(Luận văn) đánh giá khả năng trung hòa độc tốc nọc độc rắn hổ mang (naja naja) bằng kháng thể lòng đỏ (igy) kháng nọc rắn

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN VĂN TÂM lu an n va RẮN HỔ MANG (NAJA NAJA) BẰNG KHÁNG THỂ p ie gh tn to ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TRUNG HÒA ĐỘC TỐ NỌC ĐỘC d oa nl w LỊNG ĐỎ (IGY) KHÁNG NỌC RẮN lu Cơng nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 u nf va an Chuyên ngành: TS Lê Văn Phan ll Người hướng dẫn khoa học: m oi TS Nguyễn Hữu Đức z at nh z m co l gm @ an Lu NHÀ XUÂT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 n va ac th si LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn lu an va n Nguyễn Văn Tâm p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th i si LỜI CẢM ƠN Trong suốt q trình học tập hồn thành luận văn, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ quý báu quý thầy cô, anh chị bạn Với lòng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cám ơn chân thành tới thầy cô giáo khoa Công nghệ Sinh học, thầy cô giáo Học viện Nông nghiệp Việt Nam chia sẻ tri thức tâm huyết để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho suốt thời gian học tập trường lu Đặc biệt xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy TS Lê Văn Phan, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam thầy TS Nguyễn Hữu Đức, Bộ mộn Công nghệ sinh học Động vật, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình bảo, giúp đỡ hướng dẫn suốt trình nghiên cứu thực khóa luận an n va ie gh tn to Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo toàn thể anh chị, bạn Công ty TNHH Một Thành Viên AVAC Việt Nam, đặc biệt anh chị phịng R&D Lab nơi tơi cơng tác tận tình hướng dẫn bảo, chia sẻ giúp đỡ suốt thời gian thực tập p Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, bạn tập thể lớp CH24 CNSHC, người động viên, giúp đỡ vượt qua khó khăn q trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành tốt luận văn oa nl w d Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2017 lu ll u nf va an Tác giả luận văn oi m Nguyễn Văn Tâm z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th ii si MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT VI DANH MỤC BẢNG VII DANH MỤC HÌNH VIII TRÍCH YẾU LUẬN VĂN IX THESIS ABSTRACT X lu PHẦN MỞ ĐẦU an n va Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Phạm vi nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn ie gh tn to 1.1 p 1.4.1 Ý nghĩa thực tiễn w 1.4.2 Ý nghĩa khoa học oa nl PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tình hình tai nạn rắn độc cắn giới việt nam 2.1.1 Tình hình tai nạn rắn độc cắn Thế giới 2.1.2 Tình hình tai nạn rắn độc cắn Việt Nam 2.2 Tổng quan loài rắn độc việt nam 2.2.1 Các loài rắn độc Việt Nam 2.2.2 Độc tố nọc rắn độc 2.2.3 Các triệu chứng lâm sàng rắn độc độc cắn 11 2.2.4 Phương pháp sơ cứu điều trị rắn độc cắn 13 2.3 Tống quan huyết kháng nọc rắn (htknr) 16 2.3.1 Cơ sở miễn dịch học 16 2.3.2 Kháng thể kháng nọc rắn 18 2.3.3 Kháng thể lòng đỏ (IgY) kháng nọc rắn 19 2.3.4 Tình hình nghiên cứu HTKNR Thế giới Việt Nam 21 d 2.1 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th iii si PHẦN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 lu an n va Địa điểm nghiên cứu 24 3.2 Thời gian nghiên cứu 24 3.3 Đối tượng vật liệu nghiên cứu 24 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu 24 3.3.2 Vật liệu nghiên cứu 24 3.4 Nội dung nghiên cứu 26 3.5 Phương pháp nghiên cứu 26 3.5.1 Phương pháp xác định liều gây chết 50% chuột (LD50) 26 3.5.2 Phương pháp gây miễn dịch cho gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn 26 3.5.3 Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch gà với kháng nguyên nọc rắn phản ứng ELISA 27 3.5.4 Phương pháp xác định đặc tính hàm lượng kháng thể lịng đỏ (IgY) kháng nọc rắn 28 tn to 3.1 p ie gh 3.5.5 Phương pháp đánh giá khả trung hòa độc tố nọc rắn hổ mang (Naja naja) kháng thể IgY kháng nọc rắn 30 w PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 Kết 33 4.1.1 Kết xác định liều nọc rắn gây chết 50% chuột (LD50) 33 4.1.2 Kết đánh giá đáp ứng miễn dịch gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn 34 4.1.3 Kết tách chiết kháng thể IgY 37 4.1.4 Kết định lượng hàm lượng kháng thể IgY kháng nọc rắn 37 4.1.5 Kết trung hòa độc tố nọc rắn kháng thể IgY kháng nọc rắn tế bào 38 4.1.6 Kết trung hòa độc tố nọc rắn kháng thể IgY kháng nọc rắn chuột 42 4.2 Thảo luận 43 4.2.1 Đáp ứng miễn dịch gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn hổ mang (Naja naja) 43 4.2.2 Đặc tính hàm lượng kháng thể IgY kháng nọc rắn 45 d oa nl 4.1 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th iv si 4.2.3 Khả trung hòa độc tố nọc rắn hổ mang (Naja naja) kháng thể IgY kháng nọc rắn 46 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 5.1 Kết luận 48 5.2 Kiến nghị 48 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 53 lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th v si DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT lu an Nghĩa tiếng Việt HTKNR Huyết kháng nọc rắn LD50 Lethal Dose 50 FCA Freund’s complete adjuvant FIA Freund’s incomplete adjuvant PBS Phosphate buffered saline µl Microlit µg Microgarm IgY Yolk Immunoglobulin IgG Immuno Globulin G CT50 Killed 50% of the cell ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FBS Fetal bovine serum n va Chữ viết tắt p ie gh tn to oa nl w BSA Bovine serum albumin d Sodium dodecyl sulfate ll u nf va an lu SDS oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th vi si DANH MỤC BẢNG lu an n va Triệu chứng rắn độc cắn thuộc họ rắn hổ 12 Bảng 2.1 So sánh số đặc tính kháng thể (KT) sản xuất từ huyết động vật (IgG) kháng thể sản xuất từ trứng gia cầm (IgY) (Schade, Calzado et al, 2005) 21 Bảng 3.1 Quy trình gây miễn dịch cho gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn 27 Bảng 4.1 Tỷ lệ chết chuột lô chuột thí nghiệm tiêm nọc rắn nồng độ khác 33 Bảng 4.2 Tỷ lệ gà xuất triệu chứng sau gây miễn dịch gà với nọc độc rắn 34 Bảng 4.3 Giá trị OD540 tỷ lệ chết tế bào sử dụng lượng nọc rắn khác đánh giá phương pháp nhuộm Neutral Red 39 Bảng 4.4 Giá trị OD540 tỷ lệ chết tế bào Vero trung hòa độc tố nọc rắn kháng thể IgY – đối chứng 56 ngày tế bào 40 tn to Bảng 2.1 Tỷ lệ chuột chết lượng kháng thể IgY khác trung hòa độc tố nọc rắn 42 p ie gh Bảng 4.5 d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th vii si DANH MỤC HÌNH lu Hình 2.1 Sơ đồ chê gây độc thần kinh qua xi-nap Hình 2.2 Sự truyền loại kháng thể từ huyết sang trứng gà 19 Hình 2.3 Hình thái cấu trúc kháng thể IgG IgY 20 Hình 4.1 Hình ảnh chuột chết lơ thí nghiệm 34 Hình 4.2 Giá trị OD405 mẫu độ pha loãng khác 35 Hình 4.3 Biến động hàm lượng kháng thể gà sau gây miễn dịch với kháng nguyên nọc độc rắn 36 Hình 4.4 Điên di SDS – PAGE kháng thể IgY sau tách chiết 37 Hình 4.6 Hình thái tế bào Vero thí nghiệm nhuộm Neutral Red 41 an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th viii si TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Văn Tâm Tên Luận văn: Đánh giá khả trung hòa độc tố nọc độc rắn hổ mang (Naja naja) kháng thể lòng đỏ (IgY) kháng nọc rắn Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60620301 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu lu Nghiên cứu thực nhằm đánh giá khả đáp ứng miễn dịch gà mái hàm lượng kháng thể thụ động từ gà mái truyền sang trứng kháng nguyên nọc độc rắn hổ mang Naja naja để làm sở cho nghiên cứu sản xuất kháng thể IgY kháng nọc rắn từ lòng đỏ trứng gà an n va Phương pháp nghiên cứu p ie gh tn to Nọc độc rắn gây miễn dịch cho gà mái giai đoạn hậu bị (16 – 18 tuần tuổi) với liều gây miễn dịch dựa vào sở xác định liều gây chết 50% chuột thí nghiệm (LD50) Phương pháp ELISA sử dụng để đánh giá hàm lượng kháng thể kháng nọc rắn có huyết gà kháng thể thụ động từ gà mẹ truyền sang trứng Các phản ứng trung hòa độc tố nọc độc rắn hổ mang (Naja naja) thực mơi trường tế bào chuột thí nghiệm nl w d oa Kết kết luận ll u nf va an lu Độc tính nọc độc rắn hổ mang Naja naja xác định chuột cho kết giá trị LD50 = 1,46µg/g Kết đánh giá hàm lượng kháng thể có huyết phản ứng ELISA cho thấy nồng độ kháng thể gà kháng nọc rắn đạt cao vào ngày 49 kéo dài đến ngày 111 sau gây miễn dịch Hàm lượng kháng thể thụ động từ gà mẹ truyền qua trứng giá trị cao vào ngày 56 sau gây miễn dịch kéo dài đến ngày 91 Kết đánh giá khả trung hòa nọc rắn kháng thể IgY lòng đỏ trứng gà tiến hành chuột Swiss môi trường nuôi cấy tế bào Vero, cho thấy kháng thể IgY tách chiết từ lòng đỏ trứng gà gà gây miễn dịch với kháng nguyên nọc rắn có khả trung hịa độc tố nọc độc rắn (2LD50) chuột Swiss có khả trung hịa 5µg nọc rắn bổ sung vào mơi trường nuôi cấy 104 tế bào Vero Như vậy, với kết cho thấy kháng thể IgY thu từ trứng gà gây miễn dịch với nọc rắn có khả trung hịa độc tố nọc rắn hổ mang (Naja naja) oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th ix si rắn sử dụng phản ứng trung hòa độc tố nọc rắn kháng thể IgY kháng nọc rắn tế bào, thực thí nghiệm xác định lỷ lệ gây chết nọc độc rắn lượng khác tế bào Vero phương pháp nhuộm Neutral Red, bước thực mơ tả phần phương pháp Thí nghiệm lặp lại lần kết xác định tỷ lệ gây chết tế bào nồng độ nọc rắn khác thể bảng 4.3 Bảng 4.3 Giá trị OD540 tỷ lệ chết tế bào sử dụng lượng nọc rắn khác đánh giá phương pháp nhuộm Neutral Red Lần Lần Lần Giá trị OD trung bình Giá trị SD Tỷ lệ chết 0.98 0.87 0.93 0.92 0.05 0% 0.86 0.82 0.85 0.85 0.02 8% 0.72 0.79 0.8 0.77 0.04 17% 0.63 0.64 0.66 0.65 0.01 30% ie 0.49 0.49 0.51 0.5 0.01 46% 0.45 0.42 0.4 0.43 0.03 54% 0.25 0.3 0.25 0.27 0.03 71% 0.11 0.09 0.1 0.1 0.01 89% 0.02 0.02 0.03 0.01 97% u nf 0.01 0.02 0.01 97% 0.01 0.02 0.02 0.01 98% lu Lượng nọc rắn (µg) an n va gh tn to p d oa 0.04 10 0.03 0.02 oi m ll 0.05 va an lu nl w z at nh Quan sát vào bảng 4.3 cho thấy lượng nọc rắn từ – 10µg gây chết hồn toàn tế bào Vero (tỷ lệ gây chết 97% - 98%) so với giếng đối chứng không bổ sung nọc độc rắn Khi giảm lượng nọc độc rắn bổ sung vào giếng tế bào tỷ lệ chết tế bào lượng nọc rắn giảm xuống Theo kết nghiên cứu Oliveira cộng sự, 2001 (Oliveira, de Oca et al 2002) lượng nọc rắn mà gây chết 50% tế bào chọn sử dụng phản ứng trung hòa nọc độc rắn điều kiện invitro Dựa số liệu bảng 4.3 với lượng nọc rắn 5µg có tỷ lệ gây chết tế bào Vero 54% so với giếng đối chứng tế bào chọn để thực z m co l gm @ an Lu cho phản ứng trung hòa n va ac th 39 si 4.1.5.2 Kết trung hòa độc tố nọc rắn kháng thể IgY kháng nọc rắn tế bào Để đánh giá khả trung hòa độc tố nọc rắn kháng thể IgY kháng nọc rắn tế bào, lựa chọn mẫu kháng thể IgY tách chiết từ trứng gà không gây miễn dịch làm đối trứng âm mẫu kháng thể IgY tách chiết từ trứng gà miễn dịch thu nhận vào ngày 56 (tại hàm lượng kháng thể IgY kháng nọc rắn cao nhất) để thực phản ứng trung hịa 5µg độc tố nọc rắn môi trường tế bào Vero, bước thực mô tả phần phương pháp Kết đánh giá khả trung hòa độc tố nọc rắn mẫu kháng thể IgY phương pháp nhuộm Neutral Red thể bảng 4.4 lu Bảng 4.4 Giá trị OD540 tỷ lệ chết tế bào Vero trung hòa độc tố nọc rắn kháng thể IgY – đối chứng 56 ngày tế bào an n va Đối chứng tế Kháng thể IgY trung hịa nọc rắn bào IgY – Âm tính IgY - 56 ngày tn to Giá trị OD540 IgY Nọc rắn 1.128 0.476 0.998 1.023 0.576 Lần 1.134 0.501 0.964 1.019 0.682 1.119 0.524 0.976 1.084 0.724 Giá trị OD540 trung bình 1.13 0.50 0.98 1.04 0.66 SD 0.01 0.02 0.02 0.04 0.08 56% 13% 8% 41% p ie gh Lần d oa nl w Lần lu va an Tỷ lệ chết tế bào ll u nf Kết thu bảng 4.4 cho thấy tế bào bổ sung nọc độc rắn có tỷ lệ chết 41% so với giếng đối chứng tế bào, tỷ lệ gây chết tế bào nọc độc rắn gần tương đương với tỷ lệ tế bào chết (56%) bổ sung hỗn hợp nọc độc rắn kháng thể IgY âm tính (IgY tách chiết từ lòng đỏ trứng gà gà không gây miễn dịch) Ngược lại tỷ lệ chết tế bào giảm rõ rệt bổ sung hỗn hợp nọc độc rắn IgY dương tính (IgY tách chiết từ lòng đỏ trứng gà gà sau gây miễn dịch mũi đầu 56 ngày), tỷ lệ tế bào chết 13% Tỷ lệ tế bào chết gần tương đương với tỷ lệ tế bào chết (8%) bổ sung kháng thể IgY dương tính Kết nghiên cứu cho thấy IgY tách chiết từ lòng đỏ trứng gà gà sau gây miễn dịch mũi đầu 56 oi m z at nh z m co l gm @ an Lu ngày có khả trung hịa độc tố nọc rắn môi trường nuôi cấy tế bào n va ac th 40 si Hình thái tế bào Vero sau nhuộm Neutral Red thí nghiệm thể hình 4.6 lu an Đối chứng tế bào Nọc độc rắn (nồng độ 5µg) n va p ie gh tn to d oa nl w an lu IgY dương tính ll u nf va IgY âm tính + nọc độc rắn oi m z at nh z m co l gm @ IgY dương tính + nọc độc rắn an Lu Hình 4.6 Hình thái tế bào Vero thí nghiệm nhuộm Neutral Red n va ac th 41 si 4.1.6 Kết trung hòa độc tố nọc rắn kháng thể IgY kháng nọc rắn chuột lu Nhằm đánh giá khả trung hòa độc tố nọc rắn chuột, IgY dương tính tách chiết từ lòng đỏ trứng gà gà sau gây miễn dịch mũi đầu 56 ngày sử dụng nghiên cứu Kháng thể IgY dương tính ủ với nọc rắn 37ºC 1h sau tiêm cho chuột theo thứ tự đánh số lô Các lô chuột tiêm nọc độc rắn, lô chuột tiêm dung dịch PBS và lô chuột tiêm kháng thể IgY dương tính coi lơ đối chứng thí nghiệm Lượng nọc rắn sử dụng phản ứng trung hịa có nồng độ 3µg/g trọng lượng thể cho chuột, bước thực mô tả chi tiết phần phương pháp Số chuột lô theo dõi 24h ghi chép lại số chuột chết lơ thí nghiệm kết thể bảng 4.5 an n va Kháng thể IgY (1ml) 200µl 400µl 600µl 800µl 1000µl 5/5 0/5 0/5 5/5 5/5 5/5 3/5 1/5 0/5 5/5 5/5 5/5 5/5 1/5 0/5 5/5 5/5 5/5 4/5 1/5 0/5 5/5 5/5 5/5 4/5 1/5 0% 0% 100% 100% 100% 80% 20% 5/5 0/5 Lần3 5/5 0/5 Trung bình 5/5 Tỷ lệ chết 100% Lượng kháng thể IgY dương tính sử dụng để trung hịa độc tố rắn d oa Lần2 PBS (1ml) nl w Lần1 Nọc độc rắn (3µg) va p ie gh tn to Bảng 4.5 Tỷ lệ chuột chết lượng kháng thể IgY khác trung hòa độc tố nọc rắn an lu 0/5 ll u nf m oi Quan sát kết trình bày bảng 4.5 cho thấy, lô đối chứng nọc độc rắn, chuột tiêm với liều 3µg/g/con có tỷ lệ chết 100% sau 24h theo dõi Đối với lơ thí chuột thí nghiệm tiêm PBS kháng thể IgY khơng có bị chết thời gian theo dõi Quan sát tỷ lệ chết chuột sử dụng lượng kháng thể khác để trung hòa nọc rắn cho thấy, với lượng kháng thể IgY từ 200µl đến 600µl tỷ lệ chết chuột 100% Ở lượng kháng thể sử dụng 800µl để trung hịa nọc độc rắn tỷ lệ chết chuột giảm 80% Tỷ lệ chết chuột giảm cịn 20% lơ thí nghiệm sử dụng 1000µl kháng thể IgY trung hịa với nọc độc rắn Kết nghiên cứu cho thấy kháng thể IgY dương tính có khả trung hịa độc tố nọc độc rắn chuột z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 42 si 4.2 THẢO LUẬN 4.2.1 Đáp ứng miễn dịch gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn hổ mang (Naja naja) lu an n va p ie gh tn to Hiện nay, quy trình để sản xuất huyết kháng nọc rắn từ huyết ngựa phức tạp nọc độc rắn phải xử lý để làm giảm độc tính nọc độc xuống (Devi, Bai et al 2002) Ngoài ra, việc sử dụng kháng thể chống nọc rắn tạo thể ngựa gây dị ứng, suy thận bệnh huyết người nhận Bệnh huyết phản ứng trích huyết ngoại lai vào thể Từ khó khăn sản xuất kháng huyết tương ngựa phản ứng phụ có trình sử dụng dẫn đến việc tìm kiếm phương pháp khác thay (Lomonte, León et al 2009), phương pháp sản xuất kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà Năm 1992, Carroll cộng (Carroll, Thalley et al 1992) người tiên phong việc nghiên cứu trình sản sinh kháng thể kháng nọc rắn từ kháng thể IgY chiết xuất từ lòng đỏ trứng gà đẻ gây miễn dịch với nọc độc Crotalus atrox Kể từ đó, số nhà nghiên cứu thử nghiệm với kháng thể IgY chất thay cho HTKNR từ ngựa điều trị tai nạn rắn độc cắn (Almeida, Kanashiro et al 1998; Paul, Manjula et al 2007; Araújo, Lobato et al 2010; Lee, Lee et al 2016; da Rocha, Fernandez et al 2017) Việc sản xuất kháng thể IgY kháng nọc rắn từ gà đẻ hướng nghiên cứu việc sản xuất kháng thể kháng nọc độc rắn, trình gây miễn dịch ảnh hưởng tới sinh trưởng gà mái không đáng kể Hơn nữa, với liều nọc độc gây miễn dịch thấp sản xuất lượng kháng thể IgY kháng nọc rắn cao trình tinh kháng thể IgY trứng dễ dàng so với việc tinh kháng thể IgG từ huyết (Araújo, Lobato et al 2010) Ngồi ra, kháng thể IgY khơng kích hoạt hệ thống miễn dịch bổ sung động vật có vú không tương tác với thụ thể Fc động vật có vú điều kiện cho phản ứng viêm đó, sử dụng kháng thể IgY gây nên tác dụng phụ (Carlander 2002) Hiện Việt Nam chưa có đề tài nghiên cứu tập trung nghiên cứu sản xuất kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà đặc hiệu cho nọc độc rắn Việt Nam Vì vậy, việc đặt vấn đề nghiên cứu sản xuất kháng thể IgY đặc hiệu nghiên cứu dùng để chữa ca bệnh người rắn độc cắn Việt Nam hướng nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng phương diện khoa học d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu thực tiễn cao n va ac th 43 si lu an n va p ie gh tn to Trên Thế giới, nghiên cứu sản xuất kháng thể kháng nọc rắn từ lòng đỏ trứng gà tiến hành nhiều loại nọc rắn khác Do độc tính, thành phần nọc độc loại nọc rắn phụ thuộc vào tuổi thọ loài rắn khác nhau, điều kiện sinh sống vùng địa lý khác nhau, mùa khác năm (Gold, Dart et al 2002) Trong nghiên cứu này, sử dụng nọc độc rắn hổ mang (Naja naja) sinh sống Việt Nam làm kháng nguyên gây miễn dịch cho gà mái Độc tính nọc độc rắn hổ mang (Naja naja) sinh sống Việt Nam xác định dựa vào giá trị LD50 (liều gây chết 50%) chuột Kết giá trị LD50 chuột theo đường tiêm da nghiên cứu có giá trị 1,46µg/g theo trọng lượng thể So sánh với số liệu giá trị LD50 Stephen Spawls and Bill Branch lồi rắn độc chuột cơng bố giá trị LD50 loài rắn Naja naja nghiên cứu lớn so với giá trị LD50 rắn Naja naja cơng bố trước Spawls cộng (Spawls, Branch et al 1995) (giá trị LD50 0,45 µg/g tiêm da, 0,35 µg/g tiêm tĩnh mạch, 0.315 µg/g tiêm phúc mạc) Tuy nhiên, giá trị LD50 Stephen Spawls and Bill Branch xác định loài rắn hổ mang Naja naja Châu Phi có điều kiện khí hậu khác với Việt Nam nên độc tính lồi rắn Naja naja sinh sống vùng có giá trị khác nhau, điều phù hợp với kết công bố nl w (Gold, Dart et al 2002) d oa Khả đáp ứng miễn dịch gà mái phụ thuộc vào kháng nguyên gây miễn dịch, kháng nguyên cần đảm bảo tính lạ vật chủ, kích thước phân tử đủ lớn, thành phần hố học tính không đồng Nọc độc rắn Naja naja hỗn hợp nhiều protein với đảm bảo yêu cầu kháng ngun có tính sinh miễn dịch Theo cơng bố Brunda cs nọc độc rắn gây miễn dịch gà mái cần đảm bảo tính lạ với ký chủ, kích thước phân tử protein có nọc rắn Naja naja từ 10 – 110kDa (Brunda, Sashidhar et al 2006) Trong nghiên cứu này, nọc độc rắn Naja naja phối trộn với chất bổ trợ FCA/FIA để gây miễn dịch cho gà mái với nồng độ nọc rắn 0,5µg/g trọng lượng thể Đánh giá đáp ứng miễn dịch gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn thông qua mẫu huyết thu thời gian gây miễn dịch 111 ngày Kết đánh giá mẫu huyết phản ứng ELISA cho thấy, độ pha loãng huyết 1:12800, kháng thể kháng nọc rắn có huyết xuất vào ngày thứ 14 sau gây miễn dịch Hàm lượng kháng thể kháng nọc rắn ổn định vào ngày 49 sau gây miễn dịch, kết tương ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 44 si đồng với kết công bố trước (Almeida, Kanashiro et al 1998; Araújo, Lobato et al 2010) Như vậy, gà mái có đáp ứng miễn dịch tốt với kháng nguyên nọc độc rắn Naja naja sống Việt Nam 4.2.2 Đặc tính hàm lượng kháng thể IgY kháng nọc rắn lu an n va p ie gh tn to Phân từ kháng thể IgY có cấu trúc tương tự với kháng thể IgG bao gồm hai chuỗi nhẹ (L) giống hệt hai chuỗi nặng (H) giống thiết kế upsilon, chuỗi chứa vùng biến thiên liên tục (Chiliza, Van Wyngaardt et al 2008) Chuỗi L chứa miền V miền C, chuỗi H chứa miền V bốn miền C (Cυ1, Cυ2, Cυ3 and Cυ4) (Sun, Mo et al 2001; Höltje, Sippl et al 2003) Các vùng Fab, tương tự động vật có vú, chứa vị trí liên kết kháng nguyên, khu vực Fc chứa vị trí phụ trách kích hoạt bổ thể thông qua đường cổ điển, opsonization cho tế bào lympho-phagocytosis tế bào mastcensisation cho phản ứng phản vệ (Schade, Calzado et al 2005) Kích thước kháng thể IgY xác định phương pháp chạy điện di SDS – PAGE cho kết chuỗi nhẹ với dải liên tục kích thước khoảng 18.66 kDa, chuỗi nặng có kích thước khoảng 65.105 kDa mảnh Fab có kích thước 45.359 kDa (Schade, Calzado et al 2005) Mẫu kháng thể IgY kháng nọc rắn nghiên cứu cho kết tương tự với kết cơng bố trước kích thước thành phần kháng thể IgY (Schade, Calzado et al 2005) Kết phân tích hàm lượng kháng thể IgY kháng nọc rắn phản ứng ELISA cho thấy, hàm lượng kháng thể IgY kháng nọc rắn bắt đầu thu từ ngày 35 sau gây miễn dịch có giá trị OD cao so với mẫu kháng thể IgY tách chiết từ lô gà đối chứng (từ gà không gây miễn dịch) hàm lượng kháng thể IgY kháng nọc rắn trứng đạt giá trị cao vào ngày 56 sau gây miễn dịch So sánh thời gian hàm lượng kháng thể kháng nọc rắn cao huyết trứng cho thấy với huyết hàm lượng kháng thể kháng nọc rắn có giá trị cao vào ngày 49, trong trứng 56 ngày sau gây miễn dịch Giải thích khác biệt đó, năm 2008, Daviso cộng công bố kết nghiên cứu thời gian truyền kháng thể IgY thụ động từ huyết sang trứng từ – ngày (Davison, Magor et al 2008) Sự ổn định hàm lượng kháng thể kháng nọc rắn trứng từ ngày 49 đến ngày 91 sau gây miễn dịch Kết nghiên cứu cho thấy, hàm lượng kháng thể kháng nọc rắn trứng gà miễn dịch giảm xuống theo thời gian Do đó, việc tiêm bổ sung kháng nguyên nọc độc cần thiết để trì hàm lượng kháng thể kháng nọc rắn cao trứng d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 45 si 4.2.3 Khả trung hòa độc tố nọc rắn hổ mang (Naja naja) kháng thể IgY kháng nọc rắn Khả trung hòa độc tố nọc rắn kháng thể IgY thu từ trứng gà gây miễn dịch với kháng nguyên nọc rắn tương ứng nhiều nhà khoa học giới chứng minh có hiệu (Thalley and Carroll 1990; Laing, Theakston et al 1992; Almeida, Kanashiro et al 1998) Theo Carroll cs, khả trung hòa kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà kháng nọc rắn mạnh 6,3 lần kháng thể kháng nọc rắn thương mại sản xuất từ huyết ngựa gây miễn dịch với nọc rắn Crotalus atrox tương ứng mạnh gấp lần kháng nguyên nọc rắn Trimeresurus flavoviridis (Carroll, Thalley et al 1992) lu an n va p ie gh tn to Trong nghiên cứu này, chúng tơi đánh giá khả trung hịa độc tố nọc rắn hổ mang (Naja naja) kháng thể IgY thu từ trứng gà gây miễn dịch với kháng nguyên nọc độc rắn hổ mang điều kiện invitro (sử dụng dòng tế bào Vero) invivo (sử dụng chuột thí nghiệm) Trong điều kiện invitro, dòng tế bào Vero sử dụng để đánh giá khả trung hòa kháng thể IgY với nọc độc rắn phương pháp nhuộm Neutral Red Dòng tế bào cho tiếp xúc với nọc độc rắn lượng khác kết cho thấy, với lượng nọc rắn 3µg trở lên tỷ lệ chết tế bào đáng kể Tại giá trị 5µg nọc rắn gây tỷ lệ chết tế bào 54%, giá trị CT50 dùng cho phản ứng trung hòa (Oliveira, de Oca et al 2002) Kết trung hòa độc tố nọc rắn kháng thể IgY từ trứng gà gây miễn dịch với thể tích 100µl/giếng tế bào tỷ lệ chết tế bào 13% so với giếng đối chứng tế bào, đó, mẫu kháng thể IgY đối chứng tỷ lệ chết tế bào 56% Như vậy, với 100µl kháng thể IgY kháng nọc rắn trung hòa độc tố nọc rắn Naja naja d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh với nồng độ 5µg/ 104 tế bào Vero z Trong điều kiện invivo, chuột Swiss sử dụng cho thí nghiệm đánh giá khả trung hòa kháng thể IgY đặc hiệu cho nọc độc rắn Kháng thể IgY từ trứng thu thời điểm 56 ngày sau gây miễn dịch với lượng khác 200µl, 400µl, 600µl, 800µl, 1000µl sử dụng để trung hòa nọc độc rắn với nồng độ 3µg/g trọng lượng thể (giá trị 2xLD50) Lượng kháng thể sử dụng tăng dần cho thấy tỷ lệ chết chuột sau tiêm giảm dần, tỷ lệ chết chuột tiêm hỗn hợp 1000µl kháng thể với nọc độc rắn 20%, đó, tỷ lệ chết chuột sau tiêm lượng 200µl, 400µl, 600µl 100% Tại m co l gm @ an Lu n va ac th 46 si lơ thí nghiệm chuột tiêm PBS kháng thể IgY tỷ lệ chết 0%, kết cho thấy PBS kháng thể IgY nguyên nhân gây chết chuột Dựa vào kết đánh giá khả trung hòa nọc độc rắn kháng thể IgY kháng nọc rắn tế bào chuột thí nghiệm cho thấy kháng thể IgY thu từ trứng gà gây miễn dịch với kháng nguyên nọc độc rắn hổ mang (Naja naja) có khả chống lại tác nhân gây độc nọc độc rắn lu an n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 47 si 16 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Với kết trình bày, chúng tơi xin đưa số kết luận sau: lu an n va p ie gh tn to - Gà mái giai đoạn hậu bị gây miễn dịch với kháng nguyên nọc rắn hổ mang Ấn Độ (Naja naja) liều 0,5µg/g (trọng lượng thể), sau 14 ngày gây miễn dịch gà có đáp ứng miễn dịch tốt với kháng nguyên nọc rắn, hàm lượng kháng thể kháng nọc rắn huyết đạt giá trị cao sau 49 ngày gây miễn dịch - Hàm lượng kháng thể IgY kháng nọc rắn trứng gà có hiệu giá cao vào ngày 56 sau gây miễn dịch - Kháng thể IgY tách chiết từ lòng đỏ trứng gà gà gây miễn dịch với kháng nguyên nọc độc rắn có khả trung hịa độc tố nọc rắn với nồng độ 5µg/104 tế bào Vero - Trên chuột thí nghiệm, với lượng kháng thể IgY kháng nọc rắn chứa 1000µl dịch kháng thể có khả trung hịa độc tố nọc rắn với nồng độ w 3µg/g trọng lượng thể oa nl 5.2 KIẾN NGHỊ d Sau trình thực đề tài, chúng tơi có số kiến nghị sau: lu ll u nf va an - Cần thu thập nọc độc rắn hổ mang (Naja naja) sinh sống vùng khác thời gian khác để đánh giá cách tổng thể độc tính nọc độc rắn hổ mang (Naja naja) sinh sống Việt Nam - Cần có nghiên cứu quy trình gây miễn dịch điều kiện chăm sóc cho gà mái để thu trứng có hàm lượng kháng thể IgY kháng nọc rắn cao - Tiếp tục thử nghiệm khả trung hòa độc tố nọc rắn hổ mang kháng thể IgY kháng nọc rắn động vật bậc cao Mục đích cuối cùng, sử dụng kháng thể IgY kháng nọc rắn việc điều trị cho nạn nhân bị rắn oi m z at nh z gm @ m co l độc hổ mang (Naja naja) cắn an Lu n va ac th 48 si 17 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: lu an n va p ie gh tn to Đặng Thị Xuân Nguyễn Thị Dụ (2005), "Tình hình ngộ độc cấp Trung tâm Chống độc BV Bạch mai 2001 - 2003", Hội nghị toàn quốc HSCC Chống độc lần thứ V, Đà Nẵng 15 - 16/8/2005 tr 407 – 413 Nguyễn Anh Tuấn (2010), "Nghiên cứu điều trị hạ Natri máu bệnh nhân bị rắn cạp nia cắn dung dịch Natriclorua 2% Trung tâm chống độc Bệnh viện Bạch Mai", Luận văn Thạc sĩ Y khoa, Đại học Y Hà Nội Nguyễn Kim Sơn (2008), "Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng điều trị bệnh nhân bị số rắn độc cạn cắn thuộc họ rắn hổ miền Bắc Việt Nam", Luận án tiến sỹ Y học Trường Đại học Y Hà Nội Nguyễn Quốc Thắng, Trần Kiên (1995) "Các loài rắn độc Việt Nam." Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Trịnh Kim Ảnh Trịnh Xuân Kiếm (1997), "Nghiên cứu sản xuất huyết kháng nọc rắn hổ đất, ứng dụng điều trị lâm sàng", Cơng trình nghiên cứu cấp Bộ Y tế - BV Chợ Rẫy 1997 Vũ Văn Đính Nguyễn Kim Sơn (1998), "Thơng báo bệnh nhân rắn độc nhập viện Khoa săn sóc tăng cường A9 - BV Bạch Mai", Tài liệu tóm tắt Hội nghị rắn độc điều trị nạn nhân rắn độc, BV Chợ Rẫy - TP Hồ Chí Minh Vũ Văn Đính Nguyễn Kim Sơn (2004), " Rắn độc, Hồi sức cấp cứu toàn tập", Nhà xuất Y học, Hà Nội tr 433 - 437 oa nl w Tiếng Anh: d Aguilar, I., E E Sanchez, M E Giron, A Estrella, B Guerrero and F A Rodriguez-Acosta (2014) "Coral snake antivenom produced in chickens (Gallus domesticus)." Revista Instituto de Medicina Tropical de São Paulo 56(1): 6166 Akita, E and S Nakai (1992) "Immunoglobulins from egg yolk: isolation and purification." Journal of food science 57(3): 629-634 Alirol, E., S K Sharma, H S Bawaskar, U Kuch and F Chappuis (2010) "Snake bite in South Asia: a review." PLoS neglected tropical diseases 4(1): e603 Almeida, C., M Kanashiro, F F Rangel, M Mata, T Kipnis and W D da Silva (1998) "Development of snake antivenom antibodies in chickens and their purification from yolk." The Veterinary Record 143(21): 579-584 Arẳjo, A., Z Lobato, C Chávez-Olórtegui and D Velarde (2010) "Brazilian IgY-Bothrops antivenom: Studies on the development of a process in chicken egg yolk." Toxicon 55(4): 739-744 Borenfreund, E and J A Puerner (1985) "Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption." Toxicology letters 24(23): 119-124 Brunda, G., R Sashidhar and R Sarin (2006) "Use of egg yolk antibody (IgY) ll u nf oi m 10 va an lu z at nh 11 z m co l an Lu 14 gm 13 @ 12 n va ac th 49 si 15 16 17 18 lu 19 an va n 20 tn to 21 p ie gh as an immunoanalytical tool in the detection of Indian cobra (Naja naja naja) venom in biological samples of forensic origin." Toxicon 48(2): 183-194 Carlander, D (2002) Avian IgY Antibody: in vitro and in vivo, Acta Universitatis Upsaliensis Carroll, S B., B S Thalley, R Theakston and G Laing (1992) "Comparison of the purity and efficacy of affinity purified avian antivenoms with commercial equine crotalid antivenoms." Toxicon 30(9): 1017-1025 Chiliza, T E., W Van Wyngaardt and D H Du Plessis (2008) "Single-chain antibody fragments from a display library derived from chickens immunized with a mixture of parasite and viral antigens." Hybridoma 27(6): 413-421 da Rocha, D G., J H Fernandez, C M C de Almeida, C L da Silva, F C Magnoli, O E da Silva and W D da Silva (2017) "Development of IgY antibodies against anti-snake toxins endowed with highly lethal neutralizing activity." Eur J Pharm Sci 106: 404-412 David, A (2005) "Guidelines for the clinical management of snake-bites in the south-east Asia region." World Health Organization, Regional Office for South East Asia, New Delhi: 1-67 Davison, F., K E Magor, B Kaspers, D Fred and A Karel (2008) "Structure and evolution of avian immunoglobulins." Avian immunology 1: 107-127 de Almeida, C M C., C L da Silva, H P Couto, R d C M Escocard, D G da Rocha, L de Paula Sentinelli, T L Kipnis and W D da Silva (2008) "Development of process to produce polyvalent IgY antibodies anti-African snake venom." Toxicon 52(2): 293-301 Devi, C M., M V Bai, A V Lal, P Umashankar and L K Krishnan (2002) "An improved method for isolation of anti-viper venom antibodies from chicken egg yolk." Journal of biochemical and biophysical methods 51(2): 129-138 Devi, C M., M V Bai, A V Lal, P R Umashankar and L K Krishnan (2002) "An improved method for isolation of anti-viper venom antibodies from chicken egg yolk." J Biochem Biophys Methods 51(2): 129-138 Gold, B S., R C Dart and R A Barish (2002) "Bites of venomous snakes." New England Journal of Medicine 347(5): 347-356 Ha, T H., J Hojer, X K Trinh and T D Nguyen (2010) "A controlled clinical trial of a novel antivenom in patients envenomed by Bungarus multicinctus." J Med Toxicol 6(4): 393-397 Ho, P L., M B Soares, T Maack, I Gimenez, G Puorto, M d F D Furtado and I Raw (1997) "Cloning of an unusual natriuretic peptide from the South American coral snake Micrurus corallinus." The FEBS Journal 250(1): 144-149 Höltje, H., W Sippl, D Rognan and G Folkers (2003) "Introduction to comparative protein modeling." Molecular Modeling: Basic Principles and Applications Kularatne, S., B Budagoda, I Gawarammana and W Kularatne (2009) "Epidemiology, clinical profile and management issues of cobra (Naja naja) bites in Sri Lanka: first authenticated case series." Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 103(9): 924-930 ll oi m 25 u nf 24 va an lu 23 d oa nl w 22 z at nh 26 z m co l gm 28 @ 27 an Lu n va ac th 50 si 29 30 31 32 33 lu an 34 va n 35 tn to 36 p ie gh 37 Laemmli, U K (1970) "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4." nature 227: 680-685 Laing, G., R Theakston, R Leite, W D Da Silva and D Warrell (1992) "Comparison of the potency of three Brazilian Bothrops antivenoms using in vivo rodent and in vitro assays." Toxicon 30(10): 1219-1225 Lee, C.-H., Y.-C Lee, M.-H Liang, S.-J Leu, L.-T Lin, J.-R Chiang and Y.-Y Yang (2016) "Antibodies against Venom of the Snake Deinagkistrodon acutus." Applied and environmental microbiology 82(1): 71-80 Lomonte, B., G Ln, Y Angulo, A Rucavado and V Núđez (2009) "Neutralization of Bothrops asper venom by antibodies, natural products and synthetic drugs: contributions to understanding snakebite envenomings and their treatment." Toxicon 54(7): 1012-1028 Meenatchisundaram, S., G Parameswari, A Michael and S Ramalingam (2008) "Neutralization of the pharmacological effects of Cobra and Krait venoms by chicken egg yolk antibodies." Toxicon 52(2): 221-227 Narat, M (2003) "Production of antibodies in chickens." Food Technology and Biotechnology 41(3): 259-267 Nelson, B K (1989) "Snake envenomation incidence, clinical presentation and management." Medical toxicology and adverse drug experience 4(1): 17-31 Nguyễn Quốc Thắng, T K v c s (1995) "Các loài rắn độc Việt Nam." Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Oliveira, J., H M de Oca, M Duarte, C Diniz and C Fortes-Dias (2002) "Toxicity of South American snake venoms measured by an in vitro cell culture assay." Toxicon 40(3): 321-325 Paul, K., J Manjula, E Deepa, Z Selvanayagam, K Ganesh and P S Rao (2007) "Anti-Echis carinatus venom antibodies from chicken egg yolk: isolation, purification and neutralization efficacy." Toxicon 50(7): 893-900 Polson, A., M B von Wechmar and M Van Regenmortel (1980) "Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens." Immunological communications 9(5): 475-493 Reed, L a M H (1938) "A simple method of estimating fifty percent endpoints." Am J Hyg 27: 493-497 Russell, F E (2001) "Toxic effects of terrestrial animal venoms and poisons." Casarett and Doull’s Toxicology: The Basic Science of Poisons: 945-964 Schade, R., E G Calzado, R Sarmiento, P A Chacana, J PorankiewiczAsplund and H R Terzolo (2005) "Chicken egg yolk antibodies (IgYtechnology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine." Altern Lab Anim 33(2): 129-154 Shemesh, I Y., C Kristal, L Langerman and A Bourvin (1998) "Preliminary evaluation of Vipera palaestinae snake bite treatment in accordance to the severity of the clinical syndrome." Toxicon 36(6): 867-873 Snyder, D., W Marquardt, E Mallinson and E Russek (1983) "Rapid serological profiling by enzyme-linked immunosorbent assay I Measurement of antibody activity titer against Newcastle disease virus in a single serum dilution." d oa nl w 38 oi z at nh 42 m 41 ll 40 u nf va an lu 39 z 44 m co l gm @ 43 an Lu n va ac th 51 si Avian diseases: 161-170 Spawls, S., B Branch and W R Branch (1995) The dangerous snakes of Africa: natural history, species directory, venoms, and snakebite, Ralph Curtis Pub Stewart, C J (2003) "Snake bite in Australia: first aid and envenomation management." Accident and emergency nursing 11(2): 106-111 Sun, S., W Mo, Y Ji and S Liu (2001) "Preparation and mass spectrometric study of egg yolk antibody (IgY) against rabies virus." Rapid communications in mass spectrometry 15(9): 708-712 Thalley, B S and S B Carroll (1990) "Rattlesnake and scorpion antivenoms from the egg yolks of immunized hens." Nature Biotechnology 8(10): 934-938 Venkatesan, C., M Sarathi, G Balasubramanaiyan, S Vimal, N Madan, N S Raj, S M Y Bilal, A N Basha, M Farook and A S Hameed (2014) "Neutralization of cobra venom by cocktail antiserum against venom proteins of cobra (Naja naja naja)." Biologicals 42(1): 8-21 Warr, G W., K E Magor and D A Higgins (1995) "IgY: clues to the origins of modern antibodies." Immunology today 16(8): 392-398 White, J (1996) "Treatment of snake bite in Australia." Envenomings and their Treatments: 267-279 Zhang, W.-W (2003) "The use of gene-specific IgY antibodies for drug target discovery." Drug Discovery Today 8(8): 364-371 45 46 47 48 49 lu an 50 va n 51 tn to 52 p ie gh d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th 52 si 18 PHỤ LỤC Phụ lục Giá trị OD405 mẫu âm tính độ pha lỗng khác lu Độ pha loãng 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800 1/25600 1/51200 1/102400 an Mẫu 1.75 1.49 1.23 0.83 0.62 0.36 0.28 0.17 0.16 0.11 0.10 0.12 Mẫu 1.62 1.40 1.14 0.87 0.53 0.30 0.20 0.15 0.11 0.11 0.14 0.10 Mẫu 1.16 1.04 0.73 0.50 0.27 0.19 0.14 0.12 0.10 0.15 0.14 0.10 Mẫu 0.90 0.82 0.75 0.48 0.37 0.28 0.21 0.15 0.11 0.12 0.09 0.10 Mẫu 0.81 1.03 0.85 0.63 0.46 0.34 0.27 0.16 0.11 0.10 0.10 0.10 Mẫu 1.03 0.97 0.99 0.85 0.62 0.46 0.29 0.22 0.13 0.11 0.11 0.09 Mẫu 1.53 1.38 1.07 0.79 0.53 0.35 0.23 0.17 0.16 0.11 0.12 0.18 Mẫu 1.55 1.32 0.94 0.78 0.49 0.35 0.22 0.15 0.13 0.14 0.11 0.12 Mẫu 10 1.57 1.28 0.86 0.70 0.48 0.27 0.18 0.13 0.11 0.09 0.14 0.08 n va Mẫu 1.62 1.41 1.07 0.87 0.70 0.31 0.20 0.15 0.13 0.11 0.14 0.12 gh tn to Phụ lục Giá trị OD405 mẫu huyết độ pha loãng 1:12800 p ie d oa nl an lu ll oi m Mẫu 0.10 0.10 0.26 0.62 0.68 0.85 0.99 1.20 1.21 1.21 1.18 0.90 0.89 0.90 0.90 0.75 Mẫu 0.10 0.14 0.30 0.58 0.78 0.95 1.00 1.02 1.04 0.99 0.98 0.85 0.70 0.62 0.62 0.54 z @ Mẫu 0.08 0.09 0.27 0.63 0.71 0.90 0.94 1.17 1.13 1.00 0.83 0.76 0.78 0.73 0.70 0.59 z at nh Mẫu 0.09 0.09 0.22 0.53 0.60 0.79 0.82 0.95 0.94 0.84 0.72 0.67 0.59 0.56 0.51 0.41 u nf Mẫu 0.11 0.14 0.21 0.59 0.56 0.73 0.78 0.93 0.93 0.92 0.89 0.79 0.74 0.72 0.72 0.63 va Mẫu 0.09 0.10 0.13 0.40 0.38 0.30 0.29 0.42 0.38 0.37 0.32 0.33 0.25 0.26 0.28 0.15 w Ngày 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 111 Mẫu 0.10 0.13 0.29 0.50 0.47 0.69 0.70 0.89 0.90 0.84 0.64 0.50 0.49 0.47 0.43 0.28 Mẫu 0.09 0.11 0.38 0.40 0.39 0.59 0.60 0.72 0.76 0.68 0.54 0.48 0.39 0.30 0.30 0.11 Mẫu 0.09 0.10 0.30 0.39 0.37 0.49 0.50 0.54 0.52 0.42 0.37 0.30 0.24 0.11 0.10 0.10 Mẫu 10 0.09 0.09 0.38 0.62 0.64 0.82 0.85 0.98 1.01 0.96 0.92 0.85 0.82 0.80 0.77 0.60 42 1.043 49 1.229 56 1.379 63 1.357 70 1.326 77 1.271 91 1.261 111 98 1.087 0.978 an Lu ĐC âm 35 0.158 0.671 m co l gm Phụ lục Giá trị OD405 mẫu kháng thể IgY kháng nọc rắn tuần khác n va ac th 53 si