phương pháp tro sulfat, quang phổ hấp thụ nguyên tử, quang phổ plasma, ; kết tạp chất vô thường không sử dụng xác định giá trị ấn định chất chuẩn gốc trừ hàm lượng đáng kể Phương pháp tro sulfat phương pháp đề cập phương pháp đơn giản, xác định tổng hàm lượng tạp chất vơ Các phương pháp khác địi hỏi lượng mẫu thời gian đáng kể để thẩm định phương pháp xác định hàm lượng cation kim loại mà không xác định hàm lượng anion Cl-, SO42-, CO3-2, nên không định lượng tổng tạp chất vơ Do đề tài lựa chọn phương pháp tro sulfat để xác định tạp chất vô Kết hàm lượng tạp vô nguyên liệu CO1 darutosid nhỏ 0,15% 0,04% cho thấy quy trình chiết xuất, phân lập tạo tạp vô không đáng kể, chủ yếu ion kim loại nặng có dung mơi hữu Từ đưa giới hạn tạp chất vô không lớn 0,2%  Xác định tạp chất hữu Trong phân lập, tinh chế hợp chất từ dược liệu, tạp chất hữu hay TCLQ hợp chất có tính chất, cấu trúc gần với chất khơng loại bỏ hồn tồn q trình phân lập, tinh chế chất TCLQ thường xác định phương pháp sắc ký Các chất chuẩn thiết lập dùng cho định tính định lượng HPLC, TCLQ có cấu trúc tính chất tương tự chất theo chướng dẫn EP khơng cần phải so sánh độ hấp thụ quang tương đối chất TCLQ Từ luận án chọn phương pháp xác định TCLQ phương pháp HPLC Thực nghiệm chứng tỏ TCLQ phân 21 tách khỏi chất HPLC có phổ hấp thụ UV-Vis cực đại hấp thụ tương đồng với chất Dựa vào tính chất chất nghiên cứu, luận án lựa chọn pha tĩnh cột RP18, pha động dung mơi thơng dụng chạy chương trình gradient, bước sóng thấp 210 -220 nm bước sóng đa số hợp chất hữu hấp thụ quang mạnh Kết nguyên liệu CO1 có 02 TCLQ; nguyên liệu darutosid có 08 TCLQ Từ kết xây dựng TĐPP, tham khảo hướng dẫn AOAC 2012 TĐPP cho đối tượng mẫu dược liệu yêu cầu hàm lượng tinh khiết chất chuẩn dùng cho định lượng chất đánh dấu dược liệu nên lớn 95%, luận án đưa giới hạn cho phép tổng hàm lượng TCLQ không lớn 5,0%  Xác định tạp phương pháp quét nhiệt vi sai Trong hai chất chuẩn, CO1 có cấu trúc tinh thể Luận án tiến hành phân tích, xác định độ tinh khiết chất chuẩn CO1 DSC Kết thu tương đương với xác định độ tinh khiết CO1 phương pháp trực tiếp Kết xác định tạp phương pháp gián tiếp không sử dụng để tính giá trị ấn định, nhiên có ý nghĩa khẳng định kết thử nghiệm xác định tạp phương pháp trực tiếp 4.3 VỀ THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN Nguyên liệu thiết lập chuẩn đạt yêu cầu chất lượng tiến hành đóng lọ, đánh giá đồng nhất, xác định giá trị ấn định theo thường quy kỹ thuật xây dựng dựa theo hướng dẫn WHO, EP, ISO Guide 35  Đánh giá độ đồng q trình đóng ống Được thực theo hướng dẫn ISO Guide 35 Thường quy kỹ thuật Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương  Xác định giá trị ấn định chất chuẩn gốc COA Sau đóng ống chuẩn xác định giá trị ấn định chất chuẩn gốc nhãn phương pháp cân khối lượng theo hướng dẫn IP, WHO Cần tiến hành xác định độ TKSK HPLC/DAD PKN đạt tiêu chuẩn GLP ISO, kết đánh giá test ANOVA yếu tố, cho thấy giá trị trung bình PKN khác khơng có ý nghĩa thống kê nghĩa nên độ TKSK lấy giá trị trung bình PKN 22  Đánh giá độ ổn định Chất chuẩn định kỳ kiểm tra xác định độ TKSK để theo dõi độ ổn định theo hướng dẫn ISO Guide 35 4.4 VỀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CHẤT ĐÁNH DẤU TRONG NỤ VỐI, LÁ VỐI VÀ HY THIÊM 4.4.1 Định tính, định lượng đồng thời kirenol, darutosid Hy thiêm HPLC Về phương pháp chuẩn bị mẫu: Kirenol darutosid diterpenoid có cấu trúc tương đồng Trên sở tham khảo Dược điển Trung Quốc Tiêu chuẩn Hồng Kông dược liệu, khảo sát phương pháp chuẩn bị mẫu Do chất diterpenoid khơng có thuốc thử đặc hiệu để phát đánh giá xem phương pháp chuẩn bị mẫu chiết kiệt chất quan tâm hay chưa, luận án tiến hành đánh giá khả chiết kiệt phương pháp chuẩn bị mẫu cách tiêm sắc ký HPLC Kết khảo sát cho thấy chương trình HPLC cơng bố khơng phù hợp để định tính, định lượng đồng thời kirenol darutosid dược liệu Hy thiêm Việt Nam, hàm lượng kirenol mẫu thử thấp, mẫu phức tạp có nhiều pic liền kề với pic kirenol darutosid Hơn ngồi kirenol darutosid cịn có pic khác có diện tích pic lớn, sau tách kirenol darutosid khỏi pic khác cuối chương trình sắc ký cần tăng tỷ lệ dung môi hữu pha động để rửa giải hết chất, tránh lưu giữ cột làm ảnh hưởng đến sắc ký đồ mũi tiêm Chương trình HPLC áp dụng để định lượng 08 mẫu Hy thiêm trồng Việt Nam, Kết cho thấy hàm lượng kirenol mẫu dao động khoảng < LOD - 0,43 mg/g, hàm lượng darutosid dao động khoảng 0,48 – 2,60 mg/g 4.4.2 Định tính, định lượng CO1 nụ Vối Vối HPLC Về phương pháp chuẩn bị mẫu: Luận án khảo sát phương pháp chiết với loại dung mơi thơng dụng ethyl acetat methanol có hỗ trợ nhiệt độ sóng siêu âm để tăng khả hịa tan CO1 có gốc phenolic, nên kiểm tra khả chiết kiệt thuốc thử sắt (III) clorid 5% - thuốc thử có độ nhạy cao phát phenolic, kiểm tra lại tiêm sắc ký HPLC không thấy xuất pic CO1 23 Do chương trình HPLC cơng bố, khảo sát mẫu phân đoạn CO1 (chứa khoảng 86% CO1) cho thấy không tách pic TCLQ khỏi pic CO1, pic CO1 không tinh khiết Tiến hành khảo sát phù hợp chương trình HPLC sử dụng kiểm nghiệm nguyên liệu CO1 định tính, định lượng CO1 nụ Vối Vối Phương pháp áp dụng để định lượng CO1 08 mẫu nụ Vối 08 mẫu Vối thu hái Việt Nam Kết cho thấy hàm lượng CO1 nụ Vối dao động khoảng 6,87-10,32 mg/g; Vối dao động khoảng 1,77 – 5,28 mg/g KẾT LUẬN - Chiết xuất, phân lập, tinh chế từ Hy Thiêm 2,37 g hợp chất darutosid từ nụ Vối 2,80 g hợp chất CO1 hàm lượng 95% thiết lập chất đối chiếu - Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu darutosid nguyên liệu CO1 dùng cho thiết lập chất chuẩn - Thiết lập 90 lọ chất chuẩn gốc darutosid số lô E0121382.01, hàm lượng 95,16 ± 0,05% theo nguyên trạng, theo dõi độ ổn định 09 tháng Thiết lập 80 lọ chất chuẩn gốc CO1 số lô E0120358.01, hàm lượng 96,52 ± 0,05% theo nguyên trạng, theo dõi độ ổn định 30 tháng - Xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời kirenol darutosid dược liệu Hy thiêm; xây dựng quy trình định tính, định lượng CO1 dược liệu Vối nụ, Vối KIẾN NGHỊ - Nâng cấp chuyên luận “Hy thiêm” DĐVN V: bổ sung tiêu định tính darutosid HPLC; bổ sung định lượng đồng thời kirenol darutosid HPLC - Nâng cấp chuyên luận “Vối nụ” “Vối lá” DDVN V: bổ sung tiêu định tính, định lượng CO1 HPLC - Tiếp tục theo dõi độ ổn định chất chuẩn thiết lập - Tiến hành chiết suất, tinh chế thêm lô nguyên liệu thiết lập chất chuẩn darutosid CO1 để đánh giá độ ổn định quy trình nâng cấp quy mơ 24 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Nguyễn Thị Phương Thảo, Giản Thị Lan, Lê Thị Thu, Phương Thiện Thương (2020), “Nghiên cứu chiết xuất phân lập 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3'5'-dimethylchalcon từ nụ Vối làm chất chuẩn”, Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, Số 1.2020, Tập 18 (67), 19 – 24 Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Hằng, Phương Thiện Thương (2021) “Nghiên cứu xây dựng qui trình định tính, định lượng 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3'5'dimethylchalcon nụ Vối Vối”, Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, Số 3.2021, Tập 19 (73), 24 – 31 Nguyễn Thị Phương Thảo, Vũ Hà Khuê, Lê Thị Thu, Nguyễn Đức Hùng, Phương Thiện Thương (2021) “Nghiên cứu định tính, định lượng đồng thời kirenol darutosid Hy thiêm phương pháp HPLCPDA”, Tạp chí Y Dược học, Số 38 - tháng 12/2021, 69 – 75 Nguyen Thi Phuong Thao, Le Quang Thao, Nguyen Duc Hung, Vu Van Tuan, Phuong Thien Thuong (2022) “Isolation and purification Siegesbeckia orientalis for of darutoside from establishing reference substance” - Journal of Medicinal Materials, Vol 27, No 4, 203 – 208