Khóa luận tốt nghiệp đánh giá tác dụng tăng tính kháng khuẩn và kháng nấm của các chất gây tổn thương oxi hóa ở dạng kết hợp với ion kim loại

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ۞۞۞ KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỖ THỊ THU HÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TĂNG TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG NẤM CỦA CÁC CHẤT GÂY TỔN THƢƠNG OXI HÓA Ở DẠNG KẾT HỢP VỚI ION KIM LOẠI Hà Nội – 2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ۞۞۞ KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TĂNG TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG NẤM CỦA CÁC CHẤT GÂY TỔN THƢƠNG OXI HÓA Ở DẠNG KẾT HỢP VỚI ION KIM LOẠI Họ tên sinh viên : Đỗ Thị Thu Hà MSV : 620843 Lớp : K62CNTPB Khóa : 62 Giảng viên hƣớng dẫn : PGS.TS Nguyễn Thị Mai Phƣơng Giảng viên hƣớng dẫn : GVC.TS Nguyễn Thị Lâm Đồn Địa điểm thực : : Phịng Sinh Hóa thực vật - Viện Cơng nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Hà Nội – 2021 THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN THỰC HIỆN KHÓA LUẬN Họ tên sinh viên : Đỗ Thị Thu Hà MSV : 620843 Số điện thoại : 0523414491 Email : Thuhado1104@gmail.com Chuyên ngành : Cơng nghệ thực phẩm Lớp : K62CNTPB Khóa : 62 Giảng viên hƣớng dẫn : PGS TS Nguyễn Thị Mai Phƣơng Giảng viên hƣớng dẫn Địa điểm thực : : GVC TS Nguyễn Thị Lâm Đồn : Phịng Sinh Hóa thực vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Hà Nội, ngày tháng Giảng viên hƣớng dẫn (Ký ghi rõ họ tên) Sinh viên thực (Ký ghi rõ họ tên) PGS TS Nguyễn Thịn Mai Phƣơng Đỗ Thị Thu Hà năm 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu báo cáo khóa luận trung thực chƣa đƣợc sử dụng Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thự khóa luận đƣợc cảm ơn thơng tin đƣợc trích dẫn khóa luận đƣợc ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên thực Đỗ Thị Thu Hà i LỜI CẢM ƠN Em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Mai Phƣơng, Phịng Sinh hóa thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam GVC.TS Nguyễn Thị Lâm Đoàn, khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam tạo điều kiện sở vật chất nhƣ hƣớng dẫn tận tình cho em suốt thời gian qua Em xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giáo khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam thầy, cô, anh, chị Viện công nghệ Sinh học tạo điều kiện để em hồn thành đề tài khóa luận Cuối cùng, em xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, anh, chị bạn bè đồng hành với em thời gian tiến hành đề tài khóa luận tồn thời gian học tập Học viện Nông nghiệp Việt Nam Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Sinh viên thực Đỗ Thị Thu Hà ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ tiếng Anh Chữ viết đầy đủ tiếng Việt CKK Chất kháng khuẩn CKN Chất kháng nấm Nồng độ ức chế tối thiểu MIC Minimal inhibitory concentration H2O2 Peroxit hydro E coli Escherichia coli ROS Reactive oxygen species 8HQ 8-Hydroxyquinoline IC50 The half maximal inhibitory Nồng độ ức chế 50% phát concentration triển Các gốc tự S mutans Streptococcus mutans S aureus Staphylococcus aureus C albicans Candida albicans T rubrum Trichophyton rubrum WHO World Health Organization Tổ chức y tế giới PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng khuếch đại gene ITS Internal transcribed spacer iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii PHẦN I : PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu PHẦN II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Chất kháng khuẩn 2.2 Chất kháng nấm 2.3 Các chất gây tổn thƣơng oxi hóa 2.3.1 Tác động ROS lên ADN 2.3.2 Tác động ROS lên protein 2.3.3 Tác động ROS lên lipid 2.4 Một số ứng dụng chất kháng khuẩn 2.4.1 Ứng dụng cơng nghệ đóng gói thực phẩm 2.4.2 Ứng dụng điều trị bệnh nhiễm trùng 10 2.5 Peroxit hydro (H2O2) 11 2.6 8-Hydroxyquinoline (8HQ) 12 2.7 Vi khuẩn Streptococcus mutans 14 2.8 Bệnh nấm da 15 2.8.1 Tổng quan bệnh nấm da ngƣời 15 2.8.2 Nấm Trichophyton rubrum 16 PHẦN III : VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Nguyên liệu, thiết bị địa điểm nghiên cứu 18 3.1.1 Nguyên liệu 18 3.1.3 Địa điểm nghiên cứu 19 3.2 Nội dung nghiên cứu 19 iv 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 20 3.3.1 Đánh giá tác dụng diệt khuẩn Streptococcus mutans 20 3.3.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 20 3.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn công thức lựa chọn đĩa thạch 21 3.3.4 Phƣơng pháp phân lập định danh nấm 21 PHẦN IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Đánh giá tác dụng kháng vi khuẩn mơ hình Streptoccocus mutans H2O2 dạng đơn lẻ H2O2 phối hợp với ion kim loại 26 4.2 Đánh giá tác dụng kháng vi khuẩn mô hình Streptoccocus mutans 8HQ dạng đơn lẻ 8HQ phối hợp với ion kim loại 28 4.3 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn H2O2 8HQ kết hợp với ion kim loại số chủng vi khuẩn Gram (-) Gram (+) 30 4.3.1 Xác định giá trị MIC thành phần công thức 30 4.3.2 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn nấm Candida albicans sử dụng công thức kháng khuẩn tiềm 32 4.4 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn H2O2 8HQ kết hợp với ion kim loại nấm gây bệnh da ngƣời Trichophyton rubrum 33 4.4.1 Phân lập nấm gây bệnh da Trichophyton rubrum bệnh nhân 33 4.4.2 Định danh chủng Trichophyton sp phân lập đƣợc phƣơng pháp giải trình tự vùng vùng ITS1-4 rDNA 35 4.4.2.1 Kết thu nhận DNA từ sinh khối nấm Trichophyton 35 4.4.2.4 Xây dựng phát sinh chủng loại 37 4.4.2.5 Đánh giá hoạt tính kháng nấm Trichophyton rubrum sử dụng tổ hợp chứa chất gây tổn thƣơng oxi hóa với ion kim loại Fe 2+, Cu2+, Zn2+ 38 PHẦN V : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 Tài liệu tiếng Việt 41 Tài liệu tiếng Anh 41 v DANH MỤC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1: Các dạng oxi phản ứng Bảng 3.1: Công thức pha môi trƣờng nuôi cấy 18 Bảng 4.1: Tác dụng gây chết tế bào vi khuẩn S mutans dạng huyền dịch biofilm H2O2 kết hợp với ion kim loại có khả 27 chuyển tiếp Bảng 4.2: Tác dụng tăng cƣờng gây chết vi khuẩn S mutans dạng huyền dịch biofilm 8HQ kết hợp với ion kim loại có khả 29 chuyển tiếp H2O2 Bảng 4.3: Các tổ hợp cơng thức đánh giá hoạt tính tăng cƣờng tổn thƣơng oxi hóa 30 Bảng 4.4: Giá trị MIC thành phần công thức 31 Bảng 4.5: Tác dụng kháng khuẩn công thức kháng khuẩn tiềm 32 Bảng 4.6: So sánh trình tự nucleotide vùng gene ITS1-4 chủng nấm Derma 001 VN với trình tự tham khảo phân mềm Blast Viewer 1.20.0 vi 37 DANH MỤC HÌNH Hình Trang Hình 2.1: Một số ví dụ chất kháng khuẩn Hình 2.2: Cấu trúc số chất kháng nấm phổ biến Hình 2.3: Một số chế gây tổn thƣơng lên tế bào thông qua cảm ứng tạo ROS Hình 2.4: Cấu trúc phân tử H2O2 11 Hình 2.5: Cơng thức cấu tạo quinoline 8HQ 13 Hình 2.6: Vi khuẩn Streptococcus mutans 14 Hình 2.7: Một số bệnh nấm thƣờng gặp 16 Hình 2.8: Mẫu nấm T rubrum đĩa thạch mặt trƣớc (a) sợi khuẩn ti (b) Hình 4.1: Ảnh hƣởng nồng độ H2O2 đến khả tiêu diệt vi khuẩn S.mutans Hình 4.2: 8HQ gây chết vi khuẩn S mutans dạng huyền dịch Hình 4.3: Mơ da nhiễm nấm Derma 001 VN (A) hình ảnh sợi nấm Derma 001 VN đĩa thạch SDA sau ngày ni cấy (B) 17 26 28 34 Hình 4.4: Kết phân lập lƣu giữ chủng Derma 001 VN 34 Hình 4.5: Mẫu ADN tổng số tách từ nấm Derma 001 VN phân lập 35 Hình 4.6: Sản phẩm PCR đƣợc tinh trƣớc đọc trình tự ADN 36 Hình 4.7: Trình tự nucleotit vùng gen ITS1-4 chủng nấm Trychophyton sp Hình 4.8: Cây phát sinh chủng loại chủng nấm Trichophyton rubrum 36 37 Hình 4.9: Tác dụng kháng nấm T rubrum phân lập tự bệnh nhân da liễu Việt Nam tổ hợp chất có khả tăng cƣờng tổn thƣơng oxi hóa vii 39 Rõ ràng 8HQ kết hợp với ion kim loại có khả chuyển đổi nhƣ với H2O2, tác dụng gây chết vi khuẩn chất tăng lên đáng kể Điều gợi ý 8HQ làm tăng cƣờng tổn thƣơng oxi hoá lên tế bào vi khuẩn S mutans 4.3 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn H2O2 8HQ kết hợp với ion kim loại số chủng vi khuẩn Gram (-) Gram (+) 4.3.1 Xác định giá trị MIC thành phần công thức Dựa công thức thiết lập với vi khuẩn mơ hình S mutans, chúng tơi tiến hành đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định với công thức (với nồng độ ion kim loại đƣợc điều chỉnh lên mM) sử dụng phƣơng pháp pha loãng đa nồng độ (Bảng 4.2) Đây phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ) nhằm mục đích đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh, yếu mẫu thử thông qua giá trị MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) sử dụng phƣơng pháp pha loãng đĩa 96 giếng Kết thể bảng 4.3 cho thấy giá trị MIC chất nhƣ sau: Bảng 4.3: Các tổ hợp cơng thức đánh giá hoạt tính tăng cƣờng tổn thƣơng oxi hóa Fe2+ Cu2+ Zn2+ A1 Fe2+ mM B1 Cu2+ mM C1 Zn2+ mM A2 H2O2 0.05% B2.H2O2 0.05% C2.H2O2 0.05% A3 8HQ 0,005% B3 8HQ 0,005% C3 8HQ 0,005% A4 Fe2+ mM + H2O2 0.05% B4 Cu 2+ mM + H2O2 0.05% C4 Zn A5 Fe2+2 mM + 8HQ 0,005% B5 Cu2+2 mM + 8HQ 0,005% H2O2 0.05% mM + H2O2 0.05% A6 Fe2+2 mM + 8HQ 0,01% B6 Cu2+2 mM + 8HQ 0,01% + C5 Zn + H2O2 0.05% 2+ 2+ mM + 8HQ 0,005% C6 Zn2+2 mM + 8HQ 0,01% + H2O2 0.05% 30 Bảng 4.4: Giá trị MIC thành phần công thức Gram (+) Gram (-) Tên mẫu (mM) Enteroco ccus faecalis ATCC29 9212 Staphyloco ccus aureus ATCC259 23 Bacillus cereus ATCC14 579 Escherichi a coli ATCC259 22 Pseudomon as aeruginosa ATCC2785 Salmonella enterica ATCC1307 A1 - - - - - - A2 - - - - - - A3 - - - - - - A4 - - - - - - A5 A5/2 - - - - - A6 A6/16 A6/32 A6/16 - - - B1 - - - - - - B2 - - - - - - B3 - - - - - - B4 B4/16 B4/16 B4/4 B4/2 B4/2 B4/2 B5 B5/64 B5/32 B5/64 B5/2 B5/2 B5/2 B6 B6/64 B6/64 B6/64 B6/4 B6/2 B6/4 C1 - - - - - - C2 - - - - - - C3 - - - - - - C4 C4/16 C4/8 C4/16 C4/4 C4/4 C4/4 C5 C5/32 C5/16 C5/32 C5/8 C5/16 C5/16 C6 C6/32 C6/32 C6/32 C6/16 C6/16 C6/16 256 256 128 32 256 128 Steptomycin 31 4.3.2 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn nấm Candida albicans sử dụng công thức kháng khuẩn tiềm Từ kết giá trị MIC tìm đƣợc thấy tổ hợp chất H2O2 8HQ kết hợp với ion kim loại có tác dụng gây chết mạnh vi khuẩn thử nghiệm so với dạng đơn lẻ Dựa số liệu thu đƣợc, lựa chọn công thức tổ hợp thử nghiệm tác dụng cho VSVKĐ gồm S aureus E coli nấm C albicans sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy môi trƣờng lỏng Bảng 4.5 Tác dụng kháng khuẩn công thức kháng khuẩn tiềm Vi sinh vật E coli ATCC25922 S aureus ATCC25923 C albicans ATCC90028 A1 - - - A2 - - - A3 - - - A4 - - - A5 + ++ - B1 - - - B2 - - - B3 ++ ++ + B4 +++ +++ +++ B5 +++ +++ +++ C1 - - - C2 - - - C3 + + + C4 ++ ++ ++ C5 ++ ++ ++ Ampicillin +++ +++ NA Nystatin NA NA +++ Tên mẫu (-): không tác dụng; (+): có tác dụng; (NA): khơng áp dụng 32 Kết lặp lại thí nghiệm xác định hoạt tính kháng khuẩn với vi khuẩn S aureus E coli nấm C albicans mơi trƣờng ni cấy đƣợc trình bày bảng 4.5 Trong số các công thức đƣợc thử nghiệm, hy vong nhiều vào cơng thức có mặt Fe2+ Tuy nhiên, kết thu đƣợc không nhƣ chờ đợi Tổ hợp công thức với Fe2+ không cho kết nhƣ mong đợi Lý Fe2+ có tính tan nƣớc tạo phức gây tủa, hạn chế khả khuyếch tán vào đĩa thạch nên không phát huy tác dụng nhƣ mong muốn 4.4 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn H2O2 8HQ kết hợp với ion kim loại nấm gây bệnh da ngƣời Trichophyton rubrum T rubrum nấm gây bệnh bệnh da phổ biến ngƣời có tính kháng thuốc cao Vì thế, chúng tơi tiến hành thử nghiệm tác dụng tổ hợp chất có chứa ion kim loại Fe2+, Cu2+ Zn2+ lựa chọn lên chủng nấm gây bệnh 4.4.1 Phân lập nấm gây bệnh da Trichophyton rubrum bệnh nhân Để thực đƣợc thí nghiệm, chúng tơi tiến hành phân lập nấm trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm Mẫu bệnh phẩm đƣợc lấy từ da chân bệnh nhân (Hình 4.3A) nhƣ mơ tả phần phƣơng pháp Mẫu bệnh phẩm đƣợc cấy lên đĩa petri chứa môi trƣờng SDA nuôi 28-300C ngày Trên môi trƣờng SDA, chủng nấm phân lập đƣợc phát triển mạnh nhanh Sợi nấm có màu trắng bơng bề mặt (Hình 4.3B) Mặt dƣới khuẩn lạc có màu vàng Trên mơi trƣờng thạch Littman Oxgall, khuẩn lạc có màu xanh lục sau 14 ngày ni cấy Khuẩn lạc có màu đỏ khơng thay đổi pH thạch chứa bromocresol Kết gợi ý nấm Trichophyton sp gây bệnh da ngƣời đƣợc đặt tên Derma 001 VN 33 A B Hình 4.3: Mô da nhiễm nấm Derma 001 VN (A) hình ảnh sợi nấm Derma 001 VN đĩa thạch SDA sau ngày nuôi cấy (B) Kết nhân sinh khối sau ngày cấy sợi nấm vào bình tam giác có chứa mơi trƣờng SDA lỏng nhiệt độ 28oC với tốc độ lắc 200 vòng/phút thu đƣợc sinh khối nấm Derma 001 VN từ da bệnh nhân da liễu Việt Nam Mẫu nấm thu đƣợc sau ni đƣợc soi dƣới kính hiển vi độ phóng đại x40 lần để quan sát sợi nấm (Hình 4.4) B A Hình 4.4 Kết phân lập lƣu giữ chủng Derma 001 VN Nấm phân lập ống thạch nghiêng (A); sợi nấm soi kính hiển vi độ phóng đại 40X từ mẫu nấm Derma 001 VN phân lập (B.) 34 4.4.2 Định danh chủng Trichophyton sp phân lập đƣợc phƣơng pháp giải trình tự vùng vùng ITS1-4 rDNA 4.4.2.1 Kết thu nhận DNA từ sinh khối nấm Trichophyton DNA tổng số từ chủng nấm phân lập đƣợc tách chiết kít tách chiết DNA nấm men/nấm mốc NorGene Biotek Canada Các sản phẩm DNA gen đƣợc phân tích gel agarose 0,8% sử dụng phƣơng pháp điện di gel agarose nồng độ ADN đƣợc đo Máy quang phổ NanoDrop (Thermo Scientific, Hoa Kỳ) bƣớc sóng 260/280nm tỷ lệ hấp thụ (A 260/280) 1,8, chứng tỏ mẫu DNA đạt mức độ tinh yêu cầu M Hình 4.5: Mẫu ADN tổng số tách từ nấm Derma 001 VN phân lập 1: ADN từ mẫu nấm Derma 001 VN; M: Thang chuẩn DNA 1kb DNA Land Scientific (kích thước nhỏ 250 bp đến 1kb) 4.4.2.2 Kết khuếch đại vùng ITS1-4 DNA chủng nấm Derma 001 VN tách chiết đƣợc dùng để khuếch đại vùng ITS1-4 PCR với cặp mồi ITS1/ITS4 Kết điện di sản phẩm PCR gel agarose (Hình 4.6) cho thấy sản phẩm PCR thu đƣợc có băng đặc hiệu với kích thƣớc phân tử khoảng 700 bp, tƣơng đƣơng với tính tốn lý thuyết 35 M ~700𝑏𝑝 Hình 4.6: Sản phẩm PCR đƣợc tinh trƣớc đọc trình tự ADN sản phẩm PCR vùng ITS 1-4 từ chủng Derma 001 VN; M: Thang chuẩn DNA 1kb DNA Land Scientific (kích thước nhỏ 250bp đến 1kb) 4.4.2.3 Giải trình tự gen ITS1-4 Sản phẩm PCR sau tinh đƣợc dùng trực tiếp để xác định trình tự nucleotide gen vùng ITS1-4 (Hình 4.5) Kết so sánh khác biệt vùng ITS1-4 chủng nấm phân lập với trình tự DNA– ITS chủng nấm ngân hàng gen NCBI cho thấy Derma 001 VN có độ tƣơng đồng nucleotide cao với chủng T rubrum 99.03% chủng T violaceum 97.24% chủng T simii 91.62% (Bảng 4.6) 5’TCTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTA ACGCGCAGGCCGGAGGCTGGCCCCCCACGATAGGGCCAAACGTCCGTCAGGGGTGAGCAGATGTGCGCC GGCCGTACCGCCCCATTCTTGTCTACCTTACTCGGTTGCCTCGGCGGGCCGCGCTCTTCCAGGAGAGCC GTTCGGCGAGCCTCTCTTTAGTGGCTAAACGCTGGACCGCGCCCGCCGGAGGACAGACGCAAAAAAATT CTTTCAGAAGAGCTGTCAGTCTGAGCGTTAGCAAGCAAAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTC TTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAAT CATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTC AGCCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGATGGACGACCGTCCGGCGCCCCCGTTTTTGGGGGTGCGGGACGCG CCCGAAAAGCAGTGGCCAGGCCGCGATTCCGGCTTCCTAGGCGAATGGGCAACAAACCAGCGCCTCCAG GACCGGCCGCCCTGGCCTCAAAATCTGTTTTATACTTATCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACC CGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA-3’ Hình 4.7: Trình tự nucleotit vùng gen ITS1-4 chủng nấm Derma 001 VN 36 Bảng 4.6: So sánh trình tự nucleotide vùng gene ITS1-4 chủng nấm Derma 001 VN với trình tự tham khảo phân mềm Blast Viewer 1.20.0 4.4.2.4 Xây dựng phát sinh chủng loại Cây phát sinh chủng loại mẫu nấm phân lập đặt tên mẫu Derma 001VN đƣợc xây dựng phần mềm MEGA X (Hình 4.8) cho thấy chủng nấm phân lập đƣợc có quan hệ gần gũi với T rubrum Hình 4.8: Cây phát sinh chủng loại chủng nấm Trichophyton rubrum 37 4.4.2.5 Đánh giá hoạt tính kháng nấm T rubrum sử dụng tổ hợp chứa chất gây tổn thƣơng oxi hóa với ion kim loại Fe 2+, Cu2+, Zn2+ Tác dụng kháng nấm T rubrum công thức chứa chất gây tổn thƣơng oxi hóa với ion kim loại Fe 2+, Cu2+, Zn2+ lựa chọn đƣợc trình bày Hình 4.9 Số liệu thu đƣợc cho thấy tổ hợp chất số 3, 4, có chứa Cu2+ cho kết kháng nấm rõ rệt với đƣờng kính vịng kháng nấm đạt 22, 25 28 mm chất đơn lẻ khơng có tác dụng Trong đó, chất kháng nấm nhƣ nystastin (50 µg/giếng) cycloheximide (30 µg/giếng) khơng có hoạt tính kháng nấm với mẫu thử Derma 001VN Vì thế, chất intraconazol dùng cho điều trị bệnh nấm da nhóm nấm thuộc chi Trychophyton sp có hiệu diệt nấm tốt đƣợc sử dụng làm chứng dƣơng nghiên cứu Kết cho thấy chất thể hoạt tính tốt với đƣờng kính vịng kháng nấm đạt 44 mm nồng độ 10 µg/giếng Đối với mẫu nghiên cứu có chứa Zn2+ có cơng thức số xuất vòng kháng nấm mạnh với đƣờng kính vịng kháng nấm đạt 26 mm cơng thức khác khơng thể hoạt tính Điều ngạc nhiên với tất cơng thức có chứa Fe2+ lại khơng xuất vịng kháng khuẩn Đây kết khơng nằm dự đốn nghiên cứu trƣớc đếu cho tổ hợp Fe2+ với 8HQ Fe2+ với H2O2 có tác dụng gây tổn thƣơng oxi hóa mạnh Tuy nhiên, nghiên cứu đƣợc thực đối tƣợng vi sinh vật khác S mutans hay nấm Candida albicans dạng dung dịch Sự khác đối tƣợng thí nghiệm khả kết tủa mạnh tạo hỗn hợp Fe2+ nguyên nhân dẫn đến hạn chế hoạt tính kháng nấm cơng thức Nhƣ vậy, kết luận tổ hợp chất gồm Cu2+ 2mM + H2O2 0.05%; Cu2+ 2mM + 8HQ 0,005%; Cu2+ 2mM + 8HQ 0,005% + H2O2 0.05% cơng thức mới, có hàm lƣợng chất kháng khuẩn thấp (< 0.01 µg/giếng với chất 8HQ so với µg/giếng với chất Itraconazole) nhƣng có khả kháng nấm T rubrum tốt kết hợp thêm với ion kim loại Các cơng thức dùng để xử lý bệnh da nhiễm nấm T rubrum hiệu quả, giúp làm giảm tác dụng phụ tác dụng kháng chất kháng nấm dùng lâu dài Tuy nhiên, rõ ràng nghiên cứu cần thực nhiều đối tƣợng nấm gây bệnh khác 38 nhƣ có đánh giá tác dụng kích ứng da nhƣ tác dụng phụ để khẳng định khả ứng dụng công thức 3 C C C 5 A B C D Hình 4.9 Tác dụng kháng nấm T rubrum phân lập từ bệnh nhân da liễu Việt Nam tổ hợp chất có khả tăng cƣờng tổn thƣơng oxi hóa A Cơng thức có chứa Cu2+; B Cơng thức có chứa Zn2+; C Cơng thức có chứa Fe2+ ; D Đối chứng dương Itraconazole H2O2 0.05%; 8HQ 0,005%; Fe2+/Cu2+/Zn2+ mM + H2O2 0.05%; Fe2+/Cu2+/Zn2+ mM + 8HQ 0,005%; Fe2+/Cu2+/Zn2+ mM + 8HQ 0,01% + H2O2 0.05% 39 PHẦN V : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thu đƣợc đƣa số kết luận sau : - H2O2 8HQ có tác dụng làm tăng cƣờng tổn thƣơng oxi hóa vi khuẩn mơ hình Streptococcus mutans kết hợp với ion kim loại - Tổ hợp công thức chứa Cu2+ Zn2+ nồng độ Cu2+/Zn2+ 2mM + 8HQ 0,005% Cu2+/Zn2+ 2mM + 8HQ 0,005% + H2O2 0.05% có tác dụng làm tăng cƣờng tổn thƣơng oxi hóa, ức chế phát triển vi sinh vật : - Đã phân lập thành công nấm Trichophytone rubrum có độ tƣơng đồng nucleotide so với trình tự ITS cua nấm khác đạt > 99% - Tổ hợp công thức Cu2+ 2mM + H2O2 0.05%; Cu2+ 2mM + 8HQ 0,005%; Cu2+ 2mM + 8HQ 0,005% + H2O2 0.05% có tác dụng kháng nấm T rubrum phân lập từ bệnh nhân da liễu tốt 5.2 Kiến nghị - Tiếp tục đánh giá tác dụng tổ hợp công thức chứa Cu2+ số nấm gây bệnh ngồi da khác để khẳng định hoạt tính kháng nấm tiềm công thức lựa chọn 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Thị Mai Phƣơng, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Đỗ Ngọc Liên, Robert E Marquis (2004) Tác dụng tăng cƣờng gây chết vi khuẩn Streptococcus mutans UA159 dạng huyền dịch biofilm 8-hydroxyquinoline kết hợp với ion kim loại có khả chuyển đổi Tạp chí Sinh học 2: 31-36 Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Thị Mai Phƣơng, Robert E Marquis (2003) Cơ chế tác dụng peroxit hydro lên vi khuẩn sâu Streptoccus mutans Tạp chí Sinh học 25(2a) :104-110 Nguyễn Thị Mai Phƣơng (2005) Luận án Tiến sỹ Sinh học Bộ Giáo dục Đào tạo Tài liệu tiếng Anh Almeida CEB, Felicio DL, Galhardo RS, Cabral-neto JB, Leitao AC (1999) Synergistic lethal effect between hydrogen peroxide and neocuproine (1,9-dimethyl 1,10-phenanthroline) in Escherichia coli Mut Res DNA Repair 433(1): 59-66 Aminov RI A brief history of the antibiotic era: Lessons learned and challenges for the future Frontiers in Microbiology 2010; 1:1‐ Ansari MA and Pramod Rai P (2017) Optimization of operating conditions for sterilization of aseptic food packaging material Int J Agric Environ Biotechnol 10(4): 423-428, Baer R L, Rosenthal S A, Furnari D Survival of dermatophytes applied on the feet J Investig Dermatol 1955; 24: 619–662 Burton H (1988) Ultra high temperature processing of milk and milk products Elsevier Appl Sci London, UK Cabiscol E, Tamarit J, Ros J, (2000) Oxidative stress in bacteria and protein damage by reactive oxygen species, Int Microbiol 3: 3-8 10 Chen, J., Yi, Jinling, Liu, Li, et al “Substrate adaptation of Trichophyton rubrum secreted endoproteases” Microbial Pathogenesis, Volume 48, Issue 2, 2010: 57-61 41 11 Curran J., Driver F., Ballard J W O., Milner R J., 1994 Phylogeny of Metarhizium: analysis of ribosomal DNA sequence data Mycological Res, 98: 547552 12 Dalecki AG, Crawford CL, Wolschendorf F (2017) Microbiology of metal ions Adv Microbial Physiol 70: 193-260 13 Deavall DG, Martin EA, Horner JM, Roberts R (2012) Drug-Induced Oxidative Stress and Toxicity, J Toxicol 2012: 645-460 14 Henle ES, and Linn S (1997) Formation, prevention and repair of DNA damage by iron/hydrogen peroxide, J Biol Chem 272: 19095-19098 15 Ho FK, Delgado-Charro B, Bolhui A (2020) Evaluation of an explanted porcine skin model to investigate infection with the dermatophyte Trichophyton rubrum Mycopathologia 185: 233–243 16 Imlay JA (2003), Pathways of oxidative damage, Ann Rev Microbiol., 57, pp 395418 17 Kappus H (1985), Lipid peroxidation: mechanism, analysis, enzymology and biological relevence, In Sies H (ed.), Oxidative stress Acad Press New York 18 Li D, Zhou B, and Bei L (2020) Antibacterial therapeutic agents composed of functional biological molecules J Chem 2020: 1-13 19 Malhotra B, Keshwani A and Kharkwal H (2015) Antimicrobial food packaging: potential and pitfalls Front Microbiol 6: 611-620 20 Marshall M, Cancro PL, and Fischman LS (1995) Hydrogen peroxide: A review of its use in dentistry J Periodontol., 66: 786-796 21 Oleinick NL., Chiu S., Ramakrishman N., and Xue L., (1986), Theformation, identification, and significance of DNA-protein cross-links in mammalian cells Brit.J Cancer, 55 (Suppl 8): 135-140 22 Oloke JK (2000) Activity pattern of natural and synthetic antibacterial agents among hospital isolates Microbios 2000; 102:175‐ 181 42 23 Patel BB, Roy FS, Saiyad MJ and Joshi DC (2016) Respiration behaviour and heat of respiration of mango (cv Langdo) under different storage conditions Int J Agric Environ Biotechnol 9(5): 855-859 24 Saadeh HA, Sweidan KA, and Mubara MS (2020) Review Recent Advances in the Synthesis and Biological Activity of 8-Hydroxyquinolines Molecules 25: 43214329 25 Shah P, Abadi LF, Gaikwad S, Chaudhari D, Kushwah V, Jain S, Bhutani KK, Kulkarni S, Singh IP (2018) Synthesisandbiologicalevaluation of 8- hydroxyquinoline-hydrazones for anti-Hiv-1 and anti cancer potential Chem Select 3: 10727–10731 26 Shen AY, Chen CP, Roffler S (1999) A chelating agent possessing cytotoxicity and antimicrobial activity: 7-morphobnomethyl-8- hydroxyquinoline, Life Sci 64(9): 813-825 27 Silveira, H.C.S., Gras D.E., Cazzaniga, R.A., et al “Transcriptional profiling reveals genes in the human pathogen ” Microbial Pathogenesis, 48(2): 2010: 91-96 28 Smith QJ.and Brown KL (1980) The resistance of dry spores of Bacillus subtilis var globigii (NCIB 8058) to solutions of hydrogen peroxide in relation to aseptic packaging J Food Technol 15: 169-179 29 Srisung S, Suksrichavalit T, Prachayasittikul V (2013) Antimicrobial activity of 8Hydroxyquinoline and transition metal complexes Int J Pharmacol 9(2): 170-175 30 Sung SY, Sin LT, Tee TT, Bee ST (2013) Antimicrobial agents for food packaging applications Trends Food Sci Technol 33(2):110–123 31 Symons MCR, Rusakiewicz S, Rees RC, Ahmad SI (2001) Hydrogen peroxide: a potent cytotoxic agent effective in causing cellular damage and used in the possible treatment for certain tumours Med Hypothesis 57(1): 56-58 32 Thomas EL, and Pera AK (1983) Oxygen metabolism of Streptococcus mutans: uptake of oxygen and release of superoxide and hydrogen peroxide, J Bacteriol., 154: 1236-1244 43 33 Ullah H and Ali S (2017) Classification of anti‐ bacterial agents and their functions Chapter in Antibacterial Agents book Intech publishing house 34 White T J., Bruns T D., Lee S B., Taylor J W., 1990 Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 18: 315 35 Yang, J., Chen, L., Wang, L., 2007 the Trichophyton rubrum Expression Database BMC Genomics 8: 250 44