(Luận văn) phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm trichoderma có hoạt tính kháng nấm từ đất trồng cây hoa màu tại tỉnh thái nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐÀM THỊ THU GIANG Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM TRICHODERMA CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ ĐẤT TRỒNG CÂY HOA MÀU TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN an lu va n KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC p ie gh tn to : CNSH Khoa : CNSH - CNTP : 2013 – 2017 a lu Ngành a nv d oa nl w Hệ đào tạo : Chính quy Khóa học ll u nf oi m tz a nh z @ om l.c gm Thái Nguyên – năm 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐÀM THỊ THU GIANG Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM TRICHODERMA CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ ĐẤT TRỒNG CÂY HOA MÀU TẠI TỈNH THÁI NGUYÊN an lu n va KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC p ie gh tn to : Chính quy Ngành : CNSH Lớp : K45 - Công nghệ Sinh học d oa nl w Hệ đào tạo a lu Khoa : CNSH - CNTP a nv : 2013 – 2017 u nf Khóa học ll Ngƣời hƣớng dẫn oi m : ThS Bùi Đình Lãm tz a nh z om l.c gm @ Thái Nguyên – năm 2017 i LỜI CẢM ƠN Được sự đ ồng ý Khoa CNSH-CNTP, Trường Đại học Nông lâm Thái Ngun Em được thực tập phịng thí nghiệm Khoa CNSHCNTP, Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên với đề tài : “Phân lập tuyển chọn số chủng nấm Trichoderma có hoạt tính kháng nấm từ đất trồng hoa màu tỉnh Thái Nguyên” Để hoàn thành khóa luận này ngoài sự nỗ lực thân em nhận được nhiều sự giúp đỡ Ban giám hiệu trường, Ban chủ nhiệm khoa CNSH-CNTP, thầy giáo tận tình giảng dạy em suốt năm Đại học Trước hết em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiê ̣u nhà trường , Ban chủ nhiệm khoa CNSH-CNTP thầ y cô giáo Khoa đã ta ̣o điề u kiê ̣n thuâ ̣n lơ ̣i cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này Đặc biệt, em xin bày tỏ lịng kính t rọng, lịng biế t ơn sâu sắ c tới ThS lu an Bùi Đình Lãm giảng viên khoa CNSH-CNTP Người đã tâ ̣n tiǹ h chỉ bảo , giúp n va đỡ và hướng dẫn em suốt trình thực hiê ̣n đề tài tn to Em xin gửi lời cảm ơn tới gia điǹ h, bạn bè, người thân đã quan tâm ủng gh hộ và là chỗ dựa tinh thần cho em suốt thời gian thực tập , cảm ơn p ie bạn bè hết lòng động viên, giúp đỡ em suố t thời gian qua d oa nl w Do điều kiện thời gian có ̣n , trình độ và kỹ thân nhiề u ̣n chế nên đề tài khó tránh khỏi những thi ếu sót Kính mong thầy a nv hồn thiện a lu giáo bạn sinh viên đóng góp ý kiến xây dựng để đề tài em được ll u nf Em xin chân thành cảm ơn! oi m Thái Nguyên, ngày 04 tháng 06 năm 2017 tz a nh Sinh viên z Đàm Thị Thu Giang om l.c gm @ ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1: Thành phần môi trường PGA 24 Bảng 3.2: Thành phần môi trường nhân sinh khối Trichoderma [5] 25 Bảng 3.3: Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 25 Bảng 3.4: Các trang thiết bị máy móc dùng thí nghiệm 26 Bảng 3.5 Trình tự mời ITS4 ITS5 31 Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR liều lượng dùng cho phản ứng 31 Bảng 3.7 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 32 Bảng 4.1 Kết phân lập mẫu đất 36 Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái chủng phân lập được 39 Bảng 4.3 Hoạt tính đối kháng Trichoderma Fusarium môi trường PGA 41 lu an Bảng 4.4 Hoạt tính đối kháng Trichoderma Phytophthora môi va n trường PGA 44 p ie gh tn to d oa nl w ll u nf a nv a lu oi m tz a nh z om l.c gm @ iii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1 Đặc điểm hình thái nấm Trichoderma Hình 2.2 Bào tử nấm Trichoderma Hình 3.1: Các bước tạo chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma 35 Hình 4.1 Nấm mốc phân lập môi trường PGA chủng C1 chủng C2 37 Hình 4.2 Hình thái nấm Trichoderma mơi trường PGA 38 Hình 4.3 Hình ảnh cấy trải chủng C1, chủng C2 chủng C3 39 Hình 4.4 Hình thái khuẩn lạc (A) hình thái tế bào (B), (C) chủng C1 39 Hình 4.5 Hình thái khuẩn lạc (A) hình thái tế bào (B) chủng C2 40 Hình 4.6 Đối kháng Trichoderma chủng C1 (A), C2 (B), C3 (C) với Fusarium đối chứng (D) Fusarium sau ngày cấy 42 Hình 4.7 Đối kháng Trichoderma chủng C1 (A), C2 (B), C3 (C) với lu an Fusarium đối chứng (D) Fusarium sau ngày cấy 42 n va Hình 4.8 Đối kháng Trichoderma chủng C1 (A) với Fusarium đối chứng tn to (B) Fusarium sau ngày cấy 43 p ie gh Hình 4.9 Đối kháng Trichoderma chủng C1 với Phytophthroza (a) và đối chứng Phytophthroza (b) 45 d oa nl w Hình 4.10 Kết tách chiết DNA tổng số 46 Hình 4.11 Kết điện di gel agarose 47 a lu Hình 4.12 Kết tinh sản phẩm PCR 47 a nv Hình 4.13 Kết so sánh trình tự gen sản phẩm PCR BLAST với mồi u nf với mồi ITS4-ITS5 từ mẫu đất (từ Xã Quyết Thắng TP Thái ll Nguyên, Tỉnh Thái Nguyên) 48 m oi Hình 4.14 Hình ảnh chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma 50 tz a nh z om l.c gm @ iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Ký hiệu µg Microgram µl Microlit dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate DNA Deoxyribonucleotide acid EDTA Ethylene diamin tetracetic acid PCR CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide RNA Ribonucleic acid Taq Thermus aquaticus 10 TAE Tris-Acetate- EDTA 11 TE Tris- EDTA 12 ĐC Đối chứng an lu STT Polymerase chain reaction n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf a nv a lu oi m tz a nh z om l.c gm @ v MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC HÌNH iii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv MỤC LỤC v PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3.Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa đề tài 1.4.1 Ý nghĩa khoa học lu an 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn va PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU n tn to 2.1 Đại cương về Trichoderma ie gh 2.2 Đặc điểm cấu tạo, hình thái tế bào nấm p 2.2.1 Cấu tạo d oa nl w 2.2.2 Đặc điểm hình thái 2.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa nấm Trichoderma a lu 2.3 Phân loại nấm Trichoderma a nv 2.4 Khả kiểm soát sinh học Trichoderma u nf 2.4.1 Tương tác với nấm bệnh ll 2.4.2 Cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng với nấm bệnh 11 m oi 2.5 Nấm Trichoderma với khả tạo chế phẩm đối kháng 11 a nh 2.5.1 Đất kháng nấm 12 tz z 2.5.2 Thiết lập quần thể tượng mầm đất 12 om l.c gm @ vi 2.5.3 Thiết lập quần thể vùng rễ 12 2.6 Cơ chế hoạt động Trichoderma 13 2.6.1 Khả phòng trừ nấm Trichoderma lồi nấm gây bệnh trờng 14 2.6.2 Hiện tượng giao thoa 15 2.6.3 Hoạt động tiết enzyme 15 2.6.3.1 Hệ enzyme thủy phân chitin 15 2.6.3.2 Hệ enzyme thủy phân celluose 16 2.7 Các dạng thuốc chế phẩm Trichoderma trừ nấm bệnh 17 2.8 Tình hình nghiên cứu ứng dụng Trichoderma 18 PHẦN ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Đối tượng, vật liệu phạm vi nghiên cứu 24 3.1.1 Đối tượng 24 lu an 3.1.2 Vật liệu hóa chất, thiết bị dụng cụ nghiên cứu 24 n va 3.1.2.1 Mơi trường cần thiết q trình nghiên cứu 24 tn to 3.1.2.2 Thiết bị, máy móc, dụng cụ hóa chất dùng phịng thí nghiệm 25 gh 3.1.3 Phạm vi nghiên cứu 26 p ie 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 26 d oa nl w 3.2.1 Địa điểm thu thập phân tích mẫu 26 3.2.2 Thời gian 26 a lu 3.3 Nội dung nghiên cứu 26 a nv 3.4 Các phương pháp tiến hành thí nghiệm 27 u nf 3.4.1 Phương pháp thu thập mẫu đất 27 ll 3.4.2 Phương pháp phân lập nấm Trichoderma 27 m oi 3.4.3 Phương pháp xác định hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc 28 a nh 3.4.4 Phương pháp thử hoạt tính đối kháng Trichoderma 28 tz z 3.4.5 Phương pháp định danh nấm Trichoderma sinh học phân tử 29 om l.c gm @ vii 3.4.5.1 Nhân thu sinh khối Trichoderma 29 3.4.5.2 Tách chiết DNA tổng số Trichoderma 30 3.4.5.3 Phản ứng PCR 31 3.4.5.4 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR 32 3.4.5.5 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 33 3.6 Phương pháp tạo chế phẩm nấm đối kháng 34 PHẦN KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 36 4.1 Kết phân lập chủng nấm Trichoderma 36 4.2 Kết nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa nấm Trichoderma 37 4.3 Kết thử hoạt tính đối kháng nấm Trichoderma 41 4.3.1 Kết khả ký sinh nấm Trichoderma nấm Fusarium gây bệnh vàng thối rễ 41 lu an 4.3.2 Kết khả ký sinh nấm Trichoderma nấm Phytophthora n va gấy bệnh thối gốc 44 tn to 4.4 Kết Định danh 45 ie gh 4.4.1 Kết tách chiết DNA tổng số Trichoderma 45 p 4.4.2 Kết PCR 46 d oa nl w 4.4.3 Kết giải trình tự gen 47 4.5 Bước đầu sản xuất chế phẩm nấm đối kháng 49 a lu PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 a nv 5.1 Kết luận 51 u nf 5.2 Kiến nghị 51 ll TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 oi m tz a nh z om l.c gm @ PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây hoa màu như: rau, lạc, đậu, lúa… loại trờng có giá trị kinh tế cao được phát triển quy mô lớn nhiều nơi giới có Việt Nam Là nguồn nguyên liệu cần thiết cho ngành sản xuất lương thực, thực phẩm , đồng thời tăng cường bảo vệ môi trường sinh thái, cải thiện kinh tế xã hội, tạo công ăn việc làm ổn định cho người dân nước, đặc biệt vùng miền núi Với lợi về đất đai và khí hậu, Thái Nguyên là vùng phát triển nhiều loại hoa màu Tuy nhiên loại lại mẫn cảm với bệnh nấm Ở đây, người dân tập trung đầu tư, thâm canh cao, lượng phân bón, hóa chất bảo vệ thực vật hàng năm sử dụng nhiều Trong việc áp dụng lu an kỹ thuật tiến về công nghệ sinh học công nghệ vi sinh n va trồng trọt hạn chế tn to Trong những năm gần Việt Nam có cơng trình nghiên cứu gh sử dụng nấm đối kháng Trichoderma phịng trừ bệnh hại p ie trờng Tuy nhiên loài nấm Trichoderma phát huy được hiểu d oa nl w số môi trường định Thái Nguyên chủ yếu là đất đời, chứa lồi nấm Trichoderma địa có khả đối kháng cao với loài nấm gây a lu bệnh, dễ phân lập a nv Nấm Trichoderma diện gần tất loại đất và u nf số môi trường sống khác Chúng là loại nấm được nuôi cấy thông dụng ll nhất, diện với mật độ cao và phát triển mạnh vùng rễ cây, số m oi giống có khả phát triển rễ Ngoài sự hình thành khuẩn lạc a nh rễ, nấm Trichoderma cịn cơng, ký sinh và lấy chất dinh dưỡng từ loài tz z nấm khác Bởi nơi Trichoderma phát triển tốt là nơi có nhiều rễ khỏe om l.c gm @ mạnh, Trichoderma sở hữu nhiều chế cho việc công loài nấm gây bệnh chế cho việc nâng cao sự sinh trưởng và phát triển Rất nhiều giống Trichoderma có khả kiểm sốt tất loài nấm gây bệnh khác Nhiều kết nghiên cứu cho thấy, nấm Trichoderma giết nhiều loại nấm gây thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia Fusarium Tricoderma tiết enzym làm tan vách tế bào loài nấm khác Sau cơng vào bên loài nấm gây hại và tiêu thụ chúng Cho phép bảo vệ vùng rễ trồng chống lại loại nấm gây thối rễ đồng ruộng [8] Những phát cho thấy số giống có khả hoạt hóa chế tự bảo vệ thực vật, từ những giống này có khả kiểm soát những bệnh tác nhân khác ngoài nấm Từ đó, Các chế phẩm nấm Trichoderma được sản xuất và sử dụng lu an là chất kiểm sốt sinh học cách có hiệu Hình thức sử dụng n va dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu để bón tn to cho trồng vừa cung cấp dinh dưỡng cho vừa tăng khả kháng Các nghiên cứu khoa học sử dụng chế phẩm nấm p ie gh bệnh d oa nl w Trichoderma giữ được quần thể sâu hại phát triển mức thấp phát triển được thành dịch, bảo vệ được loài nấm vi sinh vật có a lu ích khác , góp phần nâng cao suất chất lượng ra, bảo vệ môi trường a nv sống sức khỏe cộng đồng Các chế phẩm nấm sinh học được nghiên cứu từ u nf nấm Trichoderma được ứng dụng ngày phổ biến Việc tìm chủng ll nấm Trichoderma thực sự có giá trị, ý nghĩa và tiềm ứng dụng to m oi lớn là sở để bảo tồn nguồn gen quý tạo chế phẩm sinh học phục a nh vụ nông nghiệp Ngày chủng Trichoderma chưa được bảo tồn, bị tz z biến đổi, cân sinh học, theo chúng tơi tiến hành đề tài "Phân lập om l.c gm @ tuyển chọn số chủng nấm Trichoderma có hoạt tính kháng nấm từ đất trồng hoa màu tỉnh Thái Nguyên” 1.2 Mục đích đề tài - Mục đích đề tài: + Phân lập chủng nấm Trichoderma từ mẫu đất địa bàn tỉnh Thái Nguyên + Tuyển chọn chủng nấm Trichoderma có hoạt lực kháng nấm cao + Định danh số chủng Trichoderma có hoạt lực kháng nấm cao + Bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm nấm đối kháng 1.3.Yêu cầu đề tài + Đánh giá được hoạt tính sinh học, khả kháng nấm Trichoderma + Tuyển chọn được 1-2 chủng Trichoderma có hoạt lực diệt nấm cao lu an từ chủng nấm được phân lập n va 1.4 Ý nghĩa đề tài tn to 1.4.1 Ý nghĩa khoa học gh - Đánh giá mức độ đa dạng nấm Trichoderma được phân lập từ p ie mẫu đát khác địa bàn tỉnh Thái Nguyên d oa nl w - Phân loại chủng nấm Trichoderma có hoạt lực kháng nấm cao - Bước đầu sản xuất loại chế phẩm nấm đối kháng a lu 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn a nv - Dựa những thu được trình nghiên cứu góp phần xác ll m Trichoderma u nf định được số đặc điểm về hình thái tế bào khuẩn lạc nấm oi - Giúp sinh viên tiếp cận với công tác khoa học, nâng cao trình độ a nh chun mơn và đờng thời tạo cho thân sinh viên tác phong làm việc tz z om l.c gm @ PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đại cƣơng Trichoderma Trichoderma: nấm đối kháng dễ dàng phát triển tất loại đất tự nhiên, đất nông nghiệp, số môi trường khác Chúng diện với mật độ cao phát triển mạnh vùng rể cây, số giống có khả phát triển rễ Nấm Trichoderma loại nấm mốc có phổ đối kháng rộng loại nấm gây bệnh hại trờng có khả kích thích sự phát triển rễ Năm 1801, Person ex Gray xác định Trichoderma thuộc giới fungi, ngành Ascomycota, lớp Euascomycetes, Hypocreaceae, giống Trichoderma [14] Chúng tiêu diệt nấm bệnh phản ứng lectin trung gian phân hủy lu an thành tế bào nấm mục tiêu (nấm gây bệnh) Quá trình kìm hãm sự tăng n va trưởng hoạt động loại nấm gây bệnh Ngoài chúng sản xuất tn to enzyme thành tế bào, cho phép Trichoderma đâm xuyên vào gh nấm khác trích xuất chất dinh dưỡng cho sự phát triển Điều p ie này vơ tình gây sự sống trực tiếp vi nấm gây bệnh d oa nl w 2.2 Đặc điểm cấu tạo, hình thái tế bào nấm 2.2.1 Cấu tạo a lu Nấm mốc nói chung (trong có Trichoderma) có thành tế bào cấu tạo a nv chủ yếu chitin (là polymer n- acetylglucosamine) chitosan (chitin bị u nf deacetyl hóa) thành phần khác gờm beta- glucan, alpha- glucan, ll mannoprotein[20], chất màu, lipid (8-33%)[3] Màng tế bào dày khoảng 7µm m oi thành phần chủ yếu lipit (40%) protein (38%) Nhân phân hóa thường a nh hình trịn, đơi kéo dài, đường kính khoảng 2-3µm Ty thể hình elip, ln tz z di động để tham gia vào q trình hơ hấp tế bào[3] Những hiểu biết om l.c gm @ về cấu tạo tế bào Trichoderma sở để lựa chọn cải tiến phương pháp ly trích DNA tổng số cho phù hợp 2.2.2 Đặc điểm hình thái - Trichoderma lồi nấm bất tồn, sinh sản vơ tính bào tử từ khuẩn ty Bào tử nấm có dạng hình trứng, màu xanh lục đính sợi nấm - Khuẩn ty (sợi nấm) vi nấm khơng màu, có tốc độ phát triển nhanh, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều cuối nhánh phát triển thành khối trịn mang bào tử trần, khơng có vách ngăn, không màu, liên kết thành chùm nhỏ đầu cành nhờ chất nhày Bào tử hình cầu, hình elip, hoặc hình khn Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm - Trên môi trường PGA ban đầu có màu trắng, sinh bào tử chuyển sang xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng Ở số lồi cịn có khả lu an tiết số chất làm thạch mơi trường PGA hóa vàng [12] n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf a nv a lu oi m a nh Hình 2.1 Đặc điểm hình thái nấm Trichoderma tz z om l.c gm @ Thường quan sát thấy nấm Trichoderma tồn đất dạng sợi nấm hoăc bào tử Bào tử có nhiều đất ẩm Trên môi trường ni cấy, lồi Trichoderma có hình dạng khuẩn lạc khác Đây là những đặc điểm để nhận dạng phân biệt Khuẩn lạc Trichoderma phát triển nhanh thành thục vòng - ngày Trên môi trường PGA ủ nhiệt độ 250C, khuẩn lạc nấm Trichoderma ban đầu có màu trắng, sau chuyển sang màu xanh đậm hoặc xanh vàng có bào tử xuất Ở số lồi Trichoderma cịn có khả tiết sắc tố có màu vàng môi trường PGA [12] an lu n va gh tn to p ie Hình 2.2 Bào tử nấm Trichoderma d oa nl w (Nguồn: vuonsinhthaitrungviet.com) Ở số loài Trichoderma cuống bào tử chưa được xác định Cuống bào tử nhóm sợi nấm bện vào Một số lồi khác có cuống bào tử a lu mọc lên từ những cụm hay những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc khu vực a nv tỏa khuẩn lạc, có kích thước từ 1-7 µm, có hình đệm rắn hoặc u nf ll dạng không rắn chắc, những nốt sần dạng này được tách dễ dàng m oi khỏi bề mặt thạch agar chúng hoạt động chồi mầm tz a nh Bào tử đính Trichoderma khối tròn mọc lên đầu cuối cuống sinh bào tử (phân nhiều nhánh), mang bào tử trần bên không z om l.c gm @ có vách ngăn, khơng màu, liên kết thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy Đặc điểm bật nấm Trichoderma bào tử có màu xanh đặc trưng, số có màu trắng (như T virens), vàng hay xanh xám Chủ yếu hình cầu, hình elip hoặc hình oval (với tỉ lệ dài rộng từ 1-1,1µm) hay hình chữ nhật (với tỉ lệ dài rộng 1,4 µm), đa số bào tử trơn láng Kích thước khơng q 5µm Nhờ có khả tạo thành bào tử chống chịu (Chlamydospores) mà T.haianum tờn 110-130 ngày dù không được cung cấp chất dinh dưỡng Chlamydospores những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả sống sót Trichoderma mơi trường khơng được cung cấp chất dinh dưỡng nên Chlamydospores được dùng để tạo chế phẩm phòng trừ sinh học 2.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa nấm Trichoderma Đa số dòng nấm Trichoderma phát triển đất có độ pH từ 2.5- an lu 9.5 Phát triển tốt pH 4.5-6.5 Nhiệt độ phát triển tối ưu thường 25-30ºC Một vài dòng phát triển 35ºC Một số phát triển đưc 40ºC [16] Hình thái va n khuẩn lạc bào tử Trichoderma khác những nhiệt độ khác gh tn to Ở 35ºC chúng tạo những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ p ie mép bất thường, 37ºC không tạo bào tử sau ngày nuôi cấy [18] Các chủng Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh chúng đạt d oa nl w đường kính khuẩn lạc từ 2-4cm sau ngày nuôi cấy 20ºC Trong thời gian nhân ni, nấm Trichoderma cần có điều kiện thống a lu khí sau vô trùng cần làm cho môi trường nhân nuôi xốp cách a nv lắc để chúng không kết lại thành mảng Nếu bị kết mảng bào tử hình thành u nf ll chí sợi nấm khơng lan vào được m oi - Môi trường sống: Trichoderma nhóm vi nấm phổ biến đất tự a nh nhiên, đất nông nghiệp, đồng cỏ, rừng muối và đất xa mạc Trichoderma tz tìm thấy thực vật sống không sống nội ký sinh thực vật [15] Chúng z om l.c gm @ tờn tất vùng khí hậu từ miền cực bắc đến vùng núi cao vùng nhiệt đới Tuy nhiên, có sự tương quan giữa sự phân bố loài và điều kiện mơi trường - Trichoderma sử dụng nhiều nguồn cacbon khác từ cacbonhydrat, amino axit đến amonia - Trichoderma vi nấm ưa độ ẩm chúng đặc biệt chiếm ưu những nơi ẩm ướt Tuy nhiên lại không chịu được độ ẩm thấp và điều được cho yếu tố góp phần làm cho số lượng Trichoderma giảm rõ rệt những nơi có độ ẩm thấp, song lồi Trichoderma khác yêu cầu về nhiệt độ và độ ẩm khác - Chất chuyển hóa thứ cấp kháng sinh: Trichoderma sản xuất nhiều loại kháng sinh và enzyme như: Chitinolytic (enzyme phân giải chitin), Cellulolytic (enzyme phân giải cellulose), là enzyme phân giải lu an thành màng tế bào, phá hủy khuẩn ty nấm đối kháng với n va Trichoderma Một vài lồi Trichoderma có tác dụng làm tăng tỉ lệ nảy mầm tn to Tuy nhiên chế tác động này chưa được biết [16] gh Trong trình sinh sản vơ tính Trichoderma xảy p ie tượng đột biến nên di truyền lại cho hệ sau hoặc sai sót từ q trình phân d oa nl w chia tế bào và tác động điều kiện môi trường sống khác nên dẫn tới sự sai khác và đa dạng kiểu gen kiểu hình a lu lồi Trichoderma Vì thế, tạo những dịng thích nghi tốt điều kiện a nv sinh thái, địa lý khác và là những dịng có ý nghĩa ll m thực vật [15] u nf nghiên cứu việc tạo chế phẩm sinh học kiểm soát mầm bệnh oi Ngoài chúng sinh nhiều hợp chất ức chế dễ bay a nh trợ giúp cho sự hình thành khuẩn lạc chúng đất tz z om l.c gm @ 2.3 Phân loại nấm Trichoderma Trichoderma những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn cho việc định danh, phân loại nhiều đặc điểm cần thiết cho việc định danh, phân loại chưa biết đầy đủ Theo truyền thống, hệ thống phân loại thường dựa vào sự khác biệt về đặc trưng hình thái, đặc điểm bào tử q trình sinh sản bào tử vơ tính - Phân loại Trichoderma: + Dựa sự khác biệt về hình thái, chủ yếu hình thái bào tử đơn tính + Dựa tính đối kháng Trichoderma - Hiện có khoảng 50 lồi Trichoderma được tìm thấy, được phân thành nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum, Saturnisporum, Pachybasim Hypocreanum Trong có 11 loài có khả đối kháng cao: T.harzianum, T.aureoviride, T.atroviride, T.koningii, T.longibrachiatum, T.viride, lu an T.pseudokoningii, T.longipilis, T.minutisporum, T.hamatum, T.seesei n va 2.4 Khả kiểm soát sinh học Trichoderma tn to 2.4.1 Tương tác với nấm bệnh gh - Sự tương tác đối kháng giữa Trichoderma loài nấm khác được p ie phân loại sau: d oa nl w + Tiết chất kháng nấm bệnh + Kí sinh thể nấm bệnh a lu + Cạnh tranh dinh dưỡng với nấm bệnh a nv Các chế này không tách biệt nhau, và chế đối kháng bao u nf gờm tương tác hoặc nhiều Ví dụ, sự kiểm sốt Botritis nho ll Trichoderma bao gồm sự cạnh tranh dinh dưỡng và kí sinh hạch nấm, m oi tương tác ngăn chặn tác nhân gây bệnh a nh - Cơ chế tiết chất kháng nấm bệnh: Các chủng Trichoderma sản tz z xuất đa dạng chất chuyển hóa dễ bay và không bay hơi, vài chất om l.c gm @ 10 loại này ức chế vi sinh vật khác mà khơng có sự tương tác vật lý Chất ức chế được gọi là chất kháng sinh Các chủng Trichoderma sản xuất nhiều loại kháng sinh khác nhau, môi trường tác động vào sự hình thành chất kháng sinh về số lượng và chất lượng Hơn nữa kháng sinh đặc hiệu tác động vào tác nhân gây bệnh khác khác - Cơ chế ký sinh thể nấm bệnh: Tức giết chết loài gây bệnh cách xâm nhập vào bên loài nấm gây hại tiết những chất (enzyme) để phân hủy chúng Trichoderma nhận vật chủ nhờ có tính hướng hóa chất, ký sinh phân nhánh hướng về những nấm được định trước (do những nấm tiết hóa chất) Ngồi ra, vật ký sinh vật đối kháng được Trichoderma nhận dạng phân tử, sự nhận dạng tự nhiên hay hóa học (qua trung gian lectin bề mặt tế bào mầm bệnh vật đối kháng) Đồng thời, Trichoderma kí sinh vào cuộn an lu quanh sợi nấm vật chủ thơng qua hình thành dạng móc hay dạng giác va bám, tiết enzyme chitinase, glucanase, protease, những enzyme có khả n bào mịn thành tế bào hay tiết những loại kháng sinh gây thủng sợi gh tn to nấm vật chủ, là khả cơng trực tiếp Trichoderma Khi kí sinh p ie vào T asperellum tiết cellulase, cho phép cơng những nấm Phytophthora spp., Và Pythium spp., chúng bám vào trồng d oa nl w - Theo Chet (1990) Cơ chế đối kháng ký sinh gồm giai đoạn: + Sự tăng trưởng có tính chất hướng hóa giai đoạn tác a lu nhân kích thích hóa học hấp dẫn nấm đối kháng bệnh nấm đối kháng ll u nf a nv + Sự nhận dạng đặc hiệu lectin bề mặt tế bào tác nhân gây oi m + Sự cơng xoắn vịng sợi nấm Trichoderma xung quanh vật chủ a nh + Sự tiết enzyme phân giải thành tế bào Hệ enzyme phân tz giải thành tế bào gồm: Endochitinase Glucanase1,3-beta-glucosidase z protease om l.c gm @ 11 2.4.2 Cơ chế cạnh tranh dinh dưỡng với nấm bệnh Trichoderma sử dụng nguồn tài nguyên (dinh dưỡng, không gian sống) với sinh vật gây bệnh Trichoderma “xâm chiếm” môi trường trước tác nhân không mong muốn đến Trichoderma cạnh tranh khai thác với nấm bệnh trồng, làm suy kiệt chúng cách hút hết dưỡng chất cách thụ động dai dẳng những bào tử chống chịu (chlamydospores) + Sự cạnh tranh cho mô hoại sinh: Botrytis Sclerotinia là mầm bệnh cơng vào mơ thực vật lão hóa hoặc chết và coi ng̀n dinh dưỡng, từ tiếp tục công vào những mô khỏe mạnh Khi xử lí Trichoderma, chúng làm suy yếu, làm chậm trình hình thành khuẩn lạc Botrytis vào mơ thực vật Sau làm giảm mức độ bệnh Trichoderma được ứng dụng thành công kiểm soát Botrytis Sclerotinia những loại lu an rau cải, trái khác nhau: dâu, dưa chuột n va + Sự cạnh tranh cho chất dịch rỉ từ hạt: Bệnh chết nhát gây tn to Pythium ultimum gh Ở số loại ngũ cốc và rau được xuất phát từ sự đáp ứng nhanh p ie chóng mầm bệnh với dịch rỉ từ hạt Túi bào tử Pythium được nảy d oa nl w mầm và xâm nhiễm vào hạt giống, vòng vài lan tràn đất Xử lý Trichoderma làm giảm sút sự nảy mầm túi bào tử Pythium, a lu tượng gọi là sự cạnh tranh kích thích nảy mầm mầm bệnh gây bạc u nf a nv + Sự cạnh tranh vị trí vết thương: sử dụng T viride để kiểm soát ll 2.5 Nấm Trichoderma với khả tạo chế phẩm đối kháng oi m a nh Nấm đối kháng: là loài VSV sống hội sinh đất mà z tranh và tiêu diệt nấm gây bệnh tz trình sống sản sinh chất kháng sinh có tác dụng ức chế, kìm hãm cạnh om l.c gm @ 12 2.5.1 Đất kháng nấm - Đất tự nhiên có khả kháng nấm và khả này dần Điều này có liên quan đến sự xuất và mật độ phân bố học Trichoderma Bào tử phân sinh Trichoderma có khả kháng nấm cao và liên quan đến tượng giảm khả kháng nấm đất - Độ nhạy đất kháng nấm được công bố đất trung tính, đất kiềm chua và đất acid - Các bào tử phân sinh kháng nấm nhiều hậu mô bào tử, sợi nấm kháng nấm bào tử phân sinh 2.5.2 Thiết lập quần thể tượng mầm đất VSV đất không và hoạt động phụ thuộc vào nhiều loại chất nền đất, có nhiều phương pháp xác định khác Trong nhiều trường hợp cho thấy vấn đề này khơng thích hợp với Trichoderma và tăng lên nhiều an lu nhiều loại đất khác Khi cấy sợi nấm non (chưa có bào tử) vào đất đều va liên quan mật thiết với tình trạng thành phần mơi trường đất Bào tử sinh sôi n nảy nở và thiết lập quần thể cân đất (mật độ cân đất từ gh tn to 9-36 tuần sau cấy nấm vào đất) Điều này phụ thuộc vào tuổi nấm và p ie có liên quan đến thành phần thức ăn, và việc hình thành quần thể sợi nấm Trichoderma từ thành phần nuôi trồng không liên quan đến loại đất Viên d oa nl w Alginate chứa bào tử phân sinh được sản xuất phương pháp lên men tạo quần thể bào tử so với phương pháp nhân sinh khối đất (chủ yếu a lu là hậu mơ bào tử) Thêm vào đó, việc lên men đất được thêm vào đất chất u nf a nv Pyrax khô giúp làm tăng quần thể từ 5.103 lên 6-7.106 bào tử /gram đất 2.5.3 Thiết lập quần thể vùng rễ ll oi m Trichoderma được phân lập từ rễ và có khả dùng vào việc a nh phòng trừ sinh học vùng rễ bị bệnh tz Hiệu Trichoderma khơng xử lý mà cịn tiếp tục thiết lập z quần thể vùng rễ sau xử lý hạt om l.c gm @ 13 Trichoderma xử lý hạt phát triển nhanh xung quanh hệ rễ tạo bào tử ngăn cản bệnh xâm nhiễm trồng Nấm Trichoderma được cấy vào đất với tác dụng chống bệnh cho bắt buộc phải cấy dọc theo bề mặt rễ cách xa mầm Trichoderma có khả diệt trừ bệnh thối rễ, hạt và bệnh chết Những nghiên cứu gần cho thấy T.hazzianum không thiết lập quần thể xung quanh hệ rễ họ đậu và đậu Hà lan Quan sát bào tử vùng rễ gồm rễ, vỏ, hạt bị thối và mầm, số lượng bào tử gram đất xung quanh hệ rễ ln Bào tử Trichoderma thiết lập quần thể hay di chuyển vào vùng rễ Với T hazzianum vài bào tử được tìm thấy cách xung quanh hệ rễ 10cm, dược xử lý hạt Ngược lại, số lượng bào tử tìm thấy nhiều là mầm đậu bị thối và vỏ hạt giống kể mẫu bệnh xung quanh rễ Có nhiều giải thích về việc số lượng lu an bào tử Trichoderma tăng hoặc giảm đất và Trichoderma khơng có khả n va thiết lập quần thể vùng rễ cây, có nhiều lý bao gờm: Thiếu dinh tn to dưỡng, diện chất độc rễ hay diện chất kháng sinh hoặc gh sự diện vi sinh vật đối lập với Trichoderma vùng rễ hay mức p ie độ rễ Ví dụ: Pseudomonas đối lập với tác nhân phòng trừ sinh học d oa nl w có diện chất sắt vùng rễ hay Pseudomonas sản xuất chất độc chuyển đổi gây ảnh hưởng đến bào tử Trichoderma a lu 2.6 Cơ chế hoạt động Trichoderma a nv Nấm đối kháng là những thành viên phổ biến hệ vsv đất Chúng u nf thường tiết men, kháng sinh gây độc cho nấm gây bệnh hoặc nấm ll kháng cạnh tranh điều kiện sống với nấm gây bệnh Sự phân biệt chúng m oi phụ thuộc vào vùng địa lý, loại đất, điều kiện khí hậu, và thảm thực vật a nh khu vực Nấm đối kháng kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển nấm tz z gây bệnh, giúp phục hồi, sinh trưởng và phát triển, số loài nấm đối om l.c gm @ 14 kháng được tìm thấy: Penicillium, P frequetans, P Vermiculata,… là đối kháng nấm Pythium spp, phizocotia solani Nấm Aspergillus niger đối kháng với nấm Fusarium sokeni Đối với nấm Trichoderma, là những giống nấm có khả ức chế số nấm gây bệnh như: fusarium, Phytophthroza, gây bệnh nhiều loại hoa màu 2.6.1 Khả phịng trừ nấm Trichoderma lồi nấm gây bệnh trồng Năm 1952, Wood thông báo về tính đối kháng nấm Trichoderma viride nấm bệnh rau diếp là Botrytis cinerea Ngày nay, người ta biết sử dụng nấm Trichoderma để bảo vệ trồng khỏi bệnh nấm rễ (như Pythium, Fusarium, Rhizoctonia; Phytophthora, ) và bệnh phần mặt đất (như Botrytis cinerea) lu an Bliss (1959); Ohr và cô ̣ng sự (1973), cung cấ p bằ ng chứng thuyế t phu ̣c n va nhấ t, quầ n thể Trichoderma đấ t có khả phòng trừ nấ m Armillaria tn to mellea đấ t đã đươ ̣c xử lý xông bằ ng methyl bromide ie gh Well và cá c cô ̣ng sự (1962) lầ n đầ u tiên công bố sử du ̣ng mô ̣t số lươ ̣ng p lớn Trichoderma được nuôi trồ ng môi trường rắ n thử nghiê ̣m ngoài Sclerotium rolfsii cà chua Barkman và d oa nl w đồ ng ruô ̣ng để kiể m soát nấ m Rodriguez Kabano (1975) nuôi trồ ng T.harzianum bằ ng phương pháp thương a lu mại, giá thể chứa nấm được rải xuống đất dọc theo hàng đậu vớ i a nv lươ ̣ng 112-140 kg/ha sau 70-100 ngày sau gieo đậu Với lươ ̣ng 140 kg/ha, oi m khoảng năm ll u nf T.harzianum có tác dụng phòng chống S.rolfsii và tăng suất lên a nh Nấ m Trichodema hamatum có nhiều đất hữu vườn ươm tz Colombia có khả ngăn chặn nấm R.solani và phân lập từ đất z Mexico có khả ngăn chă ̣n nhiề u loại nấm đ ất Nhiê ̣t đô ̣ và tia phóng xa ̣ om l.c gm @ 15 gamma không thể diê ̣t nấ m R.solani môi trường T.harzianum diê ̣t đươc̣ nấ m này , là vai trò chính của Trichoderma viê ̣c phòng trừ sinh ho ̣c 2.6.2 Hiện tượng giao thoa Sự đối kháng nấm Trichoderma thông qua nhiều chế Vào năm 1932 Weinding mô tả tượng nấm Trichoderma ký sinh nấm gây bệnh đặt tên cho tượng là “Giao thoa sợi nấm” Hiện tượng gia thoa gồm giai đoạn sau: (1) Sợi nấm Trichoderma vây quanh sợi nấm gây bệnh (2) Sau sự vây quanh, sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy sợi nấm gây bệnh (3) Cuối là sợi nấm Trichoderma đâm xuyên làm thủng lớp tế bào nấm gây bệnh, làm cho chất nguyên sinh nấm gây bệnh bị phân hủy lu an và dẫn đến nấm bệnh bị chết n va Sau quan sát kính hiển vi, tượng ký sinh nấm tn to Trichoderma được mô tả sau: Tại những điểm nấm Trichoderma tiếp xúc Ngược lại những điểm khơng có sự tiếp xúc nấm Trichoderma p ie gh với nấm gây bệnh làm cho nấm gây bệnh teo lại và chết d oa nl w với nấm gây bệnh chết nhà nghiên cứu cho là tác động chất kháng sinh từ nấm Trichoderma sinh gây độc cho nấm gây bệnh a lu 2.6.3 Hoạt động tiết enzyme a nv 2.6.3.1 Hệ enzyme thủy phân chitin u nf Chitin là những polymer phong phú sinh học, ll enzyme phân giải chitin được tìm thấy tất giới: nguyên sinh, vi m oi khuẩn, nấm, thực vật, động vật có xương sống và khơng xương sống kể a nh người Sự thủy phân chitin enzyme có liên quan đến nhiều tz z trình sinh học như: sự tự phân giải, sự tạo hình, dinh dưỡng Thêm vào đó, om l.c gm @ 16 sự vi kí sinh đóng vai trò quan trọng mối quan hệ giữa nấm và sinh vật khác Người ta tinh chế được nhiều enzyme chitinase, phổ biến là endochitinase Hoạt động kháng nấm chitinase được tăng cường sự trợ lực kháng sinh Enzyme chitinase Trichoderma được xem là enzyme có hoạt tính kháng khuẩn mạnh Hoạt động chitinase phối hợp mạnh mẽ với enzyme chitinase và hợp chất có liên quan đến việc kiểm soát sinh học kháng sinh Sự phối hợp với enzyme phân giải chitin và glucan khác dấn đến sự tăng cường kỳ lạ hoạt động thủy phân và ức chế trường hợp enzyme này có hoạt tính thấp hay khơng có hoạt tính chúng được sử dụng riêng lẻ, nhiên quan trọng nữa là khả chitinase làm tăng hiệu kháng nấm hợp chất khơng có lu an chất enzyme hay vi sinh vật khác Chẳng hạn Lorito và cộng sự n va cho thấy sự phối hợp hoạt động giữa enzyme thủy phân chitin với hợp tn to chất tự nhiên tổng hợp có ảnh hưởng lên màng tế bào Cellulose là chất trùng hợp β-1,4-glucan được sử dụng p ie gh 2.6.3.2 Hệ enzyme thủy phân celluose d oa nl w nguồn lượng nhiều vsv tiết cellulase Hệ thủy phân cellulose Trichoderma bao gồm lớp enzyme: a nv đơn vị cellobiose a lu  Enzyme thủy giải 1,4- β-D-glucan, cát sợi cellulose thành u nf  Endo-1,4-D-glucanase, cắt nối glucoside ll  1,4-β-D-glucoside phân cát cello-oligosaccharide để tạo glucose oi m a nh Bên cạnh sự tác động qua lại quần thể giữa nấm đối kháng và tz nấm bênh, nấm Trichoderma Cịn có tác động trực tiếp lên sự phát triển z trồng, hoạt động, nấm này sản sinh men phân hủy glucose, om l.c gm @ 17 cellulose Nhờ men này mà chất hữu có đất được phân hủy nhanh hơn, làm tăng chất dinh dưỡng dạng dễ hấp thụ cho cậy trồng, tạo điều kiện cho trồng sinh trưởng và phát triển tốt 2.6.3.3 Các hợp chất kháng nấm từ Trichoderma [10] Theo Dennis Webster, T viride T.polysporum có khả tiết độc tố Trichodermin, T.hamatum tạo polypeptide có chất kháng sinh Okuda cho nhiều loài Trichoderma tiết Isonitrite có chất kháng sinh - Trichozianine là kháng sinh peptaibol có hoạt tính kháng nấm được phát nhiều loài T harzianum Trichozianine B (TB) kháng sinh có chất acid, Trichozianine A (TA) kháng sinh trung hòa Trichozianine kết hợp với những enzyme thủy phân vách trình ức chế sự nảy mầm và kéo dài tơ nấm trình ký sinh nấm an lu - Trichothecene từ T harzianum có hoạt tính kháng nấm thấp va Trichotoxin A là kháng sinh thuộc nhóm Peptaibol được tách chiết từ T.viride n Viridin là protein kháng nấm có kích thước 65 kDa được tách chiết từ gh tn to T.viride Ergokonin A chất có hoạt tính kháng nấm có khả ức chế sự - Một loại Trichothecene được tách chiết từ T harzianum p ie sinh tổng hợp glucan được tách chiết từ T.longibrachiatum d oa nl w harzianum A có khả kháng nấm nờng độ 100µg/ml 2.7 Các dạng thuốc chế phẩm Trichoderma trừ nấm bệnh a lu Với sự đời thuốc trừ sâu sinh học, việc ô nhiễm và thay đổi môi a nv trường được cải thiện Các chế phẩm sinh học có độ độc cao ll u nf loại gây hại cho trồng và an toàn những loài khác kể người, oi m hiệu sử dụng cao nên được ứng dụng nhiều nơng nghiệp a nh Trong chế phẩm sinh học Trichoderma được ý nhiều tz hiệu cao nhiều công dụng trở thành đối tượng nghiên cứu sản z xuất nhiều nơi trường đại học, viện nghiên cứu, trung tâm khoa học, om l.c gm @ 18 công ty…Để đáp ứng yêu cầu bứ thiết nhà nông và người trồng Chế phẩm Trichoderma được sản xuất thường dạng nước dạng bột 2.8 Tình hình nghiên cứu ứng dụng Trichoderma  Ở nước [11] Cho tới có khoảng 30 nước có những nghiên cứu sử dụng nấm Trichoderma để trừ bệnh hại trồng (Nga, Mỹ, Đức, Hunggari, Ấn Độ, Thái Lan, Philippin…) cho khoảng 150 loài vi sinh vật gây bệnh 40 loại trồng Ở Nam Mỹ, người ta dùng nấm T.harzianum phòng trừ nấm Pythium spp R solani gây bệnh chết héo đậu củ cải Ở Ấn Độ, hiệu ức chế bệnh R Solani gây khoai tây nấm T harzianum đạt tới 89,1% Ở Thái Lan, sử dụng nấm T.viride phòng trừ bệnh thối thân cà chua nấm S.rolfsii: tỷ lệ sống đạt 91,7%; đối chứng đạt 61,9% Ở Philippin, nấm T.harzianum làm giảm đáng kể tỷ lệ bị bệnh lu an nấm R.Solani đậu xanh: tỷ lệ bị bệnh dùng T.harzianum 14-19%; đối va chứng 79-86% n tn to Nấm T harzianum nuôi trồ ng môi trường rắ n có tác du ̣ng chố ng gh đươ ̣c bệnh thối trắng hành (Sclerotium cepivorum) Ai cập và Mỹ Verticillium dahlia Liên xô , p ie bê ̣nh dưa leo và bê ̣nh d oa nl w bê ̣nh chế t ̣p Rhizoctonia và bệnh tàn rụi (S.rolfsii) nhiề u trồ ng ở Israel và bê ̣nh thố i trái dưa leo Hiê ̣u quả phòng tr sinh học của nấ m nuôi trồ ng môi trường rắ n a lu a nv phụ thuộc vào nhiệt độ , loại môi trường nuôi trồng và thời điểm cấy nấm vào u nf đấ t , tỷ lệ cấy Trichoderma vào giá thể và mâ ̣t đô ̣ của nấ m gây bê ̣nh đấ t ll Khi táo đươc xử lý chế phẩm Trichoderma viride làm giảm m oi được 20-40% tỷ lệ thối nấm Botrytis cinerea, Alternaria tenuis Ở a nh Pháp người ta thử nghiệm nấm Trichoderma viride có hiệu phòng trừ tz bệnh thối xám nho giảm 70% so với đối chứng Nấm Trichoderma viride z om l.c gm @ 19 ức chế sự phát triển bệnh hại khoai tây loài Rhizoctonia solani gây nên, hiệu ức chế tối đa là 83,4% Dùng chế phẩm Trichoderma sp có tác dụng phịng trừ bệnh hại trờng, làm giảm tỷ lệ bị bệnh rõ rệt, chế phẩm nấm đối kháng nấm Trichoderma sp giúp khỏe hơn, tăng sức đề kháng với vi sinh vật gây bệnh, tác dụng kích thích sinh trưởng Khi táo đươc xử lý chế phẩm Trichoderma viride làm giảm được 20-40% tỷ lệ thối nấm Botrytis cinerea, Alternaria tenuis Ở Pháp người ta thử nghiệm nấm Trichoderma viride có hiệu phịng trừ bệnh thối xám nho giảm 70% so với đối chứng Nấm Trichoderma viride ức chế sự phát triển bệnh hại khoai tây loài Rhizoctonia solani gây nên, hiệu ức chế tối đa là 83,4% Dùng chế phẩm Trichoderma sp có tác dụng phịng trừ bệnh hại an lu trồng, làm giảm tỷ lệ bị bệnh rõ rệt, giúp sinh trưởng khỏe hơn, va tăng sức đề kháng với vi sinh vật gây bệnh, tác dụng kích thích sinh trưởng n to gh tn Trichoderma những loại nấm có khả ức chế số p ie nấm đặc biệt loài nấm đất như: Sclerotium rolfsii, Phytophthora, Fusarium, Pythium, Rhizoctonia gây bệnh loại họ đậu, ăn d oa nl w trái, hịa thảo, cơng nghiệp hoa cảnh Trichoderma khơng những tiêu diệt được nhiều lồi nấm bệnh gây hại trờng mà cịn có tác a nv a lu dụng cải thiện cấu trúc thành phần hóa học đất, đẩy mạnh sự phát triển vi khuẩn nốt sần cố định đạm có ích đất và kích thích sinh trưởng phát u nf triển trồng Những chất kháng sinh chúng tiết cịn xâm ll oi m nhập vào mơ tế bào và làm tăng tính chống chịu bệnh trồng a nh Đã thử nghiệm khả phòng trừ sinh học nấm Trichoderma tz harzianum cách cho số lượng lớn bào tử nấm nuôi trồng z om l.c gm @ môi trường rắn vào đất để kiểm soát nấm Rhizoctonia solani đậu 20 tương Trichoderma harzianum bón vào đất với tỷ lệ : 10 theo thể tích ngăn chặn được bệnh thân rễ nấm Rhizoctonia solani gây hại đồng ruộng Nghiên cứu Diby ghi nhận nấm Trichoderma harzianum IISR 1369, 1370 được phân lập từ vùng rễ hồ tiêu có khả kích thích sinh trưởng hạn chế được bệnh chết nhanh hồ tiêu nấm Phytophthora capsici gây nên Khi sử dụng chế phẩm hỗn hợp giữa nấm Trichoderma harzianum IISR - 1369 với vi khuẩn Pseudomonas fluorescens IISR - 11 cho hiệu phòng trừ đạt 63%, cao so với đối chứng 36% Hiện Mỹ, chế phẩm PlantshieldTM RootshieldTM từ lồi Trichoderma harzianum nịi T22 được khuyến cáo để sử dụng phòng trừ số bệnh nấm Phytophthora, Pythium, Fusarium số trồng Chế phẩm được sử dụng cách phun lên lá, tưới hay bón vào đất Promote lu an Plus là chế phẩm Trichoderma (Trichoderma koningii va n Trichoderma harzianum) được khuyến cáo sử dụng để phòng trừ bệnh tn to nấm Rhizoctonia solani, số loài Pythium, Phytophthora Trong những năm gần đây, Việt Nam có số cơng trình p ie gh  Ở nước [11] d oa nl w nghiên cứu thành công sử dụng nấm đối kháng Trichoderma để phịng trừ số bệnh hại trờng như: chế phẩm Trichoderma thử nghiệm a lu rau huyện Củ Chi, TP Hờ Chí Minh Viện Sinh học Nhiệt đới, chế u nf a nv phẩm Trichoderma thử nghiệm xà lách xoong Vĩnh Long Bộ môn Bảo vệ thực vật - Trường Đại học Cần Thơ, chế phẩm Trichoderma sử ll oi m dụng rau Bộ môn Bảo vệ thực vật - Trường Đại học Nông Lâm a nh TP HCM Chế phẩm sinh học đa chức MT1 Viện Bảo vệ thực vật tz ứng dụng phịng trừ bệnh chết nhanh hờ tiêu nấm Phytophthora spp., z om l.c gm @ chế phẩm Trichoderma spp phòng trừ bệnh thối ca cao nấm 21 Phytophthora palmivora Viện Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên Các kết nghiên cứu Nguyễn Văn Tuất và Lê Văn Thuyết, 2001 phát những điểm kí sinh hoặc sự quấn sợi nấm đối kháng lên sợi nấm bệnh, tác động số loại men được tiết từ nấm đối kháng thấy tượng sợi nấm bị quăn lại, chết đoạn mà khơng cần có sự ký sinh trực tiếp Nhờ men chất hữu có đất được phân hủy nhanh hơn, làm tăng chất dinh dưỡng dạng dễ hấp thu cho trồng, tạo điều kiện cho sinh trưởng phát triển tốt Tác giả Trần Thị Thuần cộng sự (2004), tiến hành phân lập từ nguồn khác và xác định khả ức chế nấm Trichoderma thu thập, kết cho thấy loài nấm Trichoderma có hiệu ức chế cao từ 67,7 - 85,5% nấm gây bệnh Rhizoctonia solani, Sclerotium an lu rolfsii, Fusarium, Aspergillus Theo tác giả Phạm Ngọc Dung nấm Trichoderma hazianum có khả va n ức chế cao sự phát triển sợi nấm Phytophthora tropicalis, gh tn to môi trường phương pháp cấy đối xứng, sợi nấm Phytophthora bị ie tiêu diệt sau ngày nuôi cấy Cũng theo tác giả, số chủng nấm p Trichoderma vừa có khả ức chế sự phát triển sợi nấm, sự nảy mầm d oa nl w bào tử Phytophthora đờng thời có khả phân hủy tốt số loại tàn dư thực vật, hữu dụng trình ủ phân hữu cơ, cung cấp phân hữu a nv a lu cho vườn hồ tiêu Sử dụng chế phẩm Trico-VTN (gồm Trichoderma virens u nf Trichoderma asperellum) với nồng độ 0,3 – 0,4% tháng lần, hạn chế ll oi m được sự phát triển gây hại bệnh nấm Phytophthora tiêu a nh ca cao điều kiện vườn ươm Trên đồng ruộng xử lý chế phẩm Trico- tz VTN với lượng 10 – 15 g/gốc, xử lý lần từ đầu mùa mưa, cách z tháng, kết hợp với bón phân hữu cơ, phân bón lá, vệ sinh đồng ruộng tiêu om l.c gm @ 22 nước hạn chế sự phát triển lây lan bệnh chết nhanh hồ tiêu đồng ruộng Theo Nguyễn Minh Châu, sử dụng nấm Trichoderma trộn với phân hữu bón vào đất, tưới nước giữ ẩm để phòng trừ số bệnh thối rễ, vàng lá, nứt gốc…cho vườn ăn tốt Các vườn ươm sử dụng nấm Trichoderma phòng trừ được bệnh nấm gây hại giống Phối trộn nấm Trichoderma với phân ch̀ng hoai mục bón cho vườn theo định kỳ hiệu càng tăng lên Nấm Trichoderma giúp thúc đẩy tiến trình phân giải chất hữu nhanh được dùng để ủ phân chuồng, phân xanh rút ngắn thời gian hoai mục Hiện nay, chủng Trichoderma Trường Đại học Cần Thơ sản xuất được nông dân sử dụng đánh giá có tác dụng tốt việc ngăn ngừa loại nấm hại Fusarium, Rhizoctonia, Phytopthora gây bệnh có lu an múi rau họ bầu, bí Vì mà chế phẩm có chứa Trichoderma n va ngày càng được lưu hành, sử dụng nhiều hơn; đặc biệt vườn trồng chanh tn to Bến Lức hoặc ruộng trồng dưa hấu Tân Trụ gh Sử dụng nấm đối kháng Trichoderma Asperellum phòng trừ nấm p ie Phytophthora gây hại cao su được nhóm tác giả thuộc Viện d oa nl w Bảo vệ Thực vật nghiên cứu Nhóm nghiên cứu lấy tổng số 80 mẫu đất thu thập được quanh vùng rễ lâu năm tỉnh: Bình Phước, Đăk Lăk a lu Quảng trị, phân lập được 18 ng̀n Trichoderma, có ng̀n a nv triển vọng có khả đối kháng với nấm bệnh Trong điều kiện phịng thí u nf nghiệm nấm Trichoderma Asperellum có khả phịng trừ ký sinh sợi ll nấm đạt hiệu là 100% nấm Phytophthora Botryosa nấm m oi Phytophthora Citrophthora Khả phòng trừ chất kháng sinh bay a nh đạt hiệu 84,8 – 93,4% nấm Phytophthora Botryosa và đạt tz z hiệu 90,4 – 91,8% nấm Phytophthora Citrophthora Các nguồn om l.c gm @ 23 khác có khả ức chế với hiệu thấp (70,3 – 85,9) Nấm Trichoderma asperellum có khả đối kháng cao với nấm Phytophthora gây bệnh cao su ký sinh trực tiếp sợi nấm chất kháng sinh bay Đồng thời nấm có hoạt độ enzyme phân giải Cellulase, Chitinase, β-Glucanase cao an lu n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf a nv a lu oi m tz a nh z om l.c gm @ 24 PHẦN ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tƣợng, vật liệu phạm vi nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng Các chủng nấm Trichoderma được phân lập từ mẫu đất khác huyện tỉnh Thái Nguyên 3.1.2 Vật liệu hóa chất, thiết bị dụng cụ nghiên cứu - Mẫu đất trồng hoa màu được thu thập huyện tỉnh Thái Nguyên - Mẫu nấm Trichoderma lấy từ Viện bảo vệ thực vật - Mẫu nấm Fusarium lấy từ Viện bảo vệ thực vật - Mẫu nấm Phytophthoa lấy từ Viện bảo vệ thực vật 3.1.2.1 Môi trường cần thiết q trình nghiên cứu lu an Các loại mơi trường sử dụng q trình thực thí nghiệm [5] n va - Dung dịch nước muối sinh lý 0,8% (cân 0,8g NaCl định mức tn to 100ml, hấp khử trùng 121ºC 20 phút) Dùng để pha lỗng mẫu ie gh - Mơi trường phân lập (PGA: Potatoes Glucose Agar) p Bảng 3.1: Thành phần môi trƣờng PGA Hàm lƣợng (g) Khoai tây 200 Đường glucose 20 Agar 20 Chloramphenicol 0,2 d oa nl w Tên hóa chất ll u nf a nv a lu a nh Chuẩn pH = oi m Nước cất vừa đủ 1000ml tz Thanh trùng 121oC 20 phút z - Môi trường nhân sinh khối Trichoderma: om l.c gm @ 25 Bảng 3.2: Thành phần môi trƣờng nhân sinh khối Trichoderma [5] Hóa chất Hàm lƣợng (g) Yeast extract 5,0 KH2PO4 0,5 K2HPO4 0,5 MgSO4 0,5 Glucose 20 CaCl2 0,2 Nước cất vừa đủ 1000ml 3.1.2.2 Thiết bị, máy móc, dụng cụ hóa chất dùng phịng thí nghiệm - Thiết bị: Đề tài nghiên cứu sử dụng thiết bị được thống kê bảng an lu Bảng 3.3: Các thiết bị sử dụng nghiên cứu Tên thiết bị STT Quốc gia Đức Nồi hấp khử trùng Nhật Bản Tủ ấm Nhật Tủ lạnh Nhật Tủ sấy Đức gh tn to Cân phân tích ie n va p d oa nl w Tủ cấy vô trùng Anh Máy ly tâm Đức a lu Máy điện di Nhật Máy PCR 10 Kính hiển vi quang học Nikon, Nhật 11 Lị vi sóng Elutrolux, Thụy Điển 12 Máy soi gel 13 Máy soi gel 14 Bể ổn nhiệt a nv PTC-100, Mỹ ll u nf oi m a nh Hàn quốc tz Hàn Quốc z Hàn Quốc om l.c gm @ 26 - Dụng cụ Đề tài nghiên cứu sử dụng dụng cụ được thống kê dưới: Bảng 3.4: Các trang thiết bị máy móc dùng thí nghiệm Dụng cụ STT Nƣớc sản xuất Đĩa petri thủy tinh đường kính 90-100mm Việt Nam Pipet Việt Nam Bình thủy tinh dung tích 250-500ml Đức Ống nghiêm Đức Đèn cồn Việt Nam Cối, chày giã Đức Kéo, pank,… Việt Nam an lu 3.1.3 Phạm vi nghiên cứu Phân lập tuyển chọn số chủng nấm có hoạt tính kháng nấm cao va n từ đất, ứng dụng kỹ thuật PCR để định danh chủng nấm tn to 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu - Địa điểm thu thập mẫu: Mẫu đất trồng hoa màu được thu thập p ie gh 3.2.1 Địa điểm thu thập phân tích mẫu d oa nl w địa bàn tỉnh Thái Nguyên - Địa điểm phân tích mẫu: Phịng nghiên cứu vi sinh vật, Khoa Cơng nghệ ll u nf 3.2.2 Thời gian a nv Nguyên a lu sinh học Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm – Đại học Thái a nh 3.3 Nội dung nghiên cứu oi m Từ tháng 11/ 2016 đến tháng 5/ 2017 tz Phân lập chủng Trichoderma từ vùng đất z Xác định hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc om l.c gm @ 27 Thử tính đối kháng Trichoderma với số chủng nấm gây bệnh Định danh 1-2 chủng Trichoderma có hoạt tính kháng nấm cao Bước đầu nghiên cứu tạo chế phẩm đối kháng 3.4 Các phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm 3.4.1 Phương pháp thu thập mẫu đất Thu thập mẫu đất địa điểm có đặc điểm địa hình, loại trờng, cách canh tác khác Các mẫu đất được thu thập cách dùng dao vô trùng, cạo bề mặt đất lấy 50g độ sâu 3-5 cm, cho vào túi vô trùng dán kín Trên túi ghi rõ vùng nghiên cứu, đặc điểm chỗ lấy mẫu giữ mẫu tủ lạnh đến phân tích và xác định [5] 3.4.2 Phương pháp phân lập nấm Trichoderma an lu Nguyên tắc: Sử dụng môi trường PGA để cấy và thu được chủng va nấm riêng rẽ từ mẫu ban đầu Các chủng được cấy ria sử dụng để tuyển n chọn [5] tn to Cách tiến hành: p ie gh - Pha môi trường PGA d oa nl w Khoai tây gọt vỏ, cắt nhỏ, nấu chín Chiết dich khoai tây lọc bỏ tinh bột Sau cho glucose vào dịch khoai tây từ từ khuấy liên tục bếp cho mau tan, sau cho agar vào và tiếp tục khuấy Cuối bỏ a lu a nv Cloramphenicol Khử trùng 121ºC 15 phút u nf - Cân g đất mẫu cho vào bình tam giác có chứa ml nước muối sinh lý ll vô trùng, lắc nhẹ để 15 phút Lấy dịch pha lỗng nờng độ oi m a nh từ 10-1 đến 10-4 Hút 100 µl dịch pha lỗng nờng độ trang lên đĩa petri tz nờng độ đĩa có chứa mơi trường PGA Ghi rõ độ pha loãng ngày cấy z đĩa petri Sau để nhiệt độ phòng [5] om l.c gm @ 28 3.4.3 Phương pháp xác định hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc Thí nghiệm ảnh hưởng mơi trường ni cấy Trong điều kiện phịng thí nghiệm, để ni cấy nấm Trichoderma sử dụng mơi trường dinh dưỡng tổng hợp lỏng hoặc rắn (có agar) hoặc ng̀n tự nhiên khác từ thực vật (các hạt ngũ cốc phế thải, kho dầu củ cải đường) Có thể ni cấy nấm Trichoderma phương pháp cấy chìm hoặc cấy bề mặt môi trường Các nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp cấy nấm bề mặt môi trường có agar Nấm Trichoderma được cấy số mơi trường ni cấy thích hợp với nấm đối kháng PGA, CMA, Chapek Sau được đặt điều kiện nhiệt độ: 250C 3.4.4 Phương pháp thử hoạt tính đối kháng Trichoderma - Phương pháp đục lỗ thạch [4], [9], [13] lu an * Nguyên tắc: n va Tác động đối kháng Trichoderma với tác nhân gây bệnh nhờ chế tn to cạnh tranh dinh dưỡng, chế ký sinh hay tạo chất kháng sinh chúng tiết • Cách tiến hành: p ie gh trình sinh trưởng và phát triển d oa nl w Rót mơi trường PGA hấp khử trùng vào đĩa petri vô trùng để nguội và kiểm tra nhiễm tạp sau 24h a lu Cấy nấm Trichoderma lên thạch đĩa peptri, sau cấy chủng nấm bệnh a nv lên lỗ thạch đục đối xứng nhau, ủ nhiệt độ phòng Theo dõi sự phát u nf triển về kích thước (đường kính khuẩn lạc, thời gian tiếp xúc, ức chế) ll Trichoderma với nấm gây bệnh thực vật oi m tz cộng lần, theo cơng thức: a nh Mỗi thí nghiệm lặp lại lần và số liệu kết cuối là trung bình z KT = ( a+b+c)/3 om l.c gm @ 29 Trong đó: KT kích thước đương kính khuẩn lạc trung bình a,b,c : đường kính khuẩn lạc lần thí nghiệm - Chỉ tiêu theo dõi: + Chỉ tiêu 1: Theo dõi đường kính đối kháng có chủng Trichoderma ức chế hoàn toàn nấm gây bệnh thực vật Lúc này, so sánh khả đối kháng giữa chủng Trichoderma với nấm gây bệnh + Chỉ tiêu 2; Theo dõi mẫu thử đối kháng hai khuẩn lạc Trichoderma và nấm gây bệnh tiếp xúc với Ghi nhận kết nấm đối kháng Tìm hiểu khả ức chế nấm Trichoderma nấm gây bệnh chất kháng sinh bay hơi: Dựng đĩa có đường kính nhau, mơi trường PGA, đĩa cấy nấm gây bệnh, đĩa cấy nấm Trichoderma , úp đĩa vào và giữ kín hộp đĩa Đối chứng cặp petri cấy nấm gây bệnh lu an Theo dõi sự sinh trưởng, phát triển loại nấm khả ức chế nấm va n gây bệnh chất kháng sinh bay nấm Trichoderma sinh tn to 3.4.5 Phương pháp định danh nấm Trichoderma sinh học phân tử - Nhân sinh khối Trichoderma: p ie gh 3.4.5.1 Nhân thu sinh khối Trichoderma d oa nl w Trong môi trường nhân sinh khối nấm lỏng lắc + Chuẩn bị môi trường: Tất thành phần môi trường được cho a nv a lu với lượng nước cất vừa đủ dung lượng cần thiết, khuấy đều Cho vào bình tam giác 100ml mơi trường Hấp khử trùng 20 phút 121ºC Để nguội u nf ll + Cắt khoảng nhỏ thạch chứa sợi nấm mọc môi trường PGA cho oi m vào những bình tam giác Rời đem lắc với cường độ 150 vòng/phút a nh nhiệt độ phòng, để sợi nấm tiếp xúc tối đa với môi trường sợi nấm ln tz trạng thái sinh trưởng mạnh nên không mọc bào tử Lắc liên tục z om l.c gm @ 30 sợi nấm mọc nhiều và đều khắp môi trường (khoảng 2-3 ngày), dừng lại thu lấy sợi nấm 3.4.5.2 Tách chiết DNA tổng số Trichoderma - Hóa chất sử dụng tách chiết DNA + Đệm chiết CTAB ( tris, EDTA, CTAB, NaCl, β- mercaptoetanol 1%) + NaCl 5M + EDTA 0,1M + CIAA (chloroform/ isoamylalcohol 24:1) + Isopropanol + Ethanol 70% Dung dịch TE 1X ( Tris HCl 1M, pH = 8, EDTA 0,5M) - Quy trình chiết DNA theo phương pháp CTAB [18]: + Nấm Trichoderma nuôi lắc môi trường nhân sinh khối lu an + Lấy khoảng 1,5ml sinh khối, ly tâm 10000 vòng/phút phút va n rửa sinh khối EDTA tn to + Thu cặn, bổ sung khoảng 1,2 ml đệm CTAB + Ủ 70ºC 45 phút (cứ phút vortex lần) p ie gh + Siêu âm phút (5 giây nghỉ giây) d oa nl w + Ly tâm 10000 vòng/phút 10 phút, nhiệt độ thường + Thu 700µl dịch nổi, bổ sung 700µl CIAA, đảo trộn mạnh a lu + Ly tâm 10000 vòng/phút 10 phút, nhiệt độ thường a nv + Thu 400µl dịch nổi, bổ sung 400µl isopropanol, đảo trộn mạnh ll u nf + Ly tâm 10000 vòng/phút 15 phút, nhiệt độ thường oi m + Thu kết tủa (DNA), rửa kết tủa 1000µl cờn 70% Ly tâm 10000 a nh vịng/phút phút, đổ cờn, tiếp tục ly tâm kép để loại cồn tz + Lấy DNA hịa tan 50 µl dung dịch TE z + Ủ 70ºC đến kết tủa tan hết vào dung dịch TE om l.c gm @ 31 + Kiểm tra chất lượng DNA phản ứng PCR, sử dụng cặp mồi 18S và điện di gel agarose 1,5% 3.4.5.3 Phản ứng PCR PCR kỹ thuật phổ biến sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo nhiều sao) từ đoạn DNA mà không cần sử dụng vi sinh vật sống E coli hay nấm men DNA làm khuôn: Thu nhận qua q trình ly trích DNA gen nấm Trichoderma, sau pha lỗng đến nờng độ DNA thích hợp cho phản ứng PCR Bảng 3.5 Trình tự mồi ITS4 ITS5 Primer Trình tự primer theo chiều 5’- 3’ ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G lu an Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR liều va n lƣợng dùng cho phản ứng to Nồng độ Thể tích ( µl) DNA khn 0,1-1µg 2,5 Buffer 10X 2,5 Dntp 2,5 mM 1,5 Prime (xi+ngược) 10µM 1,5 Taq DNA polymerase 5U/µl 0.2 p ie gh tn Thành phần d oa nl w 16,8 u nf Tổng a nv a lu H2O 25 ll oi m tz a nh z om l.c gm @ 32 Bảng 3.7 Chu trình nhiệt phản ứng PCR Chu trình nhiệt phản ứng PCR Các giai đoạn phản Nhiệt độ ứng PCR (0ºC) Thời gian Chu kỳ Biến tính ban đầu 94 phút Biến tính 94 30s Gắn mồi 52 30s Kéo dài 72 50s Kéo dài cuối 72 Ủ bảo quản 25  Kết hợp cải tiến quy trình Wang C Z (2002), White cs (1990), Carbone Kohn (1999) VBI – CLF (2002) cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm [6], [22], [23] Các bước phản ứng PCR: lu an Tính thể tích thành phần cần cho hoặc nhiều phản ứng PCR n va Pha Mix ống ependorf, thành phần tích lớn cho trước trừ tn to DNA), Taq cho sau điều kiện lạnh, trộn dung dịch micropipet Các mẫu DNA được pha loãng trước dùng, cho tương ứng với p ie gh tránh tượng tạo bọt (chú ý sau cho Taq không được vortex) d oa nl w mẫu (trong ống ependort) Bổ sung dung dịch Mix vào mẫu DNA tương ứng (hỗn hợp phản ứng giữ diều kiện lạnh) a nv a lu Spindown ống ependort chứa hỗn hợp phản ứng mẫu DNA tương ứng mẫu âm tính (khơng có DNA) sau đặt vào máy PCR với chu ll u nf trình nhiệt đặt trước oi m 3.4.5.4 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR a nh DNA là đại phân tử sinh học mang điện tích âm, mơi tz trường có điện trường, phân tử DNA có kích thước khác di chuyển z từ cức âm sang cực dương với tốc độ khác om l.c gm @ 33 Các bƣớc tiến hành: - Chuẩn bị gel agarose 1,5% (đun nóng đến đờng thể), đổ bảng điện di có lược cài sẵn tạo giếng tra mẫu - Mẫu (sản phẩm phản ứng PCR) được nhuộm với thuốc nhuộm bromophenol blue 1% - Tra mẫu nhuộm vào giếng chạy điện di Để kiểm tra kích thước đoạn DNA, thường chạy đồng thời với mẫu DNA chuẩn (thang chuẩn) - Chạy điện di với dòng điện 90-120mA, đến vạch màu chạy được khoảng 3/4 chiều dài gel kết thúc điện di - Nhuộm DNA dung dịch ethydium bromide 1% 10 phút - Kiểm tra kết ánh sáng tử ngoại bước sóng 260nm 3.4.5.5 Phương pháp tinh sản phẩm PCR an lu Thực phản ứng PCR với thể tích lớn sau tinh sản phẩm va PCR Kít PCR quick-SpinTM để đảm bảo chất lượng sản phẩm cho phản n ứng giải trình tự Quy trình tinh sản phẩm PCR được tiến hành sau: to gh tn - Bổ sung 700 ml đệm Binding buffer với hỗn hợp sản phẩm PCR, để p ie hỗn hợp sản phẩm phút nhiệt độ phòng - Ly tâm 10000 vòng phút d oa nl w - Loại bỏ dịch, giữ nguyên cột - Bổ sung 700ml đệm rửa Washing buffer a lu - Ly tâm 10000 vòng phút a nv - Loại bỏ dịch, giữ lại cột ll u nf - Chuyển cột sang ống effendorf 1,5 ml oi m - Bổ sung 20 ml đệm Elution buffer z - Điện di kiểm tra sản phẩm tz - Thu lại dịch, loại bỏ cột a nh - Ly tâm 10000 vòng phút om l.c gm @ 34 3.6 Phƣơng pháp tạo chế phẩm nấm đối kháng Nấm Trichoderma được nuôi môi trường PGA dùng làm nguồn để nhân sinh khối Bào tử nấm Trichoderma dùng làm nguồn nhân sinh khối được chuyển vào môi trường nhân sinh khối thóc, gạo hoặc ngơ Mơi trường nhân sinh khối được hấp khử trùng 45 phút 1210C Sau nguồn nấm Trichoderma được nuôi cấy điều kiện tốt là đậy nút hở và đảo trộn lần sau ngày và 10 ngày, điều kiện ánh sáng xen kẽ 12 sáng 12 tối nhiệt độ phòng vòng 15 ngày Sau 15 ngày ni cấy, nấm Trichoderma được phơi bóng râm khơ Chế phẩm sau được đóng gói túi nilon, được hút chân khơng bảo quản nhiệt độ 280C Quy trình sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng Trichoderma được nêu cụ thể hình: an lu n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf a nv a lu oi m tz a nh z om l.c gm @ 35 Nấm Trichoderma được nuôi cấy giữ nguồn môi trường PGA sau Cơ chất được cho vào túi nilon bổ sung nước với lượng thích hợp, được 6-8 ngày hấp khử trùng Bào tử nấm tách đượ cấy vào môi trường nhân sinh khối sau hấp để nguội Lắc nhẹ túi nilon để đảo trộn, đảm bảo bào tử nấm được phân bố đều môi trường nhân sinh khối túi nilon để hở an lu n va Nấm được ni cấy điều kiện nhiệt độ phịng, cấy Thời gian nuôi to p ie gh tn cấy 15 ngày d oa nl w Chế phẩm được phơi bóng râm khơ ll u nf a nv a lu m oi Chế phẩm được đóng gói túi , được hút chân khơng bảo quản tz a nh z Hình 3.1: Các bƣớc tạo chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma om l.c gm @ 36 PHẦN KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN Trong khuôn khổ đề tài, sau thời gian nghiên cứu, thu thập mẫu đất, xác định hình thái, định danh chủng Trichoderma Đề tài thu được số kết sau: 4.1 Kết phân lập chủng nấm Trichoderma Để tiến hành phân lập nấm Trichoderma, công việc thu thập mẫu đất trồng hoa màu được thực huyện tỉnh Nguyên Tiến hành thu mẫu đất những vùng đất trồng hoa màu: Đỗ tương, rau, lạc, đậu, sinh trưởng phát triển, cách rễ khoảng 2-5 cm Thí nghiệm tiến hành với mẫu trồng hoa màu huyện tỉnh Thái Nguyên Tiến hành thu mẫu đất những vùng đất trồng hoa màu: Đỗ tương, rau, lạc, đậu,… sinh trưởng phát triển, cách an lu rễ khoảng 2-5 cm Các mẫu đất được pha lỗng cấy mơi trường PGA va Và sau nấm mốc được kiểm tra lại hình thái môi trường PGA n đề cập phần phương pháp nghiên cứu Kết phân lập chủng gh tn to Trichoderma mẫu đất được thể bảng: p ie Bảng 4.1 Kết phân lập mẫu đất Đất rau Đất trồng đậu Đất đỗ tương - 2 10 1 11 d oa nl w Đất đỗ Số chủng nấm phân lập Địa điểm Số mẫu thu Đối tƣợng a nv a lu ll u nf Phường Quang Vinh, thành phố Thái Nguyên Xã Quyết Thắng, TP Thái Nguyên Chủng Viện bảo vệ Thực vật Huyện Phú lương, TP Thái Nguyên Huyện Đồng Hỷ, Thái nguyên Tổng oi m tz a nh z om l.c gm @ Tên chủng C1 C2 C3-C6 C7-C11 11 - 37 Trong tổng số 10 mẫu thu thập huyện , có 11 mẫu phân lập được nấm Trichoderma, có mẫu có triển vọng Kết cho thấy nguồn đối kháng Trichoderma tự nhiên cịn q thấp, việc nhân ni bổ sung vào đất vi sinh vật đối kháng có ý nghĩa quan trọng hạn chế sự phát triển tác nhân gây bệnh tồn đất Việc nghiên cứu lồi có khả đối kháng tác nhân gây bệnh đất cần thiết Giúp tăng cao lượng thiên địch tự nhiên loài nấm gây bệnh những biện pháp quan trọng ứng dụng chế phát triển C1 C2 an lu n va gh tn to p ie Hình 4.1 Nấm mốc phân lập môi trƣờng PGA chủng C1 (mẫu đất d oa nl w Xã Quyết Thắng, TP Thái Nguyên) chủng C2 (Viện bảo vệ Thực vật) 4.2 Kết nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa nấm Trichoderma a lu a nv Những khuẩn lạc ban đầu có màu trắng, sinh bào tử chuyển sang u nf xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng (như hình 4.1) sau được cấy ll chuyển tiếp lên môi trường PGA (để kiểm tra lại hình thái khuẩn lạc) kết oi m tz a nh hình 4.2 z om l.c gm @ 38 Hình 4.2 Hình thái khuẩn lạc nấm Trichoderma mơi trƣờng PGA Hình thái khuẩn lạc Trichoderma ban đầu có màu trắng, sinh bào tử chuyển sang xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng số lồi cịn có khả tiết số chất làm thạch môi trường PGA hóa vàng, phù hợp với hình thái khuẩn lạc nghiên cứu trước , màu sắc sợi nấm khác từ xanh đậm, xanh nhạt đến màu xanh mạ… lu an Các chủng Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh chúng đạt đường n va kính khuẩn lạc từ 2-4 cm sau ngày ni cấy nhiệt độ 20º C ie gh tn to C1 p C1 d oa nl w ll u nf a nv a lu oi m tz a nh z om l.c gm @ 39 C2 C3 Hình 4.3 Hình ảnh cấy trải chủng C1 (mẫu đất Xã Quyết Thắng, TP Thái Nguyên), chủng C2 (Viện bảo vệ Thực vật) chủng C3 (Huyện Phú lƣơng, TP Thái Nguyên) Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái chủng phân lập đƣợc Chủng C1 an lu STT n va ie gh tn to p d oa nl w A C2 Đặc điểm Khuẩn lạc Bào tử Khuẩn lạc nấm lúc đầu có Hình cầu, màu xanh trắng màu trắng hoặc lục trắng đính sợi nấm sau chuyển sang màu xanh đậm hoặc xanh lục Khuẩn lạc nấm có màu Dạng hình trứng, màu lục, lục đậm xanh lục đính sợi nấm B C ll u nf a nv a lu oi m tz a nh z Hình 4.4 Hình thái khuẩn lạc (A) hình thái tế bào (B), (C) chủng C1 om l.c gm @ 40 A B Hình 4.5 Hình thái khuẩn lạc (A) hình thái tế bào (B) chủng C2 Các nguồn nấm Trichoderma cấy môi trường PGA nhiệt độ 25 – 28oC phát triển sau: Sau cấy bào tử nẩy mầm tạo thành ống mầm Ống mầm phát triển thành sợi nấm Từ điểm tăng trưởng ban đầu (điểm cấy lu nấm), sợi nấm lan xung quanh tạo thành hình tia Sợi nấm an suốt, mịn, sau cấy ngày sợi nấm bắt đầu phân nhánh, sợi nấm va n không rời khỏi mặt môi trường Những sợi nấm gọi sợi nấm nền Ngày gh tn to thứ sau cấy, sợi nấm nền tiếp tục lan rộng, phát triển tạo thành thể sợi nấm p ie nền Sau bề mặt mơi trường hình thành những sợi nấm mọc d oa nl w phía Đây là những sợi nấm khí, những sợi nấm khí cụm lại với tạo thành đám nhỏ Trên sợi nấm khí hình thành bào tử Nếu nhiều sợi nấm khí hình thành nhiều bào tử Ngày hình thành, bào tử có a lu màu xanh nhạt Nhiều bào tử cụm lại tạo thành đám có màu xanh Các a nv u nf đám bào tử cụm lại thành mụn u thảm nấm có màu xanh ll đặc trưng Các đám bào tử theo thời gian lan rộng dần, đợt tạo thành m oi những đường trịn đờng tâm bề mặt mơi trường, sau ngày nuôi cấy nấm a nh Trichoderma môi trường có màu xanh, giai đoạn này lượng bào tử được tz z tích lũy và bắt đầu tượng tự phân giải riêng rẽ sợi nấm om l.c gm @ 41 4.3 Kết thử hoạt tính đối kháng nấm Trichoderma 4.3.1 Kết khả ký sinh nấm Trichoderma nấm Fusarium gây bệnh vàng thối rễ Sử dụng chủng nấm Trichoderma được phân lập, cấy đối xứng môi trường PGA, theo dõi sự phát triển sợi nấm sau ni cấy 3,6,9 ngày, kết trình bày bảng 4.3 Bảng 4.3 Hoạt tính đối kháng Trichoderma Fusarium mơi trƣờng PGA Đƣờng kính tản nấm (cm) ngày Chủng Trichod Fusa C1 5,8 C2 Trichde Fusa Đ/c rma rium 2,8 7,8 5,0 3,0 C3 4,2 Đ/c Trichode Fusa rma rium 2,4 9,1 1,1 7,5 2,5 9,0 1,3 2,7 6,6 2,5 8,4 1,5 4,1 3,1 6,7 2,9 8,2 1,6 5,0 3,0 7,0 2,8 8,8 1,4 6,0 2,2 8,1 1,4 Đ/c n va rium ngày gh an lu erma ngày tn to C4 p ie 2,0 4,0 2,0 6,2 2,4 7,8 2,0 C8 4,0 2,5 6,9 2,3 8,0 2,0 C9 3,4 2,1 6,3 2,5 8,2 1,6 C10 4,6 2,2 7,4 2,3 8,5 1,7 C11 3,8 2,6 2,8 7,9 1,8 C6 C7 2,8 ll u nf a nv 3,0 a lu d oa nl w C5 oi m tz a nh 6,4 z om l.c gm @ 42 Trong thí nghiệm nấm bệnh (Fusarium) nấm Trichoderma được cấy chung đĩa petri Nếu Trichoderma có hoạt tính đối kháng với nấm bệnh sự phát triển nấm bệnh bị hạn chế, thể qua đường kính khuẩn lạc nấm Đường kính khuẩn lạc nấm bệnh phát triển thời gian cấy chung với Trichoderma Kết cho thấy Trichoderma có khả đối kháng cao với nấm bệnh Fusarium , thể qua đường kính khuẩn lạc nấm bệnh Fusarium nhỏ dần, không tăng lên A B C D an lu n va tn to Hình 4.6 Đối kháng Trichoderma chủng C1 (A), C2 (B), C3 (C) với Sau ngày cấy, nấm bệnh Fusarium nấm Trichoderma phát triển tốt p ie gh Fusarium đối chứng (D) Fusarium sau ngày cấy B C D ll u nf a nv a lu A d oa nl w chậm, bào tử Trchoderma mọc chậm (hình 4.6) oi m a nh Hình 4.7 Đối kháng Trichoderma chủng C1 (A), C2 (B), C3 (C) với tz z Fusarium đối chứng (D) Fusarium sau ngày cấy om l.c gm @ 43 Sau ngày cấy, thấy dấu hiệu sự ức chế nấm bệnh Fusarium chế phẩm Trichoderma Nấm bệnh phát triển chậm lại, tơ nấm co lại, chế phẩm mọc nhiều (hình 4.7) A B Hình 4.8 Đối kháng Trichoderma chủng C1 (A) với Fusarium đối chứng lu an (B) Fusarium sau ngày cấy n va Sau ngày nuôi cấy, nấm bệnh không phát triển nữa, tơ nấm lụi tn to dần So với đối chứng đường kính khuẩn lạc nấm bệnh Fusarium nhỏ dần, gh khơng tăng lên, kìm hãm được sự phát triển nấm bệnh, tiêu diệt p ie chúng chất kháng sinh enzyme, thưa dần, lại sự phát triển d oa nl w nấm Trichoderma (hình 4.8) ll u nf a nv a lu oi m tz a nh z om l.c gm @ 44 4.3.2 Kết khả ký sinh nấm Trichoderma nấm Phytophthora gấy bệnh thối gốc Bảng 4.4 Hoạt tính đối kháng Trichoderma Phytophthora môi trƣờng PGA Đƣờng kính tản nấm (cm) ngày Chủng ngày Tricho Phyto derma phthroza C1 5,0 2,6 7,8 C2 4,9 3,0 C3 4,2 C4 ngày an lu n va Phyto derma phthroza 2,4 9,1 1,1 7,5 2,6 8,9 1,4 2,8 6,6 2,5 8,4 1,2 4,1 3,0 6,7 2,9 8,2 1,6 C5 4,5 3,2 7,2 2,7 8,8 1,4 C6 4,0 2,2 6,0 2,2 8,1 1,4 C7 4,3 2,3 6,2 2,4 7,8 2,0 C8 4,0 2,6 6,9 2,3 8,0 2,0 C9 3,4 2,4 6,3 2,5 8,2 1,6 C10 3,6 2,2 7,4 2,3 8,5 1,7 C11 3.8 2,7 6,4 2,8 7,9 1,8 2,5 Phyto phthroza Đ/c 5,4 p ie gh tn to Tricho Đ/c Trichoderma Đ/c 7,6 d oa nl w ll u nf a nv a lu oi m tz a nh z om l.c gm @ 45 a b Hình 4.9 Đối kháng Trichoderma chủng C1 với Phytophthroza (a) đối chứng Phytophthroza (b) Nấm Phytophthroza phát triển nhanh mọc phần thạch mà lu an Trichoderma không mọc Sau Phytophthroza bị Trichoderma vây kín n va ký sinh làm nấm bệnh thu nhỏ lại, thưa dần, tơ nấm lụi dần, cuối bị tn to tiêu diệt gh Ở công thức đối chứng, nấm bệnh sinh trưởng phát triển tốt sau p ie ngày đạt đường kính tối đa Hiệu ức chế dòng nấm Trichoderma nấm bệnh cao d oa nl w Một số dòng nấm Trichoderma cịn có khả sinh chất kháng sinh bay có khả tiêu diệt nấm bệnh, khơng có sự tiếp xúc trực a nv a lu tiếp với nhau.Qua thí nghiệm cạnh tranh với Fusarium Phytophthoza ta thấy 11 chủng phân lập được chủng C1 chủng C2 (chủng lấy u nf từ viện Bảo vệ Thực vật) có hoạt tính đối kháng cao ll oi m 4.4 Kết Định danh a nh 4.4.1 Kết tách chiết DNA tổng số Trichoderma tz Một khó khăn gặp phải tách chiết DNA từ nấm mốc là thành tế z bào nấm mốc tương đối dày, việc phá hủy thành tế bào om l.c gm @ 46 enzyme thường cho hiệu suất tách chiết DNA thấp Mặt khác, tế bào nấm mốc nhiều Polysaccharide, polysaccharide kết tủa DNA trình tách chiết và ảnh hưởng đến phản ứng PCR được thực về sau Do chúng tơi lựa chọn sử dụng phương pháp CTAB kết hợp sóng siêu âm để phá vỡ thành tế bào Saghai maroof, 1984 (Jame.C, 2008) [18] an lu n va tn to Hình 4.10 Kết tách chiết DNA tổng số ie gh Giếng 1: Chủng C1 (mẫu đất Xã Quyết Thắng, TP Thái Nguyên), Giếng p 2: Chủng C2 (Viện bảo vệ Thực vật) d oa nl w Kết DNA tổng số thu được nhìn chung loại được hồn toàn RNA, band rõ nét, gọn DNA tổng số đạt chất lượng nồng độ tốt để thực 4.4.2 Kết PCR a nv a lu cho thí nghiệm u nf Dựa vào thang ladder cho thấy qui trình PCR khuếch đại vùng ITS – ll rDNA với cặp primer ITS4/ ITS5 cho kết thể điện di gel m oi agarose % 110V, 400A 20 phút, có kích thước khoảng 600bp Mẫu a nh xuất band mong muốn hồn tồn khơng có band phụ tz z om l.c gm @ 47 Hình 4.11 Kết điện di gel agarose Giếng 1: Chủng C1 (mẫu đất Xã Quyết Thắng, TP Thái Nguyên), Giếng (chủng T5 phân lập từ đất trồng công nghiệp) an lu n va gh tn to 600bp p ie d oa nl w a lu Hình 4.12 Kết tinh sản phẩm PCR a nv Giếng 1: Chủng C1 (mẫu đất Xã Quyết Thắng, TP Thái Nguyên), Giếng ll u nf (chủng T5 phân lập từ đất trồng công nghiệp) oi m 4.4.3 Kết giải trình tự gen a nh Sản phẩm PCR sau được tinh được gửi giải trình tự z sau: tz chiều hãng First Base Singapore và được thu được kết om l.c gm @ 48 CGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACT CCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTC ACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGG AACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTTA CAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGG ATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAA GTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGC ACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCA TTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGA CCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCTAAATACAGTGGCGGTCTCGCCG CAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCG GCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTC GGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATA Từ kết giải trình tự gen thu được tiến hành so sánh Blast lu an NCBI, kết được thể hình 4.13 n va p ie gh tn to d oa nl w a nv a lu Hình 4.13 Kết so sánh trình tự gen sản phẩm PCR BLAST với ll u nf mồi với mồi ITS4-ITS5 từ mẫu đất (từ Xã Quyết Thắng oi m TP Thái Nguyên, Tỉnh Thái Nguyên) a nh Dựa vào độ tương đồng di truyền 99% đến 100% so với lồi tz NCBI, khẳng định là chủng Trichoderma asperellum Trichoderma z asperellum vài lồi Trichoderma có hoạt tính đối kháng mạnh om l.c gm @ 49 với nhiều loài nấm đất gây bệnh Pythium, Phytophthora, Sclerotinia, Sclerotium, Thielaviopsis basicola, Rhizoctonia, Verticillium Mức độ an toàn chúng thuộc nhóm 1, khơng gây độc cho người gia súc, không gây ô nhiễm môi trường Nấm Trichoderma asperellum có chế đối kháng gờm ký sinh trực tiếp, tiết enzyme phân hủy vách tế bào nấm gây bệnh, cải thiện chất lượng đất hình thành số hợp chất có khả cảm ứng tạo tính kháng tập nhiễm hệ thống 4.5 Bƣớc đầu sản xuất chế phẩm nấm đối kháng Chủng nấm Trichoderma sau định danh được sử dụng để nghiên cứu tạo chế phẩm nấm đối kháng Quy trình tạo chế phẩm Nấm đối kháng Trichoderma được để cập phần vật liệu và phương pháp nghiên cứu: Chủng nấm Trichoderma được cấy môi trường PGA sau 6-8 ngày được trộn với thóc được khử trùng nhiệt độ 121ºC 20 phút, nuôi lu an điều kiện ánh sáng xen kẽ 12 sáng 12 tối nhiệt độ phòng n va vòng 15 ngày Kết bước đầu tạo chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma tn to được thể hình 4.14 gh Thơng qua hình 4.14 ta thấy nấm Trichoderma sinh trưởng phát p ie triển tốt chất thóc bền màu đặc trưng Trichoderma sau d oa nl w tháng nghiên cứu ll u nf a nv a lu oi m tz a nh z om l.c gm @ 50 Hình 4.14 Hình ảnh chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma an lu n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf a nv a lu oi m tz a nh z om l.c gm @ 51 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã phân lập được 11 chủng, tuyển chọn được chủng Trichoderma có hiệu đối kháng cao với nấm gây bệnh Fusarium Phytophthora Nấm Trichoderma phát triển môi trường PGA có khuẩn lạc lúc đầu màu trắng hoặc lục trắng sau chuyển sang màu xanh đậm hoặc xanh lục, tế bào hình cầu hoặc hình trứng, màu xanh lục hoặc xanh trắng đính sợi nấm Từ 11 chủng trên, thu được chủng có hoạt tính đối kháng mạnh là chủng C1 và chủng C2 (trong chủng C2 là Viện Bảo vệ Thực vật) Các chủng này được sử dụng để tạo chế phẩm nấm đối kháng lu an Đã định danh được chủng C1 là Trichoderma asperellum với mức độ n va tương đồng lên đến 99-100% tn to Bước đầu tạo được chế phẩm nấm đối kháng sử dụng chất là thóc ie gh khử trùng p 5.2 Kiến nghị d oa nl w Tiếp tục phân lập và tuyển chọn chủng Trichoderma có hoạt tính kháng nấm bệnh những vùng sinh thái khác a lu Kiểm tra khả đối kháng Chủng Trichoderma asperellum C1 a nv số loại nấm bệnh khác ll oi m nấm Trichoderma tạo u nf Đánh giá ngoài đồng ruộng khả diệt nấm bệnh chế phẩm tz a nh z om l.c gm @ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng Việt Tô Minh Châu, Vương Thị Việt Hoa, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thúy Hương (1999), Vi sinh vật học đại cương, NXB Đại học Nơng Lâm Tp Hờ Chí Minh Đỗ Thu Hà (2004), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam-Đà Nẵng, Luận án tiến sĩ Khoa Học, ĐHSP Hà Nội Trần Thu Hà, Phạm Thanh Hòa (2012), “Khả đối kháng nấm Trichoderma với nấm bệnh hại trồng Scleroitum rolfsii điều kiện invitro”, Tạp chí khoa học, Đại học Huế, tập 75A, số 6, (2012) Hoàng Thị Thu Hoài (2013), Phân lập tuyển chọn số chủng nấm sợi có hoạt tính kháng khuẩn từ đất quận Cái Răng, thành phố Cần Thơ, an lu Khoa Sư Phạm, ĐH Cần Thơ không sinh độc tố nhằm tạo chế phẩm nấm đối kháng, Luận văn Thạc sĩ, n va Bùi Đình Lãm (2009), Nghiên cứu phân lập chủng Aspergillus Flavus gh tn to Trường ĐH Bách khoa Hà Nội p ie Hứa Võ Thành Long (2010), Sản xuất bào tử nấm Trichoderma spp Làm thuốc trừ nấm bệnh trồng Khóa luận cử nhân khoa Môi trường và d oa nl w CNSH, Đại học Kỹ thuật công nghệ TP.HCM Nguyễn Xuân Thành (2003), Giáo trình cơng nghệ vi sinh vật sản Hà Nội u nf a nv a lu xuất nông nghiệp xử lý ô nhiễm môi trường Nhà xuất Nông nghiệp Nguyễn Thị Thuần (1998), “Hiệu đối kháng nấm Trichoderma đối ll oi m với nấm gây bệnh hại trờng” Tạp chí Bảo vệ Thực vật 4: 35-38 a nh Nguyễn Thị Thuần (1999), “Phương pháp sản xuất và sử dụng nấm tz Trichoderma để phịng trừ bệnh hại trờng” Tạp chí Bảo vệ Thực vật 4: z om l.c gm @ 33-34 53 10 Trần Thị Thuần, Nguyễn Thị Ly, Phạm Ngọc Dung (2004), “Nghiên cứu và sử dụng nấm đối kháng Trichoderma để phịng trừ nhóm nấm tờn đất gây hại trờng”, Tạp chí bảo vệ thực vật 11 Trần Thị Thúy (2013), Nghiên cứu tuyển chọn và sản xuấ t chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng Trichoderma phòng trừ tác nhân gây bệnh thối đen ca cao, Khoa môi trường, ĐH Khoa học Tự nhiên (Luận văn Thạc sĩ) 12 Trần Thị Thanh Tuyền (2004), Khảo sát trình đối kháng nấm gây bệnh nấm mốc Trichoderma harzianum, khóa luận cử nhân khoa học ngành công nghệ sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Tp HCM II Tiếng Anh 13.Clipson N., Landy E., Otte M (2001), European register of marine species: a check-list of the marine species in Europe and a bibliography of guides to their identification Collection Patrimoines Naturels, 50, 15-19 an lu n va ie gh tn to 14.Gary E Harman (2000), Trichoderma spp., including T harzianum, T viride, T koningii, T hamatum and other spp Deuteromycetes, Moniliales (asexual classification system) Cornel University, Geneve, NY 14456 http://www.nysaes.cornell.edu/ent/biocontrol/pathogens/trichoderma.html p 15.Gary J Samuels (2004), Trichoderma a guide to identification and biology Unit States Deparment of Agriculture Agricultural Research service Systermatic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350, USA Blackwell Science,Ltd25 d oa nl w a lu ll u nf a nv 16.Gary J Samuels (9-2005), Trichoderma: Systematic, the Sexual State, and Ecology United States Department of Agriculture Agricultural Research Service Systematic Botany and Mycology Laboratory 304, B011A Beltsville, MD 20705 Acepted for publication oi m tz a nh 17.James c (2008) “ Global status of commercialized biotech/ GM Crop”, ISAAA Brief No, 37, International Service for the Acquisition of AgriBiotech application, Ithaca, NY, USA z om l.c gm @ 54 18.Prasun K Mukherjee and Kanthadai Raghu (1997), Effect of temperature on antagonistic and biocontrol pontential of Trichoderma sp on Sclerotium rolfsii Mycopathologia 139: 151-155 19.Siu-Wai Chiu Morphogenesis & David Moore (2001) Deciphering Fungal Website: http://ihome.cuhk.edu.hk/~b456741/jpeg/chitin.jpg 20 Turner D., Kovacs W., Kuhls K., Lieckfeldt E., Peter B., Arisan-Atac I., Strauss, J., Samuels G.J., Börner T., Kubicek C.P (1997), Biogeography and phenotypic variation in Trichoderma sect Longibrachiatum and associated Hypocrea species Mycol Res, 101:449-459 21.White T.J., Bruns T.M, Lee S and Taylor J (1989), Genetics and Evolution (part three) Amplication and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for Phylogenetics pp.315 – 320 an lu 22 White T.J., Bruns T., Lee S and Taylor J (1990), Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics In: M.A., Innis et al (Eds) PCR Protocols A guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego, pp 315-322 n va p ie gh tn to d oa nl w ll u nf a nv a lu oi m tz a nh z om l.c gm @ PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ MƠI TRƢỜNG PGA VÀ MƠI TRƢỜNG NHÂN SINH KHỐI Hình ảnh mơi trƣờng PGA an lu n va p ie gh tn to Hình ảnh mơi trƣờng nhân sinh khối Trichoderma d oa nl w u nf a nv a lu ll Hình ảnh mẫu đất thu thập đƣợc oi m tz a nh z om l.c gm @