Nghiên cứu các chất kháng khuẩn và kháng nấm tạo bởi vi nấm nội sinh được phân lập từ các cây thuộc họ Cam (Rutaceae).pdf

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐÈ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2015 - 2016 Tên đề tài: Nghiên cứu chất kháng khuẩn kháng nấm tạo vi nấm nội sinh phân lập từ thuộc họ Cam (Rutaceae) Số hợp đồng: 2015.01.09/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: VÕ THỊ NGỌC MỲ Đơn vị công tác: Khoa Dược Thời gian thực hiện: Tháng 01/2015 - Tháng 12/2015 TP Hô Chỉ Minh, ngày tháng năm CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành BÁO CÁO TỎNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH DÀNH CHO CÁN Bộ - GIẢNG VIÊN 2015 - 2016 Tên đề tài: Nghiên cứu chất kháng khuẩn kháng nấm tạo bôi vi nấm nội sinh phân lập từ thuộc họ Cam (Rutaceae) Sổ hợp đồng: 2015.01.09/HĐ-KHCN Chủ nhiệm đề tài: Vỗ Thị Ngọc Mỳ Đơn vị công tác: Khoa Dược Thời gian thực hiện: Tháng 01/2015 - Tháng 12/2015 Các thành viên phổi họp cộng tác: STT Họ tên Chuyên ngành Cơ quan công tác Lê Thị Thu Trang Vi sinh Khoa Dược Ký tên MỤC LỤC l TÓNG QUAN MỤC TIÊU VÀ CÁC NỘI DUNG NGHIÊN củu QUÁ TRÌNH THỤC HIỆN CÁC NỘI DUNG KẾT QUẢ VÀ SẢN PHÁM ĐÃ ĐẠT Được .10 KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 17 TÀI LIỆU THAM KHẢO 18 PHỤ LỤC: (Danh mục báo, báo khoa học) 21 TÓM TẮT (ABSTRACT) Họ Cam (Rutaceae) có nhiều ứng dụng việc điều trị bệnh Thân, cành, vỏ họ chứa nhiêu tinh dâu, hứa hẹn nơi cung câp môi trường sông hữu ích cho nhóm vi sinh vật nội sinh khác phát triên Nghiên cứu sàng lọc chủng vi sinh vật nội sinh từ họ Cam (Rutaceae) khảo sát điêu kiện nuôi chủng vi nâm nội sinh A.terreus TL3-Q phân lập từ gân quýt Citrus reticulata Blanco.; xác định hoạt tính kháng khuân, kháng nâm băng phương pháp khuêch tán qua khoanh thạch thừ kháo sát điêu kiện nuôi cấy tối ưu Nghiên cứu xác định thành phần môi trường toi ưu điều kiện thích hợp cho A terreus TL3-Q sàn sinh hoạt chât biên dưỡng kháng Staphylococcus aureus MRSA tơt nhât, ngn cacbon thích hợp mơi trường khoai tây 300g/l, glucose % pH môi trường 7; điêu kiện nuôi tĩnh; thời gian thu nhận hoạt chât thích họp ngày Từ khóa: Rutaceae, Aspergillus terreus, endophyte, vi nấm nội sinh TÓNG QUAN 1.1 Các nghiên cứu nước ngồi Đã có nhiều nhà khoa học sâu nghiên cứu ve endophyte mô cúa thực vật Phan lớn lồi endophyte có hoạt tính sinh học, tạo chất kháng sinh quan trọng đe ngăn chặn xâm nhập vi sinh vật gây bệnh chù, có lâm nghiệp nơng nghiệp Vì vậy, việc nghiên cửu vai trị chủng endophyte vấn đe quan trọng nhiều nước giới quan tâm Năm 1955, the giới chì tìm 500 chất kháng sinh 20 năm sau, năm 1975 tìm 5.000 chất kháng sinh Theo Berdy, năm 1984 the giới biết 13.000 chất kháng sinh sán xuất từ thiên nhiên Theo đó, từ năm 1990, Taxomyces andreanae lần đau tiên ly trích từ Taxus brevifolia, vi nấm sản xuat paclitaxel - chat ức che thoi phân bào q trình phân chia te bào, có phổ khối tương tự paclitaxel chiết xuất từ Thông đỏ (Taxus) Một số nhà khoa học nghiên cứu khu hệ nấm nội sinh thuộc chi Thơng tìm thấy hoạt chất Taxol (một hoạt chất sừ dụng hiệu điều trị bệnh ung thư buồng trứng, ung thư vú) nam nội sinh tổng hợp Chi Thông dở (Taxus) nguồn giàu nam nội sinh Năm 1995 - 1996, nhà nghiên cứu phân lập hàng trăm loài nam nội sinh từ Thơng đị Châu Âu, Châu Á Bắc Mỹ Có the nói Thơng đị kho báu chứa nhiều vi sinh vật chưa phát đáng ý, chúng tương tác với với chù Những nấm biết có tong hợp taxol gồm: Taxomyces andreanae, Pestolotiopsis microspora Ngồi ra, thơng qua bang chứng miễn dịch học, người ta phát tổng họp taxol nhiều nấm nội sinh khác phân lập từ Thơng đị Taxus brevifolia, bao gôm nhiêu chủng cùa Penicillium sp., Pestalotiopsis sp Trimcatella sp Bảng Một số endophyte sản xuất paclitaxel STT Endophyte Ngn ly trích Pestalotiopsis microspora Taxus wallichiana Pestalotiopsis guepini Wollemia nobilis (cây quý hiêm) Seimatoantlerium Maguireothamnus sprcỉosus Năm 1995, Willson cho vi khuân nội sinh vi khuân tiên nhân sông mô cùa thực vật mà không gây bệnh cho chủ Vi khuẩn nội sinh tìm thay nhiều lồi giong loài vi khuẩn song đất, nước như: Pseudomonas, Bacillus Azospirillum Năm 1999, Miss Yuparet Puangmali phân lập tuyển chọn số lồi vi khuẩn sống mơ cỏ có khả sàn xuất enzym L-asparaginase Tác giả phân lập 657 loài vi khuẩn từ thân thảo đe sàn xuất L-asparaginase Trong ơng tìm 220 lồi vi khuẩn có hiệu lực mạnh đe thừ nghiệm Nhóm vi khuấn hoạt động đe sinh enzym L-asparaginase 50.24 mU/ml hoạt động có hiệu 202.58 mU/ml, ứng dụng bang cách tiêm chùng vi khuẩn vào đe xúc tiến sinh trường kiểm sốt bệnh Các thí nghiệm ông với cà chua dưa chuột đem lại hiệu quà ức che số loại mầm bệnh giảm mức độ bị bệnh Năm 2000, Jinwi Kim tách chất ức che p-lactamase từ vi khuẩn sổng mô thực vật Tác già phân lập tuyển chọn vi khuẩn sống mơ cùa 25 lồi thực vật khác phân lập 600 chủng vi khuẩn Trong tìm 10 chùng có hiệu lực cao, chùng: KJ3, Z3, pọ, RV2, HL2, CL21, PG5, GB5, GB18, AS3, S21 có khà chống lại hoạt động cũa nấm men Candida albicans, chúng vi khuẩn Z3, RV2 có khả sinh chất kháng sinh p-lactamase Chùng vi khuẩn Z3 lựa chọn đe sản xuất với quy mô lớn Chùng Z3 phân lập từ thân rễ cùa Gừng chong lại nam c.albicans, không chống lại nam Aspergillus nấm Fusarium Năm 2000, Strobel cộng nghiên cứu vai trò cùa vi nam nội sinh Streptomyces sp chủng NRRL 30562 ly trích từ Kennedia nigriscans, sàn xuất kháng sinh phổ rộng munumbicins, kháng vi khuẩn Gram (+) Bacillus anthracis, M tuberculosis đa kháng so vi khuẩn kháng thuốc khác Steptomyces sp chùng NRRL 30562 phát triển Grevilea pteridifolia phát triển úc, sản xuất kháng sinh kakadumicins echinomycin cho tác động kháng pfalciparum với LD50=7-10ng/ml Năm 2001, Tan Zou chứng minh vi nấm nội sinh công nhận nguồn phong phú chất chuyển hóa cho hoạt tính sinh học Năm 2002, L Araujo cộng tiến hành biện pháp phòng trừ sinh học việc sữ dụng sản phẩm trao đối chất cũa vi khuẩn Bacillus sp., phân lập từ mơ thực vật ịng cộng sâu vào nghiên cứu lồi vi khuẩn sống mơ thực vật đe tìm chất kháng sinh có kiềm che nguồn gây bệnh phương pháp sinh học nhằm làm giảm bớt tác động đến môi trường, người sử dụng nhiều chất hoá học đe phịng trừ bệnh trùng gây hại cánh đong Với phương pháp nhóm cùa ơng phân lập tuyển chọn so chúng vi khuẩn nội sinh lựa chọn giong cam, quýt nghiên cứu đe tìm chất kháng sinh có hiệu lực cao việc phịng trừ nấm bệnh Năm 2003, Strobel cộng nghiên cửu chùng vi nấm nội sinh Cryptospriopsis quercina ly trích từ Tripterigeum wilfordii, vi nấm có the sản xuất cryptocandin cryptocin Trong đó, cryptocandin kháng số vi nấm gây bệnh cho người Candida albicans, Trichophyton spp chống so nấm gây bệnh thực vật Sclerotinia sclerotiorum Botrytis cinerea Cryptocin có tác dụng kháng Pryriaria oryzae số vi nấm gây bệnh thực vật Cùng nãm 2003, T Taechowisan s.lumyong nghiên cứu endophyte có hoạt tính kháng nấm từ rề Zingiber officinale Alpinia galanga Năm 2006, N.S.H.Raviraja cs khả kháng nấm cùa vi nấm nội sinh từ dược liệu mien Tây Ân Độ Năm 2012, Agnes Joseph Aswathy cộng nghiên cứu ve endophyte Nghệ (Curcuma longa) Các chất dinh dưỡng thân rễ cứa Nghệ mơi trường sống đa dạng cho nhóm vi khuẩn khác Một số vi khuẩn nội sinh liên quan có the thúc đẩy tăng trưởng Trong nghiên cứu này, hai endophyte Paenibacillus sp phân lập từ thân rễ cù Nghệ câ hai chùng tìm thấy có khả đe sàn xuất IAA qua phân tích HPLC 1.2 Các nghiên cứu nước Từ năm 1994, nhà nghiên cứu phân lập chủng nấm nội sinh từ vỏ Thơng đị; định tên cùa chững nấm Đây lồi thực vật đặc hữu có Việt Nam, từ lâu nhân dân ta sữ dụng vị thuốc Chúng thường phân bố Pà Cị, Mai Châu, Hịa Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh, Phú Yên, Khánh Hòa, chủ yếu Lâm Đồng Trong đáng ý chùng nam Pestalotiopsis maculans (corda) NagRai có mặt tất mầu vỏ Thông đỏ lấy mẫu Chúng phù hợp với hình thái chúng nấm Pestalotiopsis sp tìm thấy vỏ Thơng đở Mỳ nhà khoa học tiến hành lên men, nuôi cấy, chiết rút, chạy sắc kí bân móng với chất taxol chuẩn Năm 2002, Phạm Quang Thu sừ dụng endophyte có khả ức che phát triển cùa nấm gây bệnh rừng, tác già sâu vào nghiên cứu khả tương tác cùa vi sinh vật có khả ức che sinh vật gây bệnh với loài sinh vật đặc thù khác vi sinh vật phân giài lân, vi sinh vật kích thích sinh trưởng, vi sinh vật cố định đạm hội sinh cộng sinh, vi sinh vật đối kháng với nấm gây bệnh đe tạo che phẩm hỗn họp gọi “phân vi sinh chức năng” Phân vi sinh chức nghiên cứu sản xuất thử cho đối tượng như: Bông, Đậu, Cà chua, Điều số khác Keo, Thông nhựa, Thông mã vĩ Năm 2005, Lê Mai Hương cộng phân lập, sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn cùa 45 mẫu lấy vùng Yên Tữ, Hà Nội vườn thuốc Mê Linh thu 89 chùng vi nấm nội sinh có 32 chùng có hoạt tính kháng sinh (chiếm 36%); 20 chủng có hoạt tính kháng nấm kháng khuẩn (chiếm 22,5% tong số), 26 chùng có hoạt tính kháng khuẩn (chiếm 29,2 % tong số), 27 chúng có hoạt tính kháng nấm (chiếm 30,33% tong so chùng phân lập) Từ 32 chùng có hoạt tính, bàng phương pháp lên men tách chiết sơ chọn chúng có hoạt tính mạnh, hoạt phổ rộng, đặc biệt chúng có kí hiệu N2 phân lập từ họ Chịm có hoạt tính cao nhất, kháng Bacillus subtilis (ATCC25922) Fusarium oxyporum Năm 2006, Nguyền Hoàng Nghĩa, Phạm Quang Thu tìm hiểu ve vai trị cùa vi khuẩn nội sinh che kháng bệnh loét thân, cành nam Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc gây bệnh hại keo lai Năm 2009, Trần Thị Như Hằng cộng nghiên cứu vi nấm nội sinh Kho sâm (Croton tonkinensis Gapnep.) Bùm bụp (Mallotus paella Lour.) thu chùng nam Trỉchoderma konỉlangbra KS14 sán sinh chat ergosterol, ergosterol peroxide, sorbicillin cho hoạt tính kháng vsv, độc te bào, chống oxy hóa hoạt tính enzyme ngoại bào; sorbicillin cho hoạt tính kháng s.aureus với MIC=25mg/ml Chat ergosterol peroxide bieu hoạt tính độc te bào mạnh với dòng tế bào thứ ung thư gan, ung thư màng tứ cung ung thư màng tim Năm 2010, Nguyền Đinh Nga cộng sàng lọc chùng vi nấm nội sinh thực vật Ngũ sac (Lanata camara L.) thu chùng Pseudeurotium NS-T1 kháng c.albicans, Mã de (Plantago major L.) thu chủng Fusarium MĐ-TR1 MĐ-TR3 cho hoạt tính kháng c.albicans MRSA, Tía tơ (Perilla ocymoides L.) thu chủng Trichoderma TT-L1 kháng c.albicans MRSA, Trầu (Piper betle L.) thu chùng Fusarium TR-T1 kháng c.albicans Năm 2010, nhà nghiên cứu thuộc phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học Họp chất Thiên nhiên đưa biểu đồ ve quy luật phân bố cùa chùng nấm nội sinh phận cùa Thông đỏ (Taxus wallichiana) Sàng lọc sơ hoạt tính kháng sinh chủng phân lập được, từ 157 chủng nam nội sinh sàng lọc 68 chững có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ) tương đối cao Thứ hoạt tính sinh học cùa dịch chiet 68 chùng nấm nội sinh, đáng ý có 17 mẫu (25%) có hoạt tính gây độc với dịng te bào ung thư mẫu chiết chủng SHT4, SHT6, SHT9 Với kết quà đạt được, dự án góp phần tích cực vào cơng tác bào ton phục hoi hữu hiệu lồi Thơng q bị đe dọa tuyệt chủng Việt Nam, đồng thời giúp nhà quân lý hiểu biết tốt vai trò cùa nấm nội ký sinh sản phẩm cùa chúng việc hồ trợ điều trị bệnh ung thư Các nhà khoa học tìm thấy nhiều chất có hoạt tính sinh học tạo endophyte trình chúng ton phát triển, số chùng endophyte có hoạt tính sinh học cao, tạo chất kháng sinh quan trọng đe ngăn chặn xâm nhập cùa sinh vật gây bệnh gây đoi với chủ, có thuộc lâm nghiệp, nông nghiệp ăn Hiện the giới có nhiều nghiên cứu vai trò ứng dụng cùa endophyte việc phịng trừ bệnh trùng gây hại, sản xuất kháng sinh ức che khối u sàn xuất chất có hoạt tính sinh học khác Tìm kiểm khám phá hoạt chất đích ngắm mà nhà nghiên cứu sinh dược học không ngừng vươn tới MỤC TIÊU VÀ CÁC NỘI DUNG NGHIÊN cúu Theo thống kê Tổ chức Y te The giới (WHO) có khoảng 80% dân so giới, chù yếu từ nước phát triển dựa vào loại thuốc truyền thống (nguồn gốc từ thực vật) đe chăm sóc sức khỏe Trong 119 loại hợp chất hóa học, 90 loại có nguồn gốc từ thực vật, loại thuốc sữ dụng ngày nhiều nhiều quốc gia (theo Balick cộng sự, 1996) Hiện có nhiều chất chiết xuất từ có tác dụng chữa bệnh, vấn đe đặt chất có hoạt tính sinh học sinh kết cúa mối liên hệ tương sinh với vi nấm nội sinh có ích mơ thực vật Nhiều nghiên cứu cho thay cộng sinh mô thực vật, vi nấm nội sinh sàn sinh nhiều chất có hoạt tính sinh học kháng khuẩn kháng nam Ớ quy mô rộng, vi nấm nội sinh có tác động quan trọng nơng nghiệp, rừng quan tâm nghiên cứu tiềm cùa chúng có ý nghĩa lớn lĩnh vực y học, nông nghiệp công nghiệp Nhiều công trình nghiên cứu thực vật người cho thấy tinh dầu cùa vỏ họ Cam (Rutaceae) có tác dụng an than, chữa cảm cúm Từ đặc tính cho thấy, tiềm cùa họ chứa hệ endophyte phong phú, tiết nhiều chất biến dưỡng có ỷ nghĩa việc điều trị bệnh Tuy vậy, cho đen nay, Việt Nam nói riêng the giới nói chung chưa cỏ nhiều nghiên cứu ve endophyte loài thuộc họ Rutaceae Do đó, việc nghiên cứu tìm kiếm chủng vi nấm nội sinh có khâ tạo chất biến dưỡng có lợi có khà sản sinh chất có hoạt tính sinh học với hy vọng dùng đe điều trị bệnh cho người công việc thú vị nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Từ chúng tơi thực đe tài: “Nghiên cúu chất kháng khuẩn kháng nấm tạo vi nấm nội sinh phân lập từ thuộc họ Cam (Rutaceae)” với mục tiêu tìm chùng vi nấm nội sinh có hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm cao họ thực vật QUÁ TRÌNH THỤC HIỆN CÁC NỘI DUNG 3.1 Lấy mẫu dược liệu: a Đổi tirợng thu mầu: Thực vật nghiên cứu có đặc diem sau két hợp nhiều đặc điểm: • Những tài liệu nghiên cửu có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm • Những thuốc theo kinh nghiệm dân gian sữ dụng đe rửa, chữa trị vet thương lở loét bệnh nấm da b Xác định tên khoa học thực vật: dựa theo tên gọi dân gian, mô tá hình thái cùa thực vật, đặc điểm hoa, quà, hạt (nếu có) phận khác, đe từ có sở đem so sánh với khóa phân loại tài liệu tham khảo chuyên biệt đê xác định tên khoa học thực vật c Nguyên tắc chọn mẫu: • Chọn khỏe mạnh, khơng cịi cọc, không bị sâu hại hay biểu bệnh đốm lá, úng • Thu tất cà phận rễ, thân, cành, lá, hoa cùa họ thực vật nghiên cứu Mầu sau thu hái rừa vòi nước, đe nơi khơ mát sau xừ lý phải giữ nhiệt độ thấp (khoảng °C) vòng 24 kịp xữ lý 3.2 Phưomg pháp xử lý mẫu: Mầu xứ lý PTN, điều kiện vô trùng tù cấy Chủ ỷ: Kích thước vị trí cắt đe đưa mẫu vào ly trích vi nấm nội sinh: • Rễ: cắt thành đoạn dài lem • Lá: cắt thành mảnh vng diện tích 1x1 cm, vị trí dọc gân lá, bên thịt vị trí đầu, giữa, cuối cuống • Thân cành: cắt bỏ vỏ ngồi dao vơ trùng, chẻ nhò dọc theo thân, cắt thành đoạn dài cm 3.3 Ly trích vi nấm nội sinh: Giai đoạn 1: Mầu sau xứ lý đặt môi trường thạch, không chứa chất dinh dưỡng khác Các vi nấm nội sinh phát triển bang chất dinh dưỡng lấy từ mầu Đĩa thạch đặt mẫu ũ nhiệt độ phòng theo dõi phát triển cùa vi nấm nội sinh khoáng từ 1-2 tuần Vi nam nội sinh phân biệt với vi nấm ngoại nhiễm dựa vào nơi xuất phát khóm nấm khóm vi khuẩn Sau cấy chuyền vi nấm nội sinh sang mơi trường dinh dưỡng thích hợp Từ phân biệt chùng giong khác nhau, ký hiệu chùng Giai đoạn 2: Cấy chuyền vi nấm nội sinh sang mơi trường dinh dưỡng thích họp Dựa vào đặc điểm ve hình thái mơ tả vi học đe gộp chung chủng giống nhau, phân biệt chủng khác ký hiệu chúng Các môi trường thường sừ dụng thạch khoai tây đường (PDA), thạch Czapeck-Dox, thạch Sabouraud (SDA) ủ nhiệt độ phòng theo dõi phát triển cùa vi nấm nội sinh từ 1-2 tuần lâu tùy theo tốc độ phát triển vi nấm nội sinh 3.4 Khảo sát hoạt tính sinh học chủng vi nấm nội sinh Vi nấm nội sinh phóng thích chất biến dường có hoạt tính sinh học vào mơi trường ni cay q trình phát triển Các tác động phát đánh giá bang phương pháp khuếch tán đĩa thạch 3.5 Định danh chủng vi nấm có hoạt tính mức Chi Tên khoa học cùa chúng vi nấm nội sinh cho chất biến dưỡng mơi trường có tác động kháng khuẩn, kháng nam, chống oxi hóa xác định đến mức chi dựa đặc diem vi nấm ❖ Các qui tắc định danh - Chững nấm tuyệt đối khiết (không lẫn nam mốc vsv khác) - Sừ dụng môi trường nuôi cấy có thành phần phù hợp - Quan sát ghi lại đặc diem phân loại cùa chùng vi nam can định danh (đặc diem khuẩn lạc, mặt phải, mặt trái, tốc độ phát triển, đặc điểm vi học ) - Dùng chuyên luận nhóm phân loại đe định loại nấm đen mức chi - Kiểm tra chùng vi nam định danh với chùng nam có sưu tam mầu - Viet tên nhóm phân loại với danh pháp quốc te ❖ Định danh - Định danh sơ kính hiển vi sau nhuộm với Lacto phenol cotton blue de sơ phân loại nam - Cấy nam vào môi trường chuyên biệt - Dựa vào hình thái khuẩn lạc (đường kính, màu sắc, hình dạng ) sắc tố vi nấm tiết môi trường để định danh Các vi nam nội sinh định danh theo khóa phân loại Guy St Germain, năm 1995 3.6 Các phưong pháp khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu đế chủng vi nấm nội sinh sản xuất tối đa hoạt chất sinh học - Khảo sát loại môi trường bàn: PDA, SDA, CDA - Nguôn Cacbon - Nguồn Nitơ ■ KẾT QUẢ VÀ SẢN PHÁM ĐÃ ĐẠT ĐƯỢC 4.1 Kết sàng lọc Họ Cam (Rutaceae) nước ta có 30 chi với 110 loài mang lại nhiều giá trị dược liệu quý giá điển hình khâ kháng khuẩn, kháng nấm.Vì vậy, nham hiểu rõ sứ dụng tốt nguồn dược liệu này, tiến hành nghiên cứu khả kháng khuẩn, kháng nấm cùa vi sinh vật nội sinh với đối tượng vi nam nội sinh họ Cam (Rutaceae) Sau thời gian nghiên cứu thu số chúng endophhyte từ cam, chanh, tắc, bưởi, nguyệt que, quýt thuộc họ Cam (Rutaceae) Trong đỏ, phân lập tất 65 chủng, có 59/65 chúng không cho tác động kháng khuẩn, kháng nấm mong muốn 1/10 chùng từ bười Long An, 1/12 chùng từ tắc Long An, 1/13 chùng từ bưởi Bình Dương, 1/12 chùng từ quýt Lái Thiêu-Bình Dương, 2/4 chúng từ bưởi Vũng Tàu cho tác động kháng khuẩn có 5/6 chúng cho tác động kháng khuẩn vừa 1/6 chùng cho tác động yếu, khơng có chùng cho tác động kháng nấm Bảng 4.1 Ket quà sàng lọc chủng vi nấm nội sinh từ họ Cam (Rutaceae) STT Thực vật Noi lấy mẫu Chủng thu Bưởi-1 Long An 10 10 Chủng kháng khuẩn, kháng nấm Tắc Long An 12 Bưởi-2 Bình Dương 13 Bưởi Vũng Tàu Chanh Long An 12 Chanh-2 Lái Thiêu-BD Lái Thiêu-BD 12 Quýt Nguyệt quế-2 Bình Dương Nguyệt quế-3 Bình Dương 10 Tổng số 65 06 4.2 Kêt thử kháng Chùng vi nấm nội sinh sau sàng lọc môi trường PDA bo sung chloramphenicol 1% ni PDA ngày sau đem thứ hoạt tính mong muốn Bảng 4.2 Ket quà thừ kháng chùng vi nấm nội sinh từ họ Cam (Rutaceae) Chủng Thực vật s aureus S.feacalis Pseudomonas E.colì MRSA Candida 4-44-4GL1-B1 Bưởi-1 TL3-T Tắc - - - - 4-4- - CL3-B2 Bưởi-2 4-4- - - - 4-4- - TL3-Ọ Quýt +4+ + + - Bưởi-3 - 4-4-4- BT2 + + + - + + BC2 Bưởi-3 Chú thích: (+): có tác động kháng khn u; (++); có tác động kháng khn trung bình; (+++): có tác động kháng khuẩn mạnh; (-): khơng có tác động kháng khuẩn Ket thừ kháng thu từ việc thừ hoạt tính chúng vi nấm nội sinh sàng lọc từ họ Cam (Rutaceae) với chùng khuẩn: s aureus, s feacalis, Pseudomonas sp., E coli, MRSA chủng nấm c albicans Thu chủng cho hoạt tính kháng khuẩn, đó: - GL1-B1, CL3-B2, TL3-Q cho thấy khâ kháng s.aureus MRSA; TL3-T chi cho thấy khà kháng MRSA Các chùng BC2 BT2 có phổ kháng khuẩn rộng (kháng chùng vi khuẩn s aureus, s feacalis, E coli, MRSA) nhiên khà sinh hoạt chất kháng khuẩn tưong đối yeu - Chùng TL3-Q có khả nâng sinh hoạt chất kháng s aureus MRSA cao nên chọn chủng đe nghiên cứu chuyên sâu 4.3 Định danh vi nấm nội sinh từ thuộc họ Cam (Rutaceae) cho hoạt tính kháng khuẩn 4.3.1 Chủng GL1-B1 - Chùng GL1 -B1 mang đặc điểm Actinomyces sp Đặc điểm nuôi cấy môi trường PDA Tốc độ tăng trưởng nhanh = 6cm/ ngày khóm nấm trịn, màu trang, dạng nam sợi, xom, sọi nấm màu trang, phát triển môi trường làm cứng môi trường, khuếch tán sắc tố màu vàng nâu sầm, già sợi nấm hóa đen Mặt sau mà sầm 11 Đặc điểm vi thể Sợi nấm mánh, xoan lò xo, phận sinh sản khơng rõ, bào tử có the dạng thẳng, sợi nam có vách ngăn Hình 4.1 Khóm nấm cấy PDA (A: mặt trước; B: mặt sau) 4.3.2 Chủng TL3-T Chùng TL3-T quan sát hình thái kính hiền vi chưa định danh ❖ Đặc điếm nuôi cấy môi trường PDA Tốc độ phát triền nhanh = cm/ ngày, khóm nam trịn màu xámg tang, khơ, sợi nấm dạng bông, sinh sắc tố màu nâu nhạt môi trường phát triển ngày, già khóm nấm chuyển sang màu đen Đặc điểm vi thể Sợi nam to, khơng màu, khơng có vách ngăn, khơng có bào tử, phận sinh sàn không rõ Chưa xác định tên nấm Hình 4.2 Chững TL3-T mơi trường PDA (A: MP; B: MT) 4.3.3 Chủng CL3-B2 - Chủng CL3-B2 mang đặc diem cũa Actinomyces sp Đặc điểm nuôi cấy môi trường PDA Tốc độ phát triển nhanh = cm/6 ngày Khóm nấm trịn, màu trang, sợi nấm to rõ, cứng, xôm nhẹ, già khóm nam chuyển sang màu đen, sinh sắc tố màu vàng nâu môi trường Đặc điểm vi thể Sợi nấm không màu, mành nhỏ, không vách ngãn, xoắn nhẹ, hệ sợi khơng phân nhánh 12 Hình 4.3 Chủng CL3-B2 môi trường PDA (A: MP; B: MT) 4.3.4 Chủng TL3-Q - Chủng TL3-Ọ mang đặc điểm cùa Aspergillus terreus Đặc điểm nuôi cấy môi trường PDA TL3 - Q ni cấy PDA khơng có tơ nấm, có bào từ mịn, mem, rìa màu trắng, mặt sau đậm mặt trước, tiet sac tố mơi trường, có hạt to be mặt Đặc điểm vi thể Sợi nấm có vách ngăn, tồn bào từ đính bên - loại bào từ đính hay hạt đính Phần đĩnh to thành bọng hình chùy, bọng mang the bình Các the bình song song hợp thành cụm đinh bọng The bình có hai tầng Hình 4.4 Khóm nấm PDA (A); Đặc điểm vi thể (B) (A:Mặt trước; B: Mặt sau) 4.3.5 Chủng BT2 Chủng BT2 mang đặc điểm cùa Epicoccum sp Đặc điểm nuôi cấy môi trường PDA Tốc độ phát triển nhanh = cm/ ngày Khóm nấm trịn, màu vàng kem, sợi nấm màu trang mịn, viền màu trắng, thành nhiều vòng sắc tố thay đổi từ ngoài, sinh sac tố vàng nâu khuếch tán môi trường Mặt trái màu vàng sẫm gần nâu Đặc điểm vi thể Sợi nấm có vách ngăn, khơng màu non cho màu nâu trưởng thành Cuống sinh bào từ ngăn Bào từ trân sinh đơn độc giá sinh bào từ trân không rõ rệt, tạo thành đám đông thời hay đơn độc, có đáy rộng Bào từ nhóm cụm nhỏ gọn (khôi bào từ) Bào từ màu nâu, vách thơ, có khơng có vịng Kiểu phát sinh bào từ trần: nảy choi 13 Hình 4.5 Đặc điểm hình thái cùa chủng BT2 4.3.6 Chủng BC2 Chủng BC2 mang đặc điểm cùa Pseuderotium sp Đặc điểm nuôi cấy môi trường PDA Tốc độ phát triển nhanh = 6,5 cm/ ngày Khóm nấm sợi bơng ban đầu khơng màu sau chuyển sang màu xám tro, ngồi rìa có dạng sợi, sợi nam mịn, sinh sắc tổ xanh ngồi mơi trường Mặt trái ban đầu màu xanh đen sau phát triển chuyến sang màu đen Đặc điểm vi thể The q hình cầu đen bầu dục, khơng có lỗ Bào từ sinh sản vơ tính giong Sporothrix sp với cuống sinh bào từ dài, vách trơn, không màu, đinh thon nhọn Các cuống sinh bảo từ họp thành với góc 30 ° Te bào sinh bào từ hình bầu dục, đính chùm bào từ không cuống Bào tử hỉnh bầu dục đen cầu, vách trơn Hình 4.6 Đặc điểm hình thái cùa chủng BC2 4.4 Khảo sát khả phát triển chủng A terreus TL3-Q Chọn chủng A terreus TL3-Q đe nghiên cứu chuyên sâu Nuôi cấy chùng ba loại môi trường PDA, SDA, CDA, nhiệt độ phịng sau ngày ni cấy đo tốc độ phát triển chủng A terreus loại môi trường Bảng 4.3 Tốc độ cùa chững A terreus ba mơi trường sau ngày ni cay Kích thước (cm) PDA SDA CDA Z5 Chúng TL3 - Q có tơc độ phát triên nhanh nhât mơi trường CDA 4.5 Khảo sát khả sinh hoạt chất sinh học điều kiện nuôi cấy khác 4.5.1 Bước đầu khảo sát môi trường phù họp cho nghiên cứu Tien hành nuôi chùng A terreus TL3-Ọ mơi trường PDA, SDA, CDA nhiệt độ phịng sau ngày tiến hành thừ khâ sinh chất biến dưỡng có hoạt tính kháng khuẩn bốn 14 chùng khuẩn: s aureus, S.feacalis, E coli, MRSA thí nghiệm lặp lại lần thu kêt quâ sau: Bảng 4.4 Tác động kháng khuẩn chùng A terreus mơi trường PDA > Đường kính vòng kháng (mm) g aureus s feacalis E coli MRSA PDA 15 0 17.5 SDA 12 0 13 CDA 10 0 10 Trên môi trường PDA chùng A terreus TL3-Q có khả sinh chât kháng khuân cao, ổn định Trên môi trường SDA cùa A terreus có khà sinh chất biến dưỡng kháng khuẩn mức tương đối thấp so với nuôi cấy môi trường PDA Các chùng A terreus CDA có khâ sinh chat biến dưỡng kháng khuẩn chi mức thấp thấp loại môi trường nghiên cứu Khi khảo sát chùng A terreus mơi trường thạch ta có kết sau: PDA môi trường nuôi cấy chủng A terreus cho chất biến dưỡng có hoạt tính kháng khuẩn cao CDA môi trường nuôi cấy chủng A terreus cho chất biến dưỡng có hoạt tính kháng khuẩn thấp 4.5.2 Khảo sát pH mơi trường Từ kết quà có nghiên cứu mơi trường thạch ta có PDA mơi trường ni cấy chúng A terreus TL3-Q cho hoạt chất kháng khuẩn cao Dựa vào thành phần môi trường PDA tiếp tục nghiên cứu nhằm tìm pH tối ưu cùa chùng A terreus TL3-Q nghiên cứu môi trường PDB sau thời gian ngày nuôi cay pH thay đổi từ đen sau thữ khà kháng với s aureus, MRSA, E.coli, s feacalis (thí nghiệm lặp lại lần) Bảng 4.5 Đường kính vịng kháng khuẩn chùng A terreus TL3-Ọ nuôi môi trường có pH thay đổi Vi khuẩn s aureus Đường kính vịng kháng khuẩn (mm) pH pH pH pH pH pH 0 10,5 11 13 11,5 MRSA 11 12,5 14,5 14,5 13 Chùng A terreus TL3 - Q có khà nâng sinh hoạt chât kháng khuân pH ưu pH 4.5.3 Khảo sát nguồn cacbon Với nguồn đường glucose khảo sát nong độ 1%, 2%, 3% với mốc thời gian ngày, ngày, ngày, 12 ngày Với nguồn cacbon saccharose với nồng độ 0.5%, 1%, 2% thử hoạt tính kháng khuẩn sau ngày, ngày, ngày, 12 ngày Sự biến thiên cúa nong độ hoạt chất kháng khuẩn dịch nuôi cấy cùa chùng A terreus TL3-Q theo nong độ glucose, saccharose theo thời gian the qua đường kính vịng kháng khuẩn xác định phương pháp đục lồ thạch chúng khuẩn s aureus, MRS A Và bảng số liệu sau trình bày cố định theo nong độ glucose, thí nghiệm khảo sát lặp lại lần 15 Bảng 4.6 Sự biến thiên nồng độ chất kháng khuẩn dịch nuôi cấy chủng TL3-Q theo nồng độ glucose, saccharose theo thòi gian Glucose Saccharose Khuẩn Ngày 1% 2% 3% 0,5% 1% 2% 17 s aureus 15,5 15,5 0 11,5 11,5 11 0 MRSA 17 s aureus 17 18 15 12,5 14,5 17 17 MRSA 18 18 16 15,5 17 17 s aureus 20 20 17,5 17 20 20 18 19 21 17,5 MRSA s aureus 18 18 18 15 15,5 12 MRSA 22 22 23 16 17 Qua kêt q ta có ni với nguôn đường glucose nông độ 3% sau 12 ngày nuôi cấy cho khà kháng khuẩn cao Nhưng đe phù hợp điều kiện nghiên cứu, kinh te, giâm hao ton ve thời gian chọn nuôi cấy nồng độ 2% glucose sau ngày nuôi cấy Khi nồng độ saccharose 2% khả sinh chất kháng khuẩn A terreus TL3-Ọ đạt mức thấp nong độ nghiên cứu sau ngày nuôi cấy, sau 12 ngày nuôi cấy chất kháng khuẩn khơng cịn ton dịch ni cấy Chùng A terreus TL3-Ọ thích hợp ni mơi trường có glucose 2% sau ngày nuôi cấy đe cho chất kháng khuẩn cao 4.5.4 Nguồn nitơ khoai tây Sau có nguồn carbon tối ưu cho chùng A terreus TL3-Ọ, tiến hành nuôi cấy PDB với nguồn nito khoai tây thay đổi từ 200g/l, 300g/l, 400g/l thử hoạt tính kháng khuẩn sau ngày, ngày, ngày, 12 ngày nuôi cấy thu bảng kết quà sau Với nguồn nitơ đậu nành thực tương tự với nguồn nitơ khoai tây với hàm lượng đậu lg/1, 16.5g/l, 22g/l Ta có bảng két q sau (thí nghiệm lặp lại lan) Bảng 4.7 Sự biến thiên nồng độ chất kháng khuẩn dịch nuôi cấy chủng TL3-Q theo hàm lượng khoai tây, đậu nành theo thòi gian Khoai tây Đậu nành Vi khuẩn Ngày 200 300 400 11 16,5 22 s aureus 15,5 19 12 0 16,5 19 12 0 MRSA 18 s aureus 21 18 0 17 MRSA 21 20 0 s aureus 18 22 18 0 12 19 20 21 12 MRSA s aureus 17 20 16 12 12 14 MRSA 21 21 18 0 Qua kêt khảo sát nguôn nitơ nhận thây: Chùng A terreus TL3-Q cho hoạt tính cao ni với hàm lượng khoai tây 300g/l sau ngày nuôi cay Với nguồn nitơ đậu nành khà kháng khuẩn cùa chùng A terreus TL3-Q thấp KÉT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận 16 Qua trình thực nghiên cứu, thu kết quà sau: Từ loài thực vật thuộc họ Cam (Rutaceae) lấy Long An, Bình Dương, Tp.Hồ Chí Minh, phân lập 65 chùng vi nấm nội sinh có 6/65 chùng cho hoạt tính kháng khuẩn, chưa có chủng cho hoạt tính kháng nấm Trong đó: - Có chùng kháng s.aureus MRSA là: GL1-B1, CL3-B2, TL3-Q - Các chúng BC2 BT2 có phổ kháng khuẩn rộng (kháng chững vi khuan s aureus, s feacalis, E coli, MRSA) nhiên khả sinh hoạt chất kháng khuẩn tương đổi yếu - Chùng TL3-Q có khả sinh hoạt chất kháng s aureus MRSA cao nên chọn chủng đe nghiên cứu chuyên sâu - Chùng số TL3-Q cho chất biến dưỡng có tác động kháng khuẩn mạnh cà môi trường ran lẫn môi trường lỏng nong độ đường glucose saccharose khác Vì chủng TL3 - Ọ thích hợp cho nghiên cứu chuyên sâu khà nâng sinh chất biến dưỡng kháng khuẩn cao ổn định loại môi trường + Các điêu kiện nuôi cấy tối ưu cùa chùng A terreus TL3 - ọ phù hợp điều kiện thí nghiệm, kinh te là: môi trường khoai tây 300g/l, glucose % sau ngày nuôi cấy 5.2 Kiến nghị Neu có thêm thời gian nghiên cứu, chúng tơi đề nghị tiếp tục nghiên cứu phần sau: Chiết tách họp chất kháng khuẩn tinh khiết từ dịch nuôi cấy chủng TL3 - ọ điều kiện nuôi cay thích hợp xác định cơng thức cùa chất kháng khuẩn Khảo sát điều kiện nuôi cay giúp sinh hoạt tính chống oxi hóa theo hướng chun sâu Chủ nhiệm đề tài ThS Võ Thị Ngọc Mỹ 17 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Hà Thị Thanh Bình, Nguyền Quốc Khang, Trần Quỳnh Hoa (2005), “ Khảo sát tác dụng kháng khuẩn chống viêm thực nghiệm flavonoid chiết từ chè - Camellia sinensis, Lind! O.Kuntze” Tạp chí dược học, sơ 352, tr 17 Trương Vãn Châu, Tran Hong Quang, Đỗ Ngọc Liên, (2004), “Đặc tính kháng khuẩn cùa so chat phenolic số loài thuộc chi Gacinia L ”, Tạp chi sinh học, số (28), tr 5962 Tài liệu tiếng Anh Barnett HL, Hunter BB 1998 - Illustrated Genera of Imperfect Fungi APS Press, St Paul, Minnesota, USA Barroso G M, Guimaraes E F., Ichaso c L F., Costa c G., Peixoto A L., Lima H c., (1986), “Sistemática de Angiospermas Brasil”, Universidade Federal de Viẹosa: Imprensa Universitária, Viqosa, Brazil, 3, pp 326 Biswajit Batabyal , Gautam K R., Kundu and Shibendu Biswas, (2012), “MethicillinResistant Staphylococcus Aureus: A Brief Review”, I Res J Biological Sci, Vol 1(7), 65-71 Carmichael JW, Kendrick BW, Conners IL, Lynne s 1980 - Genera of Hyphmycetes The University of Alberta Press, Edmonton, Alberta CA Esterhuizen L L., Meyer R., Dubery I A., (2006), “Antimicrobial compounds from Coleonema album (Rutaceae)”,z Naturforsch c,61(7-8), pp 489-98 Franẹois L., Mayer , Duncan Wilson , Bernhard Hube, (2013), “Candida albicans pathogenicity mechanisms”, Virulence, 4(2): 119-128 Frye A., Haustein c., (2007), “Extraction, Identification, and Quantification of Harmala Alkaloids in Three Species of Passifiora”, American journal of undergraduate research, 6(3), pp 19-26 10 Huang Y, Wang J, Li G, Zheng z, Su w 2001 - Antitumor and antifungal activities in endophytic fungi isolated from pharmaceutical plants Taxus mairei, Cephalataxus fortunei and Torreya grandis FEMS Immunology and Medical Microbiology 31, 163-167 11 Khan R., Shahzad s., Choudhary M L, Khan s A., Ahmad A., (2010), “Communities of endophytic fungi in medicinal plant withania somnifera”, Pak J Bot., 42(2), pp 1281-1287 12 p Saravana Bhavan, R Rajkumar, s Radhakrishnan, c Seenivasan, s Kannan, (2010), “Culture and Identification of candida albicans from Vaginal Ulcer and Separation of Enolase on SDS-PAGE”, International Journal of Biology, Vol 2, No 13 Powthong p., Jantrapanukom B., Thongmee A., Suntomthiticharoen p (2013), “Screening of antimicrobial activities of the endophytic fungi isolated from Sesbania grandiflora (L.) Pers", J Agr Sci Tech, 15, pp 1513-1522 14 Ryan KJ; Ray CG, ed (2004) Sherris Medical Microbiology (ed 4.) McGraw Hill ISBN 0-8385-8529-9 15 Sadgrove N J., Gonẹalves-Martins M., Jones G L., (2014 ), “Chemogeography and antimicrobial activity of essential oils from Geijera parviflora and Geijera salicifolia (Rutaceae): two traditional Australian medicinal plants”, Phytochemistry, 104, pp 60-71 18 BÁO CÁO sử DỤNG KINH PHÍ o o o Tổng kinh phí duyệt: 28.000.000 Kinh phí cấp: 14.000.000 Sử dụng kinh phí: liệt kê theo bảng Các khoản chi Cơng lao động, th khốn chun mơn Nội dung Nội dung Nguyên vật liệu / Thiết bị/Dụng cụ - Nguyên vật liệu - Thiết bị dụng cụ Chi khác Tài liệu In ấn Cơng tác phí Tổng cộng Kỉnh phí chi 10.000.000 10.000.000 2.000.000 2.000.000 4.000.000 28.000.000 20 PHỤ LỤC - Danh mục báo, báo cáo khoa học cúa tác già liên quan đến đề tài (đính kèm báo, báo cáo) + Báo cáo hội nghị: “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn vi nấm nội sinh phân lập thân Fortunella japonica (Thunb.) Swingle”, Kỹ yếu Hội nghị Nấm học: Nghiên cứu ứng dụng khu vực Phía Nam, 2014, tr 29 “Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu chùng vi nấm nội sinh phân lập từ Bưởi (Citrus maxima (Burm.) Merr.)”, Kỹ yếu Khoa học - Đào tạo, 2014, tập 1, tr 67, NXB KHKT + Báo cáo khoa học: “Khảo sát điều kiện nuôi cấy chùng vi nấm nội sinh phân lập từ bưởi (Citrus maxima (Burm.) Merr.)” (2015), Tạp chí Dược học, 472 (55), tr 32-37 “Antibacterial activity of the endophytic fungi isolated from Fortunella japonica (Thunb.) Swingle”, Tạp chí Khoa học kĩ thuật (Đã nhận đăng) - Quyết định liên quan đến hướng dần sinh viên làm luận văn (nếu có) - Phiếu đăng ký đe tài - Thuyết minh đe tài - Hợp đồng thực đe tài NCKH (photo bàn ký với Trường) 21 ... đe tài: ? ?Nghiên cúu chất kháng khuẩn kháng nấm tạo vi nấm nội sinh phân lập từ thuộc họ Cam (Rutaceae)” với mục tiêu tìm chùng vi nấm nội sinh có hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm cao họ thực vật... dõi phát triển cùa vi nấm nội sinh khoáng từ 1-2 tuần Vi nam nội sinh phân biệt với vi nấm ngoại nhiễm dựa vào nơi xuất phát khóm nấm khóm vi khuẩn Sau cấy chuyền vi nấm nội sinh sang mơi trường... nội sinh từ 1-2 tuần lâu tùy theo tốc độ phát triển vi nấm nội sinh 3.4 Khảo sát hoạt tính sinh học chủng vi nấm nội sinh Vi nấm nội sinh phóng thích chất biến dường có hoạt tính sinh học vào mơi