Nghiên cứu công nghệ sản xuất trà hibiscus hòa tan

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN BÁ HIÊN | ĐẶNG HỮU ANH | VŨ THỊ NGỌC CAO THỊ BÍCH PHƯỢNG Chủ biên: PGS.TS NGUYỄN BÁ HIÊN GIÁO TRÌNH NẤM HỌC THÚ Y NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP – 2022 i ii LỜI NÓI ĐẦU Trong nghiệp giảng dạy, PGS.TS Nguyễn Bá Hiên làm chủ biên để đồng nghiệp biên soạn nhiều giáo trình cho môn học: Vi sinh vật thú y, Vi sinh vật học công nghiệp, Vi sinh vật – Bệnh truyền nhiễm vật nuôi, Miễn dịch học thú y, Miễn dịch học ứng dụng, Bệnh truyền nhiễm thú y, Bệnh truyền lây người động vật, Thực hành vi sinh vật Bệnh truyền nhiễm thú y Năm 2008, theo khung chương trình đào tạo Học viện, ngành Thú y xây dựng thêm số môn học mới, môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm phân công soạn thảo nội dung tiến hành giảng dạy môn “Nấm Bệnh nấm gây ra” Trước đây, số loài nấm gây bệnh phổ biến cho gia súc, gia cầm giới thiệu chương giáo trình Vi sinh vật Thú y xuất năm 2001 Những hiểu biết chưa đủ thực tế sản xuất, bệnh Nấm gây động vật nuôi phổ biến đa dạng, đặc biệt có nhóm nấm gây bệnh chung cho động vật người, tiết độc tố gây nguy hại cho sức khỏe vật nuôi sức khỏe người Chính việc xây dựng mơn học để trang bị cho sinh viên kiến thức sâu rộng nấm bệnh gây cần thiết Để nâng cao yêu cầu đào tạo cán bậc đại học chuyên ngành thú y thuộc chương trình Học viện, thể theo nguyện vọng nhà thú y hoạt động lĩnh vực chuyên môn, để cung cấp tài liệu mới, đại cho sinh viên học tập, nghiên cứu Sau 10 năm giảng dạy trải nghiệm kinh nghiệm lâm sàng, chúng tơi tiến hành biên soạn giáo trình “Nấm học thú y” Cấu trúc giáo trình chia làm phần lớn: Nấm học đại cương, Nấm học chuyên khoa Nấm học thực hành Giáo trình gồm 14 chương, phân công biên soạn sau: Mở đầu: PGS.TS Nguyễn Bá Hiên Phần nấm học đại cương PGS.TS Nguyễn Bá Hiên, ThS Cao Thị Bích Phượng biên soạn gồm chương Phần nấm học chuyên khoa PGS.TS Nguyễn Bá Hiên, TS Đặng Hữu Anh biên soạn gồm chương Phần Nấm học thực hành PGS.TS Nguyễn Bá Hiên, ThS Vũ Thị Ngọc biên soạn gồm chương Trong q trình biên soạn, chúng tơi cố gắng cập nhật kiến thức mới, thể tính bản, tính đại, tính khoa học, tính hệ thống chương trình mơn học Hy vọng sách giáo trình học tập tốt cho sinh viên tài liệu tham khảo hữu ích cho cán chuyên ngành Để biên soạn sách này, chúng tơi có sử dụng số hình ảnh tư liệu nhiều đồng nghiệp, xin cảm ơn tác giả iii Mặc dù cố gắng đọc, học, tham khảo nhiều tài liệu bậc tiền bối trong, nước cập nhật kinh nghiệm ngồi thực tế khả người viết có hạn nên khơng tránh khỏi nhiều thiếu sót Rất mong dẫn đóng góp ý kiến bạn đọc xa gần để sách hoàn thiện lần xuất sau Xin trân trọng cảm ơn! Các tác giả iv MỤC LỤC LỜI NÓI ĐẦU iii PHẦN A ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM HỌC THÚ Y Chương GIỚI THIỆU CHUNG VỀ GIỚI NẤM 1.1 ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỀ CẤU TẠO CỦA GIỚI NẤM 1.1.1 Đặc điểm chung giới nấm 1.1.2 Đặc điểm cấu tạo chung nấm 1.2 NẤM MEN 1.2.1 Đặc điểm chung 1.2.2 Hình thái cấu trúc tế bào nấm men 1.2.3 Sinh sản chu kỳ sống nấm men 10 1.2.4 Chu kỳ sống nấm men phân thành loại hình 15 1.2.5 Phân loại nấm men 15 1.2.6 Vai trò nấm men 16 1.3 NẤM SỢI 17 1.3.1 Đặc điểm chung 17 1.3.2 Dinh dưỡng tăng trưởng nấm mốc 17 1.3.3 Hình thái cấu trúc nấm sợi 18 1.3.4 Sinh sản nấm mốc 22 1.3.5 Các dạng biến hóa hệ sợi nấm 26 1.3.6 Hệ thống phân loại nấm 28 1.3.7 Vai trò nấm sợi 29 CÂU HỎI ÔN TẬP 31 Chương PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ CÁC BỆNH DO NẤM GÂY RA 32 2.1 PHÒNG CÁC BỆNH DO NẤM 32 2.1.1 Thực vệ sinh đề phòng nấm xâm nhập thể 32 2.1.2 Ngăn ngừa nhiễm nấm gây lan 33 2.1.3 Chủ động phòng bệnh cách điều trị 33 2.2 CHỮA CÁC BỆNH DO NẤM 33 2.2.1 Nguyên tắc chung 33 v 2.2.2 Điều trị bệnh nấm da 35 2.2.3 Điều trị bệnh nấm lơng tóc 44 2.2.4 Điều trị nấm móng 44 2.2.5 Điều trị bệnh nấm men 44 2.2.6 Điều trị bệnh nấm nội tạng 46 2.3 KHÁNG SINH VÀ BIỆT DƯỢC CHỐNG NẤM 47 2.3.1 Thuốc gây trở ngại tổng hợp vách tế bào 47 2.3.2 Thuốc gây tổn hại màng tế bào chất 47 2.3.3 Thuốc gây trở ngại tổng hợp Sterol 57 2.3.4 Thuốc gây trở ngại máy dẫn truyền điện tử 58 2.3.5 Kháng sinh hệ Quinon 59 2.3.6 Thuốc gây trở ngại tổng hợp ADN 59 2.3.7 Thuốc trở ngại mạng lưới nội chất 60 CÂU HỎI ÔN TẬP 64 PHẦN B NẤM HỌC THÚ Y CHUYÊN KHOA VÀ BỆNH NẤM THƯỜNG GẶP Ở ĐỘNG VẬT 65 Chương NẤM DA VÀ NẤM NGOÀI DA 65 (SUPERFICIAL AND CUTANEOUS MYCOSES) 65 3.1 TRICHOPHYTON 66 3.1.1 Đặc điểm hình thái phân loại 66 3.1.2 Đặc điểm nuôi cấy đặc điểm sinh học 68 3.1.3 Sức đề kháng 69 3.1.4 Độc lực 70 3.1.5 Tính gây bệnh 70 3.1.6 Chẩn đoán 71 3.1.7 Phòng trị bệnh 72 3.2 MICROSPORUM 73 3.2.1 Đặc điểm hình thái phân loại 73 3.2.2 Đặc điểm nuôi cấy đặc điểm sinh học 75 3.2.3 Sức đề kháng 76 3.2.4 Độc lực 76 3.2.5 Tính gây bệnh 77 vi 3.2.6 Chẩn đoán 78 3.2.7 Phòng trị bệnh 78 3.3 EPIDERMOPHYTON 79 3.3.1 Đặc điểm hình thái phân loại 79 3.3.2 Đặc điểm nuôi cấy đặc điểm sinh học 79 3.3.3 Sức đề kháng 80 3.3.4 Độc lực 80 3.3.5 Tính gây bệnh 80 3.3.6 Chẩn đoán 81 CÂU HỎI ÔN TẬP 82 Chương NẤM DƯỚI DA (SUBCUTANEOUS MYCOSES) 83 4.1 SPOROTHRIX 83 4.1.1 Đặc điểm hình thái phân loại 83 4.1.2 Đặc điểm nuôi cấy đặc điểm sinh học 84 4.1.3 Sức đề kháng 85 4.1.4 Độc lực 85 4.1.5 Tính gây bệnh 85 4.1.6 Chẩn đoán 86 4.1.7 Phòng trị bệnh 87 4.2 MYCETOMA 87 4.2.1 Đặc điểm hình thái phân loại 87 4.2.2 Đặc điểm nuôi cấy đặc điểm sinh học 89 4.2.3 Sức đề kháng 90 4.2.4 Độc lực 90 4.2.5 Tính gây bệnh 90 4.2.6 Chẩn đoán 91 4.2.7 Phòng trị bệnh 92 CÂU HỎI ÔN TẬP 92 Chương NẤM NỘI TẠNG (SYSTEMIC MYCOSES) 93 5.1 BLASTOMYCES 93 5.1.1 Đặc điểm hình thái phân loại 93 5.1.2 Đặc tính nuôi cấy đặc điểm sinh học 95 vii 5.1.3 Các yếu tố độc lực chế sinh bệnh 95 5.1.4 Sức đề kháng 96 5.1.5 Tính gây bệnh 96 5.1.6 Chẩn đoán 99 5.1.7 Phòng, trị bệnh 101 5.2 COCCIDIOIDES 101 5.2.1 Đặc điểm hình thái phân loại 101 5.2.2 Đặc điểm nuôi cấy 102 5.2.3 Sức đề kháng 102 5.2.4 Độc lực 102 5.2.5 Tính gây bệnh 103 5.2.6 Chẩn đoán 104 5.2.7 Phòng trị bệnh 107 5.3 CRYPTOCOCCUS 107 5.3.1 Đặc điểm hình thái phân loại 107 5.3.2 Đặc điểm nuôi cấy đặc điểm sinh học 108 5.3.3 Sức đề kháng 110 5.3.4 Độc lực 111 5.3.5 Tính gây bệnh 111 5.3.6 Chẩn đoán 112 5.3.7 Phòng trị bệnh 114 5.4 HISTOPLASMA 114 5.4.1 Đặc điểm hình thái phân loại 114 5.4.2 Đặc điểm nuôi cấy đặc điểm sinh học 116 5.4.3 Sức đề kháng 116 5.4.4 Độc lực 117 5.4.5 Tính gây bệnh 117 5.4.6 Chẩn đoán 118 5.4.7 Phòng điều trị 119 5.5 ASPERGILLUS 119 5.5.1 Đặc điểm hình thái phân loại 120 5.5.2 Đặc điểm nuôi cấy đặc điểm sinh học 121 viii 5.5.3 Sức đề kháng 123 5.5.4 Độc lực 123 5.5.5 Tính gây bệnh 126 5.5.6 Chẩn đoán 127 5.5.7 Phòng trị bệnh 128 CÂU HỎI ÔN TẬP 128 Chương NẤM CƠ HỘI (OPPORTUNISTIC MYCOSES) 129 6.1 CANDIDA 129 6.1.1 Đặc điểm hình thái phân loại 129 6.1.2 Đặc điểm nuôi cấy đặc điểm sinh học 130 6.1.3 Sức đề kháng 131 6.1.4 Độc lực 131 6.1.5 Tính gây bệnh 132 6.1.6 Chẩn đoán 133 6.1.7 Phòng trị bệnh 134 6.2 MUCOR 135 6.2.1 Hình thái phân loại 135 6.2.2 Đặc điểm nuôi cấy đặc điểm sinh học 136 6.2.3 Sức đề kháng 137 6.2.4 Độc lực 137 6.2.5 Tính gây bệnh 138 6.2.6 Chẩn đoán 139 6.2.7 Điều trị 139 6.3 RHIZOPUS 139 6.3.1 Đặc điểm hình thái phân loại 139 6.3.2 Đặc điểm nuôi cấy đặc điểm sinh học 140 6.3.3 Sức đề kháng 141 6.3.4 Độc lực 141 6.3.5 Tính gây bệnh 142 6.3.6 Chẩn đoán 142 6.3.7 Phòng trị bệnh 142 CÂU HỎI ÔN TẬP 143 ix Chương BỆNH DO NẤM GÂY RA Ở GIA CẦM 144 7.1 BỆNH DACTYLARIA (NẤM NÃO) 144 7.1.1 Căn bệnh 144 7.1.2 Một số đặc điểm dịch tễ học 144 7.1.3 Triệu chứng bệnh tích 144 7.1.4 Chẩn đoán 144 7.1.5 Phòng điều trị 145 7.2 BỆNH DO ASPERGILLUS (NẤM PHỔI) - ASPERGILLOSIS 145 7.2.1 Căn bệnh 145 7.2.2 Một số đặc điểm dịch tễ học 145 7.2.3 Triệu chứng bệnh tích 145 7.2.4 Chẩn đoán 146 7.2.5 Phòng điều trị 146 7.3 BỆNH DO MONILIA (NẤM ĐƯỜNG TIÊU HÓA) - MONILIASIS 147 7.3.1 Căn bệnh 147 7.3.2 Một số đặc điểm dịch tễ học 147 7.3.3 Triệu chứng bệnh tích 147 7.3.4 Chẩn đoán 147 7.3.5 Phòng điều trị 148 7.4 BỆNH FAVUS (NẤM DA) 148 7.4.1 Căn bệnh 148 7.4.2 Một số đặc điểm dịch tễ học 148 7.4.3 Triệu chứng bệnh tích 148 7.4.4 Chẩn đoán 148 7.4.5 Phòng điều trị 149 7.5 BỆNH NGỘ ĐỘC THỨC ĂN DO ĐỘC TỐ NẤM MỐC (MYCOTOXICOSIS) 149 7.5.1 Căn bệnh 149 7.5.2 Một số đặc điểm dịch tễ học 150 7.5.3 Triệu chứng bệnh tích 150 7.5.4 Chẩn đoán 151 7.5.5 Phòng điều trị 151 CÂU HỎI ÔN TẬP 152 x - Hấp 120oC - Lọc qua - San vào ống nghiệm - Hấp 110oC 30 phút Nếu arbutin bị nấm phân huỷ, mơi trường có màu nâu đậm 13.2 KỸ THUẬT NUÔI CẤY NẤM Thủ thuật nuôi cấy nấm phải tiến hành qua bước: Định hướng cấy, nuôi cấy, theo dõi sau nuôi cấy 13.2.1 Định hướng nuôi cấy nấm Nuôi cấy nấm gây bệnh thú y khác với điều tra nấm ngồi thiên nhiên, cần phải có định hướng nuôi cấy Diễn biến lâm sàng, bệnh phầm lấy điều kiện giúp cho định hướng nuôi cấy Đồng thời sau kết phân lập đầu tiên, hình dạng nấm gợi ý cho định hướng nuôi cấy nấm tiếp tục Việc định hướng ni cấy nấm quan trọng định thủ thuật nuôi cấy, xác định loại môi trường cần thiết, ấn định quy tắc theo dõi 13.2.2 Nuôi cấy nấm Có nhiều thủ thuật ni cấy khác Ni cấy hạt nghiêng, nuôi cấy môi trường lỏng, nuôi cấy đĩa thạch, nuôi cấy phiến kính, ni cấy nhẫn 13.2.2.1 Ni cấy nấm thạch nghiêng Hầu loại nấm cần nuôi cấy thạch nghiêng để phân lập, định loại, giữ giống Thường dùng hai loại ống nghiệm 18×180mm 30×180mm Đối với bệnh phẩm tiến hành thủ thuật cấy chuyển Thường cấy môi trường mặt thạch điểm, có điểm giữa, có điểm bờ Khi có khuẩn lạc thường soi kính quan sát điểm bờ thạch bờ khơng dày, dễ soi 13.2.2.2 Nuôi cấy nấm môi trường lỏng Thủ thuật nuôi cấy nấm môi trường lỏng giống cấy nấm thạch nghiêng Cần ý hơ nóng que cấy cần để nguội để khơng làm nóng mơi trường 13.2.2.3 Ni cấy nấm đĩa thạch Trong ống nghiệm ni cấy khó thấy chi tiết khuẩn lạc thể tích thạch hạn chế Để có khuẩn lạc lớn ni cấy nấm đĩa thạch Một phương thức khác đem lại kết tương tự nuôi cấy chai Roux Nuôi cấy nấm đĩa thạch cịn có ưu điểm tạo điều kiện để dễ quan sát phần rìa phần đáy khuẩn lạc 208 Thường dùng hộp lồng petri để đổ thạch thành lớp mỏng Khi đổ thạch khơng nên đổ lúc thạch cịn q nóng để trách giọt nước đọng nắp hộp Sau có hộp thạch, cấy nấm phải làm thao tác nhanh Chỉ cần mở hộp thạch để cấy làm tránh tạp nhiễm 13.2.2.4 Ni cấy nấm phiến kính Ni cấy nấm phiến kính cần số mơi trường Phương pháp nuôi cấy phương pháp ni cấy diện tích nhỏ giúp cho dễ theo dõi hình thái nấm nấm mỏng manh, dễ gẫy Phiến kính dùng để nuôi cấy phải thật suốt, vô trùng Lamen chuẩn bị phiến kính Ngồi cịn cần chuẩn bị khung thuỷ tinh nhỏ hình chữ U Sau ni cấy phiến kính khung đặt vào hộp lồng Trên mặt kính nhỏ môi trường cấy nấm Khung thuỷ tinh dùng để ngăn cách môi trường khuẩn lạc với lamen Cũng đặt thẳng lamen khuẩn lạc muốn quan sát 13.2.2.5 Nuôi cấy nấm nhẫn Phương pháp nhằm ni nấm diện tích nhỏ tránh tạp nhiễm quan sát theo chiều nghiêng Dụng cụ nuôi cấy nhẫn hình đặc biệt, đường kính 15mm, dày 2mm, làm kim loại khơng rỉ, vịng có lỗ nhỏ cách 90 độ, lỗ thông với ống kim khí hình phễu để nút bơng Nhẫn tiệt khuẩn tủ sấy khơ, trước tiệt khuẩn phải nút hai nỗ Phiến kính, lamen phải tiệt khuẩn trước, cịn parafin để gắn dùng phải đun nóng chảy 58oC parafin sấy 160oC trước để tiệt khuẩn Thường người ta dùng môi trường Sabouraud có 1,5% thạch Trong q trình chế mơi trường phải lọc thật kỹ qua lần gạc, nuôi cấy phải đun cho tan Tuỳ theo mục đích nghiên cứu mà cách cấy nhẫn khác a Phương pháp chọc sâu Dùng ống hút Pasteur vô trùng, lấy mơi trường nóng chảy cho vào nhẫn, cho thạch vào tránh để bọt, phải để đứng thạch nửa vòng nhẫn Sau thạch đông, mở nút đối diện với mặt thạch dùng que cấy bạch kim thẳng cấy sát phía lamen kính đậy nút bơng lại b Phương pháp cấy bề mặt Cho thạch vào nhẫn cách nói trên, nhỏ giọt nước muối sinh lý có bào tử nấm mặt thạch 209 c Phưuơng pháp cấy nghiêng Hồ bào tử nấm với mơi trường đun nóng chảy để nguội đến 50oC Dùng ống hút Pasteur lấy hỗn hợp cho vào vịng nhẫn, đổ cần để nghiêng để tiện rót mơi trường, tốt rót phần bên lamen kính, nấm mọc nghiêng lamen kính có mơi trường d Phương pháp ni cấy lamen kính Cấy nấm vào lamen có lớp mơi trường mỏng úp lamen lên vịng nhẫn Ngồi cịn có cách cấy bào tử lên lamen cho giọt mơi trường đun nóng chảy để nguội đến 50oC lên trên, xong lại gắn lamen vào nhẫn Phương pháp đưa lại kết tương đối tốt khắc phục khó khăn kể trên, cho biết hình thái sợi nấm, phân bố sợi nấm, ví dụ cách chia nhánh cuống bào tử đặc điểm khác nấm e Phương pháp nuôi cấy J.T Dancn Đun thạch cho nóng chảy đổ vào đĩa thành lớp mỏng độ dày khoảng 2mm, thạch đơng hồn tồn dùng dao vơ trùng cắt thành mẩu hình vng, mẩu có khích thước 1cm, sau cho lên phiến kính vơ trùng cấy nấm lên cạnh mẩu thạch Đậy lamen lại để vào hộp lồng nói Nấm mọc lên phiến kính lamen Có thể lấy soi mà không bị nhiễm nấm tạp Khi nấm mọc đạt yêu cầu gỡ nhẹ lamen ra, úp lên phiến kính có giọt dung dịch làm ướt thấm thuốc nhuộm Giỡ bỏ lớp thạch để nguyên phần nấm phiến kính, cho giọt dung dịch thấm ướt, đậy lamen lên tiêu thứ hai f Phương pháp nuôi cấy nấm giấy bóng kính So sánh với phương pháp ni cáy phiến kính, lamen kính, ni cấy bóng kính đạt kết tốt Có hai phương pháp đơn giản: * Dùng bóng kính cắt thành mẫu nhỏ kích thước khoảng 3cm đem ngâm giấy vào hộp lồng tiệt khuẩn nước Dùng kẹp vô trùng lấy số mẫu cho vào hộp lồng sấy khô, hộp để chứng 6-8 mẩu giấy vừa; thời gian nuôi cấy cần lâu dài lót vào nắp hộp lồng mẩu giấy thấm nước cất vô trùng Trên mẩu giấy bóng kính cấy nhiều điểm, sau để nhiệt độ thích hợp theo dõi nấm phát triển * Phương pháp ni cấy nấm giấy bóng kính Fleming Smith: Lấy mẩu giấy bóng kính ngâm vào ống nghiệm ngắn, sau đem đun sơi tiệt khuẩn áp suất cao Dùng kẹp vô trùng lấy số mẩu giấy bóng đặt vào mặt hộp lồng có thạch Cấy nấm lên mẩu giấy bóng nhiều điểm khác nhau, chất dinh dưỡng khuếch tán qua lớp màng mỏng giấy bóng kính làm cho nấm mọc bình thưuờng Muốn nghiên cứu bào tử nảy mầm dùng loại mơi trường nào, kiểm tra tiếp sinh trưởng sinh sản bào tử tốt dùng mơi trường pha lỗng độ 10 lần, có 100 lần Như thu khuẩn lạc mỏng suốt 210 Bằng phương pháp này, lấy từ mẫu tùy thời gian kiểm tra giai đoạn sinh trưởng khác nhau, xử lý phương pháp khác Nhờ giấy suốt nên soi phần trung tâm khuẩn lạc cách dễ dàng Cũng gấp đơi cho đường gấp qua khuẩn lạc, cuống hạt dính bong khỏi đường gấp quan sát cách rõ ràng Tiêu đặt trực tiếp vào dung dịch laclophenol, cố định trước formalin Khi nhuộm dùng thuốc khơng bắt màu vào giấy bóng kính Làm nước gắn keo để bảo tồn tiêu lâu dài 13.2.3 Theo dõi ni cấy nấm Q trình theo dõi ni cấy nấm nhằm mục đích định loại nghiên cứu cần có khiết khuẩn lạc nấm, quan sát đại thể vi thể khuẩn lạc 13.2.3.1 Thuần khiết khuẩn lạc nấm Thơng thường khuẩn lạc mọc có nấm tạp nhiễm tạp nhiễm vi khuẩn mọc mơi trường phải khiết khuẩn lạc nấm tiên hành định loại nghiên cứu Muốn khiết khuẩn lạc nấm, phải tiến hành biện pháp: Ngăn cản phát triển vi khuẩn tách rời khuẩn lạc nấm với khuẩn lạc tạp nhiễm, pha lỗng khuẩn lạc cộng sinh để có khuẩn lạc nấm mọc riêng rẽ, dùng yếu tố nhiệt độ thích hợp để tách khuẩn lạc, cấy truyền, ngăn cản phát triển nấm vi khuẩn tạp nhiễm lấy bệnh phẩm nuôi cấy Những bệnh phẩm nấm thường dễ tạp nhiễm thương tổn nấm có tượng cộng sinh với nhưũng vi sinh vật khác; phịng thí nghiệm nấm, tủ cấy nấm, sau q trình sử dụng dễ tạp nhiễm Vì trường hợp nuôi cấy nấm cần khuẩn thiết a Ngăn cản phát triển vi khuẩn môi trường cấy nấm Những kháng sinh thơng dụng penicilin, tetraxyclin… có tác dụng ngăn cản phát triển nhiều loại vi khuẩn khơng có tác dụng ngăn cản phát triển nấm Hiện nay, môi trường nuôi cấy nấm thường bổ sung them kháng sinh để tránh tạp nhiễm vi khuẩn q trình ni cấy nấm Cần ý sử dụng nhiều loại kháng sinh phối hợp, kháng sinh phải khơng có tác dụng ức chế phát triển nấm b Tách riêng rẽ khuẩn lạc cấy Kết định loại, nghiên cứu thường gặp khó khăn mơi trường ni cấy có nhiều khuẩn lạc vi sinh vật mọc gần nhau, không nhận định khuẩn lạc riêng rẽ Có từ bệnh phẩm có giống loại nấm khác mọc gần Những khuẩn lạc vi sinh vật mọc gần ức chế lẫn có khuẩn lạc ưu làm tàn lụi khuẩn lạc khác Do đặc điểm này, cấy nấm phải tiến hành đường cấy rời rạc nhau, xa Cũng không nên cấy 211 lượng nhiều bệnh phần mà nên cấy lượng bệnh phẩm nhỏ Từ thủ thuật tiến hành có khuẩn lạc tương đối khiết từ lần cấy c Pha loãng nấm Có loại bệnh phẩm nấm men ni cấy khuẩn lạc thường mọc đặc, mọc dày mơi trường có cộng sinh nhiều loại khuẩn lạc vi khuẩn khác Trong trường hợp này, phải tiến hành pha loãng nấm Cách thức pha loãng nấm tiến hành theo cách thức cổ điển để pha lỗng vi khuẩn Cách pha lỗng thơng dụng đổ mơi trường có khuẩn lạc mọc vào mơi trường thạch đun lỏng có nhiệt độ khoảng 40oC, sau đổ thạch vào hộp lồng petri Dùng dao mổ ngòi bút chủng đậu khoét riêng rẽ khoảng thạch có khuẩn lạc mọc để cấy truyền theo dõi d Dùng yếu tố nhiệt độ để khiết nấm Do đặc điểm sinh thái, giống loại nấm có yêu cầu nhiệt độ khác Có loại nấm mọc tốt nhiệt độ 25oC có loại nấm mọc tốt nhiệt độ 37oC Lợi dụng đặc điểm sinh thái này, cấy nấm cần để ống nuôi cấy tối thiểu tủ ấm khác nhau: tủ ấm 25oC tủ ấm 37oC Nếu có điều kiện đặt ống mi trưuờng nhiệt độ phịng thí nghiệm, tủ ấm 37oC Nếu tiến hành từ lần cấy có khuẩn lạc khác nhau, phát triển khác Loại nấm ưa nhiệt độ 25oC phát triển nhanh tốt tủ ấm thích hợp Cá biệt có loại nấm ưa nhiệt độ cao phát triển điều kiện nhiệt độ 37oC (thường 40–42oC) e Cấy truyền nấm để khiết Từ bệnh phẩm qua lần đầu ni cấy dễ có nhiều loại khuẩn lạc Phương pháp cấy truyền cần thiết để có khuẩn lạc nấm khiết Khi cấy truyền phải ý cấy truyền thời gian khơng để nấm có biến dị biến dạng Số lần phải truyền thay đổi tuỳ theo trường hợp, nói chung phải cấy truyền lúc có khuẩn lạc khiết f Chống tạp nhiễm từ khâu lấy bệnh phẩm nuôi cấy phịng thí nghiệm Khi lấy bệnh phẩm, phải ý tuân thủ nguyên tắc tiệt khuẩn dẫn giảm nhiều khuẩn lạc cộng sinh vi khuẩn Phịng thí nghiệm, từ ni cấy nấm nơi tiếp thu nhiều nấm bệnh khác nhau, thường có nhiều bào tử nấm Vì phải tiệt khuẩn phòng thường kỳ tiệt khuẩn tia cực tím Các phiến kính, ống nghiệm, que cấy sau sử dụng cần tiệt khuẩn triệt để Ngay người tiến hành nuôi cấy, quần áo mặc cần ý thực vô khuẩn 13.2.3.2 Quan sát đại thể khuẩn lạc nấm Trong q trình ni cấy, khuẩn lạc nấm theo dõi hàng ngày nhằm quan sát phát triển đại thể, việc quan sát nhiều khâu: tốc độ phát triển khuẩn lạc, 212 hình dạng khuẩn lạc, cấu tạo mặt khuẩn lạc, tâm khuẩn lạc, ria khuẩn lạc, cấu tạo mặt khuẩn lạc a Tốc độ phát triển khuẩn lạc Tốc độ phát triển khuẩn lạc có liên quan đế việc định loại nấm Có loại khuẩn lạc mọc sớm, có loại khuẩn lạc mọc muộn Sau mọc, tốc độ phát triển tiếp tục nhanh hay chậm thay đổi tuỳ theo sinh thái loại nấm Vì quan sát đại thể phải ý: Thời gian xuất khuẩn lạc tốc độ phát triển tiếp tục Trong quan sát tốc độ phát triển nấm, cần ý tới dung tích mơi trường Những ống cấy nhỏ, chứa mơi trường làm hạn chế tốc độ phát triển khuẩn lạc nấm Cần ý thêm có loại nấm mọc chậm; có loại nấm mọc tháng sau ni cấy Vì không nên loại bỏ sớm ống nuôi cấy chưa thấy khuẩn lạc mọc sau tuần lễ b Hình dạng khuẩn lạc Hình thái khuẩn lạc nấm quan trọng cho định loại Khuẩn lạc nấm đa dạng hình thái Mỗi loại nấm khác có hình dạng khuẩn lạc khác nhau, khuẩn lạc nấm có dạng tơ hay lơng, có mượt nhung, có có dạng nhẵn vi khuẩn… Bề mặt khơng đặn, có khuẩn lạc mọc phẳng có khuẩn lạc có sùi c Cấu tạo bề mặt khuẩn lạc Tuỳ theo loại nấm, mặt khuẩn lạc có vết nhăn hình cuộn xoắn, xếp theo dạng tia Cũng có loại nấm bề mặt có rãnh Tuỳ theo giai đoạn phát triển, khuẩn lạc tạo thành quầng d Rìa khuẩn lạc Hình thái rìa khuẩn lạc khác tuỳ loại Có khuẩn lạc có rìa nham nhở khơng đặn; có khuẩn lạc có rìa dài, có loại có rìa mỏng e Màu sắc khuẩn lạc Màu sắc khuẩn lạc thay đổi: - Màu sắc thay đổi tuỳ theo giai đoạn phát triển: Có thể lúc đầu khuẩn lạc có màu trắng, sau chuyển sang màu nâu, cuối chuyển sang màu đen … - Khuẩn lạc có màu sắc thay đổi tuỳ theo vùng: có khoảng trắng khoảng nâu xen kẽ lẫn lộn, vùng màu trắng, vùng rìa màu xám,… - Khuẩn lạc có sắc tố màu khác rải rác - Đáy khuẩn lạc có màu khác Khi quan sát khuẩn lạc đại thể, cần ý đặt ống nghiệm hộp lồng nuôi cấy để quan sát màu sắc đáy khuẩn lạc 213 Cho đến việc quan sát đại thể khuẩn lạc khâu quan trọng định loại nghiên cứu nấm Quá trình quan sát phải tiến hành thường xuyên, có ghi chép, có đối chiếu với nhưũng đặc điểm định dạng nấm 13.2.3.3 Quan sát vi thể nấm Sau tiến hành quan sát đại thể nấm, phải tiếp tục quan sát vi thể nhằm nhận xét hình dạng vi thể Trước tiên nên dùng kính lúp để quan sát bề mặt khuẩn lạc Việc quan sát lúp giúp xác định vị trí lấy nấm để quan sát kính hiển vi Trong quan sát vi thể đơn giản kht mảnh mơi trường có nấm để soi kính Mảnh kht phải khơng lớn phải đủ không thừa để tách xem kính Thường tách mảnh nấm dung dịch lacto – phenol tốt dung dịch xanh coton lactophenol, tốt dùng dung dịch xanh coton lactophenol Phương pháp đơn giản không đủ để kết luận cho quan sát vi thể, mảnh nấm khơng thể đại diện cho toàn khuẩn lạc mà khoảng khuẩn lạc Nguồn: Phan Thị Thanh Diễm & cs (2018) Hình 12.5 Một số hình dạng nấm mốc 214 CÂU HỎI ƠN TẬP Trình bày số môi trường nuôi cấy nấm? Trình bày kỹ thuật ni cấy nấm? 215 Chương 14 GÂY NHIỄM NẤM TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM Nghiên cứu chẩn đoán bệnh nấm gây ra, cần thiết phải gây nhiễm nấm động vật Muốn gây nhiễm thực nghiệm nấm tốt phải chọn lọc động vật cảm nhiễm, chọn lọc đường gây nhiễm, phải có mầm bệnh nấm gây nhiễm thích hợp cuối phải đọc kết xác Chương trình bày số kỹ thuật gây nhiễm nấm động vật thí nghiệm 14.1 ĐỘNG VẬT GÂY NHIỄM Những động vật gây nhiễm thường dùng chuột lang, chuột nhắt trắng, chuột cống trắng, thỏ Những súc vật gây nhiễm phải khơng có bệnh, ni dưỡng tốt để khơng gây nhầm lẫn kết sống dài ngày đáp ứng cho yêu cầu thí nghiệm 14.2 ĐƯỜNG GÂY NHIỄM Có nhiều đường gây nhiễm thơng thường dùng đường tiêm da đường tiêm vào phúc mạc Đường tiêm tĩnh mạch thường dùng dễ gây phản ứng sai lệch Đường gây nhiễm nên tương tự thực tế lâm sàng, ví dụ gây thương tích, sây xát trước gây nhiễm loại nấm gây nhiễm phương pháp cho hít bụi nấm gây nhiễm đường phế quản Đối với nấm gây bệnh da, phương pháp nhiễm tốt cho da tiếp xúc trực tiếp với nấm Tuỳ theo phương pháp cụ thể, tiến hành tiêm truyền gây nhiễm khác 14.2.1 Tiêm nội bì (trong da) Thường dùng để thử phản ứng kháng nguyên nấm Dùng ống tiêm loại 1ml kim nhỏ, cách tiêm người Khi tiêm nội bì, nên chọn vật lơng trắng khơng phải bôi thuốc rụng lông trước ngày cạo lông để quan sát rõ nốt mần phản ứng kháng nguyên Tiêm da với động vật khó người da động vật mỏng Khi tiêm phải tạo thành nốt phồng không tiêm vào da Khi rút kim phải lấy cồn ấn chặt vào mũi tiêm tinh chất nấm không chảy theo 14.2.2 Tiêm da Được áp dụng loại nấm bệnh da Sporotrichum, Blastomyces… Người ta lấy hỗn dịch nấm tiêm vào thành bụng hay bẹn Đối với bệnh nấm gây tổn thương bạch hạch huyết Sporotrichum nên tiêm bẹn để sau dễ quan sát hạch bị sưng to Chỉ cần cố định vật thật tốt, sát trùng cẩn thận, beo da lên tiêm bệnh phẩm vào, không cần phải cạo nhổ lông Nếu thấy chỗ 216 tiêm lồi lên tiêm phương pháp, không thấy lồi tức tiêm vào ổ bụng, cần phải rút kim tiêm lại Sau tiêm lấy ấn chặt vào mũi tiêm cho tinh chất nấm không chảy 14.2.3 Tiêm bắp thịt Thường tiêm vào bắp thịt đùi chân sau, bắp thịt thành bụng phía bên thành vùng xương ức 14.2.4 Tiêm tĩnh mạch Tuỳ theo loại động vật thí nghiệm mà chọn vị trí tĩnh mạch tốt 14.2.4.1 Thỏ Nơi tiêm tốt tĩnh mạch tai thỏ Để đề phòng trường hợp phải tiêm nhiều làm nát tĩnh mạch tắc lần nên tiêm từ cuối tĩnh mạch, lần sau tiêm lên cao Trước tiêm, cố định thỏ bàn mổ có người giữ, lấy tay búng khẽ vào tai thỏ nhiều lần làm cho tĩnh mạch giãn lên rõ rệt nắm lấy tai thỏ vuốt nhẹ dễ gây xung huyết Tiêm bệnh phẩm từ từ vào tĩnh mạch Nếu tiêm vào tĩnh mạch, bệnh phẩm đẩy máu chảy tan ra, tai thỏ trở nên trắng bơm dễ dàng Không nên tiêm vào tĩnh mạch hai mép tai Sau rút kim ra, tĩnh mạch hay bị chảy máu nên phải lấy cồn giữ chặt vào chỗ tiêm vài phút bỏ Nếu máu chảy nhiều bứt lơng bụng ấn vào chỗ máu chảy, máu cầm 14.2.4.2 Chuột lang Tiêm tĩnh mạch chuột lang khó, thường phải cố định chuột lên bàn mổ, gây mê, mổ đùi chuột, bộc lỗ tĩnh mạch để tiêm Tiêm xong khâu da lại 14.2.4.3 Chuột bạch Thường tiêm vào tĩnh mạch hai bên đuôi chuột Trước tiêm nhúng đuôi chuột vào nước nóng 50oC nửa phút để làm cho da mềm máu tụ lại, mạch máu giãn to để tiêm Sau cho chuột vào ống cốc có khe nhỏ để lịi ngồi tiến hành tiêm tĩnh mạch, tiêm xong phải tiệt trùng Đối với số bệnh nấm nội tạng với bệnh nấm có khả nhiễm vào máu Candida thường gây nhiễm đường tĩnh mạch 14.2.5 Tiêm vào màng bụng 14.2.5.1 Thỏ chuột lang Phải uốn cong vật phía trước ruột dồn phía hồnh, sau sát trùng beo da bụng, đâm thẳng kim vào Khi kim tiêm đâm qua thành bụng xoay ống tiêm vịng để xem kim có bị vướng vào ruột, vào thịt khơng, sau bơm bệnh phẩm chất nấm Tiêm xong rút kim sát trùng 217 14.2.5.2 Chuột bạch Trước hết dùng tay phải nắm đuôi chuột, tay trái nắm gáy chuột, sau tay trái vừa nắm gáy chuột vừa kẹp chuột lật ngửa chuột ra, tay phải sát trùng tiêm qua màng bụng, không thấy phồng 14.2.6 Tiêm vào não Thường gây nhiễm vào não với loại nấm gây bệnh lỗ chức thần kinh Cryplococcus neoformans hay Torula neoformans Vị trí tiêm hai mắt, phải tiến hành gây mê cho vật Với chuột nhắt trắng, dùng loại ống tiêm 1ml với kim nhỏ chọc qua da xương sọ bơm bệnh phẩm dịch nấm vào khoảng 0,2ml Đối với vật lớn thỏ, phải dùng khoan vơ trùng hay dùi vơ trùng để xuyên thủng xương sọ tiêm kim thường Thể tích tiêm từ 0,1-0,15ml với chuột lang, 0,20,3ml với thỏ 14.2.7 Gây nhiễm thực nghiệm với nấm da Trước hết phải nhổ hết lông dùng thuốc bôi rụng lông để bộc lộ vùng da cần gây nhiễm Sau dùng kim chủng đậu đinh ghim rạch lên da nhiều vết không làm chảy máu Lấy bào tử nấm trộn lẫn với mật ong bôi lên vùng da gây nhiễm vật Khi xuất tổn thương hàng ngày cạo lấy vẩy xét nghiệm tìm nấm tiến hành nuôi cấy 14.2.8 Gây nhiễm nấm niêm mạc Thường tiến hành với nấm Candida Lấy nấm men hoà vào nước muối sinh lý vô trùng bơm miệng cho vật nuốt dùng xông nhỏ cho vào dày bơm bệnh phẩm vào 14.3 BỆNH PHẨM GÂY NHIỄM Bệnh phẩm gây nhiễm nên dùng bệnh phẩm lấy trực tiếp từ thương tổn nấm Nếu mủ, dùng 0,1-0,5ml để gây nhiễm Nếu miếng sinh thiết, nên dùng miếng mỏng 1mm gây nhiễm kim thông Trocart (ống thăm dị, ống rỗng) Tuy nhiên có lúc phải gây nhiễm nấm có mơi trường ni cấy; trường hợp cần lấy nấm khuẩn lạc phát triển đầy đủ với hình thể có 14.4 NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ GÂY NHIỄM Thơng thường kết gây nhiễm nhận định khoảng 15-30 ngày sau gây nhiễm Tuy nhiên có trường hợp bệnh phát muộn không nên sớm bỏ động vật gây nhiễm chưa thấy phát bệnh sau 30 ngày Kết nấm da 218 gây bệnh thường dễ nhận định vào thương tổn da Nhưng nấm gây bệnh nội tạng việc nhận định kết nhiều khó khăn Kết nhiễm thực nghiệm thường cần khẳng định thêm cách nuôi cấy phục hồi nấm, xét nghiệm thể bệnh học, làm phản ứng miễn dịch Cần ý xử lý động vật sau gây nhiễm lấy mẫu theo quy trình để tránh mầm bệnh khơng phát tán ngồi mơi trường CÂU HỎI ƠN TẬP Trình bày đường gây nhiễm nấm động vật thí nghiệm? 219 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ainsworth G C & Austwick P K C (1973) Fungal diseases of animals Fungal diseases of animals Buller, AH Reginald Researches on fungi, Vol VII: the sexual process in the Uredinales University of Toronto Press, 1950 Carter G R (1982) Essentials of veterinary bacteriology and mycology Essentials of veterinary bacteriology and mycology Dhama K., Chakraborty S., Verma A K., Tiwari R., Barathidasan R., Kumar A & Singh, S D (2013) Fungal/mycotic diseases of poultry-diagnosis, treatment and control: a review Pakistan Journal of Biological Sciences: PJBS, 16(23), 16261640 Diaz D E (2005) The mycotoxin blue book Nottingham University Press Gupta V K., Tuohy M G., Ayyachamy M., Turne, K M & O’Donovan A (Eds.) (2012) Laboratory protocols in fungal biology: current methods in fungal biology Springer Science & Business Media Gwynne-Vaughan, H C I., and B Barnes "The structure and development of the fungi 2nd Edit." The Univ Press, Cambridge (1937): 449 Ingold, C T "Liberation mechanisms of fungi." Airborne Microbes PH Gregory and JL Monteith, eds Cambridge University, London, UK (1967): 102-115 Kerl M E (2003) Update on canine and feline fungal diseases Veterinary Clinics: Small Animal Practice, 33(4), 721-747 Kuraishi, H "Ubiquinone systems in fungi I Distribution of ubiquinones in the major families of ascomycetes, basidiomycetes, and deuteromycetes, and their taxonomic implications." Trans Mycol Soc Japan 26 (1985): 383-395 LéJohn, H B., Roselynn M Stevenson, and R Meuser "Multivalent regulation of glutamic dehydrogenases from fungi effects of adenylates, guanylates, and acyl coenzym A derivatives." Journal of Biological Chemistry 245.21 (1970): 55695576 Moretti A & Susca A (Eds.) (2017) Mycotoxigenic fungi: methods and protocols Humana Press Nguyễn Ngọc Thụy, Lê Trần Anh (2004) Bệnh nấm Y học Nhà xuất Quân đội nhân dân, Hà Nội Nguyễn Văn Bá, Cao Ngọc Điệp & Nguyễn Văn Thành (2005) Giáo trình mơn Nấm học Nhà xuất Đại học Cần Thơ Phạm Hồng Sơn (2005) Giáo trình Vi sinh vật học Thú y Nhà xuất Đại học Huế 220 Phạm Minh Đức, Nguyễn Thanh Phương & Trần Ngọc Tuấn (2010) Tổng quan bệnh nấm động vật thủy sản Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ (16b): 88-97 Phan Thị Thanh Diễm, Phạm Thị Ngọc Lan, Ngô Thị Bảo Châu & Trần Quốc Dung (2018) Phân lập sàng lọc số chủng nấm mốc phục vụ cho nghiên cứu tạo dòng biểu gen pectinase Tạp chí Khoa học Đại học Huế 127 (1C): 95–106 Samanta I (2015) Veterinary Mycology Springer India Songer J G & Post K W (2004) Veterinary microbiology-E-book: bacterial and fungal agents of animal disease Elsevier Health Sciences Tiêu chuẩn Quốc gia (TCVN 8989:2012) Vi sinh vật thực phẩm – Phương pháp xác định Aspergillus parasiticus Aspergillus versicolor giả định 221 NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP Trâu Quỳ - Gia Lâm - Hà Nội Điện thoại: 0243 876 0325 - 024 6261 7649 Email: nxb@vnua.edu.vn www.nxb.vnua.edu.vn Chịu trách nhiệm xuất bản: ThS ĐỖ LÊ ANH Giám đốc Nhà xuất Biên tập: ĐỖ LÊ ANH ĐÀO THỊ HƯƠNG Thiết kế bìa TRẦN TÚ ANH Chế vi tính ISBN: 978 – 604 – 924 – 671 - NXBHVNN - 2022 In 150 cuốn, khổ 19 × 27 cm, tại: Cơng ty TNHH In Ánh Dương Địa chỉ: Bình Minh – Trâu Quỳ - Gia Lâm – Hà Nội Số đãng ký kế hoạch xuất bản: 463-2022/CXBIPH/7-18/ĐHNN Số định xuất bản: 14/QĐ - NXB - HVN, ngày 05/04/2022 In xong nộp lưu chiểu: II - 2022 222