Nghiên cứu đặc điểm thực vật học loài sâm cau (curculigo orchioides gaertn ) tại thanh hóa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO UBND TỈNH THANH HÓA TRƯỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC NGUYẾN HOÀNG YẾN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC LOÀI SÂM CAU (CURCULIGO ORCHIOIDES GAERTN.) TẠI THANH HÓA LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THANH HÓA, NĂM 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO UBND TỈNH THANH HÓA TRƯỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC NGUYỄN HOÀNG YẾN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC LỒI SÂM CAU (CURCULIGO ORCHIOIDES GAERTN.) TẠI THANH HĨA LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Thực vật học Mã số: 60 42 01 11 Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Đình Chắc THANH HĨA, NĂM 2017 Danh sách Hội đồng chấm luận văn Thạc sĩ khoa học theo Quyết định số1307 ngày 15 tháng năm 2017 Hiệu trưởng Trường Đại học Hồng Đức: Học hàm, học vị, Họ tên Cơ quan Công tác Chức danh Hội đồng GS.TS Chu Hoàng Mậu ĐHSP Thái Nguyên Chủ tịch TS Nguyễn Văn Dư Viện ST TNSV Phản biện TS Sỹ Danh Thường ĐHSP Thái Nguyên Phản biện TS Nguyễn Thùy Liên ĐHKH Tự nhiên HN Ủy viên PGS TS Nguyễn Bá Thông ĐH Hồng Đức Thư ký Xác nhận Người hướng dẫn TS Lê Đình Chắc Học viên chỉnh sửa theo ý kiến Hội đồng i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu số kết đồng tác giả với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, đặc biệt trình tự gen rpoB2 gen rpoC1 lồi sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) Thanh Hóa kết công bố Việt Nam, phần công bố tạp chí Khoa học Tự nhiên trường Đại học Hồng Đức, Thanh Hóa với đồng ý cho phép đồng tác giả có 02 trình tự gen công bố ngân hàng gen quốc tế Phần cịn lại chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Thanh Hóa, ngày tháng năm 2017 Tác giả HV Nguyễn Hoàng Yến ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc chân thành tới TS Lê Đình Chắc - Trưởng Bộ môn Thực vật học, người thầy tận tình dạy bảo, hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi nhất, giúp đỡ chia sẻ khó khăn với suốt thời gian thực hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô Bộ môn Thực vật học, Ban chủ nhiệm Khoa KHTN Trường Đại học Hồng Đức Thanh Hóa Tơi xin cảm ơn giúp đỡ Phịng Quản lý Sau đại học Ban lãnh đạo Trường Đại học Hồng Đức, Thanh Hóa tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập làm nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn quan tâm giúp đỡ quý báu tất anh, chị em bạn lớp K8 cao học Thực vật học Cuối cùng, tơi muốn tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến tất người thân gia đình sát cánh bên tôi, quan tâm, động viên tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn này! Thanh Hóa, ngày tháng năm 2017 HV Nguyễn Hồng Yến iii MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây sâm cau 1.1.1 Đặc điểm phân loại hình thái lồi sâm cau 1.1.2 Thành phần hóa học bản, giá trị dược học sâm cau 1.1.3 Tình hình nghiên cứu đặc điểm giải phẫu đặc điểm gen rpoC1 rpoB2 sâm cau 1.2 Mã vạch dna (DNA Barcode) 1.2.1 Giới thiệu DNA barcode 1.2.2 Các đặc điểm trình tự barcode 1.2.3 Một số trình tự sử dụng DNA barcode thực vật 11 1.3 Ứng dụng mã vạch dna nhận biết dược liệu 17 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị 21 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 21 2.1.2 Hóa chất, thiết bị máy móc 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Phương pháp thu mẫu 21 2.2.2 Phương pháp lập tiêu giải phẫu lá, thân, rễ 22 2.2.3 Các phương pháp sinh học phân tử 22 2.2.4 Phương pháp xác định trình tự nucleotide đoạn gen rpoCl, rpoB2 26 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết phân tích đặc điểm hình thái, giải phẫu sâm cau 27 iv 3.1.1 Đặc điểm hình thái thân, lá, rễ, hoa, sâm cau 27 3.1.2 Đặc điểm giải phẫu, rễ, thân sâm cau 28 3.2 Kết phân tích đoạn gen rpoc1 rpob2 sâm cau 31 3.2.1 Kết tách chiết DNA tổng số từ sâm cau 31 3.2.2 Kết nhân bản, xác định phân tích trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 31 3.2.3 Kết nhân bản, xác định phân tích trình tự nucleotide đoạn gen rpoB2 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 Kết luận 47 Đề nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC P1 PHỤ LỤC P2 PHỤ LỤC P3 PHỤ LỤC P4 PHỤ LỤC P5 PHỤ LỤC P6 PHỤ LỤC P7 PHỤ LỤC P8 v DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1: Trình tự nucleotide hai cặp mồi PCR khuếch đại đoạn gen rpoC1 ropB2 24 Bảng 2: Thành phần phản ứng PCR 24 Bảng 1: Nồng độ độ tinh mẫu 31 Bảng 2: Sự sai khác trình tự gen rpoC1 thu trình gen rpoC1 công bố ngân hàng gen quốc tế mã số JF972180 36 Bảng 3: So sánh với loài Hypoxis aurea thuộc họ Hypoxidaceae 36 Bảng 4: Sự sai khác trình tự gen rpoB2 thu trình gen rpoB2 cơng bố ngân hàng gen quốc tế mang mã số HQ182868 43 Bảng 5: So sánh với loài Molineria capitulata thuộc họ Hypoxidaceae 44 vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1: Cây sâm cau A: Hình thái sâm cau; B: Gốc thân (1) rễ (2); C: Lá sâm cau 27 Hình 2: Hình thái hoa, quả, hạt sâm cau 28 Hình 3: Ảnh hiển vi cấu tạo giải phẫu rễ sâm cau 29 Hình 4: Cấu tạo giải phẫu thân sâm cau 29 Hình 5: Ảnh hiển vi cấu tạo giải phẫu sâm cau 30 Hình 6: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen rpoC1 từ hai mẫu sâm cau với cặp mồi rpoC1-F/rpoC1-R 32 Hình 7: Trình tự rpoC1 sâm cau thu Bến En Xuân Liên 33 Hình 8: Kết so sánh trình tự gen rpoC1 thu với trình tự rpoC1 cơng bố ngân hàng gen quốc tế, mã số JF972810 35 Hình 9: Sơ đồ dựa trình tự nucleotide gen rpoC1 mẫu thu với trình tự gen rpoC1 Hypoxis aurea thuộc họ Hypoxidaceae mã số JF972180 37 Hình 10: Kết Blast trình tự gen rpoC1 thu trình tự gen rpoC1 ngân hàng Genbank mã số JF972810 38 Hình 11: Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen rpoB2 từ hai mẫu sâm cau với cặp mồi rpoB2-F/rpoB2-R 39 Hình 12: Kết đọc trình tự gen rpoB2 mẫu thu Bến En Xuân Liên 40 Hình 13: Kết so sánh trình tự gen rpoB2 thu với trình tự rpoB2 lồi Molineria capitulata cơng bố ngân hàng gen quốc tế, mã số HQ182868 43 Hình 14: Sơ đồ dựa trình tự nucleotide gen rpoB2 mẫu thu với trình tự gen rpoB2 Molineria capitulata thuộc họ Hypoxidaceae 44 Hình 15: Kết Blast trình tự gen rpoB2 thu trình tự gen rpoB2 ngân hàng Genbank mã số HQ182868 45 vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BioEdit DNAstar: Phần mềm Tin sinh học phân tích liệu DNA Blast : Basic Local Alignment Search Tool BE : Bến En CTAB : Cetyl trimethyllammonium Bromide rpoB : RNA polymerase B gen rpoC1 : RNA polymerase C gen PCR : Polymerase chain reaction XL : Xuân Liên 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Về đặc điểm hình thái, giải phẫu giá trị của sâm cau i) Cây sâm cau thu Bến En Xuân Liên (Thanh Hóa) thuộc chi Curculigo, họ Hypoxidaceae dạng thân thảo có rễ chùm, màu nâu sẫm, khả xuyên sâu không cao, thân rễ màu nâu sẫm đậm, chứa nhiều dinh dưỡng Lá sâm cau có bẹ tương đối dài, phiến có màu xanh tương đối đậm, thn dài, rộng từ 3,0 đến 4,5 cm, dài khoảng 30-45 cm, gân song song chạy dọc theo phiến Hoa màu vàng, thường cánh, cuống hoa dài, mọc từ nách lá, sâm cau hoa gần quanh năm, từ tháng đến tháng 10 năm ii) Hai mẫu sâm cau thu Bến En Xuân Liên (Thanh Hóa) giống cấu tạo hiển vi thân, rễ, có cấu trúc điển hình mầm iii) Sâm cau loài dược liệu quý, sử dụng chữa số bệnh liệt dương, phong thấp, thần kinh suy nhược, sốt xuất huyết, huyết áp cao sử dụng nâng cao sức khỏe 1.2 Về đặc điểm phân loại học phân tử i) Hai đoạn gen lục lạp phân lập từ hai mẫu sâm cau thu Bến En Xuân Liên (Thanh Hóa) Đoạn gen rpoC1 có kích thước 574 nucleotide đoạn gen rpoB2 có kích thước 523 nucleotide ii) Dựa trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 rpoB2, hai mẫu sâm cau thu Bến En Xn Liên (Thanh Hóa) thuộc lồi Curculigo orchioides 48 1.3 Về đặc điểm hình thái, giải phẫu trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 rpoB2 Các đặc điểm hình thái, giải phẫu trình tự nucleotide đoạn gen rpoC1 rpoB2 phân lập từ hệ gen lục lạp sâm cau thu Bến En Xuân Liên (Thanh Hóa) liệu sở cho nhận diện sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn ) Việt Nam Đề nghị Cần tiếp tục nghiên cứu đặc điểm sinh học khác phân tích thêm trình tự gen phân loại khác phục vụ thiết lập mã vạch DNA cho sâm cau Việt Nam nói chung Thanh Hóa nói riêng 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, NXB Y học HN, tr 198 – 199,342-343,371-403 Võ Văn Chi (2003), Từ điển thực vật thông dụng, tập 1, NXB Khoa học & Kỹthuật, tr 137-144, 827-829 Vũ Văn Chuyên (1976), Tóm tắt đặc điểm họ thuốc, NXB Y học, tr.10-11 Danh lục loài thực vật Việt Nam, tập II, Viện sinh thái tài nguyên sinh vật, Trung tâm nghiên cứu tài nguyên môi trường, NXB Nông nghiệp Lê Trần Đức (1997), Cây thuốc Việt Nam: trồng hái, chế biến, trị bệnh ban đầu, NXB Nơng nghiệp, tr 1070-1071 Phạm Hồng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, III, tr.502-503 Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập II, NXB Khoa học & Kỹ thuật, tr 693-696 Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng NxB Đại học Thái Nguyên 10 Viện dược liệu (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập 1, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 11 Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Hà Nội 12 Nguyễn Tập (2007), Cẩm nang thuốc cần bảo vệ Việt Nam, Nxb Mạng lưới lâm sản gỗ Việt Nam, Hà Nội 50 Tiếng Anh 13 Agrawal V S.(1997), Drugs Plants of India, Kalyani Publisher, New Delhi 306 14 Aron J F., Kevin S B., Prasad R K., Sean W G., Steven G N., Brian C H., Diana M P., Mehrdad Hajibabaei, Spencer C H B (2008), “Multiple multilocus DNA barcodes from the plastid genome discriminate plant species equally well” PLoS ONE, 3(7), pp 2802 15 Borsch T., Hilu K.W., Quandt D., Wilde V., Neinhuis C., Barthlott W (2003), “Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms”, J Evol Biol, (6), pp 558-576 16 Cao DP, Zheng YN, Qin LP, Han T, Zhang H, Rahman K, Zhang QY Maturitas (2008) “Curculigo orchioides, a traditional Chinese medicinal plant, prevents bone loss in ovariectomized rats” Apr 20;59(4):373-80 17 Chase M W., Nicolas S., Mike W., James M D., Rao P K., Nadia H., and Vincent S (2005), “Land plants and DNA barcodes: short-term and long-term goals”, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 360 (1462), pp 1889-1895 18 Chauhan NS, Sharma V, Thakur M, Dixit VK (2010) “Curculigo orchioides: the black gold with numerous health benefrpoB2.” Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao 2010 Jul;8(7):613-23 19 German Serino and Pal Maliga (1998), “RNA Polymerase SubunrpoB2 Encoded by the Plastid rpo Genes Are Not Shared with the NucleusEncoded Plastid Enzyme” PlantPhysiol Aug, 117(4): 1165-1170 20 He Y, Dong X, Jia X, Li M, Yuan T, Xu H, Qin L, Han T, Zhang Q (2014) “Qualitative and quantitative analysis on chemical constituents from Curculigo orchioides using ultra high performance liquid 51 chromatography coupled with electrospray ionization quadrupole time-offlight tandem mass spectrometry” J Pharm Biomed Anal Jan;102:236-45 21 Hollingsworth Pm, G.S., Little Dp (2011), “Choosing and using a Plant DNA Barcode”, PLoS ONE, (5) 22 Jiao L, Cao DP, Qin LP, Han T, Zhang QY, Zhu Z, Yan F (2009) “Antiosteoporotic activity of phenolic compounds from Curculigo orchioides.” Phytomedicine Sep;16(9):874-81 23 Nie Y., Dong X et al (2013), “Medicinal plants of genus Curculigo: Traditional uses and a phytochemical and ethnopharmacological review”, JournalofEthnopharmacology 147(3), 547 – 563 24 Kim S, Kim J, Liu J (2009) Genetic discrimination of Catharanthus roseus cultivars by pyrolysis mass spectrometry J Plant Biol 52: 462 465 doi:10.1007/s12374-009-9059-1 25 Kool A, de Boer HJ, Kruger Ả, Rydberg A, Abbad A, Bjõrk L, et al (2012) Molecular Identification of Commercialized Medicinal Plants in Southern Morocco PLoS ONE 7(6): e39459 doi: 10.1371/journal.pone.0039459 26 Kress JW, Wurdack KJ, Zimmer EA, Wei LA, Janzen DH (2005) Use of DNA barcodes ti identify flowering plants Proc.Natl.Acad.Sci USA 102: 8369-8374 27 Kress W J., Erickson D L (2008), “DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics”, Proc Natl Acad Sci U S A, 105(8), pp 2761-2762 28 Ole S and Gitte P (2009), “How many loci does it take to DNA barcode a crocus?”, PLoS ONE, 4(2), pp 4598 29 Sandelius, Anna Stina (2009) The Chloroplast Interactions with the Environment Springer p 18 ISBN 978-3-540-68696-5 30 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., 52 Duistermaat C H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources (9), pp.1086-1091 31 Shaw J., Lickey E.B., Schilling E E., Small R.L (2007),” Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms”, The tortoise and the hare III Amer J Bot, (94), pp 275-288 32 Paul D N Hebert*, Alina Cywinska, Shelley L Ball and Jeremy R deWaard (2003) Biological identifications through DNA barcodes Proc R Soc Lond B (2003) 270, 313-321 313 Ó 2003 The Royal Society DOI 10.1098/rspb.2002.2218 33 Zhang JG, Liu Q, Liu ZL, Li L, Yi LT (2015), “Antihyperglycemic activity of Anoectochilus roxburghii polysaccharose in diabetic mice induced by high-fat diet and streptozotocin” J Ethnopharmacol 22;164 pp,180-185 34 Taberlet P., Eric C., Franỗois P., Ludovic G., Christian M., Alice V., Thierry V., Gérard C., Christian B., and Eske W (2007),” Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding”, Nucleic Acids Res, 35(3), pp14 35 Tang SY, Whiteman M, Peng ZF, Jenner A, Yong EL, Halliwell B , (2004) “Characterization of antioxidant and antiglycation properties and isolation of active ingredients from traditional chinese medicines” Radic Biol Med 2004 Jun 15;36(12):1575-87 36 Van den Berg C., Higgins W E., Dressler R L., Whitten W M., Soto Arenas M A., Culham A., Chase M W (2000), “A phylogenetic analysis of Laeliinae 53 (Orchidaceae) based on sequence data from nuclear internal transcribed spacers (RPOB2) of ribosomal DNA”, Lindleyana (15), pp.96114 37 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009), “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives”, Molecular Ecology Resources (9), pp.1086-1091 38 Vijayan K and Tsou C H (2010), “DNA barcoding in plants: taxonomy in a new perspective”, Current science, vol 99, pp 1530 - 1540 39 Wu F., Mueller L A., Crouzillat D., Petiard V., Tanksley S D (2006), “Combining bioinformatics and phylogenetics to identify large sets of single-copy orthologous genes (COSII) for comparative, evolutionary and systematic studies: A test case in the euasterid plant clade”, Genetics (174), pp 1407-1420 40 Wouter G van Doorn (2009), Role of chloroplasts and other plastids in ageing and death of plants and animals: a tale of Vishnu and Shiva Ageing research reviews, (2) :117-30 DOI: 10.1016/j.arr.2009.08.003 41 Yao H., Song J., Liu C., Luo K., Han J (2010), “Use of RPOB22 region as theuniversal DNA barcode for plants and animals”, PLoS ONE (5), pp.13102 42 Yong H L., Jinlan R., Shilin C., Jingyuan S., Kun L., Dong L and Hui Y (18 December, 2010) “Authentication of Taxillus chinensis using DNA barcoding technique”, Journal of Medicinal Plants Research Vol 4(24), pp 2706-2709 Tài liệu Internet 43 http://www.barcoding.si.eu) 44 http://www.kew.org/barcoding/protocols.html 45 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KC561139 P1 PHỤ LỤC Kết Blast gen rpoC1 mẫu sâm cau thu Thanh Hóa P2 PHỤ LỤC Kết Blast gen rpoB2 mẫu sâm cau thu Thanh Hóa P3 PHỤ LỤC Ảnh chụp sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu Bến En, Thanh Hóa P4 PHỤ LỤC Ảnh chụp sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn ) thu Xuân Liên, Thanh Hóa P5 PHỤ LỤC Trình tự gen rpoC1 lồi sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) Bến En, Thanh Hóa cơng bố ngân hàng gen quốc tế P6 PHỤ LỤC Trình tự gen rpoB2 loài sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) Xn Liên, Thanh Hóa cơng bố ngân hàng genbank P7 PHỤ LỤC Trình tự gen rpoC1 lồi sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) Xuân Liên, Thanh Hóa công bố ngân hàng genbank P8 PHỤ LỤC Trình tự gen rpoC1 lồi sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) Bên En, Thanh Hóa cơng bố ngân hàng gen quốc tế