Nghiên cứu đánh giá chất lượng của một số giống lúa triển vọng

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA TRIỂN VỌNG Sinh viên : ĐOÀN ÁNH HỒ Lớp : K62 CNSHA Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : GS TS PHAN HỮU TÔN Hà Nội, tháng năm 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu khoa học tơi thực hướng dẫn GS.TS Phan Hữu Tôn cán Trung tâm Bảo tồn Phát triển nguồn gen Cây trồng Số liệu kết nghiên cứu báo cáo hoàn toàn trung thực, chưa sử dụng công bố cơng trình khác Mọi giúp đỡ cho việc thực đề tài cảm ơn, thơng tin trích dẫn báo cáo ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 14 tháng năm 2021 Sinh viên thực Đoàn Ánh Hồ i LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp thực phịng thí nghiệm Bộ mơn sinh học phân tử Công nghệ sinh học Ứng dụng khu thí nghiệm Trung tâm Bảo tồn Phát triển nguồn gen trồng, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp, ngồi nỗ lực cố gắng thân, nhận quan tâm, dạy bảo, giúp đỡ tận tình thầy cơ, bạn bè người thân gia đình Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng biết sâu sắc tới GS.TS Phan Hữu Tơn, người tận tình hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ tơi chun mơn suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn giảng viên cán Bộ môn Sinh học phân tử Công nghệ sinh học Ứng dụng, Trung tâm Bảo tồn Phát triển Nguồn gen Cây trồng - Khoa Công nghệ sinh học hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian thực tập Bộ môn Trung tâm Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam trang bị cho tơi kiến thức cần thiết để thực hồn thành khóa luận Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn người thân gia đình, anh em, bạn bè động viên, giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa luận Hà Nội, ngày 14 tháng năm 2021 Sinh viên thực Đoàn Ánh Hồ ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU vii TÓM TẮT viii PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu lúa 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.1.2 Giá trị kinh tế lúa 2.2 Tình hình sản xuất lúa giới Việt Nam 2.2.1 Tình hình sản xuất lúa gạo giới 2.2.2 Tình hình sản xuất lúa gạo Việt Nam 2.3 Một số yếu tố định suất 2.3.1 Mùi thơm lúa gạo 2.3.2 Hàm lượng amylose 10 2.4 Kỹ thuật thị phân tử 10 2.4.1 Khái niệm thị phân tử 10 2.4.2 Kỹ thuật chuỗi đa hình nhân cắt (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences – CAPS) 11 PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 13 iii 3.1 Vật liệu 13 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 13 3.3 Nội dung nghiên cứu 13 3.4 Phương pháp nghiên cứu 13 3.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm ngồi đồng ruộng 13 3.4.2 Phương pháp đánh giá đặc điểm nông sinh học 13 3.4.3 Phương pháp xác định gen amylose 25 3.4.4 Phương pháp xác định gen mùi thơm 27 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Kết đặc điểm nông sinh học 30 4.2 Kết đánh giá khả mang gen amylose 32 4.2.1 Kết nhiệt hóa hồ 32 4.2.2 Kết thị phân tử xác định khả mang gen amylose 34 4.3 Kết đánh giá khả mang gen mùi thơm 35 4.3.1 Phương pháp hóa sinh 35 4.3.2 Tỷ lệ gạo lật / gạo xát 36 4.3.3 Đánh giá chiều dài/ chiều rộng hạt gạo 36 4.3.4 Đánh giá độ bạc bụng 37 4.3.5 Kết thị phân tử xác định khả mang gen mùi thơm 37 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Đề nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40  iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Các tính trạng đặc trưng giống lúa 14 Bảng 3.2 Thang điểm đánh giá nhiệt hóa hồ độ phân hủy 25 Bảng 3.4 Bảng đánh giá độ bạc bụng 28 Bảng 3.5 Trình tự mồi sử dụng PCR đánh giá mùi thơm 29 Bảng 4.1 Đặc điểm nông sinh học giống lúa nghiên cứu 31 Bảng 4.2 Kết q trình nhiệt hóa hồ 32 Bảng 4.3: Đánh giá mùi thơm 35 Bảng 4.4: Đánh giá mùi thơm gạo 35 Bảng 4.5: Tỷ lệ gạo lật tỷ lệ gạo xát 36 Bảng 4.7: Kết đánh giá độ bạc bụng 37 Hình 4.6 Kết điện di xác định gen mang mùi thơm giống lúa 38  v DANH MỤC HÌNH Hình 4.1: Q trình thực đo chiều dài địng 31 Hình 4.2: Thu đếm số lượng 1000 hạt giống lúa 32 Hình 4.3 Q trình nhiệt hóa hồ 33 Hình 4.4 Kết điện di kiểm tra DNA 34 Hình 4.5 Kết tách chiết DNA tổng số điện di khả mang gen Wx kỹ thuật PCR 34 Hình 4.6 Kết điện di xác định gen mang mùi thơm giống lúa 38  vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU ARN : Acid Ribonucleic DNA : Acid Deoxyribo Nucleic Bộ NN&PTNT : Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn CNSH : Công nghệ sinh học Cs : Cộng EDTA : EthyleneDiamineTetraacetic Acid IRRI : International Rice Research Institute - Viện Nghiên cứu lúa quốc tế NST : Nhiễm sắc thể PCR : Polymerase Chain Reaction - phản ứng khuếch đại gen TE : Tris-EDTA TCN : Trước cơng ngun vii TĨM TẮT Hiện nay, chất lượng giống lúa điều mà người sản xuất lúa quan tâm theo dõi ngày Để bắt kịp xu hướng người tiêu dùng không ăn để no mà cịn thơm, ngon Do Trung tâm Bảo tồn Phát triển nguồn gen trồng, Học viện Nông nghiệp Việt Nam thực nghiên cứu đánh giá chất lượng số giống lúa Và đề tài: “ Nghiên cứu đánh giá chất lượng số giống lúa triển vọng” tiến hành đánh giá đặc điểm hình thái, nơng sinh học, suất chất lượng giống lúa tham gia thí nghiệm, đồng thời kiểm tra đánh giá chất lượng amylose mùi thơm thị phân tử Từ kết theo dõi tiêu hình thái, nông sinh học, suất, chất lượng điện di sản phẩm PCR chọn giống lúa có hàm lượng amylose cao, mùi thơm tốt để phục vụ cho đời sống kinh tế phát triển viii PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Lúa gạo (Oryza sativa) xem sản phẩm quốc gia trọng tâm sản xuất nông nghiệp Một nhiệm vụ đặt chọn tạo giống lúa suất chất lượng nhằm bổ sung cho cấu giống Tại Việt Nam, lúa có truyền thống sản xuất lâu đời, có vai trị quan trọng việc thúc đẩy kinh tế xã hội phát triển Lúa đảm bảo lương thực cho hầu hết dân số, vừa đóng góp vào việc đưa Việt Nam trở thành quốc gia xuất gạo lớn giới Những năm gần đây, suất sản lượng lúa ổn định, đảm bảo an ninh lương thực Tuy nhiên chất lượng gạo chưa ngon, giá trị thấp Tỷ lệ gạo chất lượng cao, gạo thơm cho xuất tiêu dùng nội địa cịn Việt Nam có sản lượng gạo xuất lớn, phải nhập gạo ngon Hiện tiêu đánh giá chất lượng giống lúa ngon mùi thơm lúa gạo hàm lượng amylose Để góp phần giải vấn đề hướng dẫn GS.TS Phan Hữu Tôn tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu đánh giá chất lượng số giống lúa triển vọng” 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích Nghiên cứu đánh giá chọn lọc dòng giống lúa mang đặc điểm nơng sinh học tốt, hàm lượng amylose thích hợp có chứa gen mùi thơm 1.2.2 Yêu cầu Đánh giá số đặc điểm nông sinh học cấu thành suất giống lúa Sử dụng phương pháp sinh hóa đánh giá mùi thơm hàm lượng amylose giống lúa nghiên cứu lượng amylose cao Wxb chủ yếu tìm thấy gạo japonica với hàm lượng amylose thấp trung bình (Sano 1984; Wang et al 1995) Chúng sử dụng cặp mồi PCR-AccI CAPS marker thiết kế Cai cs ( 2002), mồi gắn nhân lên đoạn 530bp có chứa trình tự vùng xảy đột biến thay nu G nu T vị trí cắt 5’ intron1 Bảng 3.3 Trình tự primer PCR-AccI CAPS marker (Cai et al, 2002) Tên mồi Trình tự mồi Forward primer(Wx-F) 5’-gcttcacttctctgcttgtg-3’ Reverse primer(Wx-R) 5’-atgatttaacgagttgaa-3’ Chuẩn bị thành phần phản ứng PCR với thể tích 25μl gồm: Thành phần phản ứng PCR với thể tích 25μl gồm: 0.2μl Taq DNA polymerase, 2.5 μl Taq Buffer 10X, 2.5 μl MgCl2 25mM, 0.5 μldNTP 10mM, 1μl Wx-F, 1μl WxR, 15.3μl nuclerase free water 1μl DNA tổng số Mỗi mẫu cho vào ống eppendorf có tên tương ứng, đưa lên máy chạy PCR, kiểm tra thiết lập chu kỳ hoạt động: 950C 3’; 35 chu kỳ: 940C – 45’’, 580C– 45” ,720C- 45” 720C 10 phút Sau chạy phản ứng PCR đem điện di gel agarose 1% phát gene 3.4.4 Phương pháp xác định gen mùi thơm 3.4.4.1 Phương pháp hóa sinh - Mùi thơm lá: lấy 1g vào giai đoạn đẻ nhánh rộ, cắt nhỏ trộn với KOH 1,7% giữ nhiệt độ phòng vòng 10 phút Năm người ngửi mùi thơm cho điểm theo ba mức: thơm: thơm nhẹ: không thơm - Mùi thơm gạo: lấy 1g gạo nghiền thành bột trộn với 1ml KOH 1,7%, giữ nhiệt độ phòng vòng 20 phút Sau đó, mẫu đánh giá cách ngửi tương tự phương pháp 27 3.4.4.2 Đánh giá tỷ lệ gạo lật/ gạo xát - Cân 200g thóc sấy khô (độ ẩm 13%), đem xay xát máy tính tiêu xay xát: - Tỷ lệ gạo lật= Khối lượng gạo bóc vỏ/ Khối lượng thóc ban đầu x 100 - Tỷ lệ gạo xát= Khối lượng gạo xát/ Khối lượng thóc ban đầu x 100 3.4.4.3 Đánh giá chiều dài / chiều rộng hạt gạo Mỗi giống đo lấy hạt gạo nguyên Tiến hành đo chiều dài chiều rộng hạt gạo Thu thập số liệu lấy tỷ lệ chiều dài/ chiều rộng Đưa kết luận Đây tiêu quan trọng để giống lúa lai canh tranh với giống lúa chất lượng phổ biến 3.4.4.4 Đánh giá độ bạc bụng Chọn hạt bóc vỏ điển hình, bẻ đơi hạt gạo, quan sát thiết diện vết bạc giống để đánh giá độ bạc bụng Dựa vào diện tích vết bạc chia mức sau: Bảng 3.4 Bảng đánh giá độ bạc bụng Bạc bụng 0- Không bạc Bạc trung tâm 1- Ít (20%) 3.4.4.5 Sử dụng thị phân tử xác định gen mùi thơm Phương pháp PCR Tách chiết DNA: theo phương pháp CTAB (Cetryl Ammunium Bromide) Doyle Doyle có cải tiến (Doyle and Doyle, 1990): Nghiền 0,5g với 800μl CTAB buffer chày cối sứ đến dung dịch có màu xanh xuất Chuyển dung dịch sang ống eppendorf, bổ sung thêm 56μl SDS 10%, lắc 28 Ủ mẫu 65oC bể ổn nhiệt 60 phút, để nguội nhiệt độ phòng Bổ sung 800μl hỗn hợp chloroform : isoamylalcohol (24:1), lắc nhẹ tới thành dạng nhũ sữa, ly tâm 13000 vòng/phút, phút, 4oC Hút dịch chuyển sang ống eppendorf mới, bổ sung 800μl hỗn hợp chloroform : isoamylalcohol (24:1), ly tâm 13.000 vòng/phút, phút, 4oC Thu dịch sang ống eppendorf, kết tủa DNA isopropanol với tỉ lệ 1:1(v/v) Để tủ lạnh sâu Ly tâm 13000 vòng/ phút, phút, 4oC Rửa kết tủa DNA ethanol 70% Làm khơ DNA nhiệt độ phịng Hịa tan DNA nước cất cất lần (khoảng 200μl) DNA tách chiết kiểm tra độ nguyên vẹn gel agarose 1% Phản ứng PCR Mỗi phản ứng PCR 25µl bao gồm: 8,2µl nước cất hai lần khử ion; 1,5µl đệm PCR 10X + MgCl2 25mM; 0,5µl dNTPs 10mM; 0,8µl Taq DNA polymerase 1U/µl; 3µl mồi xi 5µM + Mồi ngược 5µM; 1,0µl DNA 10 µg/µl Chương trình PCR máy Bio-rad 9800: 950C - phút; 35 chu kỳ (950C - 30 giây; 580C - phút; 720C - 1,5 phút); 720C - phút; giữ mẫu 40C Bảng 3.5 Trình tự mồi sử dụng PCR đánh giá mùi thơm Tên mồi Gen liên kết Trình tự Kích thước (bp) ESP: 5’-TTGTTTGGAGCTTGCTGATG-3’ IFAP:5’CATAGGAGCAGCTGAAATATATACC-3’ 580 257 BADH INSP: 5’-CTGGTAAAGTTTATGGCTTCA-3’ Gen fgr 355 EAP : 5’-AGTGCTTTACAGCCCGC-3’ 580 Điện di sản phẩm PCR đọc kết (Theo Bradbury cs (2005)) 29 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết đặc điểm nông sinh học Trong nghiên cứu này, dòng lúa triển vọng khảo nghiệm vụ xuân khu ruộng thí nghiệm Trung tâm bảo tồn phát triển nguồn gen trồng, Học viện Nơng Nghiệp Việt Nam Trong đó, số đặc tiêu nơng sinh học dòng lúa theo dõi thu thập nhằm chọn dòng lúa xuất sắc Thời gian sinh trưởng dịng lúa ưu tú xếp vào nhóm ngắn ngày Cụ thể, tất dịng lúa có thời gian sinh trưởng ≤ 135 ngày (vụ Xuân) ≤ 115 ngày (vụ Mùa) mức độ tương đối ngắn so với giống đối chứng Các dịng TC, T68, T62, KĐ 3, T60 có chiều cao mức trung bình, biến động từ 82,6÷113,1 cm thấp giống đối chứng Nếp hoa vàng 125,2 cm, giống lại cao BLC, KC, KL, T61 (119,8÷ 145,9cm) Một điểm quan trọng để đánh giá khả thích ứng diện rộng dòng lúa tốt xem xét yếu tố cấu thành suất suất thực thu Phân tích số trọng lượng 1000 hạt ghi nhận vượt trội dòng triển vọng KL, KC, KĐ 3, BLC, T68( 24,701 ÷ 35,362 gam) so với đối chứng (24,203gam) Các kết theo dõi đồng ruộng ghi nhận nhỉnh yếu tố cấu thành suất suất thực thu dòng triển vọng so với đối chứng Cụ thể, tiêu số hữu hiệu/ khóm( 5,4 ÷ 9,4) cao giống đối chứng 5,2, số hạt chắc/ bơng cao vượt trội( 75,2÷ 96,7) so với 73,4 giống Nếp hoa vàng Như giống lúa triển vọng có đặc tính nơng sinh học khá, thời gian sinh trưởng ngắn, trọng lượng 1000 hạt, tiêu suất cao vượt trội so với giống đối chứng Nếp hoa vàng 30 Bảng 4.1 Đặc điểm nông sinh học giống lúa nghiên cứu Thời gian từ STT gieo trỗ (ngày) 83 Thời gian sinh trưởng (ngày) 120 Chiều cao (cm) Dài cổ (cm) Dài bơng (cm) 145,9 4,9 31,7 Số bơng hữu hiệu/ khóm 7,8 Số hạt chắc/bơng Dài địng (cm) 92,5 28,6 Khối lượng 1000 hạt (gam) 35,362 86 134 125,3 6,5 28,16 5,4 93,7 32,3 30,614 92 141 105,8 5,6 30,1 5,6 84,6 35,6 30,767 90 125 133,3 9,9 30,36 6,2 91,2 29,5 30,092 95 129 102,7 8,5 26,58 5,4 96,7 37,2 23,075 88 136 140,8 7,1 30,6 9,4 75,2 28,7 21,639 93 133 107,2 8,3 28,92 8,6 81,6 38,5 21,389 89 133 119,8 4,4 27,2 7,3 93,9 36,5 24,701 94 129 90,1 5,2 21,9 7,8 92,8 32,2 20,54 10 102 150 125,2 5,4 23,6 5,2 73,4 30,2 24,203 Chú thích: Các giống STT từ đến 10 tương ứng với giống: Khẩu lếch, Khẩu cảm, Khẩu đăm 3, Blau cẩm, T60, T61, T62, T68, Tẻ cẩm, giống đối chứng Nếp hoa vàng Hình 4.1: Quá trình thực đo chiều dài địng 31 Hình 4.2: Thu đếm số lượng 1000 hạt giống lúa 4.2 Kết đánh giá khả mang gen amylose 4.2.1 Kết nhiệt hóa hồ Bảng 4.2 Kết q trình nhiệt hóa hồ Giống BLC KL KC T68 T60 T62 T61 TC KĐ3 Điểm 4 1 Cao Thấp Thấp Thấp Thấp Thấp Cao Cao Cao Cao Độ phân hủy kiềm Nhiệt độ hóa hồ Trung bình Trung bình Thấp Cao Trung Trung bình bình Trung Trung bình bình Nhiệt độ hóa hồ có liên quan đến thời gian nấu cơm, nhiệt độ hóa hồ cao thời gian nấu chín cơm lâu Qua kết đánh giá cho thấy, có mẫu giống có nhiệt độ hóa hồ thấp (