Đề tài công nghệ lên men gluconic acidĐề tài công nghệ lên men gluconic acidĐề tài công nghệ lên men gluconic acidĐề tài công nghệ lên men gluconic acidĐề tài công nghệ lên men gluconic acidĐề tài công nghệ lên men gluconic acidĐề tài công nghệ lên men gluconic acid
Trang 1Gluconic acid GVHD: PGS TS Lé Vin Việt Mẫn CHUONG 1: NGUYEN LIEU
Glucose được sử dụng là nguồn carbon cho hầu hết các loài vỉ sinh vat san xuất gluconie acid Tuy nhiên trong sản xuất hầu hết các nhà máy đều không sử dung glucose tinh khiét, đa số đều sử dụng những nguyên liệu rẻ tiền khác như mật rỉ hay sản phẩm từ sự thủy phân tỉnh bột Nguyên liệu sử dụng trong bài báo cáo là mật rỉ
1.1 Mat ri
Mật rỉ ( rỉ đường ): là phế liệu chứa đựng nhiều đường không kết tỉnh trong sản xuất đường từ mía hoặc củ cải đường Thông thường tỷ lệ rỉ đường trong sản xuất đường mía chiếm 3 - 3.5% trọng lượng mía, tủy thuộc vào giống mía, điều kiện trồng trọt, công nghệ
Thành phần mật rỉ dao động như sau: nước: 15 - 20%, chất khô: 80 - 85%,
trong đó có 60% là đường (40% là đường saccharose, 20% là fructose và glucose, còn 40% còn lại là chất phi đường, thành phần cụ thể cho dưới bảng sau: Bảng 1: Thành phần các hợp chất trong mật ri Thành phần Tỷ lệ | Mậtrỉ từ củ cải đường Mat ri từ mía Đường tổng số % 48 - 52 48 - 56 Chất hữu cơ khác đường | % 12-17 9-12 Protein (N x 6.25) % 6-10 2-4 Kali % 2.0- 7.0 1.5 - 5.0 Canxi % 0.1 - 0.5 0.4-0.8 Magie % Khoảng 0.09 Khoáng 0.06 Photpho % 0.02 - 0.07 0.6 - 2.0 Biotin mg/kg 0.02 - 0.15 1.0 - 3.0 Acid pantotenic mg/kg 50 - 110 15 - 55 Inozitol mg/kg 5000 - 8000 2500 - 6000
Tiamin mg/kg Khoang 1.3 Khoang 1.8
Trong mật rỉ luôn có mặt vi sinh vật với mật độ rất lớn, thường gặp nhất là
những vi sinh vật gây màng và gây chua Vì vậy trong sản xuất người ta thường dùng fluosilicate natri với nông độ 2 %o so với trọng lượng mật rỉ để dé bao quan Trước khi đưa mật rỉ vào sản xuất cần phải qua giai đoạn xử lý mật rỉ để tách tạp
chất, đồng thời ức chế hoặc tiêu điệt hệ vi sinh vật có trong mật rỉ Có nhiều quy
trình khác nhau để xử lý mật ri Ví đụ như theo Rehm và cộng sự (1996) thì đầu tiên mật rỉ sẽ được pha loãng với nước, sau đó bổ sung acid sulfuric và xử lí nhiệt ở 90°C để ức chế vi sinh vật Tiếp theo, bổ sung phosphate với hàm lượng 1-2% để tách cặn lắng rồi làm nguội Ở một qui trình xử lí khác, người ta sẽ pha loãng mật rỉ, gia nhiệt rồi ly tâm để tách bỏ những chất không hòa tan
Trang 21.2 Các phụ liệu khác
1.2.1 Nước: được sử dụng để pha loãng mật rỉ về giá trị nồng độ chất khô cho quá trình lên men Nước phải đạt các tiêu chuân như tiêu chuẩn nước uông
Bảng 2: Chỉ tiêu chất lượng đối với nước dùng để ăn uống,
nước dùng cho các cơ sở để chế biến thực phẩm ( QCVN 01:2009/BYT )
Tên chỉ tiêu Đơn vị Giới hạn tối đa
Mau sac TCU 15
Mùi vi - Không có mùi, vị lạ
Độ đục NTU 2
pH - 6,5 — 8,5
Độ cứng, tính theo CaCO; mg/l 300
Hàm lượng Clorua mg/l 250 - 300
Hàm lượng sắt tổng số ( Fe”, Fe”) mg/l 0,3
Ham lượng mangan tổng số mg/l 0,3 Hàm lượng nitrat mg/l 50 Hàm lượng nitrit mg/l 3 Hàm lượng sunphat mg/l 250 Clo dư (trong khử trùng) mg/l 0,3 — 0,5 Coliform téng 36 vi khuan/100ml 0 E coli hoac Coliform chiu nhiét vi khuẩn /100ml 0 1.2.2 Chất chỉnh pH và acid hóa
- Chỉnh pH của rỉ đường về pH lên men 6.5 đùng tác nhân là H;SO¿
- Chỉnh pH trong quá trình lên men trong khoảng 4.5 - 6.5 dùng tác nhân trung
hòa 1a CaCO
Trang 3Gluconic acid GVHD: PGS TS Lé Vin Việt Mẫn
1.2.3 Chất phá bọt
Sự hấp thu oxy của vi sinh vật là một quá trình rất phức tạp, con đường mà oxy chứa trong một bọt khí phải đi qua để tiếp xúc được với một enzyme chứa trong tế bào vi sinh vật ở thé lơ lửng trong môi trường bị ngăn cắn đo sự tồn tại
của những diện tích tiếp xúc có bề mặt từ vài micromet tới vài milimet, kích thước của các bọt khí này phụ thuộc chặt chế vào tốc độ khuấy trộn của môi trường (tốc
độ khuấy cao đi đôi với kích thước bọt khí nhỏ) Chất phá bọt thực chất là làm giảm sức căng bề mặt của giao dién khi/ long Nhu vay, chat dé pha bot phai là một chất hoạt động bề mặt, phá hủy các bọt khí sinh ra góp phần tăng hàm lượng oxy hòa tan trong quá trình lên men
Trong môi trường lên men gluconic acid do nồng d6 glucose trong méi trường lên men lớn, dẫn đến môi trường có độ nhớt cao, khi đó các bọt không khí dễ tái hợp lại thành những bọt không khí lớn hơn (nắm mốc không thể hấp thu) Để tránh hiện tượng này trong sản xuất thường dùng ancol amylic 1/80.000 hay natri oleat 1/25.000 làm chất phá bọt
1.2.4 Các chất dinh dưỡng cho nắm mốc - Nguồn N: (NH¿);SO¿ hoặc (NH¿);HPO¿, - Nguôn P: dung dịch HạPOx 70%
- Nguôn Mg: MgSOx.7HạO
Trang 4Chuong 2: GIONG VI SINH VAT 2.1 Giéi thigu vé Aspergillus
Đây là loài nắm mốc hiếu khí Tế bào có vỏ, trong tế bào chất có nhân và nhân con, có các tiêu thể Khi phát triển tế bào nắm mốc thành hệ sợi: khuẩn ty ăn sâu vào cơ chất — khuẩn ty khí sinh Giống mốc này có hệ khuẩn ty (hệ sợi) không màu hoặc vàng nhạt Có hai loại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh phát triển trên bề mặt môi trường và khuẩn ty đỉnh đưỡng ăn sâu vào môi trường đặc (còn gợi là khuẩn ty co chat), Khudn ty phân nhánh có nhiều vách ngăn tế bào Tế bào có hạch nhân Cuống đính bào tử không phân nhánh đài và thắng đầu, có nhiều cuống nhỏ Tùy loại có cuống nhỏ 1 tầng hoặc 2 tầng Tất cả cuống nhỏ có hình chai và gọi là tế bào hình chai, khi trưởng thành sỉnh ra các đính bào tử ở đầu cuống Các đính bào tử xếp thành chuỗi đài và cảng tận cùng càng lớn đần Những chuỗi đính bảo tử xếp đối xứng từng quả tròn trên chóp nang trông như đóa hoa cúc Đính bào tử điển hình thường hình cầu, đơn bào, đa hạch bề mặt xù xì Do cuống sinh bào tử và đính bào tử có màu sắc nên màu của chúng trở thành màu của khuẩn lạc mốc Các khuẩn lạc của mốc Aspergilfus thường là: vàng, vàng lục, đen, tro, nâu
Dac diém cia giéng Aspergillus là giàu các enzyme thủy phân ngoại bào (amylase, protease, pectinase, lipase ) Hiện nay người ta sử dụng rộng rãi lồi Aspergilus vào cơng nghiệp thực phẩm và một số ngành khác dé thu acid hữu cơ và enzyme Một trong những chủng được nghiên cứu kỹ trong phòng thí nghiệm và các quá trình sản xuất là Aspergilus niger Chủng này trong quá trình phân hủy các glucid có khả năng tích lũy ở môi trường một lượng acid hữu cơ và enzyme khá lớn 2.2 Giới thiệu về Aspergillus niger s* Nhóm Aspergilius niger +% Giống Aspergilius “+ Ho Aspergillaceae s* Bộ Moniliales “+ Lép Fungi imperfecti
Vi tri phân loại của Aspergilus niger:
+* Thuộc bộ các khuẩn (Plectascales), họ Aspergillaceae, lop Ascomycetes +* Hội nghị Utrecht năm 1952 công nhận như sau: Ở giai đoạn đỉnh bào tử -
giai đoạn phát triển chính cia A niger người ta xác định chúng thuộc bộ
Moniliales, lớp nằm bất toàn (Deuteromycetes) Ở giai đoạn hình thành túi
bào tử thì chúng thuộc bộ Plecfascales, lớp nắm túi Á seomycetes
Trang 5Gluconic acid
GVHD: PGS TS Lé Van Viét Man
Hinh 1: Nam moc Aspergillus niger
Aspergillus niger phat trién manh trén môi trường thạch malt và tạo thành
bào tử dài khoảng 7-10 micromet, khuẩn lạc màu đen, trên những cuống bào tử có
vô số những bao tir Cuống bảo tử có hai phần: phần thứ nhất dài va to, khoảng 2-3 micromet có màu nâu nhạt hay hoàn toàn đen
Chủng nắm mốc này có thê chịu được pH thấp 2.1-2.2, nhiệt độ thích hợp là 30-33°C và đễ phát triển trên môi trường tỉnh bột
Aspergillus niger được dùng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm để thu
nhận các acid hữu cơ như citric acid, gluconic acid, fumaric acid Ngoài ra nó
còn ứng dụng để thu nhận các chế phẩm enzyme như: amylase, protease, pectinase, glucoseoxydase
2.3 Tiéu chan chon giéng
s* Là chủng nắm mốc thuần khiết, không lẫn các chủng vi sinh vật khác Khả năng thích ứng cao, sinh sản mạnh
Lên men đường glucose với hiệu suất cao, thời gian lên men ngắn, sản phẩm chính là gluconic acid chiếm tỷ lệ cao
# Sau khi lên men dé tách sinh khối và sản phẩm
# Khả năng bảo quán dễ dàng, các đặc tính di truyền được bảo tồn trong suốt thời gian bảo quản và sử dụng
2.4 Môi trường nuôi cấy
Trong sản xuất gluconic acid môi trường nuôi cấy cần đáp ứng các yêu cầu Sau: Me oh ao of ` oe v oe
oe s Nong d6 glucose & mire cao: 150 — 250gL" Hàm lượng nitơ thấp: khoáng 20 mM nito Hàm lượng phospho thấp
Bồ sung thêm các chất khoáng, theo Bern Haure (1928) cần thêm 0.7 — 13
mM mangan
pH thích hợp cho nắm mốc phát triển: 4.5 — 6.5, dưới pH < 3 ức chế enzyme glucose oxydase
Trang 6Chương 3: QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ
Trong q trình sản xuất gluconic acid tùy thuộc và tác nhân trung hòa là NaOH hay CaCO;, điều kiện lên men mà sản phẩm thu nhận có thể là các sản phẩm khác nhau như gluconic acid, calcium gluconate, sodium gluconate Vì mỗi sản phẩm đều có những vai trò hết sức khác nhau trong lĩnh vực dược phẩm hay trong lĩnh vực thực phẩm
3.1 Sơ đồ khối
Trong khuôn khô bài báo cáo chúng tôi có đưa ra 3 quy trình công nghệ
Trang 8Chuong 4: GIAI THICH QUY TRINH CONG NGHE 4.1 Xử lý mật rí
Mục đích:
s» Tiêu diệt hệ vi sinh vật gây bệnh ngoai tri Bacillus, Clostridium s* Tiêu diệt / ức chê các vi sinh vật khác trong môi trường
“+ Tach cdc chat không hòa tan trong mật rỉ Các biến đối: va
s* Vật lý: có sự thay đôi về gradient nhiệt độ
s* Sinh học: các vi sinh vật bị tiêu diệt Thiết bị: Nguyên liệu Nước lạnh 2th m Co Co Hơi nóng —> ` Z2 N Lt | Hình 2: Thiết bị xử lý nhiệt mật rỉ
Cấu tạo: thiết bị hình trụ, đáy côn, làm bằng thép không ri Bên trong có hệ
thống ống xoắn để gia nhiệt, bên ngoài có lớp vỏ áo để làm nguội Động cơ gắn với cánh khuấy giúp cho quá trình đảo trộn nguyên liệu
Thông số công nghệ: thực hiện tuần tự theo các bước sau: s» Pha loãng mật rỉ với nước (45 — 50%)
4 Môi trường được đun nóng đến một nhiệt độ nhất định (90 - 100°C) s* Giữ ở nhiệt độ đó trong khoảng thời gian 45 — 60 phút
+* Làm nguội đến nhiệt độ cần thiết (33-35°C đối với đa số năm mốc)
* Sau khi làm nguội nguyên liệu được cho qua thiết bị ly tam dé tách các tạp chất không tan
Trang 9Gluconic acid GVHD: PGS TS Lê Văn Việt Mẫn Nguyên liệu Săn phẩm „ , Hình 3: Thiết bị ly tâm làm sạch mật rỉ
Câu tạo: thiết bị có dạng hình trụ, bên trong có bô trí các thanh chặn Khi
động cơ truyền động cho rôto bên trong quay, đưới tác động của lực ly tâm các
câu tử không tan sẽ bị văng ra, giữ lại trên các thanh chặn Thông số công nghệ: oe & oe &
Đường kính trong của rô(o: 1000 mm Sô vòng quay lớn nhat: 1500 vòng/phút 4.2 Phối trộn
Muc dich: chuẩn bị môi trường lên men cho nắm mốc sinh trưởng, phát triển và sinh tong hop gluconic acid Thành phần môi trường Môi trường bao gồm: s* Glucose 110-150 g1! “ (NH4)2HPO4 0.388 gL" “ KH2P04 0.188 gL? “% MgSO4.7H20 0.156gL” “ CaCO3 26gL" oe & Môi trường được chỉnh ở pH = 6.5 Các biến đổi: oe & oe & Vật lý: độ nhớt của dung dịch tăng lên do các cấu tử rắn hòa tan vào đụng dịch glucose
Hóa lý: sự chuyển pha rắn sang lỏng của các muối vô cơ trong môi trường hòa tan vào dung địch khi khuấy trộn
Trang 10Thiết bị: chọn thiết bị trộn có cánh khuấy mái chèo
Hình 4: Thiết bị khuấy trộn
Cấu tạo thiết bi bao gồm 1 thùng khuấy, bên trong có gắn 2 cánh khuấy mái
chèo được đặt lệch tâm, thành thùng khuấy đặt các thanh chặn Thiết bị này dùng cho chất lỏng có độ nhớt trung bình Thông số công nghệ: + Tốc độ khuấy: 200 rpm s* pH = 6.5 (hiệu chỉnh bang H,SO,) 4.3 Nhân giống
Muc dich: lam gia tăng lượng tế bào (tăng sinh khối), nhằm tích lũy đủ số lượng bào tử cần thiết để cây vào môi trường lên men
Phương pháp thực hiện: trong công nghiệp sản xuất gluconic acid quá trình nhân giông vi sinh vật thường được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy tinh (nuôi cấy theo từng mẻ - batch culture) Nhân giống trên môi trường lỏng rất ít được sử dụng, lý do thời gian nuôi kéo đài và hoạt tính enzyme thường không cao so với nuôi cây bề mặt
Môi trường thường dùng để nuôi cây nắm mốc thường là môi trường bán rắn với thành phân: cám gạo, cám mì, bột ngô, hạt kê, hoặc một số loại hạt, bột kém chất lượng khác Đề làm tăng độ xốp của môi trường, thường trong sản xuất có trộn thêm các phụ liệu khác như vó trâu (15-20%)
Quá trình nhân giống tiến hành qua nhiều cấp nhân giống trên các khay đựng canh trường đã phối trộn, thực hiện trong phòng nuôi cấy
Các biến đổi:
s* Sinh học: trong suốt quá trình phát triển của nắm mốc theo thời gian nhân giống trong môi trường bán rắn, nằm mốc thường trải qua 3 giai đoạn:
> Giai đoạn 1: kéo dài 10-14h Bào tử bắt đầu trương nở và bắt đầu hô
hấp do đó nhiệt độ phòng nuôi phải được duy tri 28-30°C
> Giai đoạn 2: kéo dài 14-18h Hệ nấm bắt đầu phát triển, quá trình hô hấp diễn ra mạnh, nhiệt độ phòng nuôi tăng nhanh Vì vậy phải thông gió và duy trì độ ẩm môi trường khoảng 80 — 90% trong giai đoạn này
Trang 11Gluconic acid
GVHD: PGS TS, Lé Van Viet Man
> Giai đoạn 3: kéo đài 10-12h Cường độ hô hấp giảm, nhiệt độ môi trường bán rắn giảm Nắm mốc bắt đầu sinh bào tử
$ Vật lý: thành phần môi trường thay đối, nồng độ cơ chất tại mỗi điểm trên khay nhân giống là khác nhau
Thông số cơng nghệ:
¢ Dé 4m của mơi trường bán rắn: 5§—60% 4 Nhiệt độ môi trường: 28-30°C
Thời gian nuôi: 36-72h, theo mỗi cấp nhân giống Chiều dảy của lớp môi trường tốt nhất: 5—10cm
* Thời gian kết thúc quá trình nhân giống khi thu được số lượng bảo tử cần thiết cho quá trình lên men (do nhà sản xuất đặt ra) + + *“* #+ +» % 4.4 Lên men Muc dich: chuyén hoa glucose thanh gluconic acid Các biến đổi:
“+ Vat ly: quá trình lên men làm cho nhiệt độ trong thùng lên men tăng, cần phải bố trí thiết bị làm mát trong quá trình lên men
* Sinh học: sinh trưởng và trao đổi chất của nắm mốc, sinh khối tăng trong
giai đoạn đầu, giai đoạn sau quá trình trao đối chất diễn ra, hệ quả tạo ra
gluconic acid và các sản phẩm phụ khác
“+ Héa hoc và hóa sinh: chuyển hóa glucose thanh gluconic acid xúc tác enzyme glucose oxydase
Cac yeu tô ảnh hưởng: hai yếu tố ánh hưởng lớn nhất là oxy và pH »> Oxy: là chất nên của quá trình oxy hóa glucosc
Gradient nồng độ và thể tích oxy vận chuyển qua môi trường ảnh hưởng đến sự chuyển pha của oxy từ thể khí sang thể lỏng Trong quá trình sản xuất gluconic acid đời hỏi lượng oxy hòa tan cao, điều này là rất cần thiết cho nắm mốc chuyên hóa các hợp chất hữu cơ trong môi trường thành năng lượng, sinh tổng hợp gluconic acid Vi dy, khi Sakurai et al tién hanh suc oxy véi áp suất cao lên xấp xỉ 6 bar kết quả đã duy trì được lượng oxy hòa tan 150 ppm
Nghiên cứu cũng cho thấy rằng trong sản xuất gluconic acid A niger sit dụng oxy tỉnh khiết nhiều hơn so với khi chúng phát triển ngồi khơng khí Theo Kapat et al: khi khuấy trộn với tốc độ 420 rpm và tốc độ thông khí 0.25 vvm, nồng độ oxy hòa tan lúc này là tốt nhat cho sy san sinh glucose oxidase Theo Lee et al: đề sản xuất đạt năng suất cao thì phải sử dung ap suat suc khi cao (2-6 bar) lúc này lượng oxy hòa tan trong môi trường có thể đạt đến 150 ppm
Nói chung trong quá trình phát triển của hệ sợi nằm lượng oxy cung cấp không đều, nguyên nhân do kích thước của các bong bóng khí ảnh hưởng nhiều bởi độ nhớt của môi trường nuôi cây Nên cần theo đõi trong suốt quá trình sản xuất
“+ pH: là yêu tố quan trọng trong việc sản xuất gluconic acid vì ở những pH khác nhau A miger cho những sản phẩm khác nhau nhu: citric acid , gluconic acid va oxalic acid
Trang 12Việc tích lũy các sản phẩm này dựa vào các giá trị pH trung bình Ví dụ pH đưới
3,5 tạo điều kiện cho sự tích tụ citric acid, để sản xuất gluconic acid thì pH = 4,5-
Trang 13Gluconic acid
Thiết bị: thiết bị lên men bề sâu
Cấu tạo: thiết bị nảy có cầu tạo là một thùng hình trụ đứng được cầu tạo từ thép
không rỉ hay lớp kim loại kép có đáy và nắp hình nón, trên nap co gan động cơ chuyên đảo và các ông nôi cho môi trường và các tác nhân hỗ trợ quá trình lên GVHD: PGS TS Lê Văn Việt Mẫn
men, van bảo hiém va các khớp nôi để gắn các dụng cụ kiêm tra Các bộ phận chính của thiết bị 1) Động cơ 2) Hộp giảm tốc 3) Khớp nối 4) Obi 5) Vong bit kin 6) Truc 7) Thanh thiét bi
8) May khuấy trộn tuabin
9) Bộ trao đôi nhiệt dạng ống xoắn 10)Khớp nối 11)Óng nạp không khí 12)Máy trộn kiêu cánh quạt 13)Bộ sủi bọt 14)Máy khuấy dạng vit 15)Ö đỡ 16)Khớp để tháo 17)Ao 18)Khớp nạp liệu 19)Khớp tháo không khí Xử lý thiết bị với H;ạSO¿ và HNO; lỗng, thơng khí trong 24h
Tiệt trùng thiết bị bằng hơi nước (0.2 bar), làm nguội bằng tác nhân lạnh thông qua vỏ áo Thông số công nghệ: 4 Nhiệt độ lên men 34°C s* pH dao động 4.5 — 6.5 s* Lưu lượng khí 0.25 — 1 vvm * Áp suất sục khí 1.5 — 2 kg/cm’ » Thời gian lên men 40h oe $ oe s* Trang 15 -¬ + L4 2 8 4 ee re | Vr # J = | H : o i Te ch 10 i a 1 i HÀ We ồ a w
Hình 7: Thiết bị lên men bề sâu
Thời điểm kết thúc lên men khi nồng độ đường còn lại 0.1%
Trang 144.5 Lọc
Mục đích: loại bỏ sinh khối vi sinh vật trong dich men
Các biến đối: - - „ -
s* Vật lý: thay đôi khôi lượng dịch lên men, màu sắc dung dich chuyên từ đục
sang trong, độ nhớt giảm
Ti hiết bị: chọn thiết bị lọc khung bản (lọc ép) „
Câu tạo: khung lọc và bản lọc đặt xen kẽ, ở giữa ta đặt vải lọc Ep chat lai ta duge
máy lọc khung bản Khi bã lọc nam day trong khung lọc ta tiên hành rửa bã đề tận
thu, sau đó làm vệ sinh rôi lọc tiệp 'Khung ae 27 2\ iX 24 JN JN 24 Š \ A 7/2////2////2 | pc | “Thiết bị lọc ép Hình 8: Thiết bị lọc khung bản Thông số công nghệ: ở Kích thước màng loc: 50 ym - s* Độ âm nguyên liệu ~ 90%, độ âm bã ~ 30% 4.6 Acid hóa Mục đích: thu hồi gluconic acid Các biến đối: - +» Vật lý: dung dịch đôi màu đục, độ nhớt tăng s* Hóa học: xảy ra phản ứng
Calcium gluconate + H;SO, = gluconic acid + CaSO, „
“+ Hoa ly: sy tach lam hai pha ran va long, két tha sinh ra lang xuông Thiết bị: chọn thiết bị phản ứng có cánh khuấy
Thiết bị gồm: vỏ thép hàn có đáy hình nón và nắp phẳng làm bằng thép chịu acid đậy kín bằng mặt lát gỗ Bề mặt trong của thiết bị được chống gỉ bằng lớp chịu acid Bề mặt ngoài được phủ lớp cách nhiệt Trong nắp thiết bị đặt máy trộn bằng thép chịu acid, cửa nối để thoát khí ra khỏi thiết bị Trong phần nối phía dưới của thiết bị có khớp nối để nhận sản phẩm Khớp nối bên trong dùng để nạp
acid HạSO¿ Ở nắp và phần nón bên dưới có các cửa - khe nhìn để sửa chữa, làm sạch và khảo sát thiết bị
Trang 15Gluconic acid GVHD: PGS TS Lé Vin Việt Mẫn 1 : | = - : 1 Cửa nạp H:SOx 4 2 Cửa nạp calcium gluconate £ ] 3 Cửa tháo sản phẩm 4 Cánh khuấy 5 Bộ đảo dạng khung 6 Bộ cào 5 7 Motor i ¬3 Hình 9: Thiết bị phản ứng Thông số công nghệ:
* Lượng H;SO¿ đùng để acid hóa môi trường tương đương với lượng CaCO; cho vào theo phương trình phản ứng:
Calcium gluconate + H,SO, = gluconic acid + CaSO,
“+ Dung dịch sau acid hóa có pH ~ 3.7 4.7 Ly tâm
Mục dich: tách kết tủa CaSO,, huyén pha trong dung dich Các biến đối:
s* Vật lý: độ nhớt giảm, tỷ trọng giảm
+* Hóa lý: sự tách làm hai pha rắn và lỏng riêng biệt Thiết bị: chọn thiết bị ly tâm lắng
Cấu tạo máy gồm có hai rơto Rơto ngồi có đạng hình nón hoặc trụ-nón, rôto trong có dạng hình trụ mà mặt ngoài của nó có gắn vít tải Rôto trong và rơto ngồi quay cùng chiều nhưng rôto trong quay chậm hơn rơto ngồi 1,5-2 % (khoảng 20-100vg/ph) nhờ hộp giảm tốc vi sai Rôto trong có đục các lỗ để dẫn huyền phù nhập liệu Góc nghiêng phần hình nón của rơto khống 9-10
Q trình lắng xảy ra trong khoảng không gian giữa hai rôto, bã bám vào mặt trong của rơto ngồi và được vít tải đây về phía cửa tháo bã Nước trong đi về phía ngược lại, chảy qua các cửa ở trên đáy rồi đi ra ngoài Trong phần rôto không
bị ngập nước, bã vừa được đưa ra khỏi rôto vừa được làm khô
Trang 16fit i Ị I r 1 7¬ # a # # ? & #
1- Cơ cấu ngưng máy khi quá tải, 2- Cửa tháo; 3-Vỏ có các vách bên trong,
4- Cổng nạp liệu; $, 10- Bệ tựa rôto; 6- Khoang để thảo chất lỏng "nguyên
chat"; 7- Vit tai; 8- Réto xilanh- non; 9- Khoang dé thảo can; 11- Bộ truyền động
Hình 10: Máy ly tâm lắng nằm ngang
Thông số công nghệ:
+ Đường kính trong của roto: 325 mm “ Số vòng quay của roto: 3500 vòng/phút 4.8 Trao đổi ion
Mục đích:
+ Khai thác: thu nhận acid gluconic
s% Hoàn thiện : tách các tạp chât ra khỏi acid
Các biến đổi : sự tương tác tĩnh điện giữa các câu tử mang điện trong dung dich lên men với các hạt nhựa mang điện tích trái dâu
Phương pháp thực hiện :
Do acid gluconic tích điện âm nên sẽ bị hấp phụ bởi anionit có các nhóm
điện tích là base Khi đó các ion âm chủ yếu là acid gluconic (ngoài ra còn có các sản phẩm phụ khác như citric acid .) hấp phụ trên hạt nhựa (pha tĩnh) giữ lại trên cột còn các phần tử khác (ion dương và tạp chất không tích điện ) do không bị giữ lại bởi pha tĩnh nên bị loại khỏi cột Do ái lực khác nhau giữa các ion với nhựa anionit va su phan hap phu do dung dich rửa giải, ion trao đôi khuếch tán vào dung dịch rửa giải Ta dùng dung địch giải hấp phụ là HCI loãng để lôi cuốn gluconic acid ra khỏi cột
Thông số công nghệ :
s» Nhựa trao đôi anionit sử dụng là anionit có nhóm điện tích -CH¿NTR; ( có khoảng pH hoạt động rộng với dung lượng trao đôi ion là 4mM OH/g }
Trang 17Gluconic acid GVHD: PGS TS Lé Vin Việt Mẫn 4.9 Cé dac Mục đích: nâng cao nồng độ gluconic acid trong sản phẩm Các biển đối: s% Vật lý: - `
> Hệ số truyền nhiệt giảm
> Độ nhớt tăng, khôi lượng riêng tăng > Thé tích dưng dịch giảm
s Hóa lý: sự bôc hơi nước
Thiết bị: sừ dụng thiết bị cô đặc chân không
Cấu tạo: máy gồm 3 bộ phận chính: buồng đốt ngoài, buồng bốc và thiết bị ngưng tụ
»> Buồng đốt ngoài: thiết bị thường dùng các loại ống có đường kính đ25, và
d38, chiều dài của ống truyền nhiệt là bội số của 0.5m (tối thiêu là 0.5m, tối
đa là 9m), ống thường bố trí ở đỉnh tam giác đều với bước ống s khoảng (1.3-1.5)dạ Mục đích: gia nhiệt cho hỗn hợp dung dịch lóng tới nhiệt độ sôi tai áp suất làm việc
»> Buông bốc: thiết bị có dạng hình trụ với đường kính lớn Nhiệm vụ chủ yếu của bường bốc là tách hỗn hợp lỏng — hơi thành những giọt lỏng rơi trở lại »> Thiết bị ngưng tụ: đưa dòng nước lạnh tiếp xúc với đòng hơi 1 1 Cửa nạp nguyên liệu 2 Cửa tháo sản phẩm 3 Bộ phận gia nhiệt 4 Buỗng tách sản phẩm và hơi thứ 5 Cửa nạp nước lạnh
6 Cửa tháo nước ngưng
Trang 18Chuong 5: SAN PHAM 5.1 Sản phẩm o9 On %% CTPT: CcH¡;OÒ; ị s% Tên gọi đây đủ: 2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanoic acid H OH “ pKa: 3.7 HO—Ì—H
+* Nhiệt độ nóng chảy (dung dich 50%) : trén 12°C
s* Nhiệt độ hóa hoi (dung dich 50%) : hon 100°C H——OH
s* Khối lượng riêng: 1.24 g/ml H—†—OH
+* Màu sắc: không màu tới nâu ^OH
Giuconic acid: là acid hữu cơ nhẹ, không ăn mòn, không độc, phố biến
trong các loài thực vật, hoa quả và các thực phẩm khác như gạo, thịt, sản phẩm sữa, rượu (lên đến 0,25%), mật ong (lên đến 1%), và đấm ăn Gluconic acid được
ứng dụng làm chất tạo vị chua (E574) trong một số thực phẩm như rượu vang, nước hoa quả Nó còn làm chất tây rửa các thiết bị của đây chuyển chế biến hay thiết bị lên men trong công nghiệp thực phẩm
Chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm:
s Trạng thái: dung dịch lỏng, min 50% w/v “ Mau sac: sáng ánh màu vàng
Trang 19Gluconic acid
5.2 So dd chuyén héa
GVHD: PGS TS Lê Văn Việt Mẫn Có nhiều phương pháp sản xuất gluconic acid: hóa học, điện hóa, hóa sinh,
bioelectrochemical, tại đó sử dụng các tác nhân oxy hóa khác nhau Tuy nhiên
Trang 205.2.1 San xuAt tir Aspergillus niger va Penicillium luteum B-D-glucose H;O; Glucose CC FAD catalase SN oxidase FADH ; x %Or Glucono-ð-lactone ⁄Q; Lactonase/ 5 spontaneous Hạ0 Gluconic acid glucose + 1⁄2 O; —› gluconic acid
Hinh 13: So dé chuyén héa glucose thanh gluconic acid bởi A niger Sự có mặt của ion Ca?" làm cho A niger sinh tổng hợp đồng thời 2 enzyme d6 1a glucose oxidase va catalase, lam thay déi qua trinh chuyén héa glucose tit con đường EMP sang con đường oxy hóa trực tiếp đưới xúc tác của các enzyme
Giuconie acid (pentahydroxycaproic acid) được sản xuất từ glucose bằng phản ứng loại bỏ hydrogen, xúc tác bởi emzyme glucose oxydase, khi đó nhóm aldedyde trên C-I của -D-glucose sẽ chuyển hóa thành nhóm carbonxyl, bên cạnh đó còn có glucono-ð-lactone (CsH¡oO¿} và hydrogen pcroxide Ngoài ra giucono-ð-lactone cũng thủy phân thành gluconic acid, giai đoạn này có thê sảy ra một cách tự nhiên hoặc có enzyme gluconolactonase xúc tác, trong khi hydrogen peroxide phan hủy thành nước và oxy dưới tác dụng của enzyme peroxidase
A niger sản xuất tất cả các enzym cần thiết cho các chuyển đôi của glucose thành axid gluconic, trong đó bao gồm glucose oxidase, catalase, lactonase va mutarotase (phục vụ để tăng tốc độ phản ứng)
% Trong quá trình sản xuất sự tich tu cua lactone (Glucono-8-lactone) trong
môi trường gây hiệu ứng xấu đến glucose oxidase, và việc sản xuất acid giuconic bị gián đoạn Tuy nhiên sự có mặt cia lactonase (A niger tiét ra) làm cho sự thủy phân Giucono-ð-lactone sẽ điển ra nhanh hơn, điều kiện phan ứng này gần như trung tính, điều này có thể giải quyết bằng cách bỗ sung NaOH hay CaCO+,
s* Catalase xúc tác cho phản ứng phân hủy H;O; thành O, va H,O
Quá trình lên men làm cho pH môi trường giảm xuống làm ức chế enzyme
glucose oxidase dan dén san suât bị dừng lại, đê kiêm soát pH biện pháp đã được
đưa ra là sử dụng CaCO; với lượng vừa đủ (thừa CaCO; sẽ làm chậm sự lên men
Trang 21Gluconic acid GVHD: PGS TS Lé Vin Việt Mẫn
do CaCO; ngăn cản sự tiếp xúc tự do giữa môi trường và hệ sợi nắm) Nhưng vẫn đề quan trọng là tính khó tan của Calcium gluconate trong nước (4 % tai 30 °C), tại nơi tập trung glucose cao lên đến 15 %, xảy ra sự quá bão hòa, và nếu nó vượt quá giới hạn calcium gluconate sẽ bị kết tủa trong hệ sợi nắm, điều này làm ngăn cản vận chuyển oxy
Sản xuất gluconic acid đã được nghiên cứa tổng quát bởi May e¿ al, Moyer, Wells et al, va Stubbs et al stt dung A niger , Currie et al sit dung Penicillium luteum va A niger cho hiéu suất tao gluconic acid tới 90 % trong 48-60 h Sau dé Moyer et al trong quá trình nghiên cứu sử dụng A miger đã cho hiệu suất tao giuconic acid lên đến 95% trong điều kiện lý thuyết (dung dich glucose: 150 - 200 g/L trong 24 h) Porges et ai thấy rằng quá trình có thể gián đoạn do sử dụng khuẩn ty chín lần liên tục tại nơi cấy được phục hồi bằng lọc hay tách ly tâm Những phát hién cua Moyer et al cho thấy: hiệu quả hơn 95% có thê đạt được nếu thêm vào dụng dịch bao gồm glucose 250 g / L và hợp chất của Bo 1% sau giai
đoạn phát triển của nắm, với sự tái sử dụng khuẩn ty trong vòng 24 h mỗi lần 5.2.2 Sdn xudt gluconic acid tir enzyme glucose oxidase
Dựa trên phản ứng chuyển đổi glucose bằng tác nhân nắm sợi (tiết ra enzyme glucose oxidase, enzyme lan dau duge cé lap tir Penicillium glaucum boi Miiller Emzyme dugc bao quan trong dudng (crystallised) béi Kusai et al, từ loài P amagasakiense Glucose oxidase trudc day duoc biét nhu notatin Glucose oxidase nhy 1a flavoprotein: mét hgp chat gdm protein két hgp hodc voi nhom ngoai FAD hoặc với EMN (gọi là caéc Flavin) Glucose oxidase 1a enzyme co nhóm ngoại FAD, khi oxy hóa glucose, dưới tác dung cla enzyme nay sé tao thành sản phẩm trung gian là Glucono-8-lactone, chất này kết hợp với nước và
chuyển thành gluconic acid Giai đoạn sau có thê xảy ra một cách tự nhiên hoặc có
thể đo enzyme glucono-lactonase xúc tác Glucose oxidase là glycoprotein
Phương pháp sử dụng enzyme trong sản suất gluconic acid có tiềm năng phát triển vì không phải qua giai đoạn tỉnh sạch sản phẩm Nếu enzyme được cô định trong màng polymer (có thể trao đổi anion) được tao ra bằng cách ghép polyethylene với 4-vinylpyridine Tuy nhiên phương pháp này không được dùng trong công nghiệp và sẽ không được cân nhắc xem xét lại vì lý đo kinh tế
5.2.3 Sản xuất gluconic acid từ vi khuẩn
“ Vi khuẩn acetic và Pseudomonas savastanoi là những vi khuẩn đầu tiên được ứng dụng vào sản xuất gluconic acid Không giống như nắm mốc trong quá trình chuyển hóa vi khuan tiét ra glucose dehydrogenase dé oxy hóa glucose thành gluconic acid, tiếp đến bị oxy hóa thành 2-ketogluconate , cuối cùng bị oxy hóa thành 2,5-diketogluconate
Trang 22D-glucose | Glucose dehydrogenase Gluconic acid | Gluconate dehydrogenase 2-ketogluconic acid | 2-ketogluconic acid dehydrogenase 2,5-diketogluconic acid
Hinh 14; So dé chuyén héa glucose thanh gluconic acid
béi Acetobacter va Pseudomonas
** Gluconobacter oxydans: vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, oxy hóa glucose qua hai con đường: đâu tiên đòi hỏi sự photphoryl hóa, bằng cách oxy hóa theo con đường penfose phosphate
Sản xuất gluconic có hạn chế ở quy mô công nghiệp vì đo sự oxy hóa tới các oxogluconic acid, kha nang cla Pseudomonas va Gluconobacter spp trong sản xuất gluconolactone và gluconic acid đã được khai thác trong việc sản xuất trên quy mô thương mại chủ yếu trong sản xuất lactone
Trang 23Gluconic acid
GVHD: PGS TS Lê Văn Việt Mẫn Chương 6: THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ
6.1 Nguyên liệu
Glucose được sử dụng là nguồn carbon cho hầu hết các loài vi sinh vật sản xuat gluconic acid
oe %
Se %
Kundu va Das thu được một lượng lớn gluconic acid từ môi trường glucose hay nguyên liệu từ sự thủy phân tỉnh bột (starch hydrolysate)
Vassilev et al su dung hydrol (nguyên liệu tử sự thủy phân tinh bột ngô) làm chất thay thé glucose để sản xuất gluconic acid bằng A niger được giữ cé định
Mukhopadhyay et al sit dung protein whey trong sita nhu 14 méi trudng bd sung chất dinh đưỡng cho sản xuất Gluconie acid, lactose được sử dụng như một chất nền, 92g gluconic acid được sản xuất từ I lít whey chứa 0,5%
glucose và 9,5% lactose bang A niger dugc git cé định trong bọc nhựa
Ikeda et al sit dung nguyén liệu là giấy thải, sau khi đường hóa thu được dung dịch có nồng độ glucose lên tới 50—100 g/L Sản lượng thu được là 92 % trong bình cất Erlenmeyer và 60% trong bình phản ứng có turbine lá cánh quạt với 800 mL, mỗi mẻ Một điểm đáng lưu ý trong nghiên cứu này là khi sử dụng xylose (loại đường pentose) và celiobiose (đẫn xuất của cellulose) làm nguồn carbon đuy nhất thì thu được sản lượng tương ứng là 83 và 56%
6.2 Vi sinh vật tổng hợp gluconic acid
Se
% Acetobacter methanolicus: được sử đụng làm xúc tác trong sự chuyển đổi glucose thành gluconic acid, không giống như những vi khuẩn khác, trong quá trình lên men A me(hanolicus sử đụng methanol, nguồn nguyên liệu rẻ tiền, như là chất nền Ngoài ra quá trình không sử đụng glucose trong quá trình phát triển, vì vậy sản lượng lý thuyết có thê đạt lớn nhất
Nghiên cứu của Currie và Carter: sử dụng trung bình 200 g/L dung dịch chứa glucose và những chất dinh đưỡng và trung hòa khác chảy qua tháp chứa đầy đăm bào gỗ (hay than cốc), sử dụng Acetobacter suboxydans, trong khi không khí đi lên xuyên qua lớp đăm bào gỗ (hay than cốc)
Tsao va Kempe, lam viéc voi Pseudomonas Ovalis va da tim ra mét ching
đặc biệt có thể chuyển hóa glucose thành gluconic acid với hiệu suất lên đến 99%, tuy nhiên tỷ lệ này phụ thuộc rất nhiều vào việc thông khi
Nắm men (Yeast) : nghiên cứu của một số tác giả sử dụng Aureobasidium pullulans đề sản xuất gluconie acid Các yếu tổ được nghiên cứu cho quá
trình sản xuất liên tục như: độ pH, oxy , nhiệt độ, thành phần trung bình của
môi trường, độ bão hòa không khí, sự chuyên hóa glucose cao nhất đến 94% và sản lượng đạt 87.1 % tại pH trung bình là 6.5 Tại pH = 4 hay pH = 5 sản lượng nghẻo nàn, tương ứng là 67.8% và 20.7% Nhiệt độ thích hợp là 29C tới 31 °C, nếu tăng nhiệt độ lên 1°C cụ thể là 32°C thì sinh khối và năng suất giảm
Trang 24Se
% Nghiên cứu của Bernhauer cho thấy A øiger cho sản lượng cao khi lượng
acid tạo thành được trung hòa bởi CaCOa, và quá trình này phụ thuộc chặt
chẽ vào pH Tuy nhiên khi sir dung Penicillium sp su phy thudc vao pH không còn bị giới hạn như khi str dung A øiger, khi đối chiếu về số lượng,
thời gian xuất hiện của các acid hữu cơ như: gluconic acid, citric acid,
oxalic acid trong những điều kiện khác nhau 6.3 Cố định (Immobilisation)
Kỹ thuật cố định (Immobilisation) là kỹ thuật khá phức tạp, nơi vi sinh vật được cố định trên màng bao hay được cố định tại những khu vực riêng Trong một số trường hợp enzyme được cô định Phương pháp này cho phép tái sử dụng vi sinh vật trong sản xuất, và là một phương pháp hiệu quả trong việc chuyển hóa nhanh chóng carbonhydrat thành acid hữu cơ
oe
& Trong quá khứ cũng có một vài nghiên cứu về việc sử đụng té bao A niger được cô định trong sản xuất gluconic aciđ, trong đó tế bào A miger được vo viên với các chất có khối lượng phân tử cao (polyelectrolyte), calcium alginate, glycidyl ester copolymers tao thành hệ keo kết đính A øiger được đưa vào sản xuất gluconic acid boi Heinrich va Rehm, Sakurai et al dua ra phương pháp cô định A niger, Vassilev et al va Mukhopadhyay et al nghiên cứu cách cố định sợi khuẩn ty trong bot polyurethane
Bằng cách cố định ƠŒ oxyđans trong điều kiện thông khí, nuôi cấy tối thiểu 6 tháng, sẽ cho năng suất 5 g/(L.h) trên 100 g/L glucose, nồng độ gluconic acid sinh ra trong trường hợp này khoảng 80 g/L Trong một nghiên cứu khác khi cho bào tử nắm mốc được giữ cố định trong kính mờ (sintered glass), da bot (pumice stone) va bot polyurethane, lic nay hé soi nâm phát trién trong da bot sé san sinh enzyme ngoai bao glucose oxidase cao (80 %
khi đối chiếu với hoạt tính của enzyme trong các tế bảo tự đo)
Nghiên cứu của Sankpal ef al trong việc sử dung A øiger được cố định trong mạng lưới cellulose (cellulosic fabric) như là chiếc khung lưới (support matrix) trong san xuat gluconic acid Dung dich glucose (100 g/L) được thiết kế chây qua ống mao mạch, như là kết cấu lưới thắng đứng Hệ thống được chạy liên tiếp trong 61 ngày, chuyển hóa toàn bộ glucose, sinh ra sản lượng gluconic acid là 20-140 g/L Sankpal and Kulkami tìm ra
được giá trị trung bình mật độ sinh khối sinh vi sinh vật trong khung
cellulose 1a 0.234 mg/cm’ 1a phù hợp cho lên men Nếu nhiều quá sẽ gây ức chế vi sinh vật ngoài ra, sự gia tăng nhanh về tế bào vi sinh vật làm cho hiệu suất chuyên hóa giảm
Trang 25Gluconic acid GVHD: PGS TS Lé Vin Việt Mẫn
TAI LIEU THAM KHAO
1 Lê Ngọc Tú, Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội, , Hà Nội 1997
2 Nguyễn Đức Lượng, Cổng nghệ sinh học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, Tp HCM, 2001, 345 trang
3 Lê Văn Việt Mẫn và cộng sự, Công nghệ chế biến thực phẩm, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, Tp HCM, 2009, 1020 trang 4 Rehm H.J,Reed G Biofechnology (1l volumes) volumes 6; Primary
metabolites VCH publish, Weinheim, 1996