Luận văn nghiên cứu xây dựng quy trình xác định acepromazine và atropine trên máy lc msms

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ SÀI GÒN LÊ MẠNH HÙNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ACEPROMAZINE VÀ ATROPINE TRÊN MÁY LC MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ Chun ngành: Cơng Nghệ Thực Phẩm TP Hồ Chí Minh - Năm 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ SÀI GỊN LÊ MẠNH HÙNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ACEPROMAZINE VÀ ATROPINE TRÊN MÁY LC MS/MS Luận văn Thạc sĩ chuyên ngành công nghệ thực phẩm Mã số: 8540101 Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Kim Phương TP Hồ Chí Minh - Năm 2019 LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phịng đào tạo Sau đại học, Khoa cơng nghệ thực phẩm - Trường Đại học công nghệ Sài Gịn, tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành Luận văn Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn TS Phạm Kim Phương - người ln tận tình dành nhiều thời gian hướng dẫn, giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu hồn thành Luận văn tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc, phòng ban Trung Tâm Y Tế Quận thành phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi trình học tập thực nghiên cứu để hồn thành Luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, đồng nghiệp, người bạn thân thiết ln giúp đỡ, động viên, khích lệ, chia sẻ khó khăn thời gian tơi học tập để hồn thành khóa học Xin chân thành cảm ơn./ Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm Học viên MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG DANH MỤC VIẾT TẮT CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .8 1.1 Tổng quan thuốc an thần kinh 10 1.1.1 Các đặc điểm thuốc an thần kinh 10 1.1.2 Phân loại thuốc an thần kinh 10 1.1.2.1 Dẫn xuất phenothiazine 10 1.1.2.2 Dẫn xuất butyrophenol .11 1.1.2.3 Dẫn xuất benzamide 11 1.1.3 Thuốc an thần kinh dùng thú y Việt Nam 12 1.2 Tổng quan hợp chất acepromazine atropine 13 1.2.1 Tổng quan hợp chất acepromazine .13 1.2.2 Tông quan hợp chất atropine 14 1.3 Tình hình nghiên cứu acepromazine atropine 15 1.3.1 Tình hình nghiên cứu acepromazine nước : 15 1.3.2 Tình hình nghiên cứu atropine nước ngồi: .18 1.4 Tổng quan hệ thống sắc ký lỏng ba tứ cực LC-MS/MS 21 1.4.1 Hệ thống sắc ký lỏng 21 1.4.2 Đầu dò khối phổ ba tứ cực 23 1.5 Tổng quan phương pháp chiết QuEChERS 26 Trang 1.5.1 Giới thiệu phương pháp chiết QuEChERS 26 1.5.2 Nguyên tắc phương pháp chiết QuEChERS 27 1.6 Thẩm định phương pháp HPLC – MS/MS 27 CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .29 2.1 Mục tiêu đề tài 29 2.2 Nội dung nghiên cứu 29 2.3 Phương pháp nghiên cứu 30 2.5 Thiết bị, hóa chất pha chế hóa chất 31 2.5.1 Thiết bị 31 2.5.2 Hóa chất 31 2.5.3 Pha chế hóa chất 31 2.6 Đánh giá phương pháp xác định acepromazin atropin LC – MS/MS 33 2.6.1 Khảo sát khoảng tuyến tính .33 2.6.2 Đánh giá ảnh hưởng mẫu thiết bị LC – MS/MS .33 2.6.3 Đánh giá hiệu suất thu hồi phương pháp 34 2.6.4 Đánh giá độ lặp lại phương pháp 34 2.6.5 Ước lượng giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng phương pháp (LOQ) .34 2.7 Đánh giá trạng sử dụng thuốc an thần chợ Thành Phố Hồ Chí Minh .34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Quy trình xác định acepromazin atropin LC – MS/MS 36 3.2 Quy trình xử lý mẫu xác định acepromazin atropin 38 Trang 3.3 Đánh giá quy trình xác định acepromazin atropin 44 3.3.1 Xây dựng khoảng tuyến tính acepromazin atropin .44 3.3.2 Đánh giá ảnh hưởng mẫu thiết bị LC – MS/MS .46 3.3.3 Đánh giá hiệu suất thu hồi phương pháp 47 3.3.4 Đánh giá độ lặp lại phương pháp 49 3.3.5 Xác định giới hạn pháp (LOD) giới hạn định lượng phương pháp (LOQ) .51 3.4 Đánh giá trạng sử dụng thuốc an thần chợ Thành Phố Hồ Chí Minh .52 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Trang DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc phân tử acepromazine 13 Hình 1.2: Cấu trúc phân tử atropine 14 Hình 1.3: Sắc ký đồ phân tích: (A) mẫu huyết ngựa điều trị medetomidine xylazine; (B) mẫu máu từ nanh điều trị acepromazine 16 Hình 1.4: sắc ký đồ (TIC) xác định AEC dẫn xuất mẫu huyết ngựa sau dùng thuốc 18 Hình 1.5: Sắc ký đồ SIM xác định atropine scopolamine mật hoa Datura 19 Hình 1.6: Sắc ký đồ phân tích dung dịch atropine sulfate obidoxime chloride thiết bị tiêm (A); Sắc ký đồ phân tích dung dịch chuẩn atropine sulfate obidoxime chloride (B) .20 Hình 1.7: Sắc ký đồ SIM sau tiêm bắp 30 phút (pralidoxime (a), atropine (b), diazepam (c), diazepam D5 (d)) 21 Hình 1.8: Hệ thống sắc kí lỏng ghép nối đầu đò khối phổ ba tứ cực .22 Hình 1.9: Sơ đồ tạo ion dương nguồn ESI 24 Hình 1.10: Q trình giải phóng ion thể 24 Hình 1.11: Bộ tứ cực 25 Hình 1.12: Sơ đồ ghi nhận liệu nhân electron 26 Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm 30 Hình 3.1: Sơ đồ xử lý mẫu xác định acepromazin atropin thịt heo, gan heo cật heo đề nghị 38 Hình 3.2: Ảnh hưởng dung môi chiết mẫu đến hiệu suất thu hồi phương pháp .39 Trang Hình 3.3: Ảnh hưởng muối chiết mẫu đến hiệu suất thu hồi phương pháp .40 Hình 3.4: Ảnh hưởng muối làm đến hiệu suất thu hồi phương pháp 42 Hình 3.5: Đồ thị khoảng tuyến tính xác định acepromazin 44 Hình 3.6: Đồ thị khoảng tuyến tính xác định atropin 45 Hình 3.7: Sắc ký đồ chuẩn acepromazin atropin 100ppb .45 Hình 3.8: Sắc ký đồ thêm chuẩn 50ppb acepromazin atropin vào mẫu trắng thịt heo 49 Trang DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Bảng pha dung dịch chuẩn làm việc 33 Bảng 2.2: Bảng số kê địa điểm số lượng mẫu cần lấy phân tích 35 Bảng 3.1 Chương trình pha động gradient dung mơi 36 Bảng 3.2: Kết đánh giá ảnh hưởng mẫu .46 Bảng 3.3: Hiệu suất thu hồi yêu cầu theo AOAC 47 Bảng 3.4: Bảng số liệu đánh giá hiệu suất thu hồi phương pháp 48 Bảng 3.5: Độ lặp lại yêu cầu theo AOAC 50 Bảng 3.6: Bảng số liệu đánh giá độ lặp lại phương pháp .51 Bảng 3.7: Bảng số liệu ước lượng LOD, LOQ phương pháp .52 Bảng 3.8: Kết phân tích acepromazin atropin thịt heo, gan heo cật heo chợ (KPH: Không phát hiện) .53 Bảng 4.1: Bảng tổng hợp kết nghiên cứu 56 Trang DANH MỤC VIẾT TẮT Ký hiệu Tên Tiếng Anh ACE Acepromazine ATR Atropine KET Ketamine MED Medetomidine XYL Xylazine HPLC High Performance Liquid Chromatography Tên Tiếng Việt Sắc ký lỏng hiệu cao MS Mass Spectrometry Khối phổ LOD Limit Of Detection Giới hạn phát LOQ Limit Of Quantitation Giới hạn định lượng Trang Hình 3.6: Đồ thị khoảng tuyến tính xác định atropin Hình 3.7: Sắc ký đồ chuẩn acepromazin atropin 100ppb Trang 45 Nhận xét : Từ kết khảo sát cho thấy, khoảng tuyến tính acepromazin atropin từ ppb đến 100 ppb với hệ số tương quan tốt (R2 ≥ 0.999) Đáp ứng tất yêu cầu đường chuẩn phân tích định lượng, nhiên, tùy thuộc vào nồng độ chất phân tích có mẫu mà xây dựng khoảng tuyến tính đường chuẩn ngắn 3.3.2 Đánh giá ảnh hưởng mẫu thiết bị LC – MS/MS Quy trình đánh giá ảnh hưởng mẫu đến chất phân tích phương pháp LC – MS/MS cần thiết đặc thù thiết bị LC – MS/MS, hợp chất phải ion hóa trước di chuyển vào đầu dị MS, đó, chất phân tích pha dung mơi tinh khiết (dung dịch chuẩn), bị ion hóa khác biệt với chất phân tích chiết mẫu đặc biệt nghiên cứu không sử dụng nội chuẩn đồng vị Vì vậy, khảo sát ảnh hưởng mẫu thiết bị LC – MS/MS cần thiết để đánh giá độ phương pháp Bảng 3.2: Kết đánh giá ảnh hưởng mẫu Thịt heo C thêm chuẩn,ppb Acepromazin C thu hồi,ppb H,% Thêm chuẩn lần 100 101 101 Thêm chuẩn lần 100 102 102 Thêm chuẩn lần 100 102 102 H tb,% SD 101.55 0.20 H tb,% SD 100.00 0.15 Thịt heo C thêm chuẩn,ppb Atropin C thu hồi,ppb H,% Thêm chuẩn lần 100 99.8 99.8 Thêm chuẩn lần 100 101 100.1 Thêm chuẩn lần 100 101 100.1 Trang 46 Nhận xét : Từ kết cho thấy, ảnh hưởng mẫu thịt đến chất phân tích thiết bị LC – MS/MS khơng đáng kể Do đó, phương pháp sử dụng phân tích dư lượng thuốc an thần acepromazin atropin 3.3.3 Đánh giá hiệu suất thu hồi phương pháp Đánh giá hiệu suất thu hồi phương pháp kỹ thuật sử dụng để đánh giá độ phương pháp Đánh giá hiệu suất thu hồi phương pháp thực ba mức nồng độ thấp, trung bình cao, nhằm đảm bảo quy trình phân tích đạt độ tốt phân tích nồng độ khác sản phẩm Để đánh giá hiệu suất thu hồi phương pháp, tiến hành thêm chuẩn vào mẫu thịt heo ba khoảng nồng độ 25ppb, 50ppb, 100ppb, mức thực lần Yêu cầu đánh giá hiệu suất thu hồi: - Đa phần phương pháp chuẩn công bố giá trị định trị phương pháp thử hiệu suất thu hồi, độ lặp lại, độ tái lặp … giá trị định trị phương pháp phịng thí nghiệm thấp giá trị mà phương pháp chuẩn công bố xem phù hợp - Tuy nhiên, nghiên cứu này, sử dụng yêu cầu định trị phương pháp thử tổ chức AOAC đánh giá độ thu hồi phương pháp theo bảng 3.3: Bảng 3.3: Hiệu suất thu hồi yêu cầu theo AOAC STT Hàm lượng (%) Đơn vị Hiệu suất thu hồi, % 100 100 % 98-102 ≥ 10 10 % 98-102 ≥1 1% 97-103 Trang 47 ≥ 0.1 0.1 % 95-105 0.01 100 ppm 90-107 0.001 10 ppm 80-110 0.0001 ppm 80-110 0.00001 100 ppb 80-110 0.000001 10 ppb 60-115 10 0.0000001 ppb 40-120 Kết thể bảng 3.4: Bảng 3.4: Bảng số liệu đánh giá hiệu suất thu hồi phương pháp Acepromazin Nồng độ thêm chuẩn H trung bình,% Yêu cầu phương pháp RSD Đánh giá % 25 ppb 90.2 80 - 110 (%) Đạt 1.8 50 ppb 89.7 80 - 110 (%) Đạt 0.73 100 ppb 88.9 80 - 110 (%) Đạt 0.87 Atropin Nồng độ thêm chuẩn H trung bình,% Yêu cầu phương pháp RSD Đánh giá % 25 ppb 87.8 80 - 110 (%) Đạt 1.5 50 ppb 86.1 80 - 110 (%) Đạt 0.83 100 ppb 86.8 80 - 110 (%) Đạt 0.45 Trang 48 Hình 3.8: Sắc ký đồ thêm chuẩn 50ppb acepromazin atropin vào mẫu trắng thịt heo Nhận xét : Từ kết đánh giá cho thấy, hiệu suất thu hồi acepromazin dao động khoảng 90% với %RSD từ 0.87% - 1.8% hiệu suất thu hồi atropin dao động khoảng 87% với %RSD 0.45% - 1.5% đáp ứng yêu cầu tiêu chuẩn AOAC Cho thấy quy trình phân tích có hiệu suất thu hồi độ ổn định cao 3.3.4 Đánh giá độ lặp lại phương pháp Mục đích nghiên cứu đánh giá thiết bị tay nghề thí nghiệm viên Nếu độ lặp lại số đo kết đo nằm sai số cho phép tin tưởng thiết bị chạy tốt tay nghề thí nghiệm viên tốt Thông số thiếu trình đánh giá phương pháp Độ lặp lại phương pháp dùng để kiểm soát mức độ tin cậy đánh giá tác động ngẫu nhiên đến kết phân tích Yêu cầu đánh giá độ lặp lại phương pháp: - Thực lặp lại thí nghiệm lần thời gian, thiết bị, hóa chất điều kiện mơi trường Trang 49 - Độ lặp lại phương pháp cho giá trị %RSD phải thấp yêu cầu định trị phương pháp thử tổ chức AOAC đánh giá độ lặp lại phương pháp theo bảng 3.5: Bảng 3.5: Độ lặp lại yêu cầu theo AOAC STT Hàm lượng (%) Đơn vị Độ lệch chuẩn tương đối (%RSD) 100 100 % 1.3 ≥ 10 10 % 1.8 ≥1 1% 2.7 ≥ 0.1 0.1 % 3.7 0.01 100 ppm 5.3 0.001 10 ppm 7.3 0.0001 ppm 11 0.00001 100 ppb 15 0.000001 10 ppb 21 10 0.0000001 ppb 30 Do đó, để đáp ứng yêu cầu đề ra, tiến hành thực lặp lại quy trình xử lý mẫu bảy lần mẫu thịt heo dương tính acepromazin atropin để đánh giá độ lặp lại phương pháp thông qua giá trị %RSD Kết thể bảng 3.6: Trang 50 Bảng 3.6: Bảng số liệu đánh giá độ lặp lại phương pháp Acepromazin Nồng độ, trung bình, ppb 39.4 SD %RSD Yêu cầu phương pháp Đánh giá 0.84 2.1