(Luận văn) phân lập và tối ưu một số điều kiện sinh trưởng của vi khuẩn nitrate hóa trong mẫu nước thải tại trường đại học nông lâm thái nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HOÀNG THỊ THANH NGA lu an Tên đề tài: n va VI KHUẨN NITRATE HÓA TRONG MẪU NƢỚC THẢI TẠI TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN p ie gh tn to PHÂN LẬP VÀ TỐI ƢU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN SINH TRƢỞNG CỦA nl w d oa KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC va an lu Hệ đào tạo u nf : Chính quy ll Chun ngành/ngành : Cơng nghệ sinh học : CNSH & CNTP z at nh Khóa học oi m Khoa : 2012 – 2016 z m co l gm @ an Lu Thái Nguyên – năm 2016 n va ac th si ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HOÀNG THỊ THANH NGA lu an n va Tên đề tài: VI KHUẨN NITRATE HÓA TRONG MẪU NƢỚC THẢI TẠI p ie gh tn to PHÂN LẬP VÀ TỐI ƢU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN SINH TRƢỞNG CỦA nl w TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN d oa KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC va an lu : Chính quy ll u nf Hệ đào tạo Khoa : CNSH & CNTP z : 2012 – 2016 gm @ Khóa học : 45 - CNSH z at nh Lớp oi m Chuyên ngành/ngành: Công nghệ sinh học Giảng viên hƣớng dẫn: ThS Dƣơng Mạnh Cƣờng m co l an Lu Thái Nguyên – năm 2016 n va ac th si i LỜI CẢM ƠN Được đồng ý Ban Giám hiệu nhà trường, Ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học-Công nghệ Thực phẩm, thời gian thực tập tốt nghiệp, em tiến hành thực đề tài “Phân lập tối ưu số điều kiện sinh trưởng vi khuẩn Nitrate hóa mẫu nước thải trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên” Sau thời gian tham gia nghiên cứu thực đề tài, đến em hoàn thành đề tài nghiên cứu Nhân dịp em xin bày tỏ lòng biết ơn tới: ThS Dương Mạnh Cường, Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm lu Thái Nguyên tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em thực đề tài an n va Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Vi Đại Lâm giúp đỡ tạo điều kiện Em xin chân thành cảm ơn thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học gh tn to tốt cho em suốt trình thực đề tài ie Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên dạy dỗ, p truyền đạt kiến thức kinh nghiệm nghiên cứu khoa học suốt thời nl w gian học tập d oa Cuối em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè ln ủng hộ, động an lu viên để em có tự tin học tập thực tập tốt nghiệp va Dù cố gắng nhiều, xong khóa luận khơng thể tránh khỏi thiếu ll m toàn thể bạn u nf sót hạn chế Kính mong nhận bảo, đóng góp ý kiến q Thầy Cơ oi Em xin chân thành cảm ơn z at nh Sinh viên z gm @ m co l Hoàng Thị Thanh Nga an Lu n va ac th si ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc dịng vi khuẩn nghiên cứu 31 Bảng 4.2 Đặc điểm tế bào dòng vi khuẩn nghiên cứu .32 Bảng 4.3 Ảnh hưởng pH đến phát triển dòng vi khuẩn A1 33 Bảng 4.4 Ảnh hưởng pH đến phát triển dòng vi khuẩn B3 34 Bảng 4.5 Ảnh hưởng nhiệt độ mơi trường ni cấy đến dịng A1 36 Bảng 4.6.Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường ni cấy dịng vi khuẩn B3 37 lu Bảng 4.7 Ảnh hưởng nguồn cacbon hữu đến sinh trưởng dòng vi an khuẩn A1 38 va Bảng 4.8 Ảnh hưởng nguồn cacbon vô kết hợp nguồn cacbon hữu đến n tn to phát triển dòng vi khuẩn A1 .39 p ie gh Bảng 4.9 Ảnh hưởng nguồn cacbon hữu đến sinh trưởng dòng vi khuẩn B3 40 w Bảng 4.10 Ảnh hưởng nguồn cacbon vô kết hợp với hữu đến sinh d oa nl trưởng dòng vi khuẩn B3 42 ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si iii DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Chu trình Nitơ tự nhiên Hình 4.1 Các dịng vi khuẩn nitrate có hoạt tính mơi trường Winogradsky I 28 Hình 4.2 Các dịng vi khuẩn nitrate có hoạt tính mơi trường WinogradskyII 29 Hình 4.3 Dịng vi khuẩn nitrite hóa mơi trường có chứa thuốc thử Griss 30 Hình 4.4 Dịng vi khuẩn nitrat hóa mơi trường có chứa thuốc thử Griss 30 Hình 4.5 Hình thái khuẩn lạc dịng vi khuẩn A1, B2 .31 Hình 4.6 Hình thái tế bào dịng A1, B3 32 lu an Hình 4.7 Biểu đồ ảnh hưởng pH đến phát triển dịng vi khuẩn A1 .34 n va Hình 4.8 Biểu đồ ảnh hưởng pH đến phát triển dịng B3 .35 tn to Hình 4.9 Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển dịng vi khuẩn A1 36 gh Hình 4.10 Biểu đồ ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển dòng vi khuẩn B3 37 p ie Hình 4.11 Biểu đồ ảnh hưởng nguồn hữu đến phát triển dòng vi khuẩn A1 39 oa nl w Hình 4.12 Biểu đồ ảnh hưởng nguồn cacbon vô kết hợp với nguồn cacbon hữu đến phát triển dòng vi khuẩn A1 .40 d an lu Hình 4.13 Biểu đồ ảnh hưởng nguồn hữu đến phát triển dòng vi va khuẩn B3 41 ll u nf Hình 4.14 Biểu đồ ảnh hưởng nguồn cacbon vô kết hợp với nguồn cacbon oi m hữu đến phát triển dòng vi khuẩn B3 .42 z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si iv DANH MỤC VÀ KÍ HIỆU VIẾT TẮT AMO : Amon Monoxygenase lu an AOB : Ammonium DO : Dissolved Oxygen ATP : Adenosine Tri-Phosphate h : Giờ ĐC : Đối chứng TAN :Total amonia nitrogen AOB : Ammonia Oxidizing Bacteria n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si v MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu đề tài .3 1.2.1 Mục tiêu đề tài 1.2.2 Yêu cầu đề tài .3 1.3 Ý nghĩa đề tài PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU lu an 2.1 Cơ sở khoa học đề tài n va 2.1.1 Chu trình Nitơ tn to 2.1.2 Tác hại việc dư thừa Nitơ đời sống môi trường 2.1.3 Trạng thái tồn q trình chuyển hóa nitơ nước thải gh p ie 2.1.4 Quá trình chuyển hóa nitơ vơ vai trị nhóm vi khuẩn nitrate hóa 10 2.1.4.1 Q trình Nitrate hóa 10 nl w 2.1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình nitrate hóa 12 d oa 2.1.5 Đặc điểm sinh học vai trò vi khuẩn tham gia q trình nitrate hóa .14 an lu 2.1.5.1 Các dòng vi khuẩn tham gia vào q trình nitrate hóa 14 va 2.1.5.2 Đặc điểm sinh học vai trò vi khuẩn Nitrosomonas 16 ll u nf 2.1.5.3 Đặc điểm sinh học vai trò vi khuẩn Nitrobacter 17 oi m 2.1.6 Hiện trạng nước thải trường Nông Lâm Thái Nguyên .19 z at nh 2.2 Tình hình nghiên cứu nước giới .20 2.2.1 Tình hình nghiên cứu nước .20 z 2.2.2 Tình hình nghiên cứu giới 20 gm @ PHẦN ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 l 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 m co 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 22 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 22 an Lu 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu .22 n va ac th si vi 3.2.2 Thời gian nghiên cứu 22 3.3 Dụng cụ, môi trường 22 3.3.1 Dụng cụ thiết bị .22 3.3.2 Môi trường 23 3.3.2.1 Môi trường Winogradsky I 23 3.3.2.2 Môi trường Winogradsky II 23 3.4 Nội dung nghiên cứu 24 3.5 Phương pháp nghiên cứu 24 3.5.1 Phương pháp thu thập mẫu 24 lu 3.5.2 Phương pháp phân lập tuyển chọn vi khuẩn nitrat hóa 24 an n va 3.5.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn 24 3.5.3 Phương pháp nhuộm gram 25 gh tn to 3.5.2.2 Phương pháp làm tuyển chọn dịng vi khuẩn có hoạt lực cao .25 ie 3.5.4 Phương pháp giữ giống 26 p 3.5.5 Phương pháp phân tích 26 nl w 3.5.6 Xác định số tính chất sinh lý, sinh hóa đến dịng vi khuẩn nitrat hóa 27 d oa PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .28 an lu 4.2 Thử nghiệm khả nitrate hóa 29 va 4.2.1 Tuyển chọn dòng vi khuẩn có hoạt tính oxy hóa amon thành nitrite 29 u nf 4.2.2 Tuyển chọn dịng có hoạt tính nitrite thành nitrate 30 ll 4.3 Định danh vi khuẩn dựa đặc điểm hình thái .31 m oi 4.4 Tối ưu số điều kiện pH, nhiệt độ, nguồn dinh dưỡng đến khả sinh z at nh trưởng vi khuẩn nitrate hóa .33 4.4.1 Ảnh hưởng pH đến phát triển vi khuẩn 33 z gm @ 4.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển dòng vi khuẩn nitrate hóa 36 4.4.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến phát triển vi khuẩn nitrate hóa .38 l m co 5.1 Kết luận 44 5.2 Kiến nghị 44 an Lu TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 n va ac th si PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nước thải - nước sau sử dụng bị nhiễm bẩn từ sinh hoạt, hoạt động công nghiệp, nông nghiệp thải khỏi khu vực sử dụng nguồn nhận ao, hồ, sông, biển Trong dịch chuyển, lượng nước thải định thấm vào đất tạo nước ngầm đem theo chất gây ô nhiễm Tác nhân gây ô nhiễm môi trường nước chất có khả chuyển hố thành chất khác chất bền tác động đến cân sinh thái môi lu trường nước nhận Về nguyên tắc, chất bền môi trường coi độc an n va hại khơng gây hại trực tiếp lên động vât, thực vật sống nước lên họ chất hữu bền mơi trường có tác dụng xấu gây loại bệnh gh tn to người cách gián tiếp tới người thông qua chuỗi thức ăn Có nhiều ie nan y, đột biến gen với nồng độ thấp Đó số họ chất bảo vệ thực vật, p hormon, kháng sinh, dược phẩm, số hợp chất đặc thù khác thâm nhập nl w vào thể người động vật trực tiếp qua thức ăn Rất nhiều hợp chất gây ô d oa nhiễm nước thải có khả chuyển hố cao mơi trường nước tự nhiên an lu thông qua phản ứng hoá học, sinh hoá, quang hoá tác động đến cân sinh va thái môi trường Các chất gây đục vơ có khả chuyển hố khơng lớn, u nf tồn nguồn nước nhận gây đục, gây tượng cản ánh sáng vào nước, ll hạn chế phát triển thuỷ thực vật sống Hậu kéo theo làm giảm m oi nguồn thức ăn thuỷ động vật, làm giảm nồng độ oxy hoà tan nước z at nh trình quang hợp thực vật bị hạn chế, gây khó khăn cho hoạt động động vật thuỷ sinh (Lê Văn Cát, 2007) z gm @ Nitơ nguyên tố sống, có mặt tất hoạt động liên quan đến sống nhiều ngành nghề sản xuất công nghiệp, nông nghiệp Hợp l m co chất hoá học chứa nitơ thành phần dinh dưỡng phạm trù nước thải đối tượng gây ô nhiễm trầm trọng cho môi trường Nếu hàm lượng nitơ có an Lu nước thải xả sông, hồ mức gây tượng ô nhiễm, điển hình n va ac th si tượng phú dưỡng Trong môi trường phú dưỡng, điều kiện sống (pH, oxy tan) biến động liên tục mạnh tác nhân gây khó khăn, chí môi trường sống thuỷ động vật Thời gian hay chu kỳ sống tảo có giới hạn, sau phát triển mạnh (bùng nổ tảo hay gọi nước nở hoa) tảo chết lắng xuống lớp đáy tiếp tục bị phân huỷ điều kiện yếm khí Giống lồi tảo phong phú, có lồi tảo độc (tiết độc tố), điều kiện phú dưỡng tỷ lệ thành phần tảo thường thay đổi theo chiều hướng bất lợi, hình thành nhiều loại tảo độc (C E Boyd, 1998), phát triển mạnh, tảo che chắn ánh sáng không cho thực vật sống lớp phát triển, gây độc làm nguồn thức ăn cho thuỷ động lu vật Khi chết tảo lắng xuống đáy, bị vi sinh vật nấm phân huỷ làm cạn kiệt nguồn an oxy hoà tan cung cấp cho loài động vật khác Trong phân huỷ tảo, chất va n dinh dưỡng hữu lại chiết môi trường nước từ trầm tích, yếu tố tn to lại thúc đẩy vi sinh vật phát triển Vi sinh vật phát triển bám vào thân, Để giải vấn đề trên, việc nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để xử lý p ie gh thực vật làm giảm khả quang hợp thực vật w nước bị ô nhiễm ngày phổ biến Khác với phương pháp vật lý, hóa oa nl học… việc sử dụng vi sinh vật giúp tăng cường khả phục hồi, khả tự làm d mơi trường, có tính ổn định cao thân thiện với môi trường an lu Trong tự nhiên, vi sinh vật loại bỏ hàm lượng Nitơ dư thừa nước u nf va cách chuyển hóa nitơ dạng hữu vơ thành dạng khí N2 ngồi mơi trường Q trình diễn chủ yếu nhờ q trình amon hóa, nitrate hóa ll oi m phản nitrate hóa Dạng tồn phổ biến Nitơ nước NH3 muối z at nh NH4+ Trong nitrate hóa q trình hiếu khí ( điều kiện có O2), NH4+ Oxi hóa thành nitrite NO2-, sau nitrite NO2- chuyển hóa thành NO3- Các z biến đổi thực vi sinh vật, ví dụ vi khuẩn: Nitrobacter, @ Nitrospira, Nitrococcus Do vậy, việc tìm dịng vi khuẩn chuyển hóa nitrate gm l vi khuẩn phân giải nitrate có ý nghĩa quan trọng việc thiết lập quy trình m co phục hồi sinh học nhằm làm giảm nồng độ nitơ nước thải Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên thuộc Tổ 10, xã Quyết Thắng–Thành an Lu Phố Thái Nguyên, nằm phía Tây cách trung tâm thành phố khoảng 5km, có diện n va ac th si 32 Bảng 4.2 Đặc điểm tế bào dòng vi khuẩn nghiên cứu STT Kí hiệu dịng A1 B3 Đặc điểm tế bào Hình que ngắn trịn, có hình bầu dục, rời rạc Gram (-) Hình que ngắn, rời rạc Gram (-) Qua nghiên cứu hình thái tế bào cho thấy hai dòng A1 B3 vi khuẩn Gram âm, rời rạc hình dạng khác Dịng A1 tế bào có hình que ngắn trịn rời rạc, cịn dịng B3 tế bào có dạng hình que ngắn lu an n va p ie gh tn to d oa nl w B3 an lu A1 u nf va Hình 4.6 Hình thái tế bào dòng A1, B3 ll Theo Stanley Mandel (1971), vi khuẩn tham gia q trình nitrite hóa m oi (AOB) bao gồm có nhóm: Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosogloea, z at nh Nitrosospira Nitrosococcus Hình dạng tế bào nhóm vi khuẩn hồn tồn khác Theo nghiên cứu Phạm Thị Tuyết Ngân (2012) dịng vi z @ khuẩn thuộc giống Nitrosomonas nhóm vi khuẩn sau nhuộm Gram gm quan sát Gram âm, có hình que ngắn Mặt khác kết thử thuốc thử m co l Griss cho thấy dịng A1 có phản ứng với thuốc thử cho màu hồng đậm từ kết luận A1 có đặc điểm hình thái giống vi khuẩn thuộc chi Nitrosomonas an Lu Theo Phạm Thị Tuyết Ngân (2012) tế bào vi khuẩn Nitrobacter hình que ngắn Kết hình 4.5b cho thấy tế bào vi khuẩn hình que nhỏ, rời n va ac th si 33 rạc, thuộc vi khuẩn Gram âm kiểm tra có mặt NO3- mơi trường cho thấy xuất nồng độ có môi trường cho màu vàng nhạt điều chứng tỏ dịng vi khuẩn có đặc điểm hình thái giống vi khuẩn thuộc chi Nitrobacter 4.4 Tối ƣu số điều kiện pH, nhiệt độ, nguồn dinh dƣỡng đến khả sinh trƣởng vi khuẩn nitrate hóa Từ kết tuyển chọn định danh sơ chúng tối tiếp tục tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng dòng vi khuẩn tuyển chọn 4.4.1 Ảnh hưởng pH đến phát triển vi khuẩn lu pH môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến phát triển vi khuẩn an n va nitrate hóa Khi pH môi trường cao dẫn đến việc tạo lượng NH3 Trong trường hợp pH môi trường thấp dẫn đến việc tích tụ lượng gh tn to môi trường làm ức chế phát triển vi khuẩn oxy hóa amon nitrite p ie lớn axit nitric chất ức chế phát triển vi khuẩn nitrate hóa Do việc xác định giá trị pH phù hợp cho trình nitrate hóa cần nghiên cứu nl w Để tối ưu pH môi trường chúng tối tiến hành khảo sát ảnh hưởng d oa pH đến sinh trưởng hai dịng vi khuẩn A1 B3 Chúng tơi khảo sát pH môi an lu trường nuôi cấy giá trị pH=6,5; 7; 7,5; 8; 8,5, đo mật độ sinh khối tế bào va máy đo OD ghi kết bảng 4.3 thể biểu đồ hình 4.6 48 72 96 120 144 pH=6,5 0,006 0,043 0,117 0,155 0,233 0,18 0,158 pH=7 0,008 0,044 0,161 0,178 0,294 0,2 0,185 pH=7,5 0,01 0,054 0,243 0,261 0,355 0,25 0,233 pH=8 0,009 0,044 0,181 0,2 0,319 0,195 0,147 pH=8,5 0,005 0,036 0,110 0,145 0,193 0,095 0,049 z at nh z m co l gm @ (OD620nm) 24 oi Mật độ m Thời gian (h) ll u nf Bảng 4.3 Ảnh hƣởng pH đến phát triển dòng vi khuẩn A1 Từ bảng 4.3 trên, ta thấy ảnh hưởng pH đến phát triển an Lu dòng vi khuẩn A1 qua biểu đồ sau: n va ac th si 34 lu Hình 4.7 Biểu đồ ảnh hƣởng pH đến phát triển dòng vi khuẩn A1 an n va Kết hình 4.7 kết hợp với bảng 4.3 cho thấy dòng vi khuẩn A1 phát triển OD620nm 0,355 sau 96h nuôi cấy Khi pH=8,5 sinh trưởng A1 thấp nhất, gh tn to tốt mức pH = 7,5 Ở pH=7,5 phát triển A1 đạt mức giá trị cao p ie giá trị OD620nm cao 0,193 sau 96h nuôi cấy 24 48 72 96 120 pH=6,5 0,005 0,013 0,15 0,23 0,181 0,11 pH=7 0,003 0,05 0,173 0,271 0,232 0,2 pH=7,5 0,11 0,076 0,277 0,352 0,332 0,26 pH=8 u nf Thời gian (h) 0,089 0,185 0,283 0,267 0,095 pH=8,5 0,004 0,032 0,12 0,25 0,132 0,087 d oa nl lu w Bảng 4.4 Ảnh hƣởng pH đến phát triển dòng vi khuẩn B3 va (OD620nm) an Mật độ 0,008 ll oi m z at nh Từ bảng 4.4 trên, ta thấy ảnh hưởng pH đến phát triển chủng B3 qua biểu đồ sau: z m co l gm @ an Lu n va ac th si 35 0,4 B3 OD = 620nm 0,35 0,3 pH=6.5 0,25 0,2 pH=7 0,15 pH=7.5 0,1 pH=8 0,05 pH=8.5 0 24 48 72 96 120 Thời gian (h) lu an Hình 4.8 Biểu đồ ảnh hƣởng pH đến phát triển dòng B3 n va Kết hình 4.8 kết hợp với bảng 4.4 cho thấy mức pH=7,5 sinh trưởng tn to dòng vi khuẩn B3 phát triển mạnh nhất, giá trị OD620nm cao 0,352 sau gh 72h nuôi cấy Ở mức pH=6,5 vi khuẩn sinh trưởng thấp nhất, giá trị OD cực đại p ie đạt 0,23 sau 72h nuôi cấy w  Trong thơng báo trước ( Hồng Phương Hà cs, 2010) nghiên oa nl cứu ảnh hưởng số điều kiện ngoại cảnh đến sinh trưởng hoạt tính d nitrate hóa số dịng vi khuẩn nitrate hóa đề cập Kết cho thấy, an lu dịng vi khuẩn nitrate hóa nghiên cứu thích nghi pH= 7,5-8 Hai dòng vi khuẩn A1 u nf va B3 có kết tương tự Cả dòng A1 B3 phát triển tốt pH=7,5-8, nhiên mức độ ảnh hưởng pH khác Hình 4.8 ll oi m pH có ảnh hưởng lớn chủng B3 Ở pH=7,5 phát triển B3 đạt giá z at nh trị cao OD620nm 0,352 sau 72h nuôi cấy Khi pH tăng lên 8,5 hay giảm xuống 6,5 giá trị OD 0,25; 0,271; 0,23 Chủng A1 bị ảnh hưởng z pH Hình 4.8 rằng, giá trị pH=7,5-8 phát triển dòng vi khuẩn @ gm cao nhất, giá trị OD620nm 0,355 0,319 sau 96h nuôi cấy l Đối với chủng, pH=8,5 6,5 không thích hợp cho phát triển, ức chế m co sinh trưởng chúng Kết phù hợp điều kiện Nitrosomonas an Lu Nitrobacter Vi khuẩn nitrosomonas Nitrobacter điển hình cho trình nitrate hóa, việc sử dụng vi sinh vật để xử lý nước thải tốc độ phát triển n va ac th si 36 vi sinh vật đóng vai trị quan trọng vi sinh vật phát triển chúng chuyển hóa chất dư thừa nước thành sinh khối góp phần đáng kể việc làm giảm ô nhiễm 4.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển dòng vi khuẩn nitrate hóa Bảng 4.5 Ảnh hƣởng nhiệt độ mơi trƣờng ni cấy đến dịng A1 Thời gian (h) 24 48 72 96 120 144 T=20oC 0,009 0,122 0,156 0,173 0,2 0,144 0,11 Mật độ T=30oC 0,008 0,248 0,281 0,35 0,375 0,278 0,236 (OD620nm) T=40oC 0,007 0,115 0,207 0,19 0,251 0,19 0,10 T=50oC 0,009 0,1 0,12 0,143 0,105 0,09 0,05 lu an va n Từ bảng 4.5, ta thấy ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển p ie gh tn to dòng vi khuẩn A1 qua biểu đồ sau: d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh Hình 4.9 Biểu đồ ảnh hƣởng nhiệt độ đến phát triển dòng vi khuẩn A1 z Từ bảng 4.5 kết hợp với hình 4.9 cho thấy nghiên cứu ảnh hưởng @ gm nhiệt độ đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A1, vi khuẩn sinh trưởng mạnh m co l nhiệt độ 30°C với giá trị OD620nm cực đại đạt 0,375 sau 96h nuôi cấy Khi nhiệt độ tăng lên 50°C hay giảm xuống 20 mật độ vi khuẩn giảm rõ rệt với giá trị an Lu OD620nm cực đại 0,105; 0,2 sau 96h nuôi cấy n va ac th si 37 Bảng 4.6.Ảnh hƣởng nhiệt độ mơi trƣờng ni cấy dịng vi khuẩn B3 24 48 72 96 120 144 T=20oC 0,012 0,187 0,249 0,28 0,272 0,245 0,211 Mật độ T=30oC 0,015 0,289 0,30 0,381 0,358 0,33 0,27 (OD620nm) T=40oC 0,009 0,25 0,274 0,34 0,323 0,3 0,246 T=50oC 0,007 0,172 0,21 0,261 0,25 0,223 0,12 Thời gian (h) Từ bảng 4.6, ta thấy ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển dòng vi khuẩn B3 qua biểu đồ sau: lu an n va p ie gh tn to d oa nl w an lu ll u nf va Hình 4.10 Biểu đồ ảnh hƣởng nhiệt độ đến phát triển dòng vi khuẩn B3 oi m Kết bảng 4.6 kết hợp với hình 4.10 cho thấy, dòng vi khuẩn B3 sinh z at nh trưởng mạnh nhiệt độ 30°C giá trị cực đại đạt 0,385 sau 72h nuôi cấy Mật độ vi khuẩn bắt đầu giảm nhiệt độ 20°C 50°C z So sánh hai hình 4.9 4.10, cho thấy mức độ phát triển dòng vi khuẩn @ gm B3 mạnh A1 Dòng A1 mật độ vi khuẩn tăng giảm rõ rệt Khi nhiệt độ tăng lên l 50°C hay giảm xuống 20°C vi khuẩn phát triển chậm Thời gian vi khuẩn sinh m co trưởng A1 B3 phát triển tốt nhiệt độ 30°C thời gian vi an Lu khuẩn sinh trưởng đạt mức tối đa lại khác Dòng A1 sinh trưởng mạnh n va ac th si 38 96h nuôi cấy giá trị OD620nm cực đại 0,375 B3 lại đạt mức tối đa sau 96h nuôi cấy với giá trị OD620nm cực đại 0,381 4.4.3 Ảnh hưởng nguồn carbon đến phát triển vi khuẩn nitrate hóa Vi khuẩn nitrate hóa nhóm vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, tự dưỡng hóa năng, sinh trưởng chậm nhạy cảm với số chất gây độc thay đổi pH, nhiệt độ Chúng sử dụng CO2 làm nguồn carbon lấy lượng từ q trình oxy hóa hợp chất nitrogen cho sinh trưởng Một số loài thuộc chi Nitrosomonas Nitrobacter sử dụng carbon hữu glucose, lactose, sucrose, acetate, pyruvate… trao đổi linh hoạt mà chúng tồn mà chúng có lu an thể tồn mơi trường sống khác Vi khuẩn nitrate hóa coi nhóm va n vi khuẩn quan trọng tham gia vào việc bảo vệ mơi trường nhờ có oxy hóa tn to hợp chất nitrogen Dưới tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nguồn ie gh carbon đến sinh trưởng phát triển dịng vi khuẩn nitrate hóa p Bảng 4.7 Ảnh hƣởng nguồn carbon hữu đến sinh trƣởng dòng nl w vi khuẩn A1 24 48 72 96 120 144 0,028 0,147 0,291 0,493 0,543 0,372 0,32 0,355 0,543 0,595 0,48 0,414 0,285 0,317 0,44 0,345 0,298 d oa Thời gian (h) (ĐC) Mật độ Glucose u nf 0,224 (OD620nm) Sucrose 0,019 0,126 Lactose 0,005 oi va an lu CaCO3 0,109 0,198 0,338 0,46 0,304 0,25 Acetate 0,043 0,143 0,176 0,283 0,27 0,18 0,201 0,044 ll m z at nh z @ Từ giá trị đo bảng 4.7, tiến hành vẽ biểu đồ thể ảnh biểu đồ sau: m co l gm hưởng nguồn carbon khác đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A1 qua an Lu n va ac th si 39 lu an n va Hình 4.11 Biểu đồ ảnh hƣởng nguồn hữu đến phát triển dòng vi khuẩn A1 to gh tn Kết bảng 4.7 kết hợp với hình 4.11 cho thấy sử dụng nguồn ie carbon hữu thay cho nguồn carbon CaCO3 dịng vi khuẩn A1 phát p triển bình thường Khi sử dụng Glucose dòng vi khuẩn A1 sinh trưởng mạnh nhất, nl w giá trị OD620nm cực đại đạt 0,595 sau 96h nuôi cấy cao sử dụng nguồn d oa carbon CaCO3 với giá trị OD cực đại 0,54 Từ kết luận chất lu thay cho mà khơng thay đổi hoạt tính dịng vi khuẩn nitrate hóa va an Chúng tiếp tục tiến hành thử nghiệm khả sinh trưởng dòng vi u nf khuẩn A1 cách kết hợp nguồn carbon hữu với nguồn carbon vô ll (CaCO3) Kết thể bảng 4.8 m oi Bảng 4.8 Ảnh hƣởng nguồn carbon vô kết hợp nguồn carbon hữu z at nh đến phát triển dòng vi khuẩn A1 0,291 0,493 0,588 0,373 0,463 0,311 120 144 0,543 0,372 0,32 0,683 0,467 0,371 0,48 0,41 0,355 0,261 0,247 an Lu 0,463 0,301 0,233 0,2 96 m co 0,374 0,133 0,223 0,166 72 l 0,067 0,05 0,032 0,038 0,147 48 gm 0,028 24 @ Mật độ (OD620nm) CaCO3 (ĐC) Glucose + CaCO3 Sucrose + CaCO3 Lactose + CaCO3 Acetate + CaCO3 z Thời gian (h) 0,511 0,4 0,35 0,354 n va ac th si 40 Từ giá trị đo bảng 4.8, tiến hành vẽ biểu đồ thể ảnh hưởng nguồn cacbon hữu đến sinh trưởng dòng vi khuẩn A1 A1 lu Mật độ OD=620nm 0,8 0,7 0,6 0,5 CaCO3 0,4 Glucose+CaCo3 0,3 Sucrose+CaCO3 0,2 Lactose+CaCO3 0,1 Acetate+CaCO3 an va 24 48 72 96 120 144 n Thời gian (h) tn to ie gh Hình 4.12 Biểu đồ ảnh hƣởng nguồn carbon vô kết hợp với nguồn carbon p hữu đến phát triển dòng vi khuẩn A1 nl w Dựa vào hình 4.12 ta thấy sinh trưởng A1 tiếp tục tăng môi trường oa sử dụng nguồn carbon hữu Glucose kết hợp với nguồn carbon vô Giá trị d OD620nm đạt cực đại 0,683 sau 96h nuôi cấy, cao bổ sung Glucose lu an không kết hợp CaCO3 với giá trị OD cực đại 0,543 (Bảng 4.8) u nf va Bảng 4.9 Ảnh hƣởng nguồn carbon hữu đến sinh trƣởng dòng ll vi khuẩn B3 24 oi m 48 72 96 120 0,21 0,274 0,33 0,281 0,24 Mật độ Glucose (OD620nm) Sucrose 0,009 0,182 0,2 0,272 0,246 0,203 0,015 0,078 0,092 0,13 0,111 0,074 Lactose 0,005 0,083 0,09 0,181 0,124 0,06 Acetate 0,01 0,195 0,261 0,284 0,273 0,251 m co l gm @ 0,014 z z at nh Thời gian (h) Na2CO3 (ĐC) Từ bảng 4.9, tiến hành vẽ biểu đồ thể ảnh hưởng nguồn carbon hữu an Lu đến sinh trưởng dòng vi khuẩn B3 n va ac th si 41 lu an va n Hình 4.13 Biểu đồ ảnh hƣởng nguồn hữu đến to Kết hình 4.13 kết hợp với bảng 4.9 có thay đổi sử dụng p ie gh tn phát triển dòng vi khuẩn B3 nguồn carbon hữu khác Vi khuẩn sinh trưởng tốt môi trường chứa nl w nguồn carbon Na2CO3 đạt giá trị OD620nm cực đại 0,33 72h sau oa acetate với giá trị OD620nm cực đại 0,284 Từ nhận thấy dùng d acetate thay cho Na2CO3 điều kiện phịng thí ngiệm hạn chế B3 sử dụng lu u nf 0,18; 0,13 va an nguồn carbon từ Lactose Sucrose với giá trị OD620nm cực đại tương ứng ll Chúng tiếp tục tiến hành thử nghiệm khả sinh trưởng dòng vi oi m khuẩn A1 cách kết hợp nguồn carbon hữu với nguồn carbon vô z at nh (Na2CO3) Kết thể bảng 4.10 z m co l gm @ an Lu n va ac th si 42 Bảng 4.10 Ảnh hƣởng nguồn carbon vô kết hợp với hữu đến sinh trƣởng dòng vi khuẩn B3 24 48 72 96 120 0,014 0,21 0,274 0,33 0,281 0,24 Na2CO3+Glucose 0,022 0,21 0,251 0,411 0,389 0,338 (OD620nm) Na2CO3+Sucrose 0,003 0,167 0,25 0,355 0,313 0,293 Na2CO3+Lactose 0,008 0,19 0,12 0,21 0,172 0,158 Na2CO3+Acetate 0,011 0,3 0,345 0,592 0,543 0,410 Thời gian (h) Na2CO3 (ĐC) Mật độ lu Từ bảng 4.10, tiến hành vẽ biểu đồ thể ảnh hưởng nguồn carbon an hữu đến sinh trưởng dòng vi khuẩn B3 n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf va an lu oi m z at nh Hình 4.14 Biểu đồ ảnh hƣởng nguồn carbon vô kết hợp với nguồn carbon hữu đến phát triển dòng vi khuẩn B3 z Khi kết hợp nguồn carbon hữu với vô cơ, mật độ vi khuẩn tăng lên, tăng @ gm cao sử dụng nguồn carbon hữu Sự sinh trưởng dòng vi khuẩn m co l B3 mạnh kết hợp Acetate với Na2CO3 với giá trị OD620nm cực đại 0,592 sau 72h nuôi cấy cho thấy kết hợp tối ưu an Lu n va ac th si 43 Sau thử nghiệm ảnh hưởng nguồn carbon đến sinh trưởng vi khuẩn nitrate chúng tơi có kết luận sau: Trong mơi trường khống sở có bổ sung nguồn carbon hữu cơ, dịng vi khuẩn A1 phát triển bình thường số nguồn carbon hữu lại khơng kích thích sinh trưởng dịng vi khuẩn B3 (Lactose Sucrose) Dòng vi khuẩn A1 sinh trưởng tốt mơi trường có nguồn carbon vơ CaCO3 kết hợp với Glucose, dòng vi khuẩn B3 sinh trưởng tốt mơi trường có nguồn carbon vơ Na2CO3 kết hợp với Acetate Kết cho thấy việc bổ sung số nguồn carbon hữu kích thích sinh trưởng dịng vi khuẩn nghiên cứu lu an Tóm lại, Các dịng vi khuẩn A1, B3 có nhiệt độ tối ưu 30oC, pH cho n va phát triển từ 7,5 đến giống với nghiên cứu Hoàng Phương Hà (2010) tn to Sinh trưởng vi khuẩn đạt tới pha cần dòng vi khuẩn A1 sau khoảng gh 96 giờ, dòng vi khuẩn B3 sau khoảng 72 khác với nghiên cứu TRần Liên p ie Hà (2007) Theo nghiên cứu Trần Liên Hả (2007) thời gian vi khuẩn w nitrosomonas sinh trưởng đạt cực đại 72 vi khuẩn nitrobacter đạt cực đại oa nl sau 96 nuôi cấy Trên số điều kiện tối ưu để thu hồi sinh khối hai d dòng vi khuẩn nhằm hướng tới ứng dụng nghiên cứu để xử lí nước thải Tuy nhiên an lu nghiên cứu này, ảnh hưởng yếu tố tới sinh trưởng dòng vi u nf va khuẩn khảo sát độc lập, để áp dụng quy mơ lớn cần phải khảo sát tương tác yếu tố tới sinh khối thu đưa hàm toán ll oi m học mối quan hệ yếu tố sinh khối z at nh z m co l gm @ an Lu n va ac th si 44 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ mẫu nước thải số địa điểm xung quanh trường Nông Lâm Thái Nguyên, tiến hành phân lập dòng vi khuẩn tự dưỡng nitrate hóa có dịng oxy hóa amon dịng oxy hóa nitrite Đã tuyển chọn dịng vi khuẩn: A1 có hoạt tính oxy hóa amon cao B3 có hoạt tính oxy hóa nitrite cao Qua nghiên cứu hình thái tế bào cho thấy, dịng vi khuẩn A1 có đặc điểm lu hình thái giống vi khuẩn thuộc chi Nitrosomonas, dòng vi khuẩn B3 có đặc an Xác định điều kiện tối ưu cho sinh trưởng phát triển vi khuẩn n va điểm hình thái giống vi khuẩn thuộc chi Nitrobacter gh tn to nitrat hóa: hai dịng nitrate hóa A1 B3 sinh trưởng thích hợp nhiệt độ 30oC, pH Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn carbon đến sinh trưởng p ie từ 7,5 đến nl w dòng vi khuẩn nitrate: dòng vi khuẩn A1 sinh trưởng tốt môi trường bổ d oa sung Glucose kết hợp với CaCO3, dòng vi khuẩn B3 sinh trưởng tốt va 5.2 Kiến nghị an lu mơi trường có bổ sung thêm Acetate kết hợp với Na2CO3 u nf Mặc dù đạt kết định việc phân lập tuyển chọn ll dịng nitrate hóa, nhiên để đưa dịng thí nghiệm vào ứng dụng thực tế m oi cần thêm số nghiên cứu sâu z at nh - Tiến hành nghiên cứu, định danh vi khuẩn nitrate phương pháp sinh học phân tử z gm @ - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố khác đến sinh trưởng hoạt tính chủng như: nồng độ oxy hòa tan, ammonium hay nitrite đến chủng m co l dòng vi khuẩn… Tối ưu điều kiện để tăng số lượng vi khuẩn, bước đầu thử nghiệm khả an Lu phân giải nitơ nước thải vi khuẩn nitrate hóa n va ac th si 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu Tiếng Việt [1] Hoàng Phương Hà, Trần Văn Nhị, Nguyễn Thị Kim Cúc (2010), “Một số tính chất sinh học bốn dịng vi khuẩn nitrat hóa phân lập Hà Nội”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 8(2): 241-251 [2] Lê Văn Khoa (1995), Giáo trình Môi trường ô nhiễm, Nxb Giáo dục [3] Lê Văn Khoa (2007), Chỉ thị sinh học môi trường, Nxb Giáo dục [4] Lê Văn Cát (2007), Xử lý nước thải giàu hợp chất Nitơ Phospho, Nxb Khoa lu học tự nhiên Công nghệ, Hà Nội an [5] Lê Xn Phương (2008), Giáo trình thí nghiệm vi sinh vật, Đại học Đà Nẵng va n [6] Nguyễn Thị Thanh, Trần Liên Hà (2006), “Phân lập dòng vi khuẩn phản nitrat hóa Khoa học lần thứ 20, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội ie gh tn to với mục tiêu ứng dụng xử lý nước hồ nhiễm”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị p [7] Nguyễn Thị Kim Thái, Lê Thị Hiền Thảo (2003), Sinh thái học Bảo vệ môi nl w trường, Nxb Xây dựng oa [8] Phạm Thị Tuyết Ngân (2012), Nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển hóa đạm d bùn ao nuôi tôm sú (Penaeus monodon) Nxb Đh Cần Thơ lu va an [9] Trần Hiếu Nhuệ, Trần Đức Hạ, Lê Hiền Thảo (1996), Quá trình vi sinh vật u nf cấp thoát nước Nxb Khoa học kỹ thuật ll [10] Trần Đức Hạ (2006), chuyên đề: Xử lý Nito nước thải, Đại Học Xây oi m Dựng Hà Nội z at nh [11] Trần Văn Nhân, Ngơ Thị Nga (1999), Giáo trình cơng nghệ xử lý nước thải, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Tr 201-202 z @ [12] Trung tâm kỹ thuật môi trường đô thị khu công nghiệp (CEEITA) (2001), dựng Hà Nội m co l gm Báo cáo hội thảo xử lý hợp chất hữu nước ngầm, trường ĐH Xây an Lu n va ac th si 46 II Tài liệu Tiếng Anh [13] A.A.Van de Graaf, A.Mulder, Peter de Bruijn, M.S.M.Jette, L.A.Robertson, J.Gijs Kuenen (1995), Anaerobic Oxidation of Ammonium Is a Biologically Mediated Process, Applied and Environmental Microbiology 61 (4) 1246-1251 [14] Alfred Brown, Heidi Smith (2014), Benson's Microbiological Applications, Laboratory Manual in General Microbiology [15] Boon N., DeWindt, W., Vertraete, W., Top, E.M (2002), Evaluation of nested PCR-DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis) with group–specific 16S rRNA primer for the analysis of bacterial communities from different lu an wastewater treatment plants FEMS Microbiology Ecology Vol 39, 101-12 n va [16] C E Boyd (1998), Pond aquaculture water quality management Cluver tn to Academic Publ Boston, USA [17] Cole J.A (1994), Biodegradation of inorganic introgen compounds in p ie gh Biochemistry of microbial degradation, Ratledge C.Kluwer Academic publishers, PP.487-512 nl w [18] D.Barnes, P.J.Bliss (1983), Biological Control of Nitrogen in Wastewater d oa Treatment London: E&FN Spon Ldt va PP.738 - 740 an lu [19] Thomas B (1994), Biology of microrganic, Englewood, cliffts, New Jersey, ll u nf [20] Smith A.C., Hussey M.A (2005), “Gram stain protocols”, American society oi m for Microbiology Conference for Undergraduate Educa [21] Stanley,W and M Mandel (1971), Comparison of the morphology and z at nh deoxyribonucleic acid composition of 27 strains of nitrifying bacteria J z Bacteriol, 107: 563-569 m co l gm @ an Lu n va ac th si