Nghiên cứu khả năng đối kháng của nấm trichoderma đối với chủng nấm phytophthora gây bệnh vàng lá thối rễ và chảy gôm trên sầu riêng tỉnh tiền giang

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA NẤM TRICHODERMA ĐỐI VỚI CHỦNG NẤM PHYTOPHTHORA GÂY BỆNH VÀNG LÁ THỐI RỄ VÀ CHẢY GÔM TRÊN SẦU RIÊNG TỈNH TIỀN GIANG Giáo viên hướng dẫn: TS Phạm Hồng Hiển GS.TS Phan Hữu Tôn Sinh viên thực hiện: Nguyễn Phương Đông Lớp: K62CNSHA Mã sinh viên: 620475 HÀ NỘI - 2021 Học viện Nơng nghiệp Việt Nam Cộng hịa xã hội chủ nghĩa Việt Nam Khoa Công nghệ sinh học Độc lập – Tự Do – Hạnh Phúc BẢNG NHẬN XÉT SINH VIÊN LÀM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Phương Đông Lớp: K62CNSHA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Tên đề tài Khóa luận tốt nghiệp: “Nghiên cứu khả đối kháng nấm Trichoderma chủng nấm Phytophthora gây bệnh vàng thối rễ chảy gôm sầu riêng tỉnh Tiền Giang” Thời gian thực hiện: Từ tháng năm 2021 đến tháng năm 2021 Địa điểm thực hiện: Trung tâm đấu tranh sinh học – Viện Bảo vệ Thực vật Ý KIẾN NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Tinh thần, thái độ học tập thực Khóa luận tốt nghiệp: Sinh viên Nguyễn Phương Đơng có tinh thần, thái độ học tập nghiêm túc thời gian thực khóa luận tốt nghiệp, tham gia thực hầu hết nghiên cứu, thí nghiệm liên quan đến khóa luận nghiên cứu khác nhóm nghiên cứu Sau kết thúc thực tập khoa luận, sinh viên Nguyễn Phương Đông nắm vững kiến thức liên quan đến phương pháp nghiên cứu nấm đối kháng nấm gây bệnh trồng nông nghiệp Năng lực sáng tạo nghiên cứu viết Khóa luận tốt nghiệp: Nguyễn Phương Đơng sinh viên có lực sáng tạo nghiên cứu khoa học, có tinh thần làm việc nhóm tổng kết đánh giá số liệu nghiên cứu Luôn chủ động việc viết hồn thiện khóa luận tốt nghiệp Mức độ hồn thành Khóa luận tốt nghiệp giao:  Hoàn thành tốt:   Hoàn thành:   Chưa hoàn thành:  Kết luận: Sinh viên đủ điều kiện nộp Khóa luận tốt nghiệp:  Sinh viên khơng đủ điều kiện nộp Khóa luận tốt nghiệp:  Hà Nội, ngày 10 tháng 09 năm 2021 Giáo viên hướng dẫn Phạm Hồng Hiển MỤC LỤC MỤC LỤC i LỜI CẢM ƠN .iii DANH MỤC VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi TÓM TẮT vii LỜI MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu sầu riêng Bệnh vàng thối rễ chảy gôm Giới thiệu nấm Phytophthora 3.1 Cách thức gây bệnh Phytophthora qua 3.2 Cách thức gây bệnh Phytophthora qua rễ Giới thiệu nấm Trichoderma 4.1 Cơ chế tác động nấm Trichoderma spp lên tác nhân gây bệnh 10 4.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng chế phẩm nấm Trichoderma phòng trừ bệnh hại trồng 11 4.2.1 Tình hình nghiên cứu nước 11 4.2.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 13 II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Vật liệu nghiên cứu 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.3 Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1 Phân lập nguồn bệnh Phytophthora 16   i 2.3.2 Lây nhiễm nhân tạo sầu riêng 17 2.3.3 Phân lập nấm đối kháng 17 2.3.4 Đánh giá khả đối kháng 17 III KẾT QUẢ 19 Phân lập nấm Phytophthora 19 Lây nhiễm nhân tạo sầu riêng 22 Phân lập nấm Trichoderma 23 Đánh giá đối kháng chủng Trichoderma với nấm Phytophthora 27 IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 30 Kết luận 30 Kiến nghị 30 V TÀI LIỆU THAM KHẢO 31   ii LỜI CẢM ƠN   Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến hai thầy hướng dẫn TS Phạm Hồng Hiển GS.TS.Phan Hữu Tôn trực tiếp dành nhiều thời gian, cơng sức hướng dẫn tơi q trình thực nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin trân trọng cảm ơn tồn thể Thầy, Cô giáo khoa Công nghệ sinh học tường Học viện nơng nghiệp Việt Nam tận tình truyền đạt kiến thức q báu, giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Tôi xin cảm ơn cán nhóm nấm có ích Viện bảo vệ thực vật tạo điều kiện tốt giúp đỡ tơi q trình thực khóa luận tốt nghiệp Do giới hạn kiến thức khả lý luận thân cịn hạn chế nên khóa luận khơng tránh khỏi thiếu sót Tơi kính mong Q Thầy, Cơ bạn bè tiếp tục có ý kiến đóng góp, giúp đỡ để đề tài hoàn thiện Một lần xin chân thành cám ơn! Hà Nội, tháng năm 2021 Sinh viên Nguyễn Phương Đông     iii DANH MỤC VIẾT TẮT BVTV Bảo vệ thực vật PDA (Potato dextrose agar)Môi trường thạch đường khoai tây PSM (Phytophthora selective medium) Môi trường chọn lọc nấm Phytophthora WA (Water agar)Môi trường thạch nước                           iv DANH MỤC BẢNG   Bảng 1: Tốc độ phát triển nấm bệnh môi trường PDA PSM 20 Bảng 2: Các nguồn nấm Trichoderma sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 3: Khả đối kháng nấm Trichoderma với nấm Phytophthora 27   v DANH MỤC HÌNH ẢNH   Hình 1: Cơ chế hoạt động Trichoderma 10 Hình 2:Bẫy cánh hoa hồng 19 Hình 3: Túi bào tử Phytophthora soi kính hiển vi từ cánh hoa bẫy 19 Hình 4: Khả phát triển nấm bệnh Phytophthora môi trường PDA PSM 20 Hình 5: Tản nấm Phytophthora mơi trường PDA PSM 21 Hình 6: Sợi nấm, bào tử Phytophthora mơi trường PDA qua kính hiển vi quang học 21 Hình 7: Túi du động bào tử nấm Phytophthora kính hiển vi quang học 22 Hình 8: Lây nhiễm nhân tạo nấm Phytophthora sầu riêng 23 Hình 9: hình thái khuẩn lạc nấm Trichoderma mơi trường PDA 24 Hình 10: Cành sinh bào tử bào tử Trichoderma kính hiển vi 24 Hình 11: Bào tử nấm Trichoderma phát kính hiển vi sau ngày 25 Hình 12: Hình thái khuẩn lạc nấm Trichoderma phát triển PDA sau ngày nuôi cấy 26 Hình 13: Khả đối kháng giống Trichoderma nấm Phytophthora gây bệnh sau ngày 28 Hình 14: Khả đối kháng nấm Trichoderma với nấm bệnh Phytophthora sau 12 ngày 29   vi TĨM TẮT Mục đích đề tài: Tìm chủng nấm Trichoderma có khả đối kháng mạnh với nấm Phytophthora gây bệnh vàng thối rễ chảy gôm sầu riêng làm sở sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ nấm bệnh Phương pháp nghiên cứu: - Phương pháp phân lập nguồn bệnh Phytophthora - Phương pháp lây nhiễm nhân tạo - Phương pháp phân lập, nuôi cấy nấm đối kháng - Phương pháp đánh giá khả đối kháng nấm Trichoderma với nấm bệnh Phytophthora Kết nghiên cứu: Phân lập chủng nấm Phytophthora quan sát hình thái nấm bệnh thấy hình thái sợi nấm, nang bào tử hậu bào tử Lây nhiễm nhân tạo thành công, sau 3, ngày thấy rõ triệu chứng bệnh Đánh giá khả đối kháng nấm Trichoderma với nấm bệnh Phytophthora gây bệnh 77,78% đến 82,67% sau 12 ngày Trong đó, Tri5 cho hiệu ức chế nấm bệnh cao đạt 82.67% sau 12 ngày Thấp dòng Tri2, hiệu ức chế nấm bệnh đạt 77,78% sau 12 ngày Kết luận: Phân lập chủng nấm Phytophthora quan sát hình thái nấm bệnh thấy hình thái sợi nấm, nang bào tử hậu bào tử Đánh giá khả đối kháng nấm Trichoderma với nấm bệnh Phytophthora có hiệu lực phịng trừ từ 77,78% đến 82,67% sau 12 ngày Trong đó, Tri5 cho hiệu ức chế nấm bệnh cao đạt 82.67% sau 12 ngày Thấp dòng Tri2, hiệu ức chế nấm bệnh đạt 77,78% sau 12 ngày   vii LỜI MỞ ĐẦU   Lí chọn đề tài Cây sầu riêng có nguồn gốc vùng Đơng Nam Á, Malaysia Indonesia Sầu riêng ngày trồng nhiều Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Việt Nam, Mianma, Philipine, Campuchia, Lào, ngồi cịn trồng Ấn Độ, Srilanca, Brunei Sầu riêng loại trái bổ dưỡng, giá trị calo, đường, đạm, chất béo, chất lượng cao so với loại trái Loại trái không chứa cholesterol, chứa nhiều chất xơ protein nên có lợi cho không muốn tăng cân 100g trái cung cấp khoảng 21% nhu cầu carbohydrate hàng ngày thể vitamin C tìm thấy nhiều riêng sầu vitamin C chất chống oxy hóa mạnh mẽ giúp giảm bớt q trình oxy hóa Riêng sầu riêng giúp làm giảm độ trầm lắng ổn định tâm nhờ giàu có vitamin B6 mà vitamin B6 lại cần thiết cho việc sản xuất serotonin giúp giảm trầm cảm Ở Việt Nam, sầu riêng trồng chủ yếu Đông Nam Bộ, Tây Nguyên Đồng Sông Cửu Long, nhiều tỉnh Tiền Giang, Bến Tre, Lâm Đồng Một số nơi Quảng Nam, Huế, Khánh Hịa trồng sầu riêng có to, múi hơn, Diện tích trồng sầu riêng Việt Nam tiếp tục mở rộng Diện tích trồng sầu riêng nước ước tính khoảng 5.000ha Hiện nay, chất lượng sầu riêng nước ta ngày cải thiện với nhiều giống cho sản lượng chất lượng tốt sầu riêng người tiêu dùng ưa chuộng Tuy nhiên, với tăng diện tích trồng trọt xuất nhiều dịch bệnh sầu riêng gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng sầu riêng đặc biệt bệnh vàng thối rễ chảy gôm Bệnh vàng thối rễ chảy gôm bệnh nghiêm trọng sầu riêng Bệnh nhẹ khiến đọt non chậm, không đọt Bệnh nặng làm rễ lớn bị thối, phần rễ tổn thương khả hấp thụ nước dinh dưỡng nuôi khiến trở nên cịi cọc xơ xác Có nhiều ngun nhân gây   Trichoderma Phytophthora Đánh giá khả ức chế vi sinh vật đối kháng phịng thí nghiệm: Cấy đồng thời nấm đối kháng nấm Phytophthora đĩa petri đường kính 90mm có chứa mơi trường PDA theo kiểu đối xứng hai bên Tiến hành cấy Trichoderma cách mép đĩa 15mm cấy chấm điểm nấm bệnh Phytophthora đối xứng với đường cấy nấm đối kháng qua tâm đĩa petri, cách mép đĩa 15mm Mỗi công thức lần nhắc lại tương ứng với đĩa petri Với công thức đối chứng, cấy riêng rẽ nấm bệnh cách mép đĩa 15mm Các đĩa thí nghiệm nuôi cấy nhiệt độ 28˚C Sau 5, 7, 12 ngày theo dõi phát triển nấm bệnh tiến hành đo kích thước vịng vơ khuẩn Trichoderma nấm bệnh Phytophthora công thức đối kháng Đo đếm bán kính khuẩn lạc nấm bệnh công thức đối kháng công thức đối chứng Hiệu lực đối kháng vi sinh nấm bệnh thông qua công thức Abott: H(%) = DC - DT DC x100 Trong đó: H phần trăm hiệu lực đối kháng DC đường kính tản nấm gây bệnh cơng thức đối chứng DT đường kính tản nấm cơng thức thí nghiệm   18 III KẾT QUẢ Phân lập nấm Phytophthora Sử dụng mẫu đất bảo quản Viện BVTV, sau ngày bẫy mẫu đất cánh hoa hồng kiểm tra số bẫy màu kính hiển vi ta thấy có 4/6 mãu đất xuất túi bào tử nấm Phytophthora Các túi bào tử hình chanh có núm đỉnh rõ ràng xuất theo cụm Bên túi bào tử chứa nhiều du động bào tử Hình 2:Bẫy cánh hoa hồng Hình 3: Túi bào tử Phytophthora soi kính hiển vi từ cánh hoa bẫy Các mẫu cánh hoa màu nuôi cấy làm môi trường PDA PSM Khả phát triển nấm bệnh Phytophthora môi trường PSM nhanh so với mơi trường PDA Đường kính tản nấm Phytophthora   19 môi trường PSM đạt 2,7 cm sau ngày 5,1 cm sau ngày, môi trường PDA đạt 2,2 cm sau ngày cm sau ngày Bảng 1: Tốc độ phát triển nấm bệnh môi trường PDA PSM Mơi trường Đường đính tản nấm Phytophthora (cm) PDA 2,2 ± 0,1 ± 0,1 PSM 2,7 ± 0,1 5,1 ± 0,1 Hình 4: Khả phát triển nấm bệnh Phytophthora môi trường PDA PSM   20 A B C D Hình 5: Tản nấm Phytophthora môi trường PDA PSM A, B: Tản nấm Phytophthora môi trường PDA sau ngày C, D: Tản nấm Phytophthora môi trường PSM sau ngày Hình 6: Sợi nấm, bào tử Phytophthora mơi trường PDA qua kính hiển vi quang học   21 Hình 7: Túi du động bào tử nấm Phytophthora kính hiển vi quang học   Quan sát hình thái tản nấm, nang bào tử Phytophthora spp quan sát kính hiển vi thấy hình thái sợi nấm, nang bào tử hậu bào tử Sợi nấm khơng màu, khơng vách ngăn, kích thước khơng đều, túi bào tử có hình trứng hình chanh, đỉnh có núm rõ ràng Lây nhiễm nhân tạo sầu riêng Các mẫu lấy bệnh nhà lưới sau rửa cồn nước vơ trùng Sau mẫu thạch chứa nấm Phytophthora đặt lên bề mặt theo dõi Sau ngày theo dõi, lây nhiễm bắt đầu xuất triệu chứng, bề mặt xuất vết bệnh đen nâu nhỏ Sau ngày triệu chứng dần rõ hơn, vết bệnh chuyển thành màu nâu bắt đầu lan rộng viền Sau ngày theo dõi, triệu chứng bệnh biểu rõ rệt: bị nhũn, héo vàng khơng cịn tươi, gân khơng cịn xanh, bề mặt điểm đặt thạch chứa nấm bệnh bắt đầu xuất sợi nấm Phytophthora trắng   22 A C B Hình 8: Lây nhiễm nhân tạo nấm Phytophthora sầu riêng A: sau ngày nhiễm; B: sau ngày nhiễm; C: sau ngày nhiễm Phân lập nấm Trichoderma Phân lập chủng nấm Trichoderma nguồn từ Trung tâm sinh học Viện BVTV Mẫu đất chứa Trichoderma pha loãng trang môi trường PDA Sau theo dõi ngày thấy đĩa cấy xuất khuẩn lạc hệ sợi màu xanh Khuẩn lạc màu xanh phân lập, làm cấy sang môi trường PDA Quan sát thấy phát triển khuẩn lạc Trichoderma nhanh môi trường PDA sau 48 nhiệt độ 28℃ bán kính đạt 3,5 cm Sau ngày, khuẩn lạc Trichoderma phát triển toàn bề mặt đĩa petri đường kính 9cm, bào tử nấm phát triển nhanh chóng, bào tử hình thành có mật độ dày đặc, tạo vịng trịn đồng tâm hướng hướng ngồi mép đĩa Quan sát khuẩn lạc   23 kính hiển vi thấy xuất bào tử nấm Trichoderma màu xanh lục xuất dày đặc có dạng hình cầu Hình 9: hình thái khuẩn lạc nấm Trichoderma mơi trường PDA Hình 10: Cành sinh bào tử bào tử Trichoderma kính hiển vi   24 Hình 11: Bào tử nấm Trichoderma phát kính hiển vi sau ngày Bảng 2: Các nguồn nấm Trichoderma sử dụng nghiên cứu (Nguồn giống Trung tâm sinh học – Viện BVTV)   STT Kí hiệu mẫu Tên khoa học Tri1 Trichoderma sp Tri2 Trichoderma sp Tri4 Trichoderma sp Tri5 Trichoderma sp Tri6 Trichoderma sp Tri7 Trichoderma sp 25 Tri1 Tri2 Tri4 Tri5 Tri6 Tri7 Hình 12: Hình thái khuẩn lạc nấm Trichoderma phát triển PDA sau ngày nuôi cấy Khuẩn lạc nấm Trichoderma lúc đầu có màu trắng, sau chuyển màu xanh lục bào tử hình thành; bào tử hình thành dạng gần vịng trịn đồng tâm phần trục gần cực Quan sát kính hiển vi, sợi nấm Trichoderma phân nhánh mạnh, nhánh sợi nấm thường mọc tạo góc với trục khoảng 90° Cuống sinh bào tử thường phình rộng giống hình trụ Bào tử có hình trứng Bề mặt bào tử gồ ghề Các bào tử hậu dạng đơn bào, hình trịn, hình thành đầu sợi nấm   26 Đánh giá đối kháng chủng Trichoderma với nấm Phytophthora Đánh giá khả đối kháng dòng Trichoderma để dòng có triển vọng phịng trừ nấm Phytophthora gây vàng thối rễ chảy gôm sầu riêng Sử dụng nguồn Trichoderma sp bảo quản phịng nghiên cứu Viện BVTV, cấy đối xứng mơi trường PDA, theo dõi phát sợi nấm sau ni cấy, kết trình bày bảng Bảng 3: Khả đối kháng nấm Trichoderma với nấm Phytophthora   Khả đối kháng Trichoderma với Phytophthora gây bệnh sầu riêng Tiền Giang Sau ngày Sau ngày Sau 12 ngày Kí Hiệu Hiệu hiệu Hiệu Đối Đối lực Đối Đối lực Đối Đối dòng lực kháng chứng phòng kháng chứng phòng kháng chứng phòng (cm) (cm) trừ (cm) (cm) trừ (cm) (cm) trừ (%) (%) (%) Tri1 1,47 2,4 38,89 1,47 3,4 56,86 1,47 7,5 80,44 Tri2 1,67 2,4  30,56 1,67 3,4 50,98 1,67 7,5 77,78 Tri4 1,4 2,4  41,67 1,4 3,4 58,82 1,4 7,5 81,33 Tri5 1,3 2,4  45,83 1,3 3,4 61,76 1,3 7,5 82,67 Tri6 1,47 2,4  38,89 1,47 3,4 56,86 1,47 7,5 80,44 Tri7 1,5 2,4  37,5 1,5 3,4 55,88 1,5 7,5 80 Sau cấy loại nấm Trichoderma phát triển nhanh môi trường Sau nuôi cấy ngày, nấm Trichoderma bắt đầu kí sinh sang sợi nấm Phytophthora Đến ngày thứ nấm Trichoderma kí sinh sang sợi nấm Phytophthora làm cho nấm teo dần, không tục phát triển Tại đĩa đối chứng (khơng có nấm Trichoderma) sau 12 ngày nấm Phytophthora sinh trưởng phát tốt đạt đường kính tối đa Hiệu ức chế dòng nấm Trichoderma nới nấm Phytophthora gây bện sầu riêng từ 77,78 – 82,67% Các dịng Trichoderma có hiệu ức chế nấm bệnh đạt từ 30,56% đến 45,83% sau   27 ngày, 50,98% đến 61,76% sau ngày 77,78% đến 82,67% sau 12 ngày Trong đó, Tri5 cho hiệu ức chế nấm bệnh cao đạt 61,67% sau ngày 82.67% sau 12 ngày Thấp dòng Tri2, hiệu ức chế nấm bệnh đạt 50,98% sau ngày 77,78% sau 12 ngày Các dòng Tri1, Tri4 Tri6 cho hiệu ức chế nấm bệnh cao 80,44%, 81,33%; 80,44% Tri1 Tri2 Tri4 Tri5 Tri6 Tri7 Hình 13: Khả đối kháng giống Trichoderma nấm Phytophthora gây bệnh sau ngày   28 Tri1>