Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của cecropin tái tổ hợp

OẠỈ HỌC Ọ l ()( (;IA HÀ NỘI TRƯỜNC; ĐẠI HỌC K IIO A HỌC TỤ NHĨÊN • • • • ■k-k-k-kỳck-kỳĩỳĩ NGHIÊN c u HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CECRỊPIN TÁI T ỏ HỢP M Ã SĨ: KLEPT.09.04 C H Ủ TRÌ ĐÊ TÀI: C Á N B ộ TH A M GIA: PG S;i'S Võ Thị T h n g Lan rhS Tạ Bích T h u ậ n l'hs Phạm A nh T h ù y D n g TS N g u yền Q u ỳ n h U yển H À N Ọ I - 20I IMụ c LC ã ô rrane V)U ChoTig 1; TNG QUAN TI LIỆU 1.1 Heplide kháng khuân (AMPs) I Ị Ị Giới thiệu chuiĩỊỊ vê ASíPs Ị 1.2 Sự LÍlạnịỉ cua AMP.S 1 ỉ.3 Tìèin nủii}i ihiíi dụng cua AM l's 1.2 Peplide kháng khuẩn tích diện dương (CAMI\s) cecropin 1.2.1 Cìiới thiệu chiiusị vê CAMPs 1.2.2 Peptide khúììịị khuân cecropin 1.3 c ác phương pháp thu nhận cecropin ỉ San xiiât cecropin theo dirờniỉ lái tò hợp 1.3.2 Lựa chọn hệ llìơnỊi vector hiẽii ỉ 3.3 Tơi ini hóa điêu kiện biêu 1.3.4 Tinh cecropin tài tơ hợp Chương 2: NGUN LIỆU VÀ PHƯƠN í ; pháp 2.1.Nguyên liệu 13 13 ì Mcĩu vậí 13 2.1.2 ( 'ác hộ vector 13 2.1.3 c 'ác chùni^ vi khuân 14 2.1.4 Cúc cặp mòi 14 1.5 Cỉel săc ký’ái lực (ìỉutatìiione Scpỉicirose 4B Ni-NTA agaro.se 15 2.1.6 Các hỏa chài thiết hị 15 2.2 l‘hiK')Tm pháp 2.2 ì TỏiìịỊ hợp cDSA íừ nlìộníỉ miíịi niõi in Iroiiy E.coH 19 -I T Tách chici pliisniicl hãniữa tế lình 3.27 Sự thay đơi mã di tru>ền »iữa tá bào nliân chiiàn tế bào nhâ Hình 3.28 Kết q dị tìm ba luicleotiíiình 3.28 Kết qua dị tìm ba nucleotide Irình tự gen ce Hình 3.29 Kết điệndi phân đoạn lình 3.29 Kết điện di phàn đoạn tinh protein dung hợp Hình 3.30 Kết quà điện di phân đoạníình 3.30 Kết điện di phân đoạn tinh protein dung hợp Hình 3.31 Kết q điện di phân đoạníình 3.31 Kết q điện di phân đoạn tinh protein dung hcrp Hình 3.32 Kết quà cầprotdn dung htrpGSHình 3.32 Kết cẩ protein dung lụp GS r-C'ecR)piiiQ vtVi protease ITirom lỉìiih 3.33 Kết diện di xứ Iv GSI -cediiih 3.33 Kel quà diện di xử lý GS l -cecH (jST-cecN với throm Hìiih 3.34 Kết quà điện di kicm tra klià ilình 3.34 Kết C|uà diện di kiổm tra năntí trờ trạng thái cặn cì Hình 3.35- Két q điệndi sàn phẩm GSTÍìiih 3.35.Kết q điệndi sản phầm (ìST-cecQ qua cột AmiconlOK Hình 3.36 Kết quà điệndi sàn phẩm GSllình 3.36.Kct quà điệndi sàn phẩm CìST-cecQ qua cột Amicon3K Hình 3.37 Kết thừ hoạt tính cecropiníìiih 3.37 Kết quà thừ hoạt tính cccropin n B suhtiìis Hình 3.38 Kết thừ hoạt tính cecropinlình 3.38 Két thừ hoạt tính cecropin ọ Hình 3.39 Kết thử hoạt tính cecMìiih 3.39 Kốl quà thử hoạt tính cecropin Q đổi với A D N DANH MỤC ( Ả( BAN í ; Trang BánịỊ 1.1: Cík loại AMỈ^S tư(Tn« tự AMI^S dược san xuất thương mại BảnịỊ 1.2: Một số sàn phàm từ CAMPs dược còng ty sán xuất phát trién phục vụ điêu trị bệnh BảnịỊ 1.3: Dặc diêm cùa hệ ihốnu vcctor biêu 11 Bảnịỉ 2.1: riiỏng tin vê mòi dùng trotm imhiòn cứu 14 Bảng 2.2: I hàiih phan diều kiên phàn ứiiu kliuêch đai cDNA cecropitì //, cecropin N cecropin ọ Bảng 2.3: Thành phần cùa phàn ứng \ư lÝ với enzynie tĩiới hạn 22 Bảng 3.1: Điều kiện tối ưu biểu GST-cecropin 38 Bảng 3.2: Điều kiện tối ưu biểu Trx-cecropin chùng E coli BL21 (DE3) 41 Bảng 3.3: Nồng độ GST-cecQ xác định phương pháp Bradtbrd 46 Bảng 3.4: Nồng độ protein cùa Trx-cecH Tr\-cecN 48 viii BÁO CẢO TỎM TẢT Tên đề tài: Nghiên cứu hoạt tính kliáim khuân cua cecropin tái tồ hợp Mã số: Kỉ.i;p i 09.04 C qu an chủ quản: Đại học ()uốc ( iia I Nội C qu an chủ trì: Trưừne Đại học Khoa liọc l ự nhiên Phịng rhí nehiệm trọng đièm Cơiiị', imhệ lín/.yni Protein Chii trì đề tài; PGS I s V5 Thị 1hưiriiíi l.an Các cán tham gia: I hS l Bích rhuận I hS Phạm Anh Hiùy Dưcrrìii ĨS Nguyễn Quỳnh lJ\ ên Thòi gian thực hiện: 36 tháng (từ 5-2009 đến 5-2012) Kinh phí: 450,000.000 đồng (Bổn trăm năm mươi triệu đồng) Mục tiêu nội dung nghiên cứu: Mục tiêu: Xây dựng qui trình thiơt kê biêu gen inã cho peptide kháng khn có nauồn gốc từ trùng; đánh aiá hoạt tính kháng khuấn cùa peptide tái tồhợp, peptide cải biến Nội íỉung: Phàn lập gen mã cho cccropin từ ruồi Drosophila melano^asíer nhộng Bomhyx mori rách dòng cecropiii cải biến từ muồi Culex qumque/asciatns rhièt kê vector pH r biêu loại cecropin vi khuân, rhiết kế vector pGEX biếu loại cecropin cải biến vi khuẩn, l ối ưu điều kiện nuôi cấy vi khuẩn dê thu nhận protein tái tổ hợp, Xác định độ bền loại cecropin với đièu kiện xử lý biến tính, Xác định hoạt tính cua cecropin tái tị hợp cecropin cài biến, Dánh aiá tác dụiiíi cua cccropin đèn tính iicuvC mi vẹn cùa ADN Các kết đạt đưọc: t Kêt qua khoa học: Tách dịntỉ thành cơnti uen mã chi) cccropin phàn lập từ ri uiấm (Drosophiỉa inclanỊcistei ) nhộim lãin {Bomhvx mon) \à inuoi {Culex quiníỊueịasciatus) IX ( Ả( K ÉT QUẢ CỦA ĐÈ TÀ Ĩ ĐẢNG KÝ VÀ ĐÃ T liỤ C HIỆN Đ U Ợ t I'ên sản phẩm cụ thê Dự kiến số lượng/ quy mô sản phẩm đăng ký Dự kiến số lượng/ quy mô sán phẩm đạt Cccropin tái tồ hợp 01 vector biểu mang gen cecropin tái tổ hợp 09 vector biều mang gen cecropin tái tổ hợp cecN, cecH, cecT Vưọt Cecropin cải biến 01 vector biểu mang gen cecropin cải biến 01 vector biểu mang gen cecropin tái tổ liợp cecQ Đạt Qui trình tổng hợp gen mã cho cecropin 1 Đạt Qui trinh tổng hợp gen mã cho cecropin cải biến 1 Đạt Bài báo tạp chí quốc tế Chưa đạt Bài báo tạp chí nước Vượt Báo cáo hội nghị toàn quốc Chưa đạt Dào tạo cừ nhân -6 íOạl lOào tạo thạc sĩ Chưa đạt 11 I loàii thànli/Vưựt — ■ -^ ị 58 m : C V Ơ N G I n d ề tài í)f I ẢI KHOA HỌC c ò m ; n(;mỉ;: \ ( m F N ( I ( M O Ạ I r Í M l K I I Ả N ( ; K I I U Ả N C Ử A ( I X R O I M N r ẢI í õ Í I Ợ l ’ ỉ ỡ n liêng Anh- Sliidy or> ;tn|iiiiirrohiiil :u ti\ i(ies ()f rcco n ib in a n t cecro p in es Thòi gian thục hiện: 36 tliáiiu B t d ầ u l iỉuiiiL’ ' 0 d ế i i i h n n / 2 Đe tài thuộc lĩnh \ irc U'U tiên: Công nuhệ Siiih học Đé tài có trìuiịỊ \ứi mộl đé íài tiến hành không ? 1'hiet k ế v e c t o r m a n ií u e n m ã c h o c e c r o p i n đ ể p h ụ c v ụ n g h i ê n c í a i c h u y ể n g e n v o c c tế b o gốc phôi cá dược đề tài KC04/06-10 thực Tuy nhiên, việc thiết kê vector biêu cecropin tế bào vi khuẩn {E.coỉi B.suhtilis), nghiên cứii tính kháng khuân cùa cecropin tái tồ hợp (recombinant peptide), cecropin cải biến ứng dụng c e c r o p i n n y t r o n g s in h - y - d ự c c h a đ ợ c đ ê c ậ p đ ê i i t r o n g c c đ ê lài d c o , Vi v ậ y dẽ cương đăng ký cùa chúng tơi hồn lồn mới, khơng trùng với đê tài tiến hành Chu trì đề tài {kèm íheo lý lịch khoa học íheo hiếu mẫu 02/KHCN/ĐHQGHN) - Họ lên: v õ THỊ 1HI rơNG LAN Nữ - Năm sinh: 1961 - Chuyên môn đào tạo: Sinh học phân tử - Học hàm, học vị: Tiến sĩ - Chức vụ: Trưởng phịng 'ỉ'hí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường phịng Genomic, Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ ProteinEnzyme, Dại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quoc Gia Hà Nội - Đ(m vị công tác: Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia 1là Nội - Dịa chi liên hệ: Phịng thí nghiệm Sinh Y, T1-P126, Khoa Sinh học 334, Nguyễn I rãi, 'ĩhanh Xuân, Hà Nội - Điện thoại: 22134496/0988551068 lí-mail; Noĩhnhuonulan c/.hus.cdu.vn; thuonẹlan 1961 '^ế/)vahoo.coni lYiin (a t lioạl (lơn^ IiL‘n C lu i Iri d ỏ lài ( /|'//I ’ã j ) ( ị i i a i ì l ý IÌ(I'I iO iỉịị ho Dtì- lai K C '( ) -U ) nliáiih ( d a n g th ự c ỊỊÌện) 20 O62008 Cliủ í ri Ngliicn cứu iliiêí kế tliang chuẩp ADN chất lưựnu cact Đẽ lài đặc biệt Í)ÍIQCÌ QG 07-1 20062 ÕO8 rhử nghiêm bất hoạt gen theo chế ARNi phục vụ chuyển gen tạo giống trơng có lính chổng chịu vi sinh vật gây bệnh Chù Iri 2002- Áp dụng kỹ thuật di truyền phân từ phát số đột biến liên quan đến bệnh di truyên người Chủ trì Đề tài đặc biệt ĐHQG, QG 03-13 Phát đột biến gen CYP21 liên quan i đến bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh ' Chủ trì Đề tài NCCB Bước đầu nghiên cínj tính đa dạng di truyên ! số lồi rong câu Gracilaria Chủ trì Đề tài KHTN, Áp dụng phưcmg pháp tách chiết ADN từ ; mẫu sinh phẩm khác dùng cho kỹ thuật PCR Ị Chù trì 2004 20012Ơ02 2000 1999 [9981999 607 406 'ĨN 2000-14 Phân tích tính đadạngdi truyền số1 Chủ tri đề lài loài rong biển ViệtNam bang chi thị ■ nhánh phân tử ADN 2003 Nghiên círu cơng nghệ sản xuất protein tái tổ hợp, protein bất hoạt ribosome có giá trị sử dụng dược nông nghiệp Dề tài KHTN, TN 99-18 ị 20 01 - Đề tài NCCB Tham gia Chương trìiili Biên Đơng Hải đáo ViệnCNSH chù quản KC 04-14 \ lọ ( sò COIIU I r i i i ỉ i (!;ì fơiiỊ4 hố liê n C|u;in (ỉan (2()()8) l iv a l u a tio n o f a n ti - in f la m a t io n a n d a n t i- o x id a t io n o f th c e x tr a c t from Ganocìernia lncidum (Leyss cx fr.).kart VNU Journal of Science, 24: 389-393 Phạm Anh 'Hiùy Dương, Tạ Bích Thuận, Võ Thị Thương Lan (2007) Effect ơt Gunoderma lucidum extract on growth oĩEscherichia co// VNU Journal of Science, 23: 146-150 Võ Thị Thương Lan, Tanaka Atsushi (2007) Methylation-independent transcriplions of repeat sequences induced by ion beams VNU Journal of Science, 23; 140-145 Trần Kiêm Hào, Nguyễn Thị Phượng, Võ Thị Thương Lan (2005) Một số đột biến gen CYP21 liên quan kiểu gen kiểu hình cùa bệnh tăng sàn thượng tliận bâm sinh Hội nghị khoa học toàn quốc 2005: 8-12 Sakamoto A., Lan Vo T.T., Hase Y., Shikazono N., Matsunaga T,, Tanaka A (2003) Disruption of the AtREV3 gene causcs hypersensitivity to Ultraviolet B light and (}amma Rays in Arabidopsis: Implication of the presence of a translesion synlhesis mechanism in plants Plant Cell, 15: 2042-2057 l.è Nhật Minh, Lê Thị Kim Tuyến, Đồ Trung Phấn, Vũ Minh Châu, Võ Thị Thuotig Lan (2003) Sừ dụng phương pháp đa hình ADN (PCR-RFLP) vùng inlron 18 đồ x c đ ịn h c th ể m a n g g e n b ệ n h m u k h ó đ n g h e m o p h i l i a A H ộ i n g h ị C ô n g n g h ệ Sin h 11 12 13 14 học loàn quốc Hà Nội 12/2003 Nhà Xuất Khoa học Kỳ thuật: 1025-1027 Võ Thị Thương Lan, Dương Văn Hợp, Nguyễn Hoài Hà, Phạm Thị Trân Châu, Phan Thị Kim (2001) Phát vi sinh vật có độc tố thực phâm băng kỹ thuật PCR Di truyền ứng dụng (tập san CNSH): 17-21 Võ Thị Thương Lan, Phạm Thị Trân Châu (2001) Phân lập gen mã cho protein ức chế tripsine (TI-IV) từ Cucurbiíaceae Di truyền ứng dụng (tập san CNSH); 32-36 Võ thị Thương Lan (2000) 'ằù ởụngAgrobacterium rhiĩOgenes làm veclor chuyển gen đậu bị Vigna unguiculata Tạp chí Khoa học, ĐHQG, 1: 33-37 Võ Thị Thương Lan, A Krause (2000) Hoạt hoá gen mã cho chalcone synthase bòi rhizobia Nod factor rễ đậu Tạp chí Sinh liọc, 1:3-9 Tóm tắt hoạt động đào tạo sau đại học chủ trì đề tài năm trở lại l ' h i uian rên aghiên cứu sinh 2001-2007 Trần Kiêm ỉỉào ()6-2008 Tên học vicn cao học }*hạm Anh 'rhùy Duxrnu, (> í (I' (|ii:iii phơi liop \ lói)^ t;if (ỉê lài {yjìi /'(> il()'u vi Víi nlìiUi íiíi iỉiith' nioi Vi! lỉlhiii lưi lììii'! ílhiiìi Ì’UI ih' liii Mõi Iiliíhi llhi yjií cic hu pliiii ( í) íìiin l\ /u /; klhhi liDí- ih(’(i hìcii Iiìaii tị ) /v//í 'i\'ỉ)ll()( iHN va r kỉCH Ví/i' ìihaiì dõìiỊ{ 1’ ihiiiiì yj(i ihtií iiicn íii' !íii) 11 ; 1 ị c.'ộne tác Mcn1(.'liíiili C'tT Cịuaii Ịihõi liợp _ ( 'luivén neanli rhS Tạ Bii.li riiuậii Vi Mllll í rhS Phạm Aiih 1'huỳ Dương Siiili lioá _ ỉ i 1lọ tên _ Kiioa Sinh lìoc Đí iKl iTl\' 'riiS Bùi Việt Anh ! i I2 Viện Vi sinh vật CNSH, ĐlÌQGHN rế bào PGS.TS Trịnh nồng rhái Sinh hóa TS Nguyễn Quỳnh Uyển Vi sinh phân tử 1’huyết minh cần thiết hình thành dự án: - Tổng quan cơng trình nghiên cứu ngồi nước ỉỉên quan đến vẩn đề nghiên cừu đề tài Ụrích dẫn lài liệu nước) Do việc sừ dụng kháng sinh không tuân thủ qui định tác động mòi trường kliác mà tượng kháng thuốc ngày phổ biến vi sinh vật gây bệnh người vật nuôi [Saeed & cs., 2009] Đặc biệt Việt Nam, tình trạng bệiứi viện ln q lái điều kiện vệ sinh chưa đảm bào khiến chi phí tăng thời gian điều trị phải kéo dài [Lê Kiều Ngãi & cs., 2005] Vì vậy, nghiên cứu phát loại kháng sinh mới, peptide có phổ kháng khuẩn rộng đồng thời phải đảm bảo an toàn với môi trường yêu cầu cấp thiết sinh - y- dược chi nước phát triểnmà cà với nước phát triển [Zasloff & cs., 2002; Bulet & cs., 2004] Hầu hết peptide có hoạt tính kháng khuẩn nói riêng có hoạt tính y-dược nói chung liai hành có nguồn gốc từ vi sinh vật, nấm Tuy nhiên, số lượng peptide có hoại lính kháng khuẩn phát ngày tăng sinh vậl nhân chuẩn, đặc biệt côn trùng Hiện nay, 200 sổ 750 peptide có hoạt tính kháng khuẩn tìm thấy triing [Brogden & cs., 2003; Saito & cs., 2005] Do ưu điềm có phơ kháng khn rộng đặc hiệu, có hoạt tính cao thời gian tác dụng lâu nên peplide có nguồn gốc từ côn trùng lựa chọn, cải biến thay acid amin nhằm mục đích tăng sản lượng tri hoạt tính kháng kliuẩn thơng qua phưong pháp tổng họp nhân tạo kỹ thuật ADN tái tổ hợp [Ovvens & cs.,'1997; Giacometti & cs., 2004; Ueno & cs., 2007; Diaz & cs., 2008] Trong số peptide có hoạt tính phát từ trùng, cecropin tìm tliấy rộng rãi i ị loài thuộc hai cảnh cánh vảy nliư bướm, tằm, ri, muỗi Cecropin thê dặc tính bật có phổ kháng khuẩn rộng (vi khuẩn Gram âm, Gram dương), chí kháng I cà virus nấm [Moore & cs., 1996; Giacometti cs., 2003; Albiol & cs., 2004] Việc dùng kết ' hợp cecropin với loại kháng sinh thông dụng làm tăng hiệu diệt khuân thc m rộĩìL’ p h ổ k h n e k h u ẩ n N h d ó c ó th ề g iả m liề u v n n g d ộ k h n g s in h c â n s d ụ n ” klìi tlicu tn bệnh Iru y ề n nhiễni, đặc biệt đối v i vi khuân n h iễ m Ir ù iig bệnh viện 1'ron g cônt’ bố ^aI! (tây Cirioni cs., [2006] kết hựp cccropin ĩi với vancoinyciii dê dicu Irị l'éiil) n l i ic i n ti ù i ie V a n r e ìts klìány m e ttiic ilin i f !■ Iiliicu Inại CCCI()Ị)1II kli:u; nhau; cliiniu dirsaccharides, glucoprotein) có mặt Irêii màng |Sato c> 20()(i| I inh c h ấ t n y k liiéii c e c r o p i i i c ỏ tá c d ụ n g đ ị n h h n g đ ố i v ứ i r i ê n g tế b \'1 k liu ã n lo t t ín h I ua c c c r o Ị ìin e h ii y ế u d o c a u tr u c ciìa h a i \ iu ig v C O O P i q u i d ị n h Tha> d ôi c ấ u iriK' I u;i tronti hdi vùng nà\ cỏ ihé làm thay dôi đanu kê phô luiại dộiiLỉ, Pliân lich iranscriploniiL' ch.o llìấy cccropiiì cịn làm íỉiay đỏi hoại dộng cùa inột sị gcii cua \'ì khuan 11ỈOIIR & c s 0 K ết q u ã n y c h o t h ấ y c c h ế t c đ ộ n g c ủ a c e c r o p i n k h ô n g đ n t h u ầ n c h i la p h v ỡ m ànu , lế b o m c ò n t h a m g i a k i ể m s o t h o t đ ộ n g c ù a n h i ề u g e n k h c n h a u K ố t luặii quan trọng mờ tiềm sử dụng cecropiii kháng sinh mà vi sinh vật gây hệnli khó có khả kháng lại Dặc biệt, cecropin có khả ức chế sinh trường cùa lế bào unt> ihư inà khơng có anh lurờiiíỉ đến lế hào binh thườiig [Moore & cs., 2006; Suttmann & cs., 2Ơ08] Một sỗ nghiên cứu gần cho thấy cecropin A, B sử dụng hoá trị (antimicrobial chemotherapy) dể diệt khối u vi sinh vật gây mà không gây tác dụng kháng hóa chất bệnh nhân phải hóa trị nhiều đợt [Suttmann & cs., 2008, Hou & cs., 2008] Ngoài ra, iTiột sổ cecropin khơng thể hoạt tính chống u rõ rệt dẫn xuất chúng có khả nhận biếl dặc hiệu làm tan tế bào ung thư [Yevtushenko & cs., 2005; Winder & cs,, 2007] Những kết quà khả quan công bố năm gần mờ tiềm ứng dụnu cecropiii điều trị ung thư liên cạnh việc sử dựng trực tiếp chất có hoạt tính kháng khuẩn, cecropin biểu sổ động thực vật chuyển gen làm tăng khả chống chịu với vi sinh vật gâv bệnh [Imamura & cs., 2006] Thuốc cà chua chuyển gen cecropin có khà ức chế xâm nhiễm có hại cùa vi khuẩn Pseudomonas syringae nấm Phytophíhora injestans [Huang & cs., 1997; Cavallarin & cs., 1998] Gen mã cho cecropin A2 biêu irong cá chuyển gen làm tăng khả chống chịu vi khuẩn gây bệnh [Dunnam & cs., 2002] Biổu cùa cecropin dòng tế bào lympho T cùa người kìm hãm virus HIV sinh trường thông qua ức chế hoạt động gen virus [Wachinger & cs., 1998] Do có khả ímg dụng rộng hướng sinh - y - dược, nên việc sản xuất tổnti hợp cecropin với số lượng lcVri nhiều phịng thí nghiệm quan tâm Cecropin biêu liiện thành công linh từ nấm men Pichia pastoris [Jiii & cs., 2006] Đặc biệt, cecropin có hoạt tính tinh vód số lượng lớn từ tế bào E.coli [Liang & cs 2006; Shen & cs., 2008] Cecropin tái tơ hợp có hoạt tính kháng vi khuân Gram âm, Gram dương nấm Ngoài ra, cecropin bị đột biến vài acid amin có cấu trúc thay đỏi có khả phổi hcrp tốt với mộl số kháng sinh lưu hành để kìm hãm sinh trưởiig cùa số vi khuẩn kháng thuốc [Giacomctti & cs., 2003] Nghiên cứu peptidc kháng khuẩn thực số phòng thí nehiệm Việt Nam l'uy nhiên, peptidc có nguồn gốc từ vi sinh vật thực vật ỊVTT Lan & cs., NX Canh & cs 2005] Gần đây, nghiên cửu peptide có hoạt tính sinh học từ sinh vậl biỏii tiến liàiih bầng kỹ thuật proteomic [PV Clii & cs., 2007J, Gcii mã cho cecroỊìiii h i'ủa ỉỉyiili>Ị'ilìora í ccrapìci dã dirực lơng hcrp nhàn lạo nhăm mục dích chuyên vào tê bào gỏc Ịià (i)ữ lài K ( ’(14/()fvlO) N t í h i c n c u p e p ú d e khí'in£ k h u ẩ n c ỏ ngiKMi £ ổ c t c ỏ n I r ù n u dộn[-^ iliụi \ ạt UM) lâl niiíi Iiic II iiiriVc Ui |! ịí-li 20()('^| \ \ ' ậ \ , liưíriiỊi Iiíihicii c u u ina tk' 1,11 t họi; t h o ihciy k h a Iiã n g uni' iì ụ n g rát rÕHL; c ù a (.'(.'CKipm t n ) i m s m h - y - d o \ ' I(li licii tliíiin khao dê viết cíề cu’(/'iìiị: Albii)! Mataiiic Y, ('astiiia V\ (2004) A n t u ir a l actisit) ul aiitim icrolníil catioiiic [icplidc atiainst Juiiiii virus aiKÌ lierpes siinplex virus Inleniitlivtưil dounial al Planl Palliogeiis Meculnr Plant-MicroorganiSìììs ImerLicíions I I 218-227 C irioni et al., (2006) E xp e rim e nta l study on thc effic a cy o f c o m b in atioii ot' a-lielical a iitim icrobial peplide an d v a n c o m y c in a g a in st Staphyỉococcus aureus \vilh interm ediate resistan ce to gly co pep tide Peptide, 27: 00 - 2606 (> D íaz M , A re n a s G, S erg io H M arshall S.H (200 8) D esigii and ex pressio iì o f a retro doub let of cecropin with enhanced activity Journaỉ of Biotechnolog}', 11, 2-9 Dunham R.A, Warr G.w, Nichols A, Duncan P.L, Argue B, Middleton D Kiicuktas H (2002) Enhanced bacterial disease resistance of transgenic channel cattíish possessing CB gene Biotechnology 4, 338-344 Giacoiĩietti A et al,, (2003) Comparative activities of cecropin A, melittin, and cecropin Amelittin peptide CA(1-7)M(2-9)NH2 against multidrug-resistant nosocomial isolates of Acinetohacter baumannii Peptide 24, 1315-1318 Giacometti A, Cirioni o, Kamysz w, D’Amato G, Silvestri c, Del Prete M.s, Liikasiak ,í Giorgio Scalise G (2004) In vitro activity and killing effect of the syntlielic hybrid ccciopin A-inelittin peptide CA(1-7)M(2-9)NH2 on methicillin-resistant nosocomial isoiates of Staphylococcus aureus and interaction s w ith clin ically used a ntibiotics Diơgnoslic Microhiology and ỉnfeclious Disease, 49, 197-200 10 G r e g o ry K, M ello C M (20 04) lm m o b iliz a tio n o f Escherichia coli cells by use o f thc a n tim ic ro b ial p eptide c e c ro p in p Applied and environmeníal microbiology, , 1 - I 134 I Hong RW, Shchepetov M, Weiser JN, Paul H Axelsen PH (2003) Transcriptional proHle of the Escherichia coli respoiise to the antim icro bial insect p e p lid e c e c ro p in A Anliniicrohiul agents andchemolherapy, 47( 1): 1-6 12 Hong SM, Kusakabe T, Lee JM, Tatsuke T, Kawaguchi Y, Kang MW Kane sw Kim KA Nho SK (2008) Structure and expression analysis of the Cecropin E gene from silkvvomi, Bombyx mori Biosci.Biotechnoỉ.Biochem., 72(8); 1992-1998 13 Hou L, Shi Y, Zhai p, Le G (2006) Antibacterial activity and in vitro anti-tumor activity of the extract of the larvae of the houseíly (Musca domestica) Ethnopharmacology, 111 (2); 227-23] 14 H iiang Y, N o rd e e n R o , Di M , Ovvens L.D , M c B e a th J H (19 97 ) Expressioii o f an E n g in e e re d C ecropin G e n e C a ss e tte in T n sg e n ic T o b a c c o Plants C o n íe r s Disease R e sista n c e to Pseudomonas syringae pv Tabaci Moỉecuỉar Plant Pathoỉogy, 87, 94 -499 15 Iniam ura M, N a k a h a Y, K a n d a T, T oshiki T a m u r a T, Taniai K (20 06 ) A transgen ic silkvvorm c x p re ssin g the im m u n e -in d u c ib le c e cro pin B -G F P re p o rte r gene liiseci ' Biocheinislry and híolecar Bioìogỵ 36, - 4 16 Jin F, Xii X X , Z h a n g \v , Gii D (2006) íỉxp ression and c h ara c teriz a tio n o f a h o u se X y ce c rop in gcne in ihe m e tlivlotro ph ic veast, Pichia /;as7o/7.v,doi: 10.101 6/J.pep.2006.03.008 17.1 ẽ Kiều N gài í t cs (2005) Tỳ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện m ộ l số y ế u tố liên quan Hệnl) ị \ icn N hi l! IIIIÌ!, iKTtiti 'Ì'C NíỊhiên cửu V học 15:206-210 I IX I.iaiig 'i', \Vang JX Z h a o X Dii XJ, X u c J|-' (2()06) M o lc c u la r cỊoniim and c lia rac tcri/a lio n ot ccLidỊiiii Iroiii tlic ( M i i s c d ( Ì omc s í ì c c i ) , a i i i l i t s c x p r c s s i o i i ì h ’\ \ h i Ị ) i n f n i u l ( n h ì Dinh Binh, Nguyeii 'I'lii Anh N g u y e l, Niiuycii (^uMili ( liaii, l'liam Miiili lluoim (20U5) liisccticidal toxicity and e ítìc a c y oí BT p re p a lio n s iii thc tìckl r r o c e e d i n ọ ^ s ọ f i l i e ' ‘' P a c i / i c R i n i C o ! i f c r c n c c Science and 'l echnics l’ ublisiiinlì ! lousc, 5; 40 9-415 22 O u e i i s ỉle u tte T.M (1997) A Singie Aiiiiiio A cid Subsiitiiliun iii thc A n íniiicrubi D e tc n se Protein C e c ro p in B !s A sso c ia te d with D im in is h e d Degraclatioii bv L e a í Intercelliilai i luid Molecular Planí-Aíicroorgani.snis ỉnleraciious 10, 525- 528 23 1’han v c , Tran 'I T , T n TMÌs', N g u y e n B N , N g u ỵ e n T I ', Bui Q N (2007) P roteoniics ol Iiiarine bioactive peptide Proceedings o f the first VAST-KOCI Workshop OÌI Science and Technology R& D C o o p era tio n , H anoi, S e p te m b er 14, 0 , pp 68-75 24 Saeed A, K hatoon n , Aiisari FA (2009) M u ltid ru g resistan t grain-iiegalive b a c ie n a m clinical isolates froni Karachi.Pak J Pharm Sá., 22(1): 4-48 25 Saito A, U eda K, Im a n iu M, A tsum i s , rab iino ki H, M iu N , W ataiiabe A, M a d o k a K itam i M, Ryoichi Sato R (2005) Puriíìcation and c D N A c lo n in g o f 'a cecropin troin the loiigicorn beetle, A c a lo le p ta luxuriosa Comparaíive Biochemislry and Physioloịịv 142, 323 26 S;ito H Teix J.fỉ (2006) I^eịilide-tiiemhrane in te ctions anci inecltanisins 01 meiiihiaiiL tlcbliLICUOII by a n ip h ip a lh ic u-lielical aiilim icrobial peptid e Biochiiìiicci Bif ilìc -lilì Iníernalional Peptide Symposium 30 V õ Thị T hư ơiig Lan, P h m Thị T rân C h âu (2001) Phân lập g e n mã c h o protein ức chế tripsine ( T i-lV ) từ Cucurhitaceae Di truyên img dụng (tậ p san C N S H ): 32-36 31 VVachinger M, K le in sc h m id t A, W in d e r D, P ec h m a n n N , L u d v ig se n A, N e u m a n n M, H olle R, S a lm o n s B, Bríle V, B c k -W e rre r R (1998) A ntib acterial p e p tid e melitin and cccrop in inliibit replication o f h u m a n in im u nod eficiency viru s by su p p r e s s in g viral gene e x p re ssio n Jo u rn a l o f G eneral V irolog y, 79, 73 1-740 32 Winder D, Walter H, Erfleb GV, Salmons B (2007) Expression oí Antimicrobial Peptiđe H as an A n titu m o u r E ffect in H u m a n Cells Biochemicaì and Biophysical Research Communications,'2^2 (3): 608-612 33 Y e v tu s h e n k o D p , R o m e r o R, F orw ard B s , H a n c o c k R n , K ay w , M isra s (2 0 ? ), P ath o g e n -in đ u c e d exp ressio n o f a cecropin A -m elittin a n tim ic ro b ia l peptide gene co n fe rs antifim gai resistance in transgenic lohacco Journơl o f Experimental Bolany 56 -1 34 Zasloff M (2002) Antimicrobial peptide of multicellular organisms Nalure, 415, 389-395 - LÁ' d c h ọ n đ ề tà i: Đ e tài c ó tín h thời s ự c a o , lic n k ế t c c c h u y ê n n g n h c ù a siiili liợc tluic n g h i ệ m v i n h a u t h ô n g q u a c c k ỹ t h u ậ t h iệ n đ i t r o n g n g h i ê n c ứ u v ề c c I^eptide c ó h o i t í n h s i n h - v - d c V iệ t N a m K e t q u c ủ a đ ề tài b c d ầ u s ẽ m t r i ể n v ọ n g ứ n g c iụ ng c ù a c c p e p t i d e t h c h ệ m i tr o n tí s i n h - V - d ợ c c ũ n g n h c u iiíi c ấ p Iií>uồn geii p h ụ c v ụ chuN cn L’,cn tạ u c c u i n u c y trơiiíi c o tín h t l i i i g c h ị u vi s i n h v ậ t g â v b ệ n h DỊa hàn (iêii liàiili Iiohiín ciVii (vã, liu>vn, tinli, vùriị;): Phuii.í' 1lií Iiưliiệiiì ÌIOIIỈ’ dKiii ( Iiiit' iiỊiliọ n / y i n \ a Piolciii .M ục t i ê u c u a d ề tà i: X ã ) (.iụng t|ui tiiiih tliiét kc h i é u h i ẹ n g c n m ã c h o pL-piidc kíiaiiị' I h u n c ó n u u i i u ỏ c lừ c ò n t r ù n g ; d n h g iá lio t tín h k h n g k h u â n c u a p c |i t i d c tái tô h u p , p c p t i d e l)iến v m triể n v ọ iig k ế t h ợ p c c p e p tic ie n y vớ i n i ộ t sô k h n g s i n h tlc n iig c a o lio ạt líiili k h n g k h u â n 10 ! óm t;ìf nội cJiin g e n , ) v k ỹ n g h ẹ A D N (th ié t kê v e c t o r h iê u h i ệ n , h i ê n n p , k iê m tra h o t tín h c ù a peptide ) i4 IM iiidn}.' |)h ;iị) liiậ iì \ ;i |)IUKU1}Í Ị)l);iị) IvImki học sư (iụ n f; t r o iiị; (1C‘ (ài: Iii' Iiiièii cÌỊcli Iiháiii 1x10 \ộ co ihc dơi \'iVi i:;ic lac nhân vi siiilì v(it cu hại Dạc hict Ị Cplidc klióiig gâ\ lac dụng phụ dói \ Ic [lao cukariot nèii khà ứng dụiig cua : chuiiL' troiiụ >'-elirợc (là lliu híil quan làm cùa nhà sinh liọc Irèii thê giới Cecropin C(') l í c h llìiKíc n l ì u \ a h o i l i n h p li ụ l l ì u ộ c \ a o d c liiiii h o l ý c u a n i ộ l s ỏ acicl a m i n n ê n v i ệ c l o i i g , ỊỢ|1 tha) dõi acicl ainiii dược thực lìiệii chu >êu bời kỹ lluiật cua \ i sinh \a di ; UNCII phân tir 'I roiig dề tai iiay chúnu tịi sử dụng mộl sơ phưcrng pháị) iihu sau; i T õ i m h o p c c ueii n iã c Ik > c e c r o p iii b ầ n g k ỹ t h u ậ t F < 'r-P C R h o ặ c b n g p h c n ig p h p t ỏ n g ị ỉ ợ p Iiliân tạ o d ự a \'à o l’( ' R , bàiií> PC'R u â \ đ ộ t liiếii h ặ c b ă n ti m u l l i p l e x P C R ĩ r i i i ẻ l k ế v e c t o r tá c h d ò n ẹ v e c l o r b i ể u ỉiiện n h s d ụ n g c c e n z y m o iớ i h n v A D N g a se X c đ ị n h h o i tínli k h n g k h u â n b n u p h c n i c p h p ứ c c h e t r ê n d ĩ a t h c h , x a c đ ị n h d ộ bên cùa cecro p in dối với yếu tố pfl Iihiệt dộ ■ r i n h s c h c c loại p e p t i d e b ằ n g c c p h n g |-)háp s i n h h o Khả sử dụng sỏ- vật chất, trang thiết bị (íên phịng thí nghiệm sử Jụng đề lài): Trang thiết bị phịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym ^rotcin Trang thiết bị cùa Trung tâm Nghiên cứu khoa học sống (xây dựng từ nguồn vôn 3PEC) Khả họp tác quốc tế -ỈỌỊ) tác đãyđaiig có: Phịng ihí nghiệm quĩ gen, JAEA, Nhật Bản Phòng miễn dịch ihử huoc, Đại học Leuven, Ri Các hoạt động nghiên cứu đề tài: Diều tra khảo sát: ® Xây dựng mơ hình thừ nghiệm: D Biên soạn tài liệu; Vict báo cáo khoa học; ® ỉ ỉội thảo khoa học: ^ l'ập huấn: o Các hoạt động khác: Trao đổi kỹ thuật ADN tái tồ họp, tách dòng, phân lập Nâng cao khả lang thực hành sử lý kỹ thuật cho cán tham gia đề tài Tạo điều kiện cho sinh viên ỉược tiếp cận nắm bắt phương pháp kỹ thuật đại 18 Sản phẩm đề tài (sản phẩm chínlí đề tài yêu cầu chất luụng cần đạt Liệt kê theo dạng sàn phâm) 18.1 Dạng I: Mầu (niodel, maket); Sàn phẩm (là hàng hóa, tiêu ihụ trẽn thị rường); Vật liệu; 'rhiết bị; máy móc; Dây chun cơn^ nghệ; Giơnii trơng; Giơng vật UIƠI \ c c loại k h c ; Muc cỉiât liiuiiị; cân (hil n I ĩ'ri S ỉ i i i phrini ( ' I I (liê \ clii tiêii cliâl l i i ọ i>» c h u y t II Diiii \ i (1(1 \ /(/// n r i i llK H iy, c iììiín ì I IOIIỊ^ mióc' c u a sản phâm C c c i o p i i i lai ló h u p ilí (llỉC O H ìớ í Dụ kién sơ luọti”/ (|iiy mơ saii ị)hàni i i n l ì ũ l ) I hc «i(Vi tạ o I ;i ! ( icii (Iriiili lự \ ' c c l o r l i i cu lnệii ị im c lc o tid c ) m a n g ẹ,en X c e c r o p i n tái t ô hợp C e c r o p i n c i bi c i i ( i e n (trinh tự V e c l o r b i ê u hi ệ i i nucleotide) m a i i g Í4c n X c e c r o p i n cài b i ê n M úc chất lưọng sản phẩm (Dạng I) so vói sản phẩm tương tự nưóc ngồi (Làm rõ sờ khoa học thực liễn đê xác ciịnh cúc chi tiên vê chát ìượnịị cán đu! cua S(in phãm đề tài: ' ĩ r i n h t ự m i c ỉ e o t i d e đ ă n g ký t r o n g n g â n h n g g e n t h ê g iớ i 18.2 Dạng II: Báo cáo khoa học (báo cáo chuyên đề, báo cáo tồng hợp kết quà nghiên cứu); Nguyên lý ứng dụng; Phương pháp; Tiêu chuẩn; Quy phạm; Phần mêm máy lính; Bàn vẽ ihiẻt kế; Quy trinh cơng Iighệ; Sơ dồ, bàn đồ; số liệu, Cơ sờ liệu; Báo cáo phân tích; Tài liệu dự báo (phươngpháp, quy trình, mơ hình, )-, Đe án, qui hoạch; Luận chứng kiii]i tế-kỹ thuật, Báo cáo nghiên cứu khà Ihi sản phâm khác -» Tên sản phâm TT Yêu cầu khoa học cần đạt Báo cáo tông hợp Số liệu khoa học xác "7 Qui trinh tổng hợỊ'1 gen mã cho cccropin Các bước (hực chi tiếl Qui trìiih tổng hợp gen mã cho cecropin cải biến Các bước thực chi tiết Ghi 18.3 Dạng III: Bài báo (tồng số); Sách chuyên khảo (tổng sổ); sàn phẩm khác dự kiên công bô (tông sô) Tên sản phẩm Yêu cẩu khoa học cẩn đạt IT Dự kiến noi công bố (Tạp chí, Nhà xuất bản) Bài báo Số liệu khoa học xác Tạp chí quốc tế Bài báo Số liệu klioa học xác Tạp chí nước Báo cáo Hội nghị khoa học Hội nghị toàn quốc Ghi Trình độ khoa học sản phẩm (Dạng II & III) so vói sản phẩm tưong tự có (Làm rõ sở khoa học thực tiễn để xác định yêu cẩu khoa học cần đạt sản phẩm đề tài) ^ 18.4 Kết tham gia đào tạo khuôn khổ đề tài — r — - ^— — cT — Chuyên : Số 7luơng ngành đào tạo c ấ p đào tạo 11 Sinh Y -6 Cử nhàn ') Sinh học thực nghiệm Thạc sỹ ■i 1lổn 1 trồ n ” : , Ghi SỸ - ^ Kliôii" 10 » ~T ~ ' ^ N ô i ( l u i i ^ l i ên (iõ l l u i T liit '11 c i i a ỉ ;ì í ' ii f í s ^ \ c i n / ì / h i ì ì i LỈCII (t í i r t-OiiỊỉ vit'í' c ú n /I i í n klnii / h o i l u m ihirr i/, hòi gian (liục hi ên l)én tháiig 111 tháiig 5-2()()9 5-2()0‘ì Ho ại tiộii” iH^hiéii CIÌII hu thập \';ì vièt tong t|iiciii lai licu Xây d ựn g dè cu(rnti chi tiẽt 1hiêt kê căp niỏi tlăc hiẽii c Ikì \s ihuât PCR R iiiiiUiplcx [ ach chiẻi Ai)N, ARN 'lách doniỊ 1-2 gcn iiiã CỈIO cecTopiii tu ruôi lioặc muôi Biên nạp \ biêu liiện cecroỊiin tái tô hc/]:) tê bào vi khuâii Bước đâu tiiili Xác dịnỉi hoạt tính ng khuẩn ' ' : ” ^ Biên nạp, tách dòng biêu cecropin cài biến vi khuẩn Xác định hoạt tính kháng khuân S ả n phâiii k h o a liọc ' liáo cáo tỏnt’ t|uaii K-2()()0 'ỉ rình tự gen mã cho cciropiii 10-2009 Điều kiên biêu hicn tối ưu Sô liệu khoa học 1-2010 12-2009 6-2010 Báo cáo khoa học '1'rinh tự gen mã clu) peptide cài biến 5-2010 10-2010 Qui trinh biêu 8-2010 11-2010 Sô liệu khoa học 12-2010 1-2011 12-2010 4-2011 Báo cáo khoa học Sô liêu khoa hoc * 3-2011 7-2011 Sô liệu khoa học 4-2011 8-2011 Sô liệu klioa học 8-2011 2-2012 Sô liệu khoa học 3-2012 4-2012 Báo cáo tơng kêt 5-2(Kì